TWI739247B - 戀臭假單胞菌s12基因編輯系統及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種戀臭假單胞菌基因編輯系統，包含戀臭假單胞菌、RedCas表達質體和外源基因表現質體。其中RedCas表達質體包含第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣，外源基因表現質體包含第二複製起始點、同源互換左臂、第二抵抗抗生素基因、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣。所述戀臭假單胞菌基因編輯系統包含CRISPR系統和λ-Red系統，可成功地一次將外源基因同源重組嵌入戀臭假單胞菌的多倍體染色體中，以得到外源基因表現穩定的同源重組體。

Description

戀臭假單胞菌S12基因編輯系統及其應用
本發明是有關於一種戀臭假單胞菌之基因表現調控系統及應用，特別是戀臭假單胞菌基因編輯之方法及其應用。
戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)是一種腐生營養土壤桿菌，屬於格蘭氏陰性菌。基於16SrRNA基因分析，戀臭假單胞菌被分類學上證實為假單胞菌屬。
戀臭假單胞菌具有耐高鹽、可利用甘油(glycerol)作為生長碳源，並具有許多代謝途徑可以分解許多有機分子(例如可降解甲苯)，因此被廣泛應用於生物修復技術，或是用於微生物分解漏油，並可作為處理石化產業大量的含鹽甘油廢水的重要菌株平台。此外，和其他假單胞菌屬的菌株相比，戀臭假單胞菌更安全無害，且不像綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)有成為人類病原體的可能性。
先前文獻報導將外源基因轉型至戀臭假單胞菌體中來進行有機分子分解的方法仍有所限制，仍以送入質體並用抗生素維持外源基因穩定存在的方式進行，完成轉型的 菌株常較不穩定，容易失去分解有機分子的能力，需要額外添加抗生素維持其分解有機分子的能力，這在工業化生產終將會額外增加大量成本。除了前述方法之外，有文獻報導可利用CRIM將外源基因嵌入戀臭假單胞菌染色體中並進行基因編輯，此方法需要以質體不斷重複轉型進入同一染色體位置，但由於此方法限制很難精確嵌入外源染色體，並且很容易流失外源基因，或是需要以十分龐大或複雜的質體轉型系統進行基因編輯，使得整個基因編輯過程需要耗時將近兩周。後續雖然有其他研究藉由特定酵素切位(I-SecI)進行雙股斷裂(double strand breaks；DSBs)輔助的方法來縮短基因編輯的花費時間，但因酵素切位限制於染色體上某些地方而不能隨意進行基因編輯。因此如何得到穩定表現外源基因的戀臭假單胞菌轉型株，將其有效地應用於生物修復，用以移除或中和污染現場內污染物，始終是相當重要的課題。
有鑒於此，本發明提供一種戀臭假單胞菌基因編輯系統及戀臭假單胞菌基因編輯方法，透過將外源基因同源重組嵌入戀臭假單胞菌染色體中，得到穩定表現外源基因的同源重組體，可克服以質體生產的短處，並可加速將外源基因同時嵌入戀臭假單胞菌的多倍體染色體的程序。而利用本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統及戀臭假單胞菌基因編輯方法，可方便快速地實現刪除、點突變、替換及片段插 入等基因編輯，用以編輯戀臭假單胞菌之代謝網路，使其成為分解有機分子之菌株。
本發明之一態樣係在於提供一種戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)基因編輯系統，包含戀臭假單胞菌、RedCas表達質體和外源基因表現質體。所述RedCas表達質體包含依序排列之第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣，其中第一複製起始點包含SEQ ID NO：1所示序列，λ-Red表現卡匣包含第一啟動子、Gam基因、Bet基因和Exo基因，Cas表現卡匣包含第二啟動子和Cas基因。所述外源基因表現質體包含依序排列之第二複製起始點、同源互換左臂、第二抵抗抗生素基因、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣，其中外源基因表現卡匣包含第三啟動子和外源基因，gRNA卡匣包含第四啟動子和gRNA序列，且gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，同源互換區之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第一特定序列相對應，間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第二特定序列相對應，且第一抵抗抗生素基因和第二抵抗抗生素基因不相同。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯系統，其中所述RedCas表達質體可更包含一araC基因，且第一啟動子可為araBAD啟動子。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯系統，其中Cas基因可包含如SEQ ID NO：9所示序列、SEQ ID NO：10所示序列或SEQ ID NO：11所示序列。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯系統，其中外源基因表現質體可更包含二Flp/FRT剔除作用序列，且第二抵抗抗生素基因位於所述二Flp/FRT剔除作用序列之間。
本發明之另一態樣係在於提供一種戀臭假單胞菌基因編輯方法，包含下述步驟：先構築RedCas表達質體和外源基因表現質體，構築之RedCas表達質體包含依序排列之第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣。其中第一複製起始點包含SEQ ID NO：1所示序列，λ-Red表現卡匣包含第一啟動子、Gam基因、Bet基因和Exo基因，Cas表現卡匣包含第二啟動子和Cas基因。構築之外源基因表現質體包含依序排列之第二複製起始點、同源互換左臂、第二抵抗抗生素基因、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣。其中外源基因表現卡匣包含第三啟動子和外源基因，gRNA卡匣包含第四啟動子和gRNA序列，gRNA序列由間隔(spacer)和骨架所構成。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成一同源互換區，同源互換區之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第一特定序列相對應，間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第二特定序列相對應，且第一抵抗抗生素基因和第二抵抗抗生素基因不相同。將RedCas表達質體轉型至戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)中，以得到第一轉型株。再進行誘 導步驟，係培養第一轉型株後加入誘導物，以誘導RedCas表達質體表現Gam蛋白、Beta蛋白、Exo蛋白和Cas蛋白。接著將外源基因表現質體轉型至經誘導後的第一轉型株中，以得到第二轉型株，使外源基因表現質體表現gRNA，其中gRNA與Cas蛋白形成Cas蛋白複合體，對第二轉型株之染色體之第二特定序列進行雙股斷裂。Gam蛋白、Beta蛋白和Exo蛋白共同引導外源基因表現質體之同源互換區與第二轉型株之染色體之第一特定序列進行同源交換，將外源基因嵌入轉型株之染色體之第一特定序列中。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯方法，其中於誘導步驟中，可將第一轉型株培養至停滯期(stationary phase)後加入誘導物，可確保轉型效率。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯方法，其中RedCas表達質體可更包含一araC基因，且第一啟動子可為araBAD啟動子。所述誘導物可為阿拉伯糖(arabinose)。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯方法，其中可更包含第一篩選步驟，係以含有第一抗生素之第一培養基培養第一轉型株。
依據前述之戀臭假單胞菌基因編輯方法，其中可更包含第二篩選步驟，係以含有第二抗生素之第二培養基培養第二轉型株。
100:戀臭假單胞菌之基因編輯方法
110、120、130、140、150:步驟
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖繪示本發明之RedCas表達質體構築示意圖；第1B圖繪示本發明之外源基因表現質體構築示意圖；第2圖繪示本發明之戀臭假單胞菌基因編輯方法之步驟流程圖；第3A圖繪示CRISPR/Cas系統測試例之構築示意圖；第3B圖為CRISPR/Cas系統造成戀臭假單胞菌雙股斷裂效率的定性圖；第3C圖為CRISPR/Cas系統造成戀臭假單胞菌雙股斷裂效率的定量圖；第4A圖繪示本發明之RedCas表達質體之第1實施例、第2實施例和第3實施例之構築示意圖；第4B圖繪示本發明之外源基因表現質體之第1實施例、第2實施例和第3實施例之構築示意圖；第4C圖繪示本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作示意圖；第4D圖繪示第1比較例、第2比較例和第3比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統之構築示意圖；第4E圖繪示第4比較例、第5比較例和第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統之構築示意圖；第5A圖為本發明之第1實施例、第2實施例和第3實施例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落之定性圖； 第5B圖為第1比較例、第2比較例和第3比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落之定性圖；第5C圖為第4比較例、第5比較例和第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落之定性圖；第5D圖為本發明之第1實施例、第2實施例和第3實施例之戀臭假單胞菌基因編輯系統之同源互換效率之結果圖；第5E圖為本發明之第1實施例、第2實施例和第3實施例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落比例之定量圖；第6A圖繪示為進行菌落(colony)PCR而設計之6組獨特引子之位置示意圖；第6B圖、第6C圖和第6D圖為利用菌落PCR確認外源基因嵌入戀臭假單胞菌染色體之結果圖；第6E圖為利用菌落PCR確認經戀臭假單胞菌基因編輯系統處理後，戀臭假單胞菌染色體原始序列存在狀況之結果圖；第7A圖為利用菌落PCR確認經戀臭假單胞菌基因編輯系統處理6天後外源基因嵌入戀臭假單胞菌染色體之結果圖；以及第7B圖為外源基因嵌入戀臭假單胞菌之染色體的基因拷貝數之結果圖。
[戀臭假單胞菌基因編輯系統]
本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統包含戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、RedCas表達質體和外源基因表現質體。請參照第1A圖和第1B圖，第1A圖繪示本發明之RedCas表達質體構築示意圖，第1B圖繪示本發明之外源基因表現質體構築示意圖。
RedCas表達質體包含依序排列之第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣，其中第一複製起始點包含SEQ ID NO：1所示序列，λ-Red表現卡匣包含第一啟動子、Gam基因、Bet基因和Exo基因，Cas表現卡匣包含第二啟動子和Cas基因。進一步地，RedCas表達質體可更包含一araC基因，且第一啟動子可為araBAD啟動子。所述第一抵抗抗生素基因可為抵抗慶大黴素(gentamicin resistance,GmR)基因、抵抗卡納黴素(kanamycin resistance,KmR)基因或抵抗四環黴素(tetracycline resistance,TcR)基因。
外源基因表現質體包含依序排列之第二複製起始點、同源互換左臂、第二抵抗抗生素基因、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣，其中外源基因表現卡匣包含第三啟動子和外源基因，gRNA卡匣包含第四啟動子和gRNA序列，gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，同源互換區之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第一特定序列 相對應，間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第二特定序列相對應，且第一抵抗抗生素基因和第二抵抗抗生素基因不相同。進一步地，外源基因表現質體可更包含二Flp/FRT剔除作用序列，且第二抵抗抗生素基因位於所述二Flp/FRT剔除作用序列之間。所述第二抵抗抗生素基因可為抵抗慶大黴素基因、抵抗卡納黴素基因或抵抗四環黴素基因。
[戀臭假單胞菌基因編輯方法]
請參照第2圖，其繪示本發明之戀臭假單胞菌基因編輯方法之步驟流程圖。第2圖中，戀臭假單胞菌基因編輯之方法100包含步驟110、步驟120、步驟130、步驟140和步驟150。
步驟110為構築RedCas表達質體，構築之RedCas表達質體包含依序排列之第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣。其中第一複製起始點包含SEQ ID NO：1所示序列，λ-Red表現卡匣包含第一啟動子、Gam基因、Bet基因和Exo基因，Cas表現卡匣包含第二啟動子和Cas基因。進一步地，RedCas表達質體可更包含araC基因，且第一啟動子可為araBAD啟動子。
步驟120為構築外源基因表現質體，構築之外源基因表現質體包含依序排列之第二複製起始點、同源互換左臂、第二抵抗抗生素基因、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣。其中外源基因表現卡匣包含第三啟動子和外源基因，gRNA卡匣包含第四啟動子和gRNA序列， gRNA序列由間隔(spacer)和骨架所構成。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成一同源互換區，同源互換區之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第一特定序列相對應，間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第二特定序列相對應，且第一抵抗抗生素基因和第二抵抗抗生素基因不相同。
步驟130為將RedCas表達質體轉型至戀臭假單胞菌中，以得到第一轉型株。進一步地，可更包含第一篩選步驟，係以含有第一抗生素之第一培養基培養第一轉型株，以篩選成功轉型RedCas表達質體的第一轉型株。所述第一抗生素可為慶大黴素(gentamicin)、卡納黴素(kanamycin)或四環黴素(tetracycline)。
步驟140為進行誘導步驟，係培養第一轉型株後加入誘導物，以誘導RedCas表達質體表現Gam蛋白、Beta蛋白、Exo蛋白和Cas蛋白。進一步地，可將第一轉型株培養至停滯期(stationary phase)後加入誘導物，再進行後續試驗。例如培養第一轉型株12小時後加入誘導物，可確保轉型效率。
步驟150為將外源基因表現質體轉型至經誘導後的第一轉型株中，以得到第二轉型株，使外源基因表現質體表現gRNA，其中gRNA與Cas蛋白形成Cas蛋白複合體，對第二轉型株之染色體之第二特定序列進行雙股斷裂。Gam蛋白、Beta蛋白和Exo蛋白共同引導外源基因表現質體之同源互換區與第二轉型株之染色體之第一特定序列進行同源交換，將外源基因嵌入轉型株之染色體之第一特定序 列中。進一步地，可更包含第二篩選步驟，係以含有第二抗生素之第二培養基培養第二轉型株，以篩選成功轉型外源基因表現質體的第二轉型株。所述第二抗生素可為慶大黴素、卡納黴素或四環黴素。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
1.建立戀臭假單胞菌CRISPR/Cas系統
目前在尚無將CRISPR/Cas系統應用於戀臭假單胞菌的文獻報導。為了驗證CRISPR/Cas系統可在戀臭假單胞菌造成雙股斷裂，試驗上建構了三種不同CRISPR/Cas系統，包括SpCas9、SaCas9以及FnCas12a，並且設計gRNA對應戀臭假單胞菌染色體之Upp位置(PP_0746)作為測試例，試驗所使用的戀臭假單胞菌為Pseudomonas putida S12。
請參照第3A圖，其繪示CRISPR/Cas系統測試例之構築示意圖。第1測試例包含pGR-SpCas9質體和pKB-UppSp質體，其中pGR-SpCas9質體包含SpCas9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，pKB-UppSp質體對應戀臭假單胞菌染色體之Upp位置的gRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。第2測試例包含pGR-SaCas9質體和pKB-UppSa質體，其中pGR-SaCas9 質體包含SaCas9基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，pKB-UppSa質體對應戀臭假單胞菌染色體之Upp位置的gRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示。第3測試例包含pGR-FnCas12a質體和pKB-UppFn質體，其中pGR-FnCas12a質體包含FnCas12a基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示，pKB-UppFn質體對應戀臭假單胞菌染色體之Upp位置的gRNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。另外為了驗證不同系統的雙股斷裂效率，試驗上另建構了pKB-ΔUpp質體做為對照組，其不會對戀臭假單胞菌染色體造成雙股斷裂。
為了證實CRISPR/Cas系統在戀臭假單胞菌中確實有效果，將前述構築好的質體轉型至戀臭假單胞菌內後，並觀察是否按照預期製造出Cas蛋白複合體並對戀臭假單胞菌之染色體上目標位置進行雙股斷裂。若成功進行雙股斷裂，則戀臭假單胞菌會因此死亡，便可以經由存活下的菌落數對比來驗證CRISPR/Cas系統是否有效果，並驗證CRISPR/Cas系統對於戀臭假單胞菌本身是否會造成毒害作用。試驗上包含實驗組及對照組，實驗組為分別加入第1測試例、第2測試例或第3測試例至戀臭假單胞菌進行轉型，而對照組為將第1測試例、第2測試例和第3測試例的gRNA置換為pKB-ΔUpp質體，藉由戀臭假單胞菌死亡率來驗證CRISPR/Cas系統在戀臭假單胞菌中造成雙股斷裂的效率。死亡率的計算如下述公式：
Figure 108147047-A0305-02-0015-1
請參照第3B圖和第3C圖，第3B圖為CRISPR/Cas系統造成戀臭假單胞菌雙股斷裂效率的定性圖，第3C圖為CRISPR/Cas系統造成戀臭假單胞菌雙股斷裂效率的定量圖。結果顯示，第1測試例和第2測試例可造成99.9%的死亡率，第3測試例所造成的死亡率較低。推測可能為FnCas12a造成雙股斷裂後的DNA缺口為不平整形狀，相較SpCas9和SaCas9的平整斷裂口，戀臭假單胞菌較易自我修復由FnCas12a造成的破損處。因此最終顯示的戀臭假單胞菌的死亡率明顯有所差異。
2.建立戀臭假單胞菌基因編輯系統
在證實CRISPR/Cas系統可確實造成戀臭假單胞菌的雙股斷裂後，本試驗例以SpCas9、SaCas9以及FnCas12a建構三種不同戀臭假單胞菌基因編輯系統，本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統包含戀臭假單胞菌、RedCas表達質體和外源基因表現質體。
請參照第4A圖，繪示本發明之RedCas表達質體之第1實施例、第2實施例和第3實施例之構築示意圖。於試驗例中的RedCas表達質體包含依序排列之第一複製起始點、第一抵抗抗生素基因、araC基因、λ-Red表現卡匣和Cas表現卡匣，其中第一複製起始點為RSF1010 ori，其SEQ ID NO：1所示序列，第一抵抗抗生素基因為如SEQ ID NO：2所示之抵抗慶大黴素基因，araC基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO：3所示。λ-Red表現卡匣包含第一啟動子、Gam基因、Bet基因和Exo基因，其中第一啟動子為如SEQ ID NO：4所示之araBAD啟動子，Gam基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，Bet基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，以及Exo基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。Cas表現卡匣包含第二啟動子和Cas基因，其中第二啟動子為如SEQ ID NO：8所示之Tet啟動子。本發明之RedCas表達質體包含第1實施例、第2實施例和第3實施例，分別為pRedSpCas9質體、pRedSaCas9質體和pRedFnCas12a質體。其中pRedSpCas9質體的Cas基因序列如SEQ ID NO：9所示，pRedSaCas9質體的Cas基因序列如SEQ ID NO：10所示，pRedFnCas12a質體的Cas基因序列如SEQ ID NO：11所示。
請參照第4B圖，繪示本發明之外源基因表現質體之第1實施例、第2實施例和第3實施例之構築示意圖。於試驗例中的外源基因表現質體包含依序排列之第二複製起始點、同源互換左臂、Flp/FRT剔除作用序列、第二抵抗抗生素基因、Flp/FRT剔除作用序列、外源基因表現卡匣、同源互換右臂和gRNA卡匣，其中第二複製起始點為如SEQ ID NO：12所示之ColE1 ori，同源互換左臂的序列如SEQ ID NO：15所示，Flp/FRT剔除作用序列如SEQ ID NO：22所示，第二抵抗抗生素基因為如SEQ ID NO：13所示的抵抗四環黴素基因。外源基因表現卡匣包含第三啟動子和外源基因，其中第三啟動子為如SEQ ID NO：14所示的HCE啟 動子，外源基因為如SEQ ID NO：21所示的HmfH基因作為例示，同源互換右臂的序列如SEQ ID NO：16所示。gRNA卡匣包含第四啟動子和gRNA序列，gRNA序列由間隔(spacer)和骨架所構成。其中第四啟動子為如SEQ ID NO：17所示之J23119啟動子。本發明之外源基因表現質體包含第1實施例、第2實施例和第3實施例，分別為pHU-Sp質體、pHU-Sa質體和pHU-Fn質體。其中pHU-Sp質體的gRNA序列如SEQ ID NO：18所示，pHU-Sa質體的gRNA序列如SEQ ID NO：19所示，pHU-Fn質體的gRNA序列如SEQ ID NO：20所示。試驗上另建構了pHΔU質體做為對照組，其不會對戀臭假單胞菌染色體造成雙股斷裂。其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，同源互換區之序列與戀臭假單胞菌之染色體之第一特定序列相對應，間隔之序列與戀臭假單胞菌之染色體之戀臭假單胞菌染色體之Upp位置相對應，骨架則與Cas蛋白相互作用。
請參照第4C圖，繪示本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作示意圖。先將前述構築好的RedCas表達質體(pRedSpCas9質體、pRedSaCas9質體和pRedFnCas12a質體)以電穿孔的方式轉型至戀臭假單胞菌中，以得到第一轉型株。進一步地，可利用含有慶大黴素的LB培養基培養第一轉型株，以篩選成功轉型RedCas表達質體的第一轉型株。再將第一轉型株培養於30mL新鮮且含有慶大黴素的LB培養基培養隔夜，再以加入0.5%的阿拉伯糖後再培養2小時，以誘導第一轉型株中的RedCas表達質體 表現Gam蛋白、Beta蛋白、Exo蛋白和Cas蛋白。以離心收集誘導後的第一轉型株，並以300mM的蔗糖洗滌2次後，再將外源基因表現質體(pHU-Sp質體、pHU-Sa質體和pHU-Fn質體)以電穿孔的方式轉型至第一轉型株中，以得到第二轉型株。進一步地，可利用含有四環黴素的LB培養基培養第二轉型株，以篩選成功轉型外源基因表現質體的第二轉型株。再培養第二轉型株，使外源基因表現質體表現gRNA，其中gRNA與Cas蛋白形成Cas蛋白複合體，對第二轉型株之染色體之第二特定序列進行雙股斷裂。Gam蛋白、Beta蛋白和Exo蛋白共同引導外源基因表現質體之同源互換區與第二轉型株之染色體之第一特定序列進行同源交換，將HmfH基因嵌入轉型株之染色體之Upp位置中，以得到同源重組體。
本試驗例另以CRISPR系統構築第1比較例至第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統。請參照第4D圖和第4E圖，第4D圖繪示第1比較例、第2比較例和第3比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統之構築示意圖，第4E圖繪示第4比較例、第5比較例和第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統之構築示意圖。
如第4D圖所示，第1比較例、第2比較例和第3比較例為將gRNA和外源基因分別構築於gRNA轉錄質體和模板質體中。其中第1比較例、第2比較例和第3比較例的模板質體相同，包含依序排列之同源互換左臂(長度約為1000bps)、Flp/FRT剔除作用序列、抵抗四環黴素基因、 Flp/FRT剔除作用序列、HCE啟動子和HmfH基因，而第1比較例、第2比較例和第3比較例的gRNA轉錄質體分別為pKB-UppSp、pKB-UppSa和pKB-UppFn。其中pKB-UppSp質體的gRNA序列如SEQ ID NO：18所示，pKB-UppSa質體的gRNA序列如SEQ ID NO：19所示，pKB-UppFn質體的gRNA序列如SEQ ID NO：20所示。試驗上另建構了pKB-ΔUpp質體做為對照組，其不會對戀臭假單胞菌染色體造成雙股斷裂。進行試驗時，第1比較例、第2比較例和第3比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統為先將帶有Cas蛋白產生質體(pGR-SpCas9、pGR-SaCas9或pGR-FnCas12a)的細胞作為勝任細胞，再同時以電穿孔的方式將模板質體和gRNA轉錄質體(pKB-UppSp質體、pKB-UppSa質體、pKB-UppFn質體或pKB-ΔUpp質體)轉型至勝任細胞中。再將共轉型後的細胞塗盤於含有四環黴素的固態培養基上，以進行存活菌落的定性分析。
如第4E圖所示，第4比較例、第5比較例和第6比較例為將gRNA和外源基因共同構築於外源基因表現質體中。第4比較例、第5比較例和第6比較例的外源基因表現質體與第1實施例、第2實施例和第3實施例的外源基因表現質體相同，分別為pHU-Sp質體、pHU-Sa質體和pHU-Fn質體。試驗上另建構了pHΔU質體做為對照組，其不會對戀臭假單胞菌染色體造成雙股斷裂。進行試驗時，第4比較例、第5比較例和第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統為先將帶有Cas蛋白產生質體(pGR-SpCas9、 pGR-SaCas9或pGR-FnCas12a)的細胞作為勝任細胞，再以電穿孔的方式將外源基因表現質體(pHU-Sp質體、pHU-Sa質體和pHU-Fn質體或pHΔU質體)轉型至勝任細胞中。再將轉型後的細胞塗盤於含有四環黴素的固態培養基上，以進行存活菌落的定性分析。
為了證實本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌中確實有效果，將前述構築好的質體轉型至戀臭假單胞菌內後，經由含有四環黴素的培養基進行篩選獲得的第二轉型株，最終存活下來之菌落數便代表成功將外源基因同源重組進入第一轉型株之染色體中之第二轉型株數量。
請參照第5A圖、第5B圖、第5C圖、第5D圖和第5E圖，第5A圖為本發明之第1實施例、第2實施例和第3實施例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落之定性圖，第5B圖為第1比較例、第2比較例和第3比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落之定性圖，第5C圖為第4比較例、第5比較例和第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落之定性圖，第5D圖為本發明之第1實施例、第2實施例和第3實施例之戀臭假單胞菌基因編輯系統之同源互換效率之結果圖，第5E圖為本發明之第1實施例、第2實施例和第3實施例之戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌運作後存活菌落比例之定量圖。
由第5A圖的結果顯示，有gRNA的組別(pHU)有明顯的菌落存活，但沒有gRNA的組別(pHΔU)則完全沒有菌落存活，表示沒有以CRISPR系統造成的雙股斷裂，單獨的λ-Red系統無法有效地將外源基因嵌入戀臭假單胞菌的染色體中，因此外源基因嵌入效率十分低下。試驗上另以未加抗生素所存活的總菌落數作為分母，加入抗生素後的存活菌落數(成功嵌入外源基因之菌落數)作為分子，計算基因編輯細菌的存活比率。而由第5B圖和第5C圖的結果顯示，經由第1比較例、第2比較例、第3比較例、第4比較例、第5比較例或第6比較例之戀臭假單胞菌基因編輯系統處理後的戀臭假單胞菌，皆未有存活的菌落，顯示單獨以CRISPR系統對戀臭假單胞菌進行基因編輯，亦無法有效地將外源基因嵌入戀臭假單胞菌的染色體中。第5D圖和第5E圖的結果顯示，第1實施例、第2實施例和第3實施例的外源基因嵌入效率皆可達接近100%，而SpCas9系統的存活比率較SaCas9和FnCas12a高。
由前述結果可見，單獨以λ-Red系統或CRISPR系統對戀臭假單胞菌進行基因編輯，皆無法有效地將外源基因嵌入戀臭假單胞菌的染色體中。而本發明之戀臭假單胞菌基因編輯及其方法，合併λ-Red系統和CRISPR系統，可成功地嵌入外源基因至戀臭假單胞菌的染色體中。
3.戀臭假單胞菌基因編輯系統在戀臭假單胞菌中促進同源互換效率
試驗上進一步利用菌落(colony)PCR進一步驗證送入的外源基因是否嵌入至戀臭假單胞菌染色體上的目標位置。請參照第6A圖，繪示為進行菌落(colony)PCR而設計之6組獨特引子之位置示意圖，菌落PCR之引子係設計於戀臭假單胞菌染色體及嵌入之外源基因兩端交界處，進行PCR後可分別得到之左端PCR產物(P1+P2)約為1.7kb及右端PCR產物(P3+P4)約為1.5kb，另若以P1+P4進行PCR可得到約6.5kb的PCR產物。此外，另針對戀臭假單胞菌染色體上原始序列設計引子P5和P6，進行PCR後可分別得到PCR產物(P5+P6)約為0.5kb，即表示未成功嵌入外源基因至戀臭假單胞菌染色體中。
請參照第6B圖、第6C圖和第6D圖，為利用菌落PCR確認外源基因嵌入戀臭假單胞菌染色體之結果圖，其中第6B圖、第6C圖和第6D圖係分別於第1實施例、第2實施例和第3實施例中分別挑選21個菌落，以引子P1與P2或P3與P4進行菌落PCR。結果顯示，雖戀臭假單胞菌具有多倍體的染色體，但以本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統進行基因編輯，不論是第1實施例、第2實施例和第3實施例的每一個挑選的菌落皆可成功將外源基因嵌入目標位置，顯示本發明之戀臭假單胞菌基因編輯及其方法可成功地一次編輯戀臭假單胞菌的多倍體染色體。
請再參照第6E圖，為利用菌落PCR確認經戀臭假單胞菌基因編輯系統處理後，戀臭假單胞菌染色體原始序列存在狀況之結果圖。其係於第1實施例、第2實施例和第3 實施例中分別挑選2個菌落，以引子P5與P6進行菌落PCR，若PCR出現訊號表示菌株本該被取代的UPP位置仍然存在，則表示外源基因嵌入錯誤位置或未完全將多倍體的染色體全部嵌入。結果顯示，不論是第1實施例、第2實施例和第3實施例的每一個挑選的菌落皆未偵測到PCR產物，再次證明本發明之戀臭假單胞菌基因編輯及其方法可成功地嵌入外源基因，並能高效的完全取代戀臭假單胞菌的多倍體染色體。
4.利用戀臭假單胞菌基因編輯系統增加戀臭假單胞菌同源重組之效率
為了證實利用本發明之戀臭假單胞菌基因編輯及其方法所得到的同源重組體的外源基因的穩定性，試驗上將確認將外源基因嵌入正確位置的第二轉型株再培養6天(經過144代)，再以菌落PCR進一步驗證送入的外源基因是否仍存在於戀臭假單胞菌染色體上的目標位置，並以定量PCR進行外源基因表現的定量分析。
請參照第7A圖和第7B圖，第7A圖為利用菌落PCR確認經戀臭假單胞菌基因編輯系統處理6天後外源基因嵌入戀臭假單胞菌染色體之結果圖，第7B圖為外源基因嵌入戀臭假單胞菌之染色體的基因拷貝數之結果圖。
第7A圖的結果顯示，經過144代的培養後，不論是第1實施例、第2實施例和第3實施例的每一個挑選的菌落，外源基因皆仍存在於戀臭假單胞菌染色體的目標位置。而第7B圖的結果顯示，經本發明之戀臭假單胞菌基因編輯 系統處理後的第二轉型株，即使經過144代的培養，於Pseudomonas putida S12中的25套染色體中仍能穩定表現外源基因(HmfH基因)，且不表現戀臭假單胞菌原始序列中的Upp基因，證明經由本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統編輯後的菌株可以於多倍體的染色體中長期穩定的表現所嵌入的外源基因。
上述結果顯示，本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統及戀臭假單胞菌基因編輯方法，其合併λ-Red系統和CRISPR系統，可以同時且有效的使戀臭假單胞菌的多倍體染色體上基因組的目標位置雙股斷裂，以造成戀臭假單胞菌的死亡，並使欲嵌入的外源基因藉由外源基因表現質體，精確地與戀臭假單胞菌的基因組整合，且在轉型後的第6天後仍能偵測到外源基因存在於戀臭假單胞菌的目標位置，顯示經由本發明之戀臭假單胞菌基因編輯系統及戀臭假單胞菌基因編輯方法所得到的同源重組體可長期穩定表現外源基因。於先前技術中λ-Red系統多被使用於大腸桿菌中，目前仍未見於戀臭假單胞菌中利用λ-Red系統進行基因編輯，是以本案提出一種新穎且有效的戀臭假單胞菌基因編輯及其方法，可以突破先前技術的限制，用少量的基因編輯時間自由地挑選需要修改的戀臭假單胞菌染色體位置，同時促進戀臭假單胞菌基因編輯的效率。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神 和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。 
				                         序列表
				<![CDATA[<110>　國立清華大學；長春人造樹脂廠股份有限公司；長春石油化學股份有限公司；大連化學工業股份有限公司]]>
				<![CDATA[<120>　戀臭假單胞菌基因編輯系統及其應用]]>
				<![CDATA[<160>　28]]>
				<![CDATA[<210>　1]]>
				<![CDATA[<211>　3160]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　RSF1010 ori]]>
				<![CDATA[<400>　1]]>
				atgaagaacg acaggacttt gcaggccata ggccgacagc tcaaggccat gggctgtgag        60
				cgcttcgata tcggcgtcag ggacgcaccc accggccaga tgatgaaccg ggaatggtca       120
				gccgccgaag tgctccagaa cacgccatgg ctcaagcgga tgaatgccca gggcaatgac       180
				gtgtatatca ggcccgccga gcaggagcgg catggtctgg tgctggtgga cgacctcagc       240
				gagtttgacc tggatgacat gaaagccgag ggccgggagc ctgccctggt agtggaaacc       300
				agcccgaaga actatcaggc atgggtcaag gtggccgacg ccgcaggcgg tgaacttcgg       360
				gggcagattg cccggacgct ggccagcgag tacgacgccg acccggccag cgccgacagc       420
				cgccactatg gccgcttggc gggcttcacc aaccgcaagg acaagcacac cacccgcgcc       480
				ggttatcagc cgtgggtgct gctgcgtgaa tccaagggca agaccgccac cgctggcccg       540
				gcgctggtgc agcaggctgg ccagcagatc gagcaggccc agcggcagca ggagaaggcc       600
				cgcaggctgg ccagcctcga actgcccgag cggcagctta gccgccaccg gcgcacggcg       660
				ctggacgagt accgcagcga gatggccggg ctggtcaagc gcttcggtca tgacctcagc       720
				aagtgcgact ttatcgccgc gcagaagctg gccagccggg gccgcagtgc cgaggaaatc       780
				ggcaaggcca tggccgaggc cagcccagcg ctggcagagc gcaagcccgg ccacgaagcg       840
				gattacatcg agcgcaccgt cagcaaggtc atgggtctgc ccagcgtcca gcttgcgcgg       900
				gccgagctgg cacgggcacc ggcaccccgc cagcgaggca tggacagggg cgggccagat       960
				ttcagcatgt agtgcttgcg ttggtactca cgcctgttat actatgagta ctcacgcaca      1020
				gaagggggtt ttatggaata cgaaaaaagc gcttcagggt cggtctacct gatcaaaagt      1080
				gacaagggct attggttgcc cggtggcttt ggttatacgt caaacaaggc cgaggctggc      1140
				cgcttttcag tcgctgatat ggccagcctt aaccttgacg gctgcacctt gtccttgttc      1200
				cgcgaagaca agcctttcgg ccccggcaag tttctcggtg actgatatga aagaccaaaa      1260
				ggacaagcag accggcgacc tgctggccag ccctgacgct gtacgccaag cgcgatatgc      1320
				cgagcgcatg aaggccaaag ggatgcgtca gcgcaagttc tggctgaccg acgacgaata      1380
				cgaggcgctg cgcgagtgcc tggaagaact cagagcggcg cagggcgggg gtagtgaccc      1440
				cgccagcgcc taaccaccaa ctgcctgcaa aggaggcaat caatggctac ccataagcct      1500
				atcaatattc tggaggcgtt cgcagcagcg ccgccaccgc tggactacgt tttgcccaac      1560
				atggtggccg gtacggtcgg ggcgctggtg tcgcccggtg gtgccggtaa atccatgctg      1620
				gccctgcaac tggccgcaca gattgcaggc gggccggatc tgctggaggt gggcgaactg      1680
				cccaccggcc cggtgatcta cctgcccgcc gaagacccgc ccaccgccat tcatcaccgc      1740
				ctgcacgccc ttggggcgca cctcagcgcc gaggaacggc aagccgtggc tgacggcctg      1800
				ctgatccagc cgctgatcgg cagcctgccc aacatcatgg ccccggagtg gttcgacggc      1860
				ctcaagcgcg ccgccgaggg ccgccgcctg atggtgctgg acacgctgcg ccggttccac      1920
				atcgaggaag aaaacgccag cggccccatg gcccaggtca tcggtcgcat ggaggccatc      1980
				gccgccgata ccgggtgctc tatcgtgttc ctgcaccatg ccagcaaggg cgcggccatg      2040
				atgggcgcag gcgaccagca gcaggccagc cggggcagct cggtactggt cgataacatc      2100
				cgctggcagt cctacctgtc gagcatgacc agcgccgagg ccgaggaatg gggtgtggac      2160
				gacgaccagc gccggttctt cgtccgcttc ggtgtgagca aggccaacta tggcgcaccg      2220
				ttcgctgatc ggtggttcag gcggcatgac ggcggggtgc tcaagcccgc cgtgctggag      2280
				aggcagcgca agagcaaggg ggtgccccgt ggtgaagcct aagaacaagc acagcctcag      2340
				ccacgtccgg cacgacccgg cgcactgtct ggcccccggc ctgttccgtg ccctcaagcg      2400
				gggcgagcgc aagcgcagca agctggacgt gacgtatgac tacggcgacg gcaagcggat      2460
				cgagttcagc ggcccggagc cgctgggcgc tgatgatctg cgcatcctgc aagggctggt      2520
				ggccatggct gggcctaatg gcctagtgct tggcccggaa cccaagaccg aaggcggacg      2580
				gcagctccgg ctgttcctgg aacccaagtg ggaggccgtc accgctgaat gccatgtggt      2640
				caaaggtagc tatcgggcgc tggcaaagga aatcggggca gaggtcgata gtggtggggc      2700
				gctcaagcac atacaggact gcatcgagcg cctttggaag gtatccatca tcgcccagaa      2760
				tggccgcaag cggcaggggt ttcggctgct gtcggagtac gccagcgacg aggcggacgg      2820
				gcgcctgtac gtggccctga accccttgat cgcgcaggcc gtcatgggtg gcggccagca      2880
				tgtgcgcatc agcatggacg aggtgcgggc gctggacagc gaaaccgccc gcctgctgca      2940
				ccagcggctg tgtggctgga tcgaccccgg caaaaccggc aaggcttcca tagatacctt      3000
				gtgcggctat gtctggccgt cagaggccag tggttcgacc atgcgcaagc gccgcaagcg      3060
				ggtgcgcgag gcgttgccgg agctggtcgc gctgggctgg acggtaaccg agttcgcggc      3120
				gggcaagtac gacatcaccc ggcccaaggc ggcaggctga                            3160
				<![CDATA[<210>　2]]>
				<![CDATA[<211>　534]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　GmR]]>
				<![CDATA[<400>　2]]>
				ttaggtggcg gtacttgggt cgatatcaaa gtgcatcact tcttcccgta tgcccaactt        60
				tgtatagaga gccactgcgg gatcgtcacc gtaatctgct tgcacgtaga tcacataagc       120
				accaagcgcg ttggcctcat gcttgaggag attgatgagc gcggtggcaa tgccctgcct       180
				ccggtgctcg ccggagactg cgagatcata gatatagatc tcactacgcg gctgctcaaa       240
				cctgggcaga acgtaagccg cgagagcgcc aacaaccgct tcttggtcga aggcagcaag       300
				cgcgatgaat gtcttactac ggagcaagtt cccgaggtaa tcggagtccg gctgatgttg       360
				ggagtaggtg gctacgtctc cgaactcacg accgaaaaga tcaagagcag cccgcatgga       420
				tttgacttgg tcagggccga gcctacatgt gcgaatgatg cccatacttg agccacctaa       480
				ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg ctgctgcgta acat             534
				<![CDATA[<210>　3]]>
				<![CDATA[<211>　879]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　araC gene]]>
				<![CDATA[<400>　3]]>
				atggctgaag cgcaaaatga tcccctgctg ccgggatact cgtttaatgc ccatctggtg        60
				gcgggtttaa cgccgattga ggccaacggt tatctcgatt tttttatcga ccgaccgctg       120
				ggaatgaaag gttatattct caatctcacc attcgcggtc agggggtggt gaaaaatcag       180
				ggacgagaat ttgtttgccg accgggtgat attttgctgt tcccgccagg agagattcat       240
				cactacggtc gtcatccgga ggctcgcgaa tggtatcacc agtgggttta ctttcgtccg       300
				cgcgcctact ggcatgaatg gcttaactgg ccgtcaatat ttgccaatac ggggttcttt       360
				cgcccggatg aagcgcacca gccgcatttc agcgacctgt ttgggcaaat cattaacgcc       420
				gggcaagggg aagggcgcta ttcggagctg ctggcgataa atctgcttga gcaattgtta       480
				ctgcggcgca tggaagcgat taacgagtcg ctccatccac cgatggataa tcgggtacgc       540
				gaggcttgtc agtacatcag cgatcacctg gcagacagca attttgatat cgccagcgtc       600
				gcacagcatg tttgcttgtc gccgtcgcgt ctgtcacatc ttttccgcca gcagttaggg       660
				attagcgtct taagctggcg cgaggaccaa cgtatcagcc aggcgaagct gcttttgagc       720
				accacccgga tgcctatcgc caccgtcggt cgcaatgttg gttttgacga tcaactctat       780
				ttctcgcggg tatttaaaaa atgcaccggg gccagcccga gcgagttccg tgccggttgt       840
				gaagaaaaag tgaatgatgt agccgtcaag ttgtcataa                              879
				<![CDATA[<210>　4]]>
				<![CDATA[<211>　28]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　araBAD promoter]]>
				<![CDATA[<400>　4]]>
				gacgcttttt atcgcaactc tctactgt                                           28
				<![CDATA[<210>　5]]>
				<![CDATA[<211>　417]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence ]]>
				<![CDATA[<223>　Gam gene]]>
				<![CDATA[<400>　5]]>
				atggatatta atactgaaac tgagatcaag caaaagcatt cactaacccc ctttcctgtt        60
				ttcctaatca gcccggcatt tcgcgggcga tattttcaca gctatttcag gagttcagcc       120
				atgaacgctt attacattca ggatcgtctt gaggctcaga gctgggcgcg tcactaccag       180
				cagctcgccc gtgaagagaa agaggcagaa ctggcagacg acatggaaaa aggcctgccc       240
				cagcacctgt ttgaatcgct atgcatcgat catttgcaac gccacggggc cagcaaaaaa       300
				tccattaccc gtgcgtttga tgacgatgtt gagtttcagg agcgcatggc agaacacatc       360
				cggtacatgg ttgaaaccat tgctcaccac caggttgata ttgattcaga ggtataa          417
				<![CDATA[<210>　6]]>
				<![CDATA[<211>　786]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　Bet gene]]>
				<![CDATA[<400>　6]]>
				atgagtactg cactcgcaac gctggctggg aagctggctg aacgtgtcgg catggattct        60
				gtcgacccac aggaactgat caccactctt cgccagacgg catttaaagg tgatgccagc       120
				gatgcgcagt tcatcgcatt actgatcgtt gccaaccagt acggccttaa tccgtggacg       180
				aaagaaattt acgcctttcc tgataagcag aatggcatcg ttccggtggt gggcgttgat       240
				ggctggtccc gcatcatcaa tgaaaaccag cagtttgatg gcatggactt tgagcaggac       300
				aatgaatcct gtacatgccg gatttaccgc aaggaccgta atcatccgat ctgcgttacc       360
				gaatggatgg atgaatgccg ccgcgaacca ttcaaaactc gcgaaggcag agaaatcacg       420
				gggccgtggc agtcgcatcc caaacggatg ttacgtcata aagccatgat tcagtgtgcc       480
				cgtctggcct tcggatttgc tggtatctat gacaaggatg aagccgagcg cattgtcgaa       540
				aatactgcat acactgcaga acgtcagccg gaacgcgaca tcactccggt taacgatgaa       600
				accatgcagg agattaacac tctgctgatc gccctggata aaacatggga tgacgactta       660
				ttgccgctct gttcccagat atttcgccgc gacattcgtg catcgtcaga actgacacag       720
				gccgaagcag taaaagctct tggattcctg aaacagaaag ccgcagagca gaaggtggca       780
				gcatga                                                                  786
				<![CDATA[<210>　7]]>
				<![CDATA[<211>　681]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　Exo gene]]>
				<![CDATA[<400>　7]]>
				atgacaccgg acattatcct gcagcgtacc gggatcgatg tgagagctgt cgaacagggg        60
				gatgatgcgt ggcacaaatt acggctcggc gtcatcaccg cttcagaagt tcacaacgtg       120
				atagcaaaac cccgctccgg aaagaagtgg cctgacatga aaatgtccta cttccacacc       180
				ctgcttgctg aggtttgcac cggtgtggct ccggaagtta acgctaaagc actggcctgg       240
				ggaaaacagt acgagaacga cgccagaacc ctgtttgaat tcacttccgg cgtgaatgtt       300
				actgaatccc cgatcatcta tcgcgacgaa agtatgcgta ccgcctgctc tcccgatggt       360
				ttatgcagtg acggcaacgg ccttgaactg aaatgcccgt ttacctcccg ggatttcatg       420
				aagttccggc tcggtggttt cgaggccata aagtcagctt acatggccca ggtgcagtac       480
				agcatgtggg tgacgcgaaa aaatgcctgg tactttgcca actatgaccc gcgtatgaag       540
				cgtgaaggcc tgcattatgt cgtgattgag cgggatgaaa agtacatggc gagttttgac       600
				gagatcgtgc cggagttcat cgaaaaaatg gacgaggcac tggctgaaat tggttttgta       660
				tttggggagc aatggcgatg a                                                 681
				<![CDATA[<210>　8]]>
				<![CDATA[<211>　73]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　Tet promoter]]>
				<![CDATA[<400>　8]]>
				taattcctaa tttttgttga cactctatcg ttgatagagt tattttacca ctccctatca        60
				gtgatagaga aaa                                                           73
				<![CDATA[<210>　9]]>
				<![CDATA[<211>　4107]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　SpCas9 gene]]>
				<![CDATA[<400>　9]]>
				atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg        60
				atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc       120
				cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa       180
				gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt       240
				tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga       300
				cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga       360
				aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa       420
				aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat       480
				atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat       540
				gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct       600
				attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga       660
				cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat       720
				ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa       780
				gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg       840
				caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt       900
				ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca       960
				atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga      1020
				caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca      1080
				ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta      1140
				gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc      1200
				aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat      1260
				gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt      1320
				gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt      1380
				cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa      1440
				gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa      1500
				aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt      1560
				tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt      1620
				tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc      1680
				gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt      1740
				tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt      1800
				attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt      1860
				ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct      1920
				cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga      1980
				cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta      2040
				gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat      2100
				agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta      2160
				catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact      2220
				gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt      2280
				attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt      2340
				atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct      2400
				gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga      2460
				gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac      2520
				attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct      2580
				gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa      2640
				aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta      2700
				acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa      2760
				ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat      2820
				actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct      2880
				aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat      2940
				taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa      3000
				tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa      3060
				atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct      3120
				aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc      3180
				cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt      3240
				gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta      3300
				cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt      3360
				gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct      3420
				tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt      3480
				aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac      3540
				tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa      3600
				tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta      3660
				caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt      3720
				cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag      3780
				cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt      3840
				attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa      3900
				ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct      3960
				cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa      4020
				gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt      4080
				gatttgagtc agctaggagg tgactga                                          4107
				<![CDATA[<210>　10]]>
				<![CDATA[<211>　3156]]>
				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　SaCas9 gene]]>
				<![CDATA[<400>　10]]>
				atgaagcgga actacatcct gggcctggac atcggcatca ccagcgtggg ctacggcatc        60
				atcgactacg agacacggga cgtgatcgat gccggcgtgc ggctgttcaa agaggccaac       120
				gtggaaaaca acgagggcag gcggagcaag agaggcgcca gaaggctgaa gcggcggagg       180
				cggcatagaa tccagagagt gaagaagctg ctgttcgact acaacctgct gaccgaccac       240
				agcgagctga gcggcatcaa cccctacgag gccagagtga agggcctgag ccagaagctg       300
				agcgaggaag agttctctgc cgccctgctg cacctggcca agagaagagg cgtgcacaac       360
				gtgaacgagg tggaagagga caccggcaac gagctgtcca ccaaagagca gatcagccgg       420
				aacagcaagg ccctggaaga gaaatacgtg gccgaactgc agctggaacg gctgaagaaa       480
				gacggcgaag tgcggggcag catcaacaga ttcaagacca gcgactacgt gaaagaagcc       540
				aaacagctgc tgaaggtgca gaaggcctac caccagctgg accagagctt catcgacacc       600
				tacatcgacc tgctggaaac ccggcggacc tactatgagg gacctggcga gggcagcccc       660
				ttcggctgga aggacatcaa agaatggtac gagatgctga tgggccactg cacctacttc       720
				cccgaggaac tgcggagcgt gaagtacgcc tacaacgccg acctgtacaa cgccctgaac       780
				gacctgaaca atctcgtgat caccagggac gagaacgaga agctggaata ttacgagaag       840
				ttccagatca tcgagaacgt gttcaagcag aagaagaagc ccaccctgaa gcagatcgcc       900
				aaagaaatcc tcgtgaacga agaggatatt aagggctaca gagtgaccag caccggcaag       960
				cccgagttca ccaacctgaa ggtgtaccac gacatcaagg acattaccgc ccggaaagag      1020
				attattgaga acgccgagct gctggatcag attgccaaga tcctgaccat ctaccagagc      1080
				agcgaggaca tccaggaaga actgaccaat ctgaactccg agctgaccca ggaagagatc      1140
				gagcagatct ctaatctgaa gggctatacc ggcacccaca acctgagcct gaaggccatc      1200
				aacctgatcc tggacgagct gtggcacacc aacgacaacc agatcgctat cttcaaccgg      1260
				ctgaagctgg tgcccaagaa ggtggacctg tcccagcaga aagagatccc caccaccctg      1320
				gtggacgact tcatcctgag ccccgtcgtg aagagaagct tcatccagag catcaaagtg      1380
				atcaacgcca tcatcaagaa gtacggcctg cccaacgaca tcattatcga gctggcccgc      1440
				gagaagaact ccaaggacgc ccagaaaatg atcaacgaga tgcagaagcg gaaccggcag      1500
				accaacgagc ggatcgagga aatcatccgg accaccggca aagagaacgc caagtacctg      1560
				atcgagaaga tcaagctgca cgacatgcag gaaggcaagt gcctgtacag cctggaagcc      1620
				atccctctgg aagatctgct gaacaacccc ttcaactatg aggtggacca catcatcccc      1680
				agaagcgtgt ccttcgacaa cagcttcaac aacaaggtgc tcgtgaagca ggaagaaaac      1740
				agcaagaagg gcaaccggac cccattccag tacctgagca gcagcgacag caagatcagc      1800
				tacgaaacct tcaagaagca catcctgaat ctggccaagg gcaagggcag aatcagcaag      1860
				accaagaaag agtatctgct ggaagaacgg gacatcaaca ggttctccgt gcagaaagac      1920
				ttcatcaacc ggaacctggt ggataccaga tacgccacca gaggcctgat gaacctgctg      1980
				cggagctact tcagagtgaa caacctggac gtgaaagtga agtccatcaa tggcggcttc      2040
				accagctttc tgcggcggaa gtggaagttt aagaaagagc ggaacaaggg gtacaagcac      2100
				cacgccgagg acgccctgat cattgccaac gccgatttca tcttcaaaga gtggaagaaa      2160
				ctggacaagg ccaaaaaagt gatggaaaac cagatgttcg aggaaaagca ggccgagagc      2220
				atgcccgaga tcgaaaccga gcaggagtac aaagagatct tcatcacccc ccaccagatc      2280
				aagcacatta aggacttcaa ggactacaag tacagccacc gggtggacaa gaagcctaat      2340
				agagagctga ttaacgacac cctgtactcc acccggaagg acgacaaggg caacaccctg      2400
				atcgtgaaca atctgaacgg cctgtacgac aaggacaatg acaagctgaa aaagctgatc      2460
				aacaagagcc ccgaaaagct gctgatgtac caccacgacc cccagaccta ccagaaactg      2520
				aagctgatta tggaacagta cggcgacgag aagaatcccc tgtacaagta ctacgaggaa      2580
				accgggaact acctgaccaa gtactccaaa aaggacaacg gccccgtgat caagaagatt      2640
				aagtattacg gcaacaaact gaacgcccat ctggacatca ccgacgacta ccccaacagc      2700
				agaaacaagg tcgtgaagct gtccctgaag ccctacagat tcgacgtgta cctggacaat      2760
				ggcgtgtaca agttcgtgac cgtgaagaat ctggatgtga tcaaaaaaga aaactactac      2820
				gaagtgaata gcaagtgcta tgaggaagct aagaagctga agaagatcag caaccaggcc      2880
				gagtttatcg cctccttcta caacaacgat ctgatcaaga tcaacggcga gctgtataga      2940
				gtgatcggcg tgaacaacga cctgctgaac cggatcgaag tgaacatgat cgacatcacc      3000
				taccgcgagt acctggaaaa catgaacgac aagaggcccc ccaggatcat taagacaatc      3060
				gcctccaaga cccagagcat taagaagtac agcacagaca ttctgggcaa cctgtatgaa      3120
				gtgaaatcta agaagcaccc tcagatcatc aaaaag                                3156
				<![CDATA[<210>　11]]>
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				<![CDATA[<212>　DNA]]>
				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
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				<![CDATA[<400>　11]]>
				atgtcaattt atcaagaatt tgttaataaa tatagtttaa gtaaaactct aagatttgag        60
				ttaatcccac agggtaaaac acttgaaaac ataaaagcaa gaggtttgat tttagatgat       120
				gagaaaagag ctaaagacta caaaaaggct aaacaaataa ttgataaata tcatcagttt       180
				tttatagagg agatattaag ttcggtttgt attagcgaag atttattaca aaactattct       240
				gatgtttatt ttaaacttaa aaagagtgat gatgataatc tacaaaaaga ttttaaaagt       300
				gcaaaagata cgataaagaa acaaatatct gaatatataa aggactcaga gaaatttaag       360
				aatttgttta atcaaaacct tatcgatgct aaaaaagggc aagagtcaga tttaattcta       420
				tggctaaagc aatctaagga taatggtata gaactattta aagccaatag tgatatcaca       480
				gatatagatg aggcgttaga aataatcaaa tcttttaaag gttggacaac ttattttaag       540
				ggttttcatg aaaatagaaa aaatgtttat agtagcaatg atattcctac atctattatt       600
				tataggatag tagatgataa tttgcctaaa tttctagaaa ataaagctaa gtatgagagt       660
				ttaaaagaca aagctccaga agctataaac tatgaacaaa ttaaaaaaga tttggcagaa       720
				gagctaacct ttgatattga ctacaaaaca tctgaagtta atcaaagagt tttttcactt       780
				gatgaagttt ttgagatagc aaactttaat aattatctaa atcaaagtgg tattactaaa       840
				tttaatacta ttattggtgg taaatttgta aatggtgaaa atacaaagag aaaaggtata       900
				aatgaatata taaatctata ctcacagcaa ataaatgata aaacactcaa aaaatataaa       960
				atgagtgttt tatttaagca aattttaagt gatacagaat ctaaatcttt tgtaattgat      1020
				aagttagaag atgatagtga tgtagttaca acgatgcaaa gtttttatga gcaaatagca      1080
				gcttttaaaa cagtagaaga aaaatctatt aaagaaacac tatctttatt atttgatgat      1140
				ttaaaagctc aaaaacttga tttgagtaaa atttatttta aaaatgataa atctcttact      1200
				gatctatcac aacaagtttt tgatgattat agtgttattg gtacagcggt actagaatat      1260
				ataactcaac aaatagcacc taaaaatctt gataacccta gtaagaaaga gcaagaatta      1320
				atagccaaaa aaactgaaaa agcaaaatac ttatctctag aaactataaa gcttgcctta      1380
				gaagaattta ataagcatag agatatagat aaacagtgta ggtttgaaga aatacttgca      1440
				aactttgcgg ctattccgat gatatttgat gaaatagctc aaaacaaaga caatttggca      1500
				cagatatcta tcaaatatca aaatcaaggt aaaaaagacc tacttcaagc tagtgcggaa      1560
				gatgatgtta aagctatcaa ggatctttta gatcaaacta ataatctctt acataaacta      1620
				aaaatatttc atattagtca gtcagaagat aaggcaaata ttttagacaa ggatgagcat      1680
				ttttatctag tatttgagga gtgctacttt gagctagcga atatagtgcc tctttataac      1740
				aaaattagaa actatataac tcaaaagcca tatagtgatg agaaatttaa gctcaatttt      1800
				gagaactcga ctttggctaa tggttgggat aaaaataaag agcctgacaa tacggcaatt      1860
				ttatttatca aagatgataa atattatctg ggtgtgatga ataagaaaaa taacaaaata      1920
				tttgatgata aagctatcaa agaaaataaa ggcgagggtt ataaaaaaat tgtttataaa      1980
				cttttacctg gcgcaaataa aatgttacct aaggttttct tttctgctaa atctataaaa      2040
				ttttataatc ctagtgaaga tatacttaga ataagaaatc attccacaca tacaaaaaat      2100
				ggtagtcctc aaaaaggata tgaaaaattt gagtttaata ttgaagattg ccgaaaattt      2160
				atagattttt ataaacagtc tataagtaag catccggagt ggaaagattt tggatttaga      2220
				ttttctgata ctcaaagata taattctata gatgaatttt atagagaagt tgaaaatcaa      2280
				ggctacaaac taacttttga aaatatatca gagagctata ttgatagcgt agttaatcag      2340
				ggtaaattgt acctattcca aatctataat aaagattttt cagcttatag caaagggcga      2400
				ccaaatctac atactttata ttggaaagcg ctgtttgatg agagaaatct tcaagatgtg      2460
				gtttataagc taaatggtga ggcagagctt ttttatcgta aacaatcaat acctaaaaaa      2520
				atcactcacc cagctaaaga ggcaatagct aataaaaaca aagataatcc taaaaaagag      2580
				agtgtttttg aatatgattt aatcaaagat aaacgcttta ctgaagataa gtttttcttt      2640
				cactgtccta ttacaatcaa ttttaaatct agtggagcta ataagtttaa tgatgaaatc      2700
				aatttattgc taaaagaaaa agcaaatgat gttcatatat taagtataga tagaggtgaa      2760
				agacatttag cttactatac tttggtagat ggtaaaggca atatcatcaa acaagatact      2820
				ttcaacatca ttggtaatga tagaatgaaa acaaactacc atgataagct tgctgcaata      2880
				gagaaagata gggattcagc taggaaagac tggaaaaaga taaataacat caaagagatg      2940
				aaagagggct atctatctca ggtagttcat gaaatagcta agctagttat agagtataat      3000
				gctattgtgg tttttgagga tttaaatttt ggatttaaaa gagggcgttt caaggtagag      3060
				aagcaggtct atcaaaagtt agaaaaaatg ctaattgaga aactaaacta tctagttttc      3120
				aaagataatg agtttgataa aactggggga gtgcttagag cttatcagct aacagcacct      3180
				tttgagactt ttaaaaagat gggtaaacaa acaggtatta tctactatgt accagctggt      3240
				tttacttcaa aaatttgtcc tgtaactggt tttgtaaatc agttatatcc taagtatgaa      3300
				agtgtcagca aatctcaaga gttctttagt aagtttgaca agatttgtta taaccttgat      3360
				aagggctatt ttgagtttag ttttgattat aaaaactttg gtgacaaggc tgccaaaggc      3420
				aagtggacta tagctagctt tgggagtaga ttgattaact ttagaaattc agataaaaat      3480
				cataattggg atactcgaga agtttatcca actaaagagt tggagaaatt gctaaaagat      3540
				tattctatcg aatatgggca tggcgaatgt atcaaagcag ctatttgcgg tgagagcgac      3600
				aaaaagtttt ttgctaagct aactagtgtc ctaaatacta tcttacaaat gcgtaactca      3660
				aaaacaggta ctgagttaga ttatctaatt tcaccagtag cagatgtaaa tggcaatttc      3720
				tttgattcgc gacaggcgcc aaaaaatatg cctcaagatg ctgatgccaa tggtgcttat      3780
				catattgggc taaaaggtct gatgctacta ggtaggatca aaaataatca agagggcaaa      3840
				aaactcaatt tggttatcaa aaatgaagag tattttgagt tcgtgcagaa taggaataac      3900
				taa                                                                    3903
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				<![CDATA[<400>　12]]>
				tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg        60
				gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg       120
				ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag       180
				cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc       240
				caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa       300
				ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg       360
				taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc       420
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				<![CDATA[<400>　13]]>
				atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc        60
				ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc       120
				atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca       180
				cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta       240
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				atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc       900
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				acagattccc aatctcttgt taaataacga aaaggcatca atcaaaacgg cggcatgtct        60
				ttctatattc cagcaatgtt ttatagggga catattgatg aagatgggta tcaccttagt       120
				aaaaaaagaa ttgctataag ctgctctttt ttgttcgtga tatactgata ataaattgaa       180
				ttttcacact tctgaaaaaa ggagctggaa ccaa                                   214
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				<![CDATA[<213>　Artificial Sequence]]>
				<![CDATA[<223>　HRL]]>
				<![CDATA[<400>　15]]>
				agaatcaggt tcagggcaat agccacaatg gcgcacaggg cgatgccctt caggccccag        60
				tcatccgggc cgtcaccgct gccgatcagc acgccgccga taccgaacac cagtgtcacc       120
				gagacgatca ccaggttgcg tgcctcgccc aggtcaatct tgtggcggat catggtgttc       180
				atgcccaccg ctgcaatcga gccgaacagc aggcaaagaa tgccgcccat caccggcacc       240
				gggatgctct gcagcagcgc gccgaacttg ccgatgaacg caagggtaat ggcgaagacc       300
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				tcgcccagca acgtccggtg caggccaggc tttttcaggt agtcacggcc ggtcacgctg       480
				cccactgcaa tcaccccgcc gatatgctcg atcgccggcg ccagcgcaac cgggacgatg       540
				aacagaatgg cctgccagtt gaacgcaggg gcggtgaaat tgggaatttc cagccacggt       600
				gcggcagcga tcctggcggt gtcgaccacg ccaaaggcga acgacagggc aaagcccacc       660
				agcacgccgg agatgatggg taccaggcgg aaaatgccct tgccgaatac ggcaacgatc       720
				aaggttgtca gcagcgctgg catcgagatc agcatggccg tcttgtacgg catcagtgcc       780
				gtaccgtccc cacctttgcc catcgccatg ttggcggcga tcggtgccat ggccaggccg       840
				atggagatga tcaccgggcc gatcaccacc ggcggcagca tgcggtcgat gaaaccggtg       900
				cctttgattt ttaccatcag ccccatgaag gtgtacacga agccggcagc cattacgcca       960
				cccatggtct cggcaaggcc gaactggcct ttggcgagga tgatcggcgt gatgaaggca      1020
				aagctcgagg ccaggaacac cggtacctga cgaccggtga ccagctggaa tagcagcgtg      1080
				ccgatgccgg cggtgaacag cgcgacgttt gggtcgaggc cggtgatcag gggcatcagc      1140
				accagcgcgc cgaatgccac gaagagcatc tgcgcgcccg aaacgacctg gcgccagagc      1200
				gggtcgttga agccgtcctg catggtcagg cgtccttttg cttggtgccg aagatcttgt      1260
				c                                                                      1261
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				aaaaaaaccg cgctagatta atctattcag cctgtgctgt cgtctggtca ttctggacgt        60
				tagtccataa atgcttgatc tgtgacgagc ggatgcgtac ctttgcccgc ttttccaaaa       120
				tgccccccgg agcgcgccat gtccgccgat ctcgagcata tccgtcaagt catgcatgaa       180
				gctgactgcc tgtacaccga agccgaagtc gaagcggcca tcgccaaagt cggcgagcag       240
				atctgcaagg acctgcacga caagaacccg gttgtgttct gcgtgatgaa cggtggcctg       300
				atcttctccg gcaaactgct gacccacctg cagttcccgc tggaagcctc gtacctgcat       360
				gctacccgct accgcaacca gaccagcggt ggcgagcttt tctggaaggc caagccggaa       420
				gtgtcgttca tcgaccgtga cgtgttgatc gttgacgata tcctcgacga aggccacacc       480
				ctcagcgcca tcatcgagtt ttgcaagcat gccggcgccc gctcggtgta caccgctgtg       540
				ctgatcgaca aggaccacga ccgcaaggca agccctgacc tcaaggccaa ctatgtgggc       600
				ctgccttgtg tcgatcgcta tatcttcggt tacggcatgg actacaaagg ttactggcgc       660
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				accaatcgct gttcgccggg ctggccgaaa aggccgctgc caacccgcgc gggcggcagc       780
				accataactt tcacgctatg gaagagccct gccaccgcat ggccgtcggg ctgcaaccaa       840
				gcacctacat tccgccgcat cgccatttga gcgccgacaa ggctgaaacc ttgatagcgc       900
				tcaaggggcg ttttggcctg ttgatcttcg atgaacaag                              939
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				ttgacagcta gctcagtcct aggtataata ctagt                                   35
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				ggatggcgga tctcacgagt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc        60
				cg                                                                       62
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				ggcggtgtag atcttcacgt gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca        60
				aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagattt                               99
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				aatttctact gttgtagatt ccaccacctc gatgccttc                               39
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				atggacaccc cgcgcgagcg tttcgactac gtcattgtcg gcggcggtag cgccggctgc        60
				gtgttggcga accgtctgtc gcaggacccc gccatccgcg tggccttgat tgaggccggc       120
				gtggataccc cgcccgatgc cgtgcccgcg gaaatcctgg actcgtaccc gatgccgctg       180
				ttcttcggcg atcgctacat ctggccctcg ctgcaagcgc gcgccgtggc cggcggccgc       240
				agcaaggtct atgagcaagg ccgcgtcatg ggcggtggct cgagcatcaa tgtgcaggcc       300
				gccaaccgcg gcctgccgcg cgactacgat gaatgggccg cgagcggcgc cagcggctgg       360
				agctggcagg atgtgttgcc ctactttcgt cacctggaac gcgacgtgga ctacggcaac       420
				agccccctgc acggtagcca cggcccggtg ccgatccgcc gcattttgcc ccaggcctgg       480
				ccgccgttct gcacggaatt cgcccatgcc atgggccgct cgggtttgtc ggccctggcc       540
				gaccagaacg ccgagttcgg tgacggttgg ttcccggcgg ccttcagcaa cctggacgac       600
				aaacgcgtca gcacggcgat cgcgtacctg gatgccgaca cccgccgtcg tgccaacctg       660
				cgcatctacg ccgagaccac cgtgcgtaag ctggtcgtgt cgggccgtga agcgcgtggc       720
				gtgatcgcca tgcgcgcgga tggttcgcgt ctggccctgg atgcgggtga agtcatcgtg       780
				agcgccggcg ccctgcagtc gccggccatc ttgatgcgcg ccggcatcgg tgatgccggc       840
				gcgttgcaag ccctgggcat cgaggtggtg gccgatcgtc ctggtgtcgg ccgtaatttg       900
				caggaccacc cggcgctgac cttctgccag ttcctggcgc cccagtaccg tatgccgttg       960
				tcgcgccgcc gtgccagcat gaccgccgcc cgctttagca gcggcgtgcc gggcggcgag      1020
				gccagcgata tgtacctgtc gagctcgacc cgtgccggct ggcacgccct gggcaatcgc      1080
				ctgggcttgt ttttcttgtg gtgcaaccgc ccgttcagcc gcggtcaggt gagcttggcc      1140
				ggcgcgcagc cggacgtgcc gcccatggtc gagctgaacc tgctggacga tgaacgtgac      1200
				ctgcgccgca tggtggccgg cgtgcgtaaa ctggtccaga tcgtgggtgc gtcggccttg      1260
				caccaacatc ctggtgattt cttcccggcc accttctcgc cccgtgtgaa agccctgtcg      1320
				cgcgtgagcc gtggcaatgt gctgctgacc gaactgctgg gtgccgtcct ggacgtgagc      1380
				ggtccgttgc gccgtagcct gatcgcccgt ttcgtgaccg gcggcgccaa cttggccagc      1440
				ctgctgacgg acgaaagcgc cctggagggc ttcgtgcgtc agtcggtgtt cggcgtgtgg      1500
				catgcctcgg gcacctgtcg catgggtgcc cacgccgatc gcagcgccgt caccgacgcc      1560
				gccggccgcg tccacgatgt gggccgcctg cgtgtgatcg acgccagcct gatgccccgc      1620
				ctgccgaccg ccaacaccaa catcccgacc atcatgctgg ccgagaagat cgcggacacc      1680
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				gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc                                    34
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				gggtgttggc tgatatgtgt                                                    20
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				cctatgccta cagcatccag                                                    20
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				acgtcccagg catcaaataa                                                    20
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				gaaggagcac tctagcacg                                                     19
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				<![CDATA[<223>　P5]]>
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				<![CDATA[<223>　P6]]>
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100‧‧‧戀臭假單胞菌之基因編輯方法
110、120、130、140、150‧‧‧步驟

Claims (10)

  1. 一種戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)S12基因編輯系統，包含：一戀臭假單胞菌S12；一RedCas表達質體，包含依序排列之一第一複製起始點、一第一抵抗抗生素基因、一λ-Red表現卡匣和一Cas表現卡匣，其中該第一複製起始點包含SEQ ID NO：1所示序列，該λ-Red表現卡匣包含一第一啟動子、一Gam基因、一Bet基因和一Exo基因，該Cas表現卡匣包含一第二啟動子和一Cas基因；以及一外源基因表現質體，包含依序排列之一第二複製起始點、一同源互換左臂、一第二抵抗抗生素基因、一外源基因表現卡匣、一同源互換右臂和一gRNA卡匣，其中該外源基因表現卡匣包含一第三啟動子和一外源基因，該gRNA卡匣包含一第四啟動子和一gRNA序列，該gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成；其中該同源互換左臂和該同源互換右臂構成一同源互換區，該同源互換區之序列與該戀臭假單胞菌S12之一染色體之一第一特定序列相對應，該間隔之序列與該戀臭假單胞菌S12之該染色體之一第二特定序列相對應，且該第一抵抗抗生素基因和該第二抵抗抗生素基因不相同。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯系統，其中該RedCas表達質體更包含一araC基因，且該第一啟動子為araBAD啟動子。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯系統，其中該Cas基因包含如SEQ ID NO：9所示序列、SEQ ID NO：10所示序列或SEQ ID NO：11所示序列。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯系統，其中該外源基因表現質體更包含二Flp/FRT剔除作用序列，且該第二抵抗抗生素基因位於該二Flp/FRT剔除作用序列之間。
  5. 一種戀臭假單胞菌S12基因編輯方法，包含：構築一RedCas表達質體，其中該RedCas表達質體包含依序排列之一第一複製起始點、一第一抵抗抗生素基因、一λ-Red表現卡匣和一Cas表現卡匣，其中該第一複製起始點包含SEQ ID NO：1所示序列，該λ-Red表現卡匣包含一第一啟動子、一Gam基因、一Bet基因和一Exo基因，該Cas表現卡匣包含一第二啟動子和一Cas基因； 構築一外源基因表現質體，其中該外源基因表現質體包含依序排列之一第二複製起始點、一同源互換左臂、一第二抵抗抗生素基因、一外源基因表現卡匣、一同源互換右臂和一gRNA卡匣，其中該外源基因表現卡匣包含一第三啟動子和一外源基因，該gRNA卡匣包含一第四啟動子和一gRNA序列，其中該gRNA序列由一間隔(spacer)和一骨架所構成，該同源互換左臂和該同源互換右臂構成一同源互換區，該同源互換區之序列與一戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)S12之一染色體之一第一特定序列相對應，該間隔之序列與該戀臭假單胞菌S12之該染色體之一第二特定序列相對應，且該第一抵抗抗生素基因和該第二抵抗抗生素基因不相同；將該RedCas表達質體轉型至該戀臭假單胞菌S12中，以得到一第一轉型株；進行一誘導步驟，係培養該第一轉型株後加入一誘導物，以誘導該RedCas表達質體表現一Gam蛋白、一Beta蛋白、一Exo蛋白和一Cas蛋白；以及將該外源基因表現質體轉型至經誘導後的該第一轉型株中，以得到一第二轉型株，使該外源基因表現質體表現一gRNA，其中該gRNA與該Cas蛋白形成一Cas蛋白複合體，對該第二轉型株之一染色體之該第二特定序列進行雙股斷裂，該Gam蛋白、該Beta蛋白和該Exo蛋白共 同引導該外源基因表現質體之該同源互換區與該第二轉型株之該染色體之該第一特定序列進行同源交換，將該外源基因嵌入該轉型株之該染色體之該第一特定序列中。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯方法，其中於該誘導步驟中，該第一轉型株培養至停滯期(stationary phase)後加入該誘導物。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯方法，其中該RedCas表達質體更包含一araC基因，且該第一啟動子為araBAD啟動子。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯方法，其中該誘導物為阿拉伯糖(arabinose)。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯方法，其中更包含一第一篩選步驟，係以含有一第一抗生素之一第一培養基培養該第一轉型株。
  10. 如申請專利範圍第5項所述之戀臭假單胞菌S12基因編輯方法，其中更包含一第二篩選步驟，係以含有一第二抗生素之一第二培養基培養該第二轉型株。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Chen et. al., "CRISPR/Cas9-based Genome Editing in Pseudomonas aeruginosa and Cytidine Deaminase- Mediated Base Editing in Pseudomonas Species" iScience 6, 222–231, 2018
Chen et. al., "CRISPR/Cas9-based Genome Editing in Pseudomonas aeruginosa and Cytidine Deaminase- Mediated Base Editing in Pseudomonas Species" iScience 6, 222–231, 2018 Sun et. al., "Genome editing and transcriptional repression in Pseudomonas putida via the type II CRISPR system" Microb Cell Fact (2018) 17:41 *
Sun et. al., "Genome editing and transcriptional repression in Pseudomonas putida KT2440 via the type II CRISPR system" Microb Cell Fact (2018) 17:41

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