TWI735926B - 裝載順鉑的微氣泡、用於治療癌症的藥物組合物及製備藥物組合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本揭露公開一種治療癌症的方法，包括以下操作。將藥物組合物給予有需要的受試者。藥物組合物包括介質和分散在介質中的複數個裝載順鉑的微氣泡。每個裝載順鉑的微氣泡包括外殼部分和核心部分。外殼部分包括複數個白蛋白分子及複數個與白蛋白分子共價鍵合的第一順鉑分子。核心部分被外殼部分包圍，其中核心部分包括惰性氣體與複數個第二順鉑分子的混合物。然後將超音波能量施加到受試者的腫瘤以破壞裝載順鉑的微氣泡。

Description

裝載順鉑的微氣泡、用於治療癌症的 藥物組合物及製備藥物組合物的方法
本發明是有關於一種藥物組合物及治療癌症的方法。本發明還涉及製備藥物組合物的方法。
幾十年來，超音波一直是醫學影像或疾病治療領域最重要的工具之一，因為它是一種非游離輻射、準確、廉價且易於操作的工具。關於超音波技術，微氣泡超音波對比劑(microbubble ultrasound contrast agent)施加到血管內，血管中超音波微氣泡對比劑的微小氣泡被超音波能量激發，產生諧波共振(harmonic resonance)，增強了接收的超音波影像品質。微氣泡超音波對比劑的應用可以幫助提高超音波成像的對比度和靈敏度。
順式-二氯二氨合鉑(II)(Cis-Diamine platinum(II)Dichloride,CDDP)，以下稱為「順鉑」，是治療頭頸癌最常用的化療藥物之一。一旦順鉑進入細胞， 就會被水分子活化而產生毒性(hydrolysis-dependent activation)。在順鉑抑制癌細胞的同時，也會毒殺全身的健康細胞，從而引起不良副作用，尤其是腎毒性(nephrotoxicity)。因此，順鉑引起的腎損傷仍然是臨床治療中的最大挑戰。
根據本揭露的一個態樣，提供裝載順鉑的微氣泡。裝載順鉑的微氣泡包括外殼部分和核心部分。外殼部分包含複數個白蛋白分子及與白蛋白分子共價鍵合的複數個第一順鉑分子。核心部分被外殼部分包圍。核心部分包括惰性氣體與複數個第二順鉑分子的混合物。
根據本揭露的一個態樣，提供用於治療癌症的藥物組合物。用於治療癌症的藥物組合物包括介質及分散在介質中的複數個裝載順鉑的微氣泡。每個裝載順鉑的微氣泡包括外殼部分及被外殼部分包圍的核心部分。外殼部分包含複數個白蛋白分子及與白蛋白分子共價鍵合的複數個第一順鉑分子。核心部分包括惰性氣體與複數個第二順鉑分子的混合物。
根據本揭露的一個態樣，提供製備藥物組合物的方法。此方法包含以下操作。將白蛋白及順鉑與生理食鹽水混合形成混合物，其中順鉑與白蛋白共價鍵結合。引入惰性氣體並對上述混合物進行超音波振盪處理，以在其中形成複數個裝載順鉑的微氣泡。每個裝載順鉑的微氣泡包括外殼 部分及被外殼部分包圍的核心部分。外殼部分包括上述白蛋白及與上述白蛋白共價鍵合的順鉑的第一部分，並且核心部分包含惰性氣體與順鉑的第二部分的混合物。
根據本揭露的一個態樣，提供治療癌症的方法。此方法包含以下操作。將上述藥物組合物給予有需要的受試者。將超音波能量施加到受試者的腫瘤以破壞上述裝載順鉑的微氣泡。
10:方法
102、104、106、108:操作
1081:白蛋白
1082:惰性氣體
1083:順鉑
當讀到隨附的圖式時，從以下詳細的敘述可充分瞭解本揭露的各方面。
第1圖為根據本揭示內容的一個實施方式繪示的製備用於治療癌症的藥物組合物的方法示意圖。
第2圖為實施例1中藥物組合物1-5的裝載效率比較圖。
第3A圖為根據各種實施例繪示的微氣泡數量與微氣泡粒徑之間的關係圖。
第3B圖為根據各種實施例繪示的出現頻率與微氣泡粒徑之間的關係圖。
第4A圖及第4B圖分別為比較例的光學顯微鏡和掃描式電子顯微鏡影像。
第4C圖及第4D圖分別為一實施例的光學顯微鏡和掃描式電子顯微鏡影像。
第5圖為根據各種實施例的使用不同超音波照射參數的微氣泡破壞圖。
第6A圖為根據各種實施例繪示的超音波照射條件與白蛋白微氣泡的超音波影像強度之間的關係圖。
第6B圖為根據各種實施例繪示的細胞存活率(cell viability)與超音波照射條件之間的關係圖。
第7A圖為根據各種實施例繪示的在不同順鉑濃度下不同形式的順鉑之間細胞存活率的比較圖。
第7B圖為根據各種實施例繪示的在不同順鉑濃度下不同形式的順鉑之間細胞存活率的比較圖。
第8圖為根據各種實施例在不同超音波強度下組織模擬瓊脂糖凝膠模型(tissue-mimicking agarose phantom)中白蛋白微氣泡的高頻超音波影像。
第9A圖為根據一實施例聚焦於頭頸癌腫瘤病變的一系列高頻超音波影像。
第9B圖為根據各種實施例的順鉑對相關器官的全身性生物分佈(systemic biodistribution)圖。
第10A圖為根據一些實施例的活小鼠的腫瘤生長和化療結果的一系列IVIS®生物冷光成像系統影像。
第10B圖為從第10A圖的IVIS®影像獲得的發光通量值與治療天數之間的關係圖。
第10C圖為根據一實施例的動物實驗設計方案中體重與治療天數之間的關係圖。
第11A圖及第11B圖分別顯示了根據各種實施例的腫瘤部位病變的H & E染色(H & E-staining)和細胞凋亡TUNEL染色切片的400倍放大影像。
第11C圖分別顯示了根據各種實施例的腎小球(kidney glomeruli)部位病變的切片的400倍放大影像。
第11D圖分別顯示了根據各種實施例的腎小管(kidney tubules)部位病變的切片的400倍放大影像。
第12圖為根據各種實施例繪示的在不同順鉑濃度下不同形式的順鉑之間相對細胞存活率的比較圖。
第13A圖為根據一些實施例繪示的聽性腦幹反應(ABR)閾值的圖表。
第13B圖為根據一些實施例繪示的變頻耳聲傳射(DPOAE)的訊噪比(SNR)的圖表。
以將以圖式揭露本發明之複數個實施方式，為明確說明起見，許多實務上的細節將在以下敘述中一併說明。在附圖和說明書中可能使用相同的附圖標記表示相同或相似的部分。
關於本文中所使用之『約』、『大約』或『大致約』一般通常係指數值之誤差或範圍約百分之二十以內，較好地是約百分之十以內，而更佳地則是約百分五之以內。文中若無明確說明，其所提及的數值皆視作為近似值，即如『約』、『大約』或『大致約』所表示的誤差或範圍。
超音波微氣泡對比劑主要由許多小微氣泡組成，其尺寸分佈為約1μm至8μm。超音波微氣泡對比劑可用於提高超音波影像的品質。通常理想的超音波對比劑具有以 下特性：(a)無生物毒性，並可被代謝；(b)可注射進入活體靜脈；(c)可通過肺循環和微循環；(d)穩定性高。包含在超音波微氣泡對比劑中的微氣泡具有穩定的外殼並且可以用於增強反射超音波的散射信號。在各種超音波能量強度下，使用超音波微氣泡對比劑可以增加化學物質或小分子在施加區域的滲透深度(即吸收效率)和/或滲透量(即吸收量)。根據微氣泡外殼的材料，微氣泡超音波對比劑可大致分為三類：白蛋白微氣泡(albumin microbubbles)，脂質體微氣泡(liposome microbubbles)或聚合物微氣泡(polymer microbubbles)。在本揭示內容中，以蛋白質作為基質，用作裝載抗癌藥物的白蛋白微氣泡。
本揭示內容的一個態樣是提供裝載順鉑的白蛋白微氣泡。詳細地說，裝載順鉑的白蛋白微氣泡可用於治療癌症。根據各種實施方式，每個裝載順鉑的白蛋白微氣泡包括外殼部分和被外殼部分包圍的核心部分。外殼部分包含複數個白蛋白分子及與白蛋白分子共價鍵合的複數個第一順鉑分子。核心部分包括惰性氣體與複數個第二順鉑分子的混合物。在一實施方式中，核心部分基本上由惰性氣體和第二順鉑分子組成。在一些實施例中，第二順鉑分子不與外殼部分的白蛋白分子共價結合。在各種實施方式中，裝載順鉑的微氣泡的平均粒徑為約0.6μm至約10μm，例如為約0.8μm、1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、5μm、或8μm。在一實施方式中，第一順鉑分子的數量大於第二順鉑分子的數量。在各種實施方式中，惰性氣體選自由 八氟丙烷(C3F8)氣體、六氟化硫(SF6)氣體及其組合組成的群組。惰性氣體使微氣泡的整體結構更穩定並且不易破裂。
本揭示內容的另一態樣是提供用於治療癌症的藥物組合物。用於治療癌症的藥物組合物包括介質及分散在介質中的複數個裝載順鉑的微氣泡。每個微氣泡包括外殼部分及被外殼部分包圍的核心部分。外殼部分包含複數個白蛋白分子及與白蛋白分子共價鍵合的複數個第一順鉑分子。核心部分包括惰性氣體與複數個第二順鉑分子的混合物。在一些實施方式中，介質能夠溶解白蛋白和順鉑。在一些實施方式中，介質包括生理食鹽水。在一實施方式中，核心部分基本上由惰性氣體和第二順鉑分子組成。在一些實施方式中，第二順鉑分子不與外殼部分的白蛋白分子共價結合。在一些實施方式中，第一順鉑與白蛋白分子的重量比為約10至約25。例如，第一順鉑與白蛋白分子的重量比可以是11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24。在一些實施方式中，用於治療癌症的藥物組合物具有順鉑濃度為約250μg/mL至約450μg/mL。例如，順鉑的濃度可以是255、265、270、275、285、295、300、305、310、315、325、335、345、355、365、375、385、395、400、405、410、415、425、435、440或445μg/mL。在一些實施方式中，第一順鉑分子的數量大於第二順鉑分子的數量。在一些實施方式中，裝載順鉑的微氣泡在藥物組合物的濃度為0.5 x 108-3 x 108顆粒/mL。
本揭示內容的另一態樣是提供用於治療癌症的 藥物組合物的方法。第1圖為根據本揭示內容的一些實施方式繪示的製備用於治療癌症的藥物組合物的方法10的示意圖。製備藥物組合物的方法10包括操作102、操作104、操作106以及操作108。
在操作102中，將白蛋白和順鉑與生理食鹽水混合以形成混合物。在操作104中，將混合物置於混合器(例如渦旋混合器等)上以合適的時間段(例如16小時至17小時或其他時間段，取決於處理條件)進行培育(incubating)，使順鉑與白蛋白共價鍵合。在一些實例中，順鉑在化學計量上的量大於白蛋白的量，因此在混合物中存在過量的順鉑。在操作106中，引入惰性氣體並對混合物進行超音波振盪處理，以在其中形成複數個裝載順鉑的微氣泡。在操作108中，將混合物離心以形成上部泡沫層及液體，其中上部泡沫層包括複數個裝載順鉑的微氣泡，液體位於泡沫層之下。在泡沫層中，每個裝載順鉑的微氣泡包括外殼部分和被外殼部分包圍的核心部分。外殼部分包括白蛋白及與白蛋白共價鍵合的順鉑的第一部分，並且核心部分包含惰性氣體與順鉑的第二部分(例如，過量的順鉑)的混合物。根據一實例，每個裝載順鉑的微氣泡基本上由白蛋白1081、惰性氣體1082、以及順鉑1083組成。然而，在一些實例中，可以將其他抗癌藥物添加到混合物中，並且可以將上述添加藥物封裝在微氣泡中。在操作108之後，可以進行純化處理以除去不與白蛋白結合也不封裝在外殼部分中的「游離(free)」順鉑。
應當理解，儘管上述方法10示出了許多操作、 動作和/或特徵，但並非上述所有的操作、動作和/或特徵都是必需的，並且，也可能存在其他未示出的操作、動作和/或特徵。例如，上述的操作104是可選擇的，並且可以由本領域已知的任何合適的混合技術代替，或者可以在一些實施方式中被省略。此外，操作108是可選擇的，並且可以被能分離裝載順鉑的微氣泡與混合物的任何合適的分離方法代替。並且，在一些實施方式中，上述操作和/或動作的順序可以與第1圖中所示的不同。此外，在一些實現方式中，所示出的動作可以進一步劃分為多個子動作，而在其他實現方式中，一些示出的動作可以彼此同時執行。
在一些實施方式中，混合物的白蛋白濃度為125-155mg/mL，順鉑濃度為1-12mg/mL。例如，白蛋白濃度可以是126、132、140、150或154mg/mL，順鉑濃度可以是2、4、6、8或10mg/mL。在一些實施方式中，惰性氣體可以是八氟丙烷(C3F8)氣體、六氟化硫(SF6)氣體或其組合。在一些實施方式中，用於治療癌症的藥物組合物基本上由白蛋白、順鉑、生理食鹽水及惰性氣體組成。在一些實施方式中，裝載順鉑的微氣泡具有平均粒徑為約0.6μm至約10μm，例如，為1.02、1.7、2.05、2.45、或2.9μm。在一些實施方式中，在藥物組合物中，裝載順鉑的微氣泡的濃度約0.1 x 108至約2.5 x 108顆粒/mL或更高。
本揭示內容的又一態樣是提供治療癌症的方法。此方法包含以下步驟。將上述用於治療癌症的藥物組合物給予受試者。將超音波能量施加到受試者的腫瘤以破壞上 述裝載順鉑的微氣泡。在一實施方式中，此方法可用於治療鱗狀上皮細胞癌(squamous cell cancer)。例如，此方法可用於治療多種其他癌症，包括肺癌、膀胱癌、頭頸部實質固態瘤(solid tumors of the head and neck)、睾丸癌及卵巢癌。在一些實施例中，超音波能量具有1W至3W的功率。在一些實施方式中，此方法還包括測量受試者的非標靶組織中的順鉑濃度和/或腫瘤組織中的順鉑濃度的步驟。在一些實施方式中，非標靶組織的順鉑濃度小於腫瘤組織的順鉑濃度。在各種實施方式中，用於治療癌症的藥物組合物的白蛋白濃度為約580mg/m2至約7600mg/m2。例如，白蛋白濃度可以為600、800、1000、1500、1800、2000、2200、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7200或7500mg/m2。在各種實施方式中，用於治療癌症的藥物組合物具有順鉑濃度為約50-650mg/m2。例如，順鉑濃度可以是60、70、80、90、100、150、170、190、200、220、240、260、280、300、310、330、350、370、390、410、420，440、460、480、500、520、550、570、600、610、620、630或640mg/m2。
實施例
以下實施例用於詳細說明本揭示內容的一些態樣，以使本領域技術人員能夠實施本揭示內容。以下描述的比較例是為使本領域技術人員能夠更好地理解本揭示內容及其技術效果。本文的實施例和比較例不旨在限制本揭示內 容。在以下由本發明的發明人撰寫的期刊論文中描述了這些實施例的細節：Insonation of Systemically Delivered Cisplatin-Loaded Microbubbles Significantly Attenuates Nephrotoxicity of Chemotherapy in Experimental Models of Head and Neck Cancer.Cancers 2018,10,311，其在此引入作為參考。
實施例1：順鉑(CDDP)濃度的優選：具有高順鉑裝載效率的裝載順鉑的微氣泡(CDDP-loaded MBs)
為了達到裝載順鉑的人類血清白蛋白(CDDP-HSA)的高順鉑裝載效率(CDDP loading efficiency)，嘗試了幾種順鉑濃度以確定相對最佳的順鉑濃度。製備下表1中列出的藥物組合物1-5。除了使用不同的順鉑濃度，藥物組合物1-5的實驗以相同的方式進行。藥物組合物1-5的參數列於下表1中。
Figure 108127259-A0305-02-0013-1
作為描述性的實例，在藥物組合物1中，在2mL生理食鹽水中1mg/mL的順鉑(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)與140mg/mL的人類血清白蛋白溶液(Octapharma,Vienna,Austria)混合以形成混合物。然後 將此混合物在黑暗中於37℃下培育，並且放置於渦旋混合器(30RPM)上17小時。然後將生理食鹽水加入混合物中，使體積達到10mL。引入八氟丙烷(C3F8)氣體，並使用超音波振盪器(Branson Ultrasonics Co.,Danbury,CT,USA)對上述混合物進行超音波振盪處理90秒。然後將混合物以1mL等分試樣以1200rpm離心2分鐘(Thermo Fisher Science，Bremen，Germany)，以形成上部泡沫層及液體層，上部泡沫層包括複數個裝載順鉑的微氣泡(CDDP-loaded MBs)，液體層位於泡沫層之下。除去底部的液體層，並加入1mL生理食鹽水(pH 7.4、0.9%氯化鈉)進行再離心。重複這些步驟三次，以消除游離(未結合)的順鉑。將裝載順鉑的微氣泡的等分試樣儲存在4℃。
第2圖為藥物組合物1-5的裝載效率比較圖。藉由將裝載在白蛋白微氣泡上的順鉑量除以最初用於製備藥物組合物的順鉑量來計算本揭露中順鉑分子的裝載效率。如第2圖所示，順鉑濃度為6mg/mL(藥物組合物4)和濃度為12mg/mL(藥物組合物5)之間沒有顯著差異。因此，在隨後的實施例中，以6mg/mL的順鉑濃度製備藥物組合物。
實施例2：白蛋白濃度的優選：具有高順鉑裝載效率的裝載順鉑的微氣泡
在實施例2中，為了達到裝載順鉑的微氣泡的高順鉑裝載效率，嘗試了幾種白蛋白濃度以確定相對最佳的白蛋白濃度。製備下表2中列出的藥物組合物4、6、7及比較 例1。除了使用不同的白蛋白濃度，藥物組合物6、7的實驗以與藥物組合物4相同的方式進行。每個實驗組的裝載順鉑的微氣泡的組成、粒徑、數量和順鉑裝載效率列於下表2中。
Figure 108127259-A0305-02-0015-2
第3A圖為實驗例2的微氣泡數量與微氣泡粒徑之間的關係圖。第3B圖為實驗例2的出現頻率與微氣泡粒徑之間的關係圖。溶液中裝載順鉑的微氣泡的尺寸分佈是藉由動態光散射儀(Nanoparticle Analyzer,Horiba,Kyoto,Japan)量測，並且使用具有30-μm孔徑探針，測量邊界為0.6-10μm的MultiSizer III裝置(Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)測量氣泡數量。
如表2和第3A-3B圖所示，沒有順鉑的白蛋白微氣泡(比較例1)的平均尺寸和濃度分別為1.02±0.11μm及1.40±2.22×108顆粒/mL。然而，請參考藥物組合物6， 當使用6mg/mL的順鉑濃度時，微氣泡濃度將降至其初始值(即比較例1)的約50%。比對藥物組合物4及藥物組合物6，將白蛋白濃度從132mg/mL增加到140mg/mL時，順鉑裝載效率和微氣泡濃度分別增加至10.09±0.23%及1.09±1.31x108顆粒/mL。進一步增加白蛋白濃度至150mg/mL(藥物組合物7)導致裝載效率顯著地降低至7.70±1.21%。因此，在隨後的實施例中，以藥物組合物4的條件(白蛋白濃度為140mg/mL，順鉑濃度為6mg/mL)製備藥物組合物。
第4A圖及第4B圖分別為比較例1的光學顯微鏡和掃描式電子顯微鏡影像。第4C圖及第4D圖分別為藥物組合物4的光學顯微鏡和掃描式電子顯微鏡影像。
實施例3-6：體外微氣泡破壞的超音波照射參數
檢驗了超音波照射的不同參數，以獲得體外微氣泡破壞的相對最佳的超音波照射參數。在實施例3-6中，聲波強度為1W/cm2，並且研究超音波照射時間和超音波操作循環次數，其列於下表3中。
Figure 108127259-A0305-02-0016-3
Figure 108127259-A0305-02-0017-4
第5圖為在實施例3-6和比較例2中使用不同超音波照射參數的白蛋白微氣泡破壞的一系列影像。第6A圖為由MATLAB程序處理獲得的超音波照射條件與白蛋白微氣泡的影像強度之間的關係圖。如表3和圖6A所示，在實施例4、5、6中，白蛋白微氣泡的破壞程度分別為36.1%、50.4%、以及73.7%。
第6B圖為比較例2和實施例3-6中的細胞存活率與超音波照射條件之間的關係圖。如第6B圖所示，在1W/cm2的聲波強度下，超音波照射30秒6個循環不影響培養中ATCC HTB-43(FaDu)細胞的存活率。因此，將30秒6個循環的超音波照射條件用於後續體外的實施例。
實施例7：體外ATCC HTB-43(FaDu)細胞細胞毒性測定實驗
在實施例7中，研究了不同形式的順鉑的細胞毒性，不同形式的順鉑即為生理食鹽水中的順鉑、在生理食鹽水中順鉑共價裝載在白蛋白微氣泡上、以及在生理食鹽水中順鉑與白蛋白微氣泡混合(即，順鉑不與白蛋白微氣泡共價結合)。製備上述各種形式的順鉑，並在1μM、5μM及10μM的不同順鉑濃度下進行實驗。詳細地說，在不同順鉑濃度下，以不同形式的順鉑處理24孔培養皿中的2×104FaDu細 胞/孔。此外，在施加或不施加超音波照射的情況下對每種順鉑形式進行實驗。各種實驗條件列於下表4中。在條件1、3和5中，未使用超音波處理，在條件2、4和6中，使用超音波處理(1W/cm2,30秒、6個循環)。
Figure 108127259-A0305-02-0018-5
第7A圖為在不同順鉑濃度下不同形式的順鉑(條件1、3、5)之間細胞存活率的比較圖。在第7A圖中，“CDDP”代表生理食鹽水中的順鉑、“CDDP+MBs”代表單純與白蛋白微氣泡混合的順鉑、“CDDP loaded MBs”代表共價裝載在白蛋白微氣泡上的順鉑。如第7A圖所示，在這些濃度中，與條件1(CDDP)相比，條件3(CDDP+MB)的毒性沒有顯著增加。然而，條件5(CDDP loaded on MBs)在任何濃度下與條件1或條件3相比，具有明顯更低的毒性反應。這些實驗顯示額外給予白蛋白微氣泡不會干擾順鉑活性，但裝載到白蛋白微氣泡上的順鉑的細胞毒性顯著地降 低。
第7B圖為在不同順鉑濃度下不同形式的順鉑(條件1-6)之間細胞存活率的比較圖。如第7B圖所示，“+US”表示施加超音波處理。有趣的是，當共同給予微氣泡時，在進行超音波處理後，順鉑的毒性明顯增強。請見CDDP+MBs+US與CDDP+MB的比對、以及CDDP loaded MBs+US與CDDP loaded MBs的比對。將條件1-2與條件3-4(白蛋白微氣泡單純地與順鉑混合)的結果進行比較，顯示白蛋白微氣泡和超音波與順鉑一起施加時，增加了順鉑的細胞毒性。這意味著對順鉑的細胞敏感性或吸收意外地增強。比較條件3-4與條件5-6，當順鉑裝載到白蛋白微氣泡上時，在超音波處理之前的細胞毒性明顯較小，但經過超音波處理之後的細胞毒性與條件3-4的細胞毒性相當。
實施例8-10：體內超音波參數實驗
在實施例8-10中，通過在組織模擬瓊脂糖模型(tissue-mimicking agarose phantoms)中測試不同的聲波強度設置，研究在體內合適的超音波參數(例如功率或強度)。測試條件和實驗結果列於表5中。
Figure 108127259-A0305-02-0019-6
Figure 108127259-A0305-02-0020-7
第8圖為實施例8-10中，在不同超音波強度下組織模擬瓊脂糖模型中白蛋白微氣泡的高頻超音波影像。如表5及第8圖所示，在1W/cm2、2W/cm2、以及3W/cm2的聲波強度下暴露30秒，白蛋白微氣泡的破壞效率分別是24.39±0.46%、54.74±0.1%、以及79.6±0.64%。因此，在所有後續體內實驗中，超音波的功率和照射時間設定為3W/cm2及30秒。
實施例11：微氣泡和超音波對體內順鉑累積的影響
第9A圖為一系列高頻超音波影像，聚焦於頭頸癌腫瘤病變(黃色箭頭)。第9A圖顯示了小鼠尾靜脈微氣泡注射後，腫瘤內(白色箭頭)白蛋白微氣泡(綠色點)的實時外觀，隨後超音波(功率設定為3W/cm2)施加至腫瘤部位30秒，以破壞微氣泡。由第9A圖可以觀查到，在施加超音波後，微氣泡隨後消失。這些影像顯示靜脈注射的微氣泡循環至腫瘤病變，在此微氣泡被所施加的超音波破壞，從而將順鉑從裝載順鉑的白蛋白微氣泡中釋放。
第9B圖顯示在使用實施例7中條件4-6所述的組合物施用各種順鉑相關的化學治療20分鐘後，順鉑對相關器官的全身性生物分佈(systemic biodistribution)。不同器官組織中的順鉑濃度是利用感應耦合電漿質譜(ICP-MS)定量法測定。如第9B圖所示，在所研究的器官中，腎臟累積了最大量的順鉑，其次是肝臟，然後是內耳。與單獨使用順鉑相比，裝載順鉑的白蛋白微氣泡及裝載順鉑 的白蛋白微氣泡並進行超音波處理的條件下均顯著降低了腎臟和肝臟中順鉑的攝取。此結果表明，順鉑與白蛋白微氣泡的結合(例如，共價鍵合)顯著地降低了其全身毒性，這與在FaDu細胞中的體外實驗結果(實施例7)一致。此外，對於內耳沒有明顯的治療差異。腫瘤中的順鉑在超音波治療後(0.34±0.07μg/組織(g))，至少為超音波治療前的3倍(0.09±0.03μg/組織(g))。
實施例12：評估在體內基於順鉑的化學療法對頭頸癌生長的抗腫瘤作用
在第0天，將嚴重聯合免疫缺陷(SCID)小鼠的右側腹區域皮下植入發光標記的下咽癌細胞株(FaDu-fLuc/GFP)(2x106cells/mouse)。在第4天，利用IVIS®生物冷光成像系統(版本4.4，Caliper Life Sciences，Alameda，CA，USA)測定被植入的SCID小鼠中腫瘤異種移植物(tumor xenograft)的形成和大小。然後將被植入的SCID小鼠分為第I組至第V組(以下以Gp I-Gp V表示)，並用不同藥物組合物治療每組被植入的SCID小鼠，其總結於下表6中。具體而言，Gp I的小鼠是對照組，並用生理食鹽水治療。Gp II的小鼠用具有順鉑溶解於其中的生理食鹽水治療。Gp III的小鼠用含有順鉑及白蛋白微氣泡混合物(濃度為1.4×108顆粒/mL)的生理食鹽水治療，隨後以超音波照射腫瘤部位(功率：3W/cm2，30秒)。Gp IV的小鼠用含有裝載順鉑白蛋白微氣泡(濃度為1.4×108顆粒 /mL)的生理食鹽水治療，並且不施加超音波照射。Gp V的小鼠用含有裝載順鉑白蛋白微氣泡(濃度為1.4×108顆粒/mL)的生理食鹽水治療治療，隨後以超音波照射(功率為3W/cm2，30秒)。所有藥物(即生理食鹽水、順鉑、順鉑與白蛋白微氣泡的混合物、以及裝載順鉑的白蛋白微氣泡)在第4天、第7天、第11天、第14天、第17天、第20天、第23天、第26天、以及第30天藉由尾靜脈注射100μL給藥。對於Gp III和Gp V，在注射後，在超音波探針和腫瘤之間放置膠狀物並將超音波探針施加於腫瘤30秒。通過每週兩次記錄由IVIS®影像獲得的螢光素酶生物冷光(luciferase bioluminescence)數據，以評估在體內基於順鉑的化學療法對頭頸癌生長的抗腫瘤作用。在第33天，在獲得小鼠的IVIS®影像後，小鼠安樂死並進行分析。
Figure 108127259-A0305-02-0022-8
第10A圖顯示從第4天到第33天Gp I-Gp V活小鼠的腫瘤生長和化療結果的一系列IVIS®影像。第10B圖 為從第10A圖的IVIS®影像獲得的發光通量值與治療天數之間的關係圖。參照第10A圖及第10B圖，在第33天的化療後，與Gp I相比，Gp II-Gp V顯著地抑制腫瘤生長，其腫瘤生長減少30-65%。在Gp II(CDDP)和Gp V(CDDP-loaded MBs+US)之間則沒有相當大的差異；然而，與Gp IV(CDDP-loaded MBs)相比，它們都顯示出明顯更好的結果。Gp III(CDDP+MBs+US)在所有的治療中，對於抑制腫瘤生長具有最佳的效果。Gp III的結果明顯優於Gp II(單獨使用順鉑治療)或Gp V(使用裝載順鉑的白蛋白微氣泡與超音波治療)，顯示白蛋白微氣泡與超音波的配合可以在體內增加頭頸癌細胞對順鉑的攝取。
第10C圖為Gp I-Gp V小鼠的中體重與治療天數之間的關係圖。如第10C圖所示，在33天的治療期間，儘管所有動物的體重(BW)均有不同程度的增加，但與Gp I、Gp V、及Gp V相比，Gp II和Gp III均顯示出統計學上較少的體重增加。與Gp II相比，Gp III體重增加較多表示在順鉑化療期間，添加白蛋白微氣泡可能對體重增加具有正面的影響。
實施例13：各種裝載順鉑的化學療法對標靶腫瘤組織和非標靶腎實質(kidney parenchyma)中細胞死亡的影響
進行組織病理學檢查，以研究在實施例12中的第33天時，基於順鉑的化學療法對Gp I-Gp V小鼠的腫瘤和腎組織的影響。取出Gp I-Gp IV的SCID小鼠的FaDu異 種移植腫瘤和腎臟用於組織學檢查。通過H&E染色和TUNEL檢測檢查異種移植腫瘤。第11A圖及第11B圖分別顯示Gp I-Gp V的H&E染色檢測和TUNEL檢測的影像(原始放大倍數x400)。腫瘤病變的H&E染色切片顯示癌細胞呈現巢狀分佈和無序排列。在對照組中，腫瘤細胞以完整及非典型(atypical)結構緊密排列。相比之下，化療組顯示出更多的腫瘤細胞凋亡，其特徵是細胞膜不完整、細胞質濃縮(condensed cytoplasm)、細胞核固縮(pyknotic)或破裂(cracking)、以及腔形組織(cavity-shaped organization)。值得注意的是，利用TUNEL染色評估Gp I-Gp V中腫瘤細胞凋亡的程度(degree)及量(extent)與第10A圖中所示的腫瘤減少的結果一致。特別是Gp III(CDDP+MBs+US)顯示出最大量的細胞凋亡，而Gp IV(CDDP-loaded MBs)顯示出較少的細胞凋亡。Gp II(CDDP)和Gp V(CDDP-MB+US)的治療顯示出相似的TUNEL陽性染色。這些結果顯示，當順鉑(CDDP)以與微氣泡結合的形式傳遞並施加超音波照射時，可以達到類似於單獨使用順鉑所獲得的腫瘤殺傷效果。
第11C圖及第11D圖分別顯示Gp I-Gp V的腎小球和腎小管的影像(原始放大倍數x400)。在非標靶腎組織中，順鉑化療的全身細胞毒性顯示順鉑治療導致腎實質(renal parenchyma)中顯著的組織學變化，如腎小球叢內襯的內皮細胞的空泡形成(vacuolation)或甚至萎縮(第11C圖)、以及腎小管上皮內襯的壞死或空泡形成及囊腫性 增大(第11D圖)。在單獨施用順鉑(Gp II)或共同施用順鉑和微氣泡(Gp III)的組別中，腎臟中具有顯著的細胞毒性組織學變化。然而，在以裝載順鉑的微氣泡(Gp IV)治療或裝載順鉑的微氣泡並照射超音波(Gp V)治療的組別中，這些變化減弱。此外，亦測量腎臟重量比(腎臟重量與體重的百分比)進行比較。在化療結束時(第33天)，與對照組(Gp I)相比，單獨以順鉑治療(Gp II)和以順鉑及白蛋白微氣泡混合並照射超音波治療(Gp III)導致明顯更高的腎臟重量比。相比之下，與對照組相比，以裝載順鉑的微氣泡治療(Gp IV(CDDP-loaded MBs)，p=0.86)及以裝載順鉑的微氣泡並照射超音波治療(Gp V(CDDP-loaded MBs+US)，p=0.87)的組別的腎臟重量比沒有顯著差異，顯示以裝載順鉑的微氣泡治療可防止順鉑導致的腎臟重量比增加。
鑒於上述實施例，這些實施例突顯順鉑與微氣泡的結合降低了體外和體內腫瘤細胞的順鉑細胞毒性，但當與超音波照射結合時，可以達成相似的抗腫瘤效果。同樣地，與傳統的順鉑治療相比，使用順鉑及白蛋白微氣泡混合並照射超音波治療以增加細胞滲透性及增強順鉑攝取和凋亡，造成更佳的腫瘤減少。
與白蛋白中間體(albumin mesospheres)直接用於裝載順鉑並使用有機溶劑(DMSO)提高裝載效率的現有技術不同，本揭示內容的裝載順鉑的微氣泡(CDDP-MBs)在生理食鹽水溶液中製備，並由封裝在血清白蛋白殼中的全氟碳化物(perfluorocarbon)氣體組成。一 般而言，沒有外殼封裝的氣泡在血流中非常不穩定，並且可能快速地溶解。無殼的微氣泡甚至不能穿過肺血管系統(lung vasculature)。現有的微氣泡通常包括兩部分或由兩部分組成：具有惰性及低可溶性氣體(例如全氟化碳或全氟丙烷)的核心、以及穩定的外殼(例如磷脂、蛋白質和聚合物)。在現有技術中，設計微氣泡表面結構及化學以減少補體活化(complement activation)和吞噬作用(phagocytosis)或直接修飾脂質外殼以助於延遲溶解，並確保微氣泡在循環中的半衰期更長。對於一些製劑，延長的循環時間可以從幾分鐘改善至1小時。在本揭露中，雖然順鉑在裝載順鉑微氣泡上的裝載效率被限制在約10%，但是超音波破壞這些具有惰性氣體核心的裝載順鉑微氣泡保留了順鉑的有效細胞毒性，而無需擔心額外的修飾或摻入其他藥劑。據我們所知，這是第一項製備氣體填充及裝載順鉑的微氣泡用於癌症化療的研究。
雖然順鉑的鉑(Pt)在含有高濃度氯化物的血液中循環時依賴其氯化物配體進入細胞，由於90%的順鉑與血漿蛋白結合，只有10%的順鉑可以進入細胞。我們的結果顯示，當順鉑與白蛋白微氣泡結合時，其變得無活性且毒性較低。順鉑與微氣泡的結合降低了其細胞毒性，並且裝載到人類血清白蛋白上的順鉑在FaDu細胞中的細胞毒性也顯著降低。實驗結果如第12圖所示。這些結果與先前研究蛋白結合的順鉑複合物的抗腫瘤活性和毒性的研究一致。對頭頸癌患者的I期研究顯示，順鉑-白蛋白複合物不管是在起始 劑量為100mg/m2或逐漸升高劑量至650mg/m2，都沒有引起明顯的腎毒性或耳毒性。順鉑-白蛋白複合物不如常規療法有效，因此，與接受常規順鉑治療的患者相比(109天與151天相比)，使用複合物治療的患者具有較短的中位存活期(median survival time)並不意外。本揭示內容試圖藉由使用順鉑裝載的微氣泡減少化療的全身性副作用，同時使用超音波增強其抗腫瘤活性來克服這個缺點。本揭示內容的結果顯示，與常規順鉑治療相比，通過施用裝載順鉑的微氣泡使腎毒性最小化。裝載順鉑的微氣泡治療或順鉑與微氣泡混和治療隨後接受超音波照射造成的抗腫瘤效果與用常規順鉑治療相似或甚至更好。順鉑、微氣泡和超音波的組合通過超音波微氣泡介導的對腫瘤細胞的穴蝕效應(cavitation effects)顯示出最大程度的腫瘤減少。因此，超音波治療使順鉑有足夠的動力在腫瘤內移動而不影響游離順鉑的細胞毒性。
幾種已知的危險因素，例如低鎂血症，心臟病和低蛋白血症與順鉑引起的腎毒性有關。癌症患者與健康受試者相比具有相對降低的血漿白蛋白水平。白蛋白水平較低的患者容易具有較高的血漿順鉑的未結合部分和較低的順鉑半衰期。低蛋白血症也可能影響小管周圍的膠體滲透壓(peritubular oncotic pressure)，進而影響鉑的排出，從而使這些患者具有更高的腎毒性風險。Morris等人最近一項關於血漿蛋白和鉑分佈的體外研究顯示，與健康對照組的血漿相比，在血清白蛋白低的兒童癌症患者血漿中的毒性順 鉑衍生水解產物增加，且蛋白質結合鉑減少。有趣的是，血漿血清白蛋白濃度的增加導致順鉑衍生的水解產物減少，顯示在順鉑治療之前增強癌症患者的血漿白蛋白濃度可以是減輕順鉑造成的毒性副作用的簡單策略。
用鉑類似物治療的患者也被認為具有發生聽力喪失的高風險。本揭露的實施方式顯示，在所有分析的器官中，內耳的鉑含量最低，並且透過結合使用聽性腦幹反應(ABR)和變頻耳聲傳射(DPOAE)測試的聽力評估顯示，在治療組和對照組中，自4kHz至32kHz頻率帶的聽性腦幹反應閾值(thresholds)，以及用65分貝聲壓級(dB SPL)刺激下所誘發的變頻耳聲傳射訊噪比(SNR)都沒有顯著差異。實驗結果如第13A圖及第13B圖所示。Astolfi等人證明，以單次高劑量14mg/g或連續三天以4.6mg/kg/天的順鉑腹腔注射才會導致大鼠聽力閾值上升。在本揭露中，使用每週兩次2mg/kg的低劑量順鉑對於小鼠聽力損失的影響並不明顯。這也意味著根據本揭露的實施例可以避免聽力損失的耳毒性(ototoxicity)副作用。
因為順鉑結合微氣泡(CDDP-MB)的毒性低於單獨使用順鉑，使用順鉑結合微氣泡加超音波治療比現有的化療方法具有一些優點，此治療操作簡單，最重要的是，順鉑結合微氣泡是為全身性的應用(systemic application)而設計。局部注射順鉑和微氣泡隨後以超音波照射局部淋巴結和腫瘤，也顯示了幾種優於傳統順鉑療法的益處，但這種方法的缺陷可能包括大血管(major blood vessel)損傷的 可能性、只能傳遞至注射部位的侷限性、以及由於腫瘤間質內壓力(intratumoral interstitial pressure)造成的順鉑滲透的限制。頭頸部鱗狀上皮細胞癌(squamous cell carcinoma of the head and neck,SCCHN)的治療晚期應該需要使用比局部方法更精緻且涵蓋面更廣的全身性化療方法，以擴大局部區域控制和改善遠端轉移(distant metastasis)率。
雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
10:方法
102、104、106、108:操作
1081:白蛋白
1082:惰性氣體
1083:順鉑

Claims (20)

  1. 一種裝載順鉑的微氣泡，藉由以下步驟製備而成：(a)將白蛋白、順鉑與一介質混合形成一初混合物，其中該初混合物具有一順鉑濃度為約1-12mg/mL，以及(b)引入一惰性氣體並對該初混合物進行超音波振盪處理以形成該裝載順鉑的微氣泡，該裝載順鉑的微氣泡包括：一外殼部分，包含複數個白蛋白分子及與該些白蛋白分子共價鍵合的複數個第一順鉑分子；以及一核心部分，被該外殼部分包圍，其中該核心部分包括一惰性氣體與複數個第二順鉑分子的一混合物。
  2. 如請求項1所述的裝載順鉑的微氣泡，其中該些第一順鉑分子的數量大於該些第二順鉑分子的數量，且該些第二順鉑分子不與該外殼部分的該些白蛋白分子共價鍵合。
  3. 如請求項1所述的裝載順鉑的微氣泡，其中該惰性氣體選自由八氟丙烷(C3F8)氣體、六氟化硫(SF6)氣體及其組合組成的群組。
  4. 如請求項1所述的裝載順鉑的微氣泡，其中該裝載順鉑的微氣泡粒徑約為0.6μm至約10μm。
  5. 如請求項1所述的裝載順鉑的微氣泡，其 中該核心部分由該惰性氣體及該些第二順鉑分子組成。
  6. 一種用於治療癌症的藥物組合物，藉由以下步驟製備而成：(a)將白蛋白、順鉑與一介質混合形成一初混合物，其中該初混合物具有一順鉑濃度為約1-12mg/ml，以及(b)引入一惰性氣體並對該初混合物進行超音波振盪處理以形成複數個裝載順鉑的微氣泡，該藥物組合物包含：該介質；以及該些裝載順鉑的微氣泡，分散在該介質中，其中每個裝載順鉑的微氣泡包含：一外殼部分，包含複數個白蛋白分子及與該些白蛋白分子共價鍵合的複數個第一順鉑分子；以及一核心部分，被該外殼部分包圍，其中該核心部分包括一惰性氣體與複數個第二順鉑分子的一混合物。
  7. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該介質包含生理食鹽水。
  8. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該核心部分由該惰性氣體及該些第二順鉑分子組成。
  9. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該些第二順鉑分子不與該外殼部分的該些白蛋白分子共價鍵 合。
  10. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該藥物組合物具有一順鉑濃度為約250μg/mL至約450μg/mL。
  11. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該些第一順鉑分子的數量大於該些第二順鉑分子的數量。
  12. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該些裝載順鉑的微氣泡在該藥物組合物的濃度為0.5×108-3×108顆粒/mL。
  13. 如請求項6所述的藥物組合物，其中該些裝載順鉑的微氣泡的一平均粒徑為約0.6μm至約10μm。
  14. 一種製備藥物組合物的方法，該方法包括：將白蛋白及順鉑與生理食鹽水混合形成一初混合物，其中順鉑與白蛋白共價鍵合，該初混合物具有一順鉑濃度為約1-12mg/ml；以及引入惰性氣體並對該初混合物進行超音波振盪處理，以在其中形成複數個裝載順鉑的微氣泡，每個裝載順鉑的微氣泡包括一外殼部分和被外殼部分包圍的一核心部分， 其中該外殼部分包括白蛋白及與白蛋白共價鍵合的順鉑中的第一順鉑分子，並且核心部分包含惰性氣體與順鉑中的第二順鉑分子的一混合物。
  15. 如請求項14所述的方法，其中該初混合物的白蛋白濃度為125-155mg/mL，順鉑濃度為1-12mg/mL。
  16. 如請求項14所述的方法，還包括在引入惰性氣體並對該初混合物進行超音波振盪處理之前，將該混合物培育(incubating)2小時至48小時。
  17. 如請求項14所述的方法，其中該惰性氣體選自由八氟丙烷(C3F8)氣體、六氟化硫(SF6)氣體及其組合組成的群組。
  18. 如請求項14所述的方法，其中該藥物組合物基本上由白蛋白、順鉑、生理食鹽水及惰性氣體組成。
  19. 如請求項14所述的方法，其中該些裝載順鉑的微氣泡具有一平均粒徑為約0.6μm至約10μm。
  20. 如請求項14所述的方法，其中該些裝載順鉑的微氣泡具有一濃度為約0.1 x 108至約2.5 x 108顆粒/mL。
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HANG-KANG CHEN, et al., "Insonation of systemically delivered cisplatin-loaded microbubbles significantly attenuates nephrotoxicity of chemotherapy in experimental models of head and neck cancer", Cancers, 5 Sep. 2018, 10(9), 311.
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KELSIE F TIMBIE, et al., "MR image-guided delivery of cisplatin-loaded brain-penetrating nanoparticles to invasive glioma with focused ultrasound", J Control Release, 2017, 263: 120~131.

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