TWI694999B - 喹啉衍生物的鹽型、晶型及其製備方法和中間體 - Google Patents

Abstract

本發明公開了一種喹啉衍生物的晶型、鹽型、鹽型的晶型及其製備方 法。

Description

喹啉衍生物的鹽型、晶型及其製備方法和中間體

本發明涉及一種喹啉衍生物的晶型、鹽型、鹽型的晶型及其製備方法。

Hedgehog蛋白最初是在果蠅中發現的分泌的信號蛋白，它們是高度疏水的蛋白質，其在胚胎發育中起著至關重要的作用。已在人類中鑒別了三種同源hedgehog蛋白，分別為Sonic hedgehog(Shh)、Indian hedgehog(Ihh)和Desert hedgehog(Dhh)。其中Shh不僅在胚胎發育中至關重要，許多證據顯示它在包括基底細胞癌等一些癌症的致癌機制上也有重要的作用(Caro，I.and J.A.Low,Clin Cancer Res,2010.16(13)：3335-9)。Shh在體內合成一個分子量為45kDa的前體蛋白，通過自切除作用產生一個分子量為20kDa的N一端片斷，這個N一端片斷具各了體內所知的所有生物活性，包括激活細胞內的hedgehog訊息通路，其通路主要成員包括patched(PTCH)，類G蛋白偶和受體致癌基因smoothened(SMO)以及轉錄因子Gli等(Bale,A.E.and K.P.Yu,Hum Mol Genet,2001.10(7)：757-62)。基底細胞癌hedgehog訊息通路的變異分析結果顯示大多數變異發生在PTCH-1和SMO上(Von Hoff,D.D.,et al.,N Engl J Med,2009.361(12)：1164-72)。PTCH-1是個有著12次跨膜結 構的膜蛋白，它是Shh的直接作用受體。在沒有Shh的情况下PTCH-1與SMO相作用，SMO為7次跨膜結構蛋白，抑制SMO的生物活力。Shh與PTCH-1的結合導致PTCH-1脫離SMO，使SMO擺脫受抑制狀態。Gli轉錄因子受控於SMO，它起著基因轉錄的開關作用，其中主要的成員包括Gli1，Gli2和Gli3。整個hedgehog通路對胚胎正常發育起著重要的作用。擾亂了這一訊息通路將會導致嚴重的畸形，比如天然致畸化合物cyclopamine就是一個hedgehog抑制劑。在通常條件下，成人體內hedgehog蛋白的濃度非常低。在hedgehog蛋白濃度很低的情况下，PTCH-1與SMO相結合並抑制其生物活力，因而整個通路處於沒有活力，或活力很低的狀態。當細胞分泌hedgehog蛋白後，hedgehog蛋白與PTCH-1受體的結合使其脫離SMO，從而失去對SMO的抑制作用。SMO進一步激活轉錄因子Gli-1從而調控基因轉錄和細胞生長。越來越多的證據表明，大部分基底細胞癌的病因是由於突變或其他原因導致過高的hedgehog訊息傳導通路活力。因此抑制過高的hedgehog訊息傳導通路的活力，能抑制癌細胞的生長從而達到治療基底細胞癌或由相同機制引起的其他癌症。SMO的組成性活化導致癌症(例如BCC)以及解除Ptch對其的抑制可以使SMO致癌的證據說明了SMO阻抗劑作為治療劑在治療所述病症中的用途(Stone等人，(1996)Nature 384：129)。一系列科學和臨床試驗結果顯示hedgehog抑制劑能有效地治療多種癌症。最新臨床試驗數據顯示hedgehog抑制劑GDC-0449能有效地治療基底細胞癌和髓母細胞癌(LorussoPM.et al.Clin Cancer Res.2011；17(8)：2502-11)，並於2012年1月得到FDA認證，或由相同機制引起的其他癌症，例如基底細胞痣綜合症(BCNS)(Goldberg LH.et al.Arch Dermatol.2011 Mar 21.)。生物化學研究表明GDC-0449的抑制點是在SMO上，抑制了SMO的活力就抑制了整個hedgehog通路的活力，從而達到抗癌的目的。除了基底細胞癌和髓母細胞 癌兩種癌症，還有許多其他癌症也和hedgehog訊息傳導通路的超高活力有關係，包括胰腺癌、腸胃癌、直腸癌、卵巢癌及前列腺癌，還有部分血癌等(De Smaele E.et al.CurrOpinInvestig Drugs.2010；11(6)：707-18)。因此研發hedgehog抑制劑作為新型抗癌藥物的前景非常廣泛。

儘管現有技術中已經存在一些SMO抑制劑，但是它們在活性、溶解性、藥代動力學、成藥性的等方面有待改進。

申請號CN201410110890.1記載了一類新的喹啉衍生物，其可作為hedgehog通路的抑制劑、特別是作為SMO抑制劑。可用於治療包括癌症在內的hedgehog通路有關病症。

其結構如式(B-1)所示：

本發明提供化合物1的A晶型，其XRPD圖譜如圖1所示。

本發明的一些方案中，A晶型XRPD解析數據如表1所示。

本發明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其差示掃描量熱曲線在111.41℃±2℃、126.08℃±2℃和146.06℃±2℃處具有吸熱峰的起始點。

本發明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其DSC圖譜如圖2所示。

本發明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其熱重分析曲線在135.65±2℃失重達0.7658%±0.2%。

本發明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其TGA圖譜如圖3所示。

本發明還提供了化合物1的B晶型，其XRPD圖譜如圖4所示。

本發明的一些方案中，B晶型XRPD解析數據如表2所示。

本發明的一些方案中，上述化合物1的B晶型，其差示掃描量熱曲線在165.73℃±2℃處具有吸熱峰的起始點。

本發明的一些方案中，上述化合物1的B晶型，其DSC圖譜如圖5所示。

本發明的一些方案中，上述化合物1的B晶型，其熱重分析曲線在120.00±2℃失重達0.2383%±0.2%，在247.60±2℃失重達0.2005%±0.2%。

本發明的一些方案中，上述化合物1的B晶型，其TGA圖譜如圖6所示。

本發明還提供了B晶型的製備方法，其包括將化合物1的A晶型加入到酯類溶劑、醇類溶劑或酯類溶劑和醇類溶劑的混合溶劑中，加熱至回流溶解，然後緩慢降溫結晶製得。

本發明的一些方案中，上述酯類溶劑選自甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯。

本發明的一些方案中，上述醇類溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、三級丁醇。

本發明的一些方案中，上述酯類溶劑和醇類溶劑的混合溶劑中，酯類溶劑和醇類溶劑的體積比為0.1：1~12。

本發明的一些方案中，上述酯類溶劑和醇類溶劑的混合溶劑中，酯類溶劑和醇類溶劑的體積比為1：2~8。

本發明提供了下式所示化合物2。

本發明提供了化合物2的C晶型，其XRPD圖譜如圖7所示。

本發明的一些方案中，C晶型XRPD圖譜解析數據如表3所示。

本發明的一些方案中，上述化合物2的C晶型，其差示掃描量熱曲線在57.33℃±5℃和212.56℃±5℃處具有吸熱峰的起始點。

本發明的一些方案中，上述化合物2的C晶型，其DSC圖譜如圖8所示。

本發明的一些方案中，上述化合物2的C晶型，其熱重分析曲線在120.00±3℃失重達5.110%±0.5%。

本發明的一些方案中，上述化合物2的C晶型，其TGA圖譜如圖9所示。

本發明提供了C晶型的製備方法，其包括化合物1溶解到有機溶劑中，緩慢滴加硫酸水溶液，攪拌析晶製得。

本發明的一些方案中，上述機溶劑選自丙酮、甲乙酮、環己酮。

本發明的一些方案中，化合物1與硫酸的莫耳比選自1：2~4。

本發明還提供了上述A晶型、B晶型、化合物2及C晶型在製備治療與SMO受體相關疾病藥物上的應用。

定義和說明。

除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在含有下列含義。一個特定的短語或術語在沒有特別定義的情况下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文出現商品名時，旨在指代其對應的商品或其活性成分。

本發明的中間體化合物可以通過本領域技術人員所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本領域技術上人員所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。

本發明具體實施方式的化學反應是在合適的溶劑中完成的，所述的溶劑須適合於本發明的化學變化及其所需的試劑和物料。為了獲得本發 明的化合物，有時需要本領域技術人員在已有實施方式的基礎上對合成步驟或者反應流程進行修改或選擇。

本領域任何合成路線規劃中的一個重要考量因素是為反應性官能基(如本發明中的氨基)選擇合適的保護基。對於經過訓練的從業者來說，Greene and Wuts的(Protective Groups In Organic Synthesis,Wiley and Sons,1991)是這方面的權威。本發明引用的所有參考文獻整體上併入本發明。

下面會通過實施例具體描述本發明，這些實施例並不意味著對本發明的任何限制。

本發明所使用的所有溶劑是市售的，無需進一步純化即可使用。反應一般是在惰性氮氣下、無水溶劑中進行的。質子核磁共振數據記錄在BrukerAvance III 400(400MHz)分光儀上，化學位移以四甲基矽烷低場處的(ppm)表示。質譜是在安捷倫1200系列加6110(&1956A)上測定。LC/MS或Shimadzu MS包含一個DAD：SPD-M20A(LC)和Shimadzu Micromass 2020檢測器。質譜儀配備有一個正或負模式下操作的電噴霧離子源(ESI)。

本發明採用下述縮略詞：DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；EA代表乙酸乙酯；DMF代表N,N-二甲基甲醯胺；DMAC代表N,N-二甲基乙醯胺；DMSO代表二甲亞碸；EtOAc代表乙酸乙酯；tol代表甲苯；THF代表四氫呋喃；EtOH代表乙醇；MeOH代表甲醇；NMP代表N-甲基吡咯烷酮；2-METHF代表2-甲基四氫呋喃；i-PrOH代表2-丙醇；Bn代表苯基；Cbz代表苯氧羰基，是一種胺保護基團；Boc代表三級丁基羰基是一種胺保護基團；Fmoc代表笏甲氧羰基，是一種胺保護基團；Alloc代表烯丙氧羰基，是一種胺保護基團；Teoc代表三甲基矽乙氧羰基，是一種胺保護基團；Boc₂O代表二-三級丁基二碳酸酯；HCl(g)代表氯化氫氣體；H₂SO₄代表硫酸；HOAc代表乙酸；TFA代表三氟乙酸；DIPEA代表二異丙基乙基胺；DIEA代表二 異丙基乙基胺；NMM代表N-甲基嗎啡啉；DBU代表1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯；Et₃N代表三乙胺；LDA代表二異丙基胺鋰；NaHMDS代表雙(三甲基矽基)氨基鈉；KHMDS代表雙(三甲基矽基)氨基鉀；LiAlH₄代表四氫鋁鋰；t-BuOK代表三級丁醇鉀；H₂O₂代表過氧化氫；NH₄Cl代表氯化銨；BaSO₄代表硫酸鋇；CaCO₃代表碳酸鈣；SnCl₂代表氯化亞錫；Zn(BH₄)₂代表硼氫化鋅；PPh₃代表三苯基膦；HMDS代表六甲基二矽胺烷；Pd/C代表鈀碳；PtO₂代表二氧化鉑；Pd(OH)₂代表氫氧化鈀；Pd₂(dba)₃代表三(二亞苯基丙酮)二鈀；Pd(PPh₃)₄代表四三苯基膦鈀；Pd(dppf)Cl₂代表1,1'-雙(二苯基磷)二茂鐵氯化鈀；Pd(PPh₃)₂Cl₂代表二氯雙(三苯基膦)鈀(II)；Pd(OAc)₂代表醋酸鈀；PdCl₂代表氯化鈀；CuI代表碘化亞銅；CuBr代表溴化亞銅；CuCl代表氯化亞銅；Cu代表銅粉；Cu₂O代表氧化亞銅；Xantphos代表4,5-雙(二苯基磷)-9,9-二甲基氧雜蒽；Sphos代表2-二環己基亞膦基-2',6'-二甲氧基聯苯；Xphos代表2-二環己基磷-2',4',6'-三異丙基聯苯；Ruphos代表2-雙環己基膦-2',6'-二異丙氧基-,1,1'-聯苯；Brettphos代表2-(二環己基膦基)-3,6-二甲氧基-2'-4'-6'-三異丙基-1,1'-聯苯。

化合物經手工或者ChemDraw®軟件命名，市售化合物采用供應商目錄名稱。

本發明粉末X-射綫衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法：

儀器型號：布魯克D8 advance X-射綫衍射儀。

測試條件：詳細的XRPD參數如下：X-ray發生器：Cu,kα,(λ=1.54056Å)；管電壓：40kV，管電流：40mA；發射狹縫：1deg.； 限高狹縫：10mm；散射狹縫：1deg.；接受狹縫：0.15mm；單色器：固定的單色器；掃描範圍：2-40deg.；以及掃描速度：10deg/min。

本發明差熱分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法：儀器型號：TA Q2000差示掃描量熱儀。

測試條件：取樣品(~1mg)置於DSC鋁鍋內進行測試，方法為：25℃-350℃，升溫速率為10℃/min。

本發明熱重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法：儀器型號：TA Q5000IR熱重分析儀。

測試條件：取樣品(2~5mg)置於TGA鉑金鍋內進行測試，方法為：室溫-350℃，升溫速率為10℃/min。

圖1為A晶型的Cu-Kα輻射的XRPD譜圖；圖2為A晶型的DSC圖譜；圖3為A晶型的TGA圖譜；圖4為B晶型的Cu-Kα輻射的XRPD譜圖；圖5為B晶型的DSC圖譜；圖6為B晶型的TGA圖譜；圖7為C晶型的Cu-Kα輻射的XRPD譜圖； 圖8為C晶型的DSC圖譜；以及圖9為C晶型的TGA圖譜。

為了更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例來做進一步的說明，但具體的實施方式並不是對本發明的內容所做的限制。

實施例1。

化合物1及A晶型的製備。

第一步：將原甲酸三甲酯(55kg，137.11mol)和2,2-二甲基-1,3-二氧六環-4,6-二酮(4kg，27.75mol)加入到30L反應釜中，加熱到100℃。體系回流三小時後加入2-溴代苯胺(3.80kg，22.09莫耳)。整個反應回流15小時，LCMS檢測顯示反應完成。蒸出多餘的溶劑，將所得固體用乙醇(1L) 洗滌，烘乾。得到目標產物5-((2-溴苯胺基)亞甲基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六環-4,6-二酮(48kg，產率89.94%)為黃色固體。

第二步：將5-((2-溴苯胺基)亞甲基)-2,2-二甲基-1,3-二氧六環-4,6-二酮(1kg，3.07mol)溶劑在二苯醚(4升)中，然後加熱到185℃，在這個溫度下攪拌10分鐘。然後將混合物加熱到250℃並繼續攪拌30分鐘。停止加熱，冷却至75℃，TLC顯示反應完成，將混合物過濾，固體用正庚烷(5L)洗滌得到8-溴-4-羥基喹啉(580g，2.59mol，收率84.32%)為黃色固體。

第三步：將8-溴-4-羥基喹啉(2kg，8.93mol)，(4-氰基苯基)硼酸(1.31kg，8.93mol)，Pd(dppf)Cl₂(130.68克，178.60毫莫耳)和碳酸鈉(1.89kg，17.86mol)的混合物中加入四氫呋喃(10L)，DMF(2升)和水(2升)。將混合物加熱到78℃。3小時後，加入4升水然後將混合物過濾。固體用水(2L)洗滌，在50℃真空乾燥箱烘乾三天得到產物4-(4-羥基喹啉-8-基)苯甲腈(1.90kg，收率86.40%)為黃色固體。

第四步：在30L的反應釜裏，加入DMF(10L)和4-(4-羥基喹啉-8-基)苯甲腈(2.2kg，8.93莫耳)，室溫攪拌，然後在5分鐘內緩慢加入NIS(2.01kg，8.93莫耳)。半小時後採樣用LCMS檢測，顯示反應完成。加入20L冰水攪拌後過濾。固體用水洗(5L×3)。產物用50℃是真空乾燥箱烘三天得4-(4-羥基-3-碘-8-喹啉基)苯甲腈(2.55kg，收率76.73%)為黃色固體。

第五步：在30L反應釜中，將4-(4-羥基-3-碘-8-喹啉基)苯甲腈(2.55kg，6.85mol)溶解在DMF(13L)中，於20℃在氮氣保護下滴加三溴化磷(1.85kg,6.85mol)。混合物在20℃下攪拌1小時。LCMS檢測反應完成。用飽和碳酸鈉溶液將體系中和至pH=7~8。減壓過濾後將固體用水(10L)洗滌。得到固體用50℃是真空乾燥箱烘三天得4-(4-溴-3-碘-8-喹啉)苯甲腈(2.95kg，6.78mol)為黃色固體。

第六步：4-(4-溴-3-碘-8-喹啉)苯甲腈(3.5kg，8.04莫耳)，(2S,6R)-2,6-二甲基-4-(5(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼烷-2-基)-2-吡啶基]嗎啉(3.07kg，9.65mol)，在四氫呋喃(30.00L)中加熱到65℃。所有反應物全部溶解後，加入Na2CO3(1.70kg，16.08莫耳)和Pd(dppf)Cl₂(294.14g，402.00mmol，0.05eq)，然後再加入DMF(5L)和水(L 4)的混合物。整個反應在在65℃反應6小時。LCMS檢測反應完全，後冷至室溫。用乙酸乙酯(10L)提取，水相用二氯甲烷DCM(5L×2)提取。有機相用硫酸鈉乾燥後濃縮。粗品用矽膠柱純化(乙酸乙酯：二氯甲烷：正庚烷比例為1：1：1)後得到4-(4-溴-3-(6-((2S,6R)-2,6-二甲基嗎啡啉-4-基)-3-吡啶基)-8-喹啉)苯甲腈(2.68kg，收率66.75%)為黃色固體。

第七步：將4-(4-溴-3-(6-((2S,6R)-2,6-二甲基嗎啡啉-4-基)-3-吡啶基)-8-喹啉)苯甲腈(2.68kg,5.37mol)溶劑在甲苯(25L)中加熱至60℃待溶解完全。將環丙基硼酸(1.84kg，21.47莫耳)，正丁基二(1-金剛烷基)膦(192.41g，536.64mmol)，碳酸銫(3.5kg，10.73mol)和Pd(OAc)₂(60.24g，268.32mmol)加入反應體系後升溫至80℃反應1小時。LCMS檢測反應完全，將體系冷却後加入水(15L)稀釋.用乙酸乙酯(20L*2)提取.有機相用鹽水(5L×2)洗滌，用硫酸鈉乾燥，然後濃縮.粗產物由柱層析(正庚烷：乙酸乙酯=5：1)純化後得到目標產物(2kg，收率80.86%)的白色固體，為A晶型。

B晶型製備。

將1kg A晶型溶於2L乙酸乙酯，加熱溶清後，回流下緩慢加入12L乙醇，加完後保持溶液澄清，攪拌下自然冷却過夜，有大量黃色固體析出，過濾，濾餅用2L 0℃乙醇淋洗，抽乾後得到850g黃色固體，即為B晶型。

C晶型製備。

將游離鹼化合物1(1.19kg，2.58mol，1當量)溶解在丙酮(12L)中，緩慢加入硫酸(3M，1.72升，2eq)持續約30分鐘，然後將混合物在25℃下攪拌1.5小時。將混合物過濾，固體乾燥後在35℃下真空乾燥48小時的目標產物鹽(1.56kg，收率92.07%)為黃色固體，即為C晶型。

A晶型在不同溶劑中的溶解度試驗：稱取約2mg樣品到1.5mL的液相小瓶中，分別用移液槍逐級加入如下溶劑，手動震搖溶解。該測試是在室溫下進行，通過肉眼來判斷溶解情况，溶解度結果見表4。

A晶型在不同溶劑中的穩定性試驗：取50mg的A晶型多份，分別加入下表中的單一或混合溶劑，25℃條件下攪拌。如果化合物全部溶解，自然揮發除去溶劑；若為混懸液，則持續攪拌3天。收集所有樣品中的固體，XRPD檢測其晶型狀態。結果見表5。

C晶型在不同溶劑中的穩定性試驗：取適量的C晶型多份，分別加入0.2mL的下表中的單一或混合溶劑，40℃條件下攪拌過夜。攪拌16小時 後，若樣品為溶液狀態，自然揮發除去溶劑；若樣品仍為混懸液，則離心樣品。收集所有樣品中的固體，XRPD檢測其晶型狀態。結果見表6。

A晶型在高溫，高濕及强光照條件下的固體穩定性試驗：稱取A晶型樣品約10mg，置於玻璃樣品瓶的底部，攤成薄薄一層。60℃及92.5%相對濕度條件下放置的樣品用鋁箔紙封瓶口，並在鋁箔紙上扎些小孔，保證樣品能與環境空氣充分接觸；强光照(5 Klux)條件下放置的樣品用螺紋瓶蓋密封。不同條件下放置的樣品於第10天取樣檢測，檢測結果與第O天的初始檢測結果進行比較，試驗結果見下表7所示。

C晶型在不同溫度和濕度條件下的物理穩定性試驗：取C晶型置於玻璃樣品瓶的底部，攤成薄薄一層，鋁箔紙封瓶口，並在鋁箔紙上扎些小孔，保證樣品能與環境空氣充分接觸。製備的樣品分別置於60℃，92.5%RH(相對濕度)，25℃/60%RH及40℃/75%RH的條件下，考察樣品10天的物理穩定性。在第10天，取出所有樣品，恢復至室溫，觀察樣品外觀變化，並用XRPD檢測樣品晶型。通過與第0天樣品的晶型進行比較，判斷C晶型的固體物理穩定性。表8為C晶型的固體物理穩定性實驗結果。

C晶型在高溫、高濕及强光照條件下的固體穩定性試驗：稱取C晶型樣品約18.75mg，置於玻璃樣品瓶的底部，攤成薄薄一層。60℃及92.5%RH條件下放置的樣品用鋁箔紙封瓶口，並在鋁箔紙上扎些小孔，保證樣品能與環境空氣充分接觸，强光照(5 Klux)條件下放置的樣品用螺紋瓶蓋密封。不同條件下放置的樣品於第5和第10天取樣檢測，檢測結果與第0天的初始檢測結果進行比較，試驗結果見下表9所示。

體外活性評價。

實驗目的：將具有Gli反應元件的螢光素酶(Gli-Luc)報告基因穩定轉染到C3H10T1/2細胞，在Shh-N刺激條件下，通過檢測細胞內報告基因表達情况從而判斷Hedgehog信號通路抑制劑的活性。本實驗以化合物的IC₅₀值為指標，來評價化合物對Hedgehog信號通路的抑制作用。

實驗材料：

細胞系：C3H10T1/2/Gli-Luc穩轉細胞株；C3H10T1/2/Gli-Luc細胞培養基(DMEM/高糖HyClone,#SH30022.01B；10%血清Hyclone,#SV30087；0.4%Hygromycin B Roche,#13398200)；0.25% Trypsin-EDTA(Gibco,#25200)；PBS(KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄ 1.44g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，加水至1L調PH 7.4)；Shh-N，HEK293/SHH-N穩轉細胞培養上清；裂解液(Promega,# E1531)； 反應液(Promega,# E1501)；384孔板，Greiner #781074；96孔培養板，Greiner # 655180；96孔微孔板，碧雲天#FPT019；CO2培養箱，Thermo #3423；潔淨工作臺，AIRTECH #A10051560；倒置顯微鏡，Nikon #TS100；離心機，湘儀#L530；以及TheromVarioSkan Flash多功能讀數儀。

實驗步驟和方法。

取對數生長期C3H10T1/2/Gli-Luc細胞，在96孔板中按照每孔20000個細胞鋪板，將細胞置37℃，5%CO₂的培養箱中培養過夜。次日，將化合物按下列方式進行稀釋：陽性化合物GDC0449(1mM)和待測化合物(1mM)按1：3和1：10分別用DMSO進行連續系列稀釋至7個化合物濃度，第8個為DMSO對照，再用新鮮培養基將其稀釋100倍。取培養過夜的細胞，除去培養基，每孔加入80μL新鮮培養基，然後加入20μL梯度稀釋過的陽性化合物和待測化合物，及100μL含30 nMShh-N的條件培養基，每個濃度做2個複孔，同時設置陽性和陰性參照孔(即Shh Ctrl：80μL新鮮培基+20μL含1%DMSO培基+100μL含30 nMShh-N的條件培養基；Unstimulated Ctrl：180μL新鮮培基+20μL含1%DMSO培基)，細胞置CO₂培養箱繼續培養24小時。

檢測細胞內熒光素酶活性：取出96孔板細胞，棄去培養基，用PBS清洗細胞兩遍，隨後每孔加入20μL裂解液(Promega E1531)，室溫震盪裂解30min。取5μL細胞裂解液轉移至384孔板(Greiner 781074)中，隨後每孔加 25μL熒光素酶反應液(Promega E1501)，經快速混合後立即放進VarioSkan Flash多功能讀數儀中讀取相對光單位(RLU)值。

數據分析：使用GraphPad公司的Prism 5進行數據分析。以對數化的化合物濃度對代表熒光素酶活性的RLU讀數作圖，並用下列方程進行曲線方程擬合得出IC₅₀值，Y(RLU讀數)=最小讀數+(最大讀數-最小讀數)/(1+10^(對數化化合物濃度-LogIC₅₀))。

結論：化合物1對hedgehog通路的抑制作用顯著。

Claims (29)

1. 一種化合物1的A晶型，其中所述化合物1的A晶型的XRPD圖譜在2-Theta為3.855、7.737、9.697、10.161、10.618、12.037、12.785、14.384、14.739、19.490、20.043、20.401、22.745、23.140處有衍射峰，

   
2. 如請求項1所述的化合物1的A晶型，其中所述化合物1的A晶型的XRPD圖譜存在如下表所示的衍射峰

   
3. 如請求項1所述的化合物1的A晶型，其中所述的化合物1的A晶型其XRPD圖譜如圖1所示。
4. 如請求項1-3中任一項所述化合物1的A晶型，其差示掃描量熱曲線在111.41℃±2℃、126.08℃±2℃和146.06℃±2℃處具有吸熱峰的起始點。
5. 如請求項4所述化合物1的A晶型，其DSC圖譜如圖2所示。
6. 如請求項1-3中任一項所述化合物1的A晶型，其熱重分析曲線在135.65±2℃失重0.7658%±0.2%。
7. 如請求項6所述化合物1的A晶型，其TGA圖譜如圖3所示。
8. 一種化合物1的B晶型，其中所述化合物1的B晶型的XRPD圖譜在2-Theta為5.853、9.307、10.547、11.415、11.671、12.459、13.899、14.275、15.120、15.556、17.053、18.652、19.085、20.068、20.602、21.156、21.747、22.318、22.934、23.425、23.956、24.313、25.040、25.832、27.470、28.120、28.714、29.364、29.777、30.462、31.099、32.717、33.638、37.325、38.863處有衍射峰；

   
9. 如請求項8所述的化合物1的B晶型，其中所述化合物1的B晶型的XRPD圖譜存在如下表所示的衍射峰：

   

   
10. 如請求項8所述的化合物1的B晶型，其中所述化合物1的B晶型其XRPD圖譜如圖4所示。
11. 如請求項8-10中任一項所述化合物1的B晶型，其差示掃描量熱曲線在165.73℃±2℃處具有吸熱峰的起始點。
12. 如請求項11所述化合物1的B晶型，其DSC圖譜如圖5所示。
13. 如請求項8-10中任一項所述化合物1的B晶型，其熱重分析曲線在120.00±2℃失重達0.2383%±0.2%，在247.60±2℃失重達0.2005%±0.2%。
14. 如請求項8-10中任一項所述化合物1的B晶型，其TGA圖譜如圖6所示。
15. 一種如請求項8-10中任一項所述B晶型的製備方法，其包括將化合物1的A晶型加入到酯類溶劑、醇類溶劑或酯類溶劑和醇類溶劑的混合溶劑中，加熱至回流溶解，然後緩慢降溫結晶製得。
16. 如請求項15所述製備方法，其中所述酯類溶劑選自甲酸丙酯、甲酸異丙酯、甲酸丁酯、甲酸異丁酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸異丙酯；醇類溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇。
17. 如請求項15所述製備方法，其中，酯類溶劑和醇類溶劑的混合溶劑中，酯類溶劑和醇類溶劑的體積比為0.1：1~12。
18. 如請求項17所述製備方法，其中，酯類溶劑和醇類溶劑的混合溶劑中，酯類溶劑和醇類溶劑的體積比為1：2~8。
19. 一種下式所示化合物2，

    
20. 一種化合物2的C晶型，其中所述化合物2的C晶型的XRPD圖譜在2-Theta為5.775、6.012、9.838、10.292、10.784、11.336、11.872、12.366、14.413、14.849、16.286、16.860、17.824、18.733、19.345、19.661、20.056、20.391、20.804、21.301、21.950、22.638、23.429、23.781、24.591、25.776、26.639、27.473、27.926、28.689、29.721、30.271處有衍射峰；

    
21. 如請求項20所述的化合物2的C晶型，其中所述化合物2的C晶型的XRPD圖譜存在如下表所示的衍射峰：

    

    
22. 如請求項20所述的化合物2的C晶型，其中所述化合物2的C晶型其XRPD圖譜如圖7所示。
23. 如請求項20-22中任一項所述化合物2的C晶型，其差示掃描量熱曲線在57.33℃±5℃和212.56℃±5℃處具有吸熱峰的起始點。
24. 如請求項23所述化合物2的C晶型，其DSC圖譜如圖8所示。
25. 如請求項20-22中任一項所述化合物2的C晶型，其熱重分析曲線在120.00±3℃失重達5.110%±0.5%。
26. 如請求項25所述化合物2的C晶型，其TGA圖譜如圖9所示。
27. 一種如請求項20-22中任一項所述C晶型的製備方法，其包括將化合物1溶解到有機溶劑中，緩慢滴加硫酸水溶液，攪拌析晶製得。
28. 如請求項27所述製備方法，其中有機溶劑選自丙酮，甲乙酮，環己酮；化合物1與硫酸的莫耳比選自1：2~4。
29. 一種如請求項1所述A晶型，請求項8所述B晶型，請求項19所述化合物2及請求項20所述C晶型在製備治療與SMO受體相關疾病藥物上的應用。

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