TWI690321B - 用於治療心肌肥厚之醫藥組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種用於治療心肌肥大之醫藥組合物，其係包含有幹細胞及藥學上可接受之載劑；其中該幹細胞係以正丁烯苯酞進行預處理反應而得。本發明的醫藥組合物可經由遠端肌肉注射至高血壓患者的體內，即可降低心肌中的超氧化物含量、提升STAT3活性、及提升促進炎症消退之巨噬細胞M2的含量，進而有效治療由高血壓所引發的心肌肥厚症狀。

Description

用於治療心肌肥厚之醫藥組合物
本發明係關於一種醫藥組合物，特別是關於一種用於治療心肌肥厚之醫藥組合物。
左心室肥厚(Left ventricular hypertrophy,LVH)是高血壓作用於心臟最容易出現的標誌性損害。原發性高血壓繼發的左心室肥厚在病理學上是因為心肌細胞受到刺激生長也使纖維細胞活化而導致間質纖維化。臨床上，心臟肥大可能會進一步提升發生包括中風、慢性腎功能衰竭、心室功能障礙、及猝死等機率。
自發性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rat,SHR)是人類原發性高血壓最廣泛使用的動物模型；經研究證實，包括超氧陰離子(superoxide anion)在內的活性氧物質(Reactive oxygen species,ROS)已被證明在介導SHR前肥厚階段的心室肥大中發揮早期作用，而線粒體功能障礙則是ROS產生的重要原因，是高血壓的常見變化。與年齡匹配的正常血壓大鼠相比，SHR 40天齡時的收縮壓顯示出顯著增加，並且通過形態學和心室肥大的分子標誌物在2個月時進行評估可確知左心室肥厚的症狀顯著。有鑑於左心室肥厚是心血管疾病發病率和死亡率的有力預測指標，因此左心室肥厚的症狀改善通常被認為是抗高血壓治療的目標。
目前，在臨床上對於心室肥大及纖維化最主要的治療方法包括使用β受體阻滯劑和血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)。
β受體阻滯劑能夠拮抗交感神經活性、減慢心率、以及降低心肌耗氧量，高血壓患者若長期服用可以顯著改善心臟射血分數，逆轉心室肥厚。然而，若長期使用β受體阻滯劑後突然停藥常使原來的症狀加重，導致血壓升高、快速型心律失常、心絞痛加劇甚至心肌梗塞；另外，對正在使用胰島素治療的糖尿病患者，使用β受體阻滯劑會延緩胰島素引起低血糖反應後的血糖恢復速度，即產生低血糖反應，故糖尿病患者或低血糖患者應慎用此類藥品。
ACEI類藥物主要是抑制血管張力素轉化酶(ACE)的活性，減少血管緊張素(Ang-II)的生成，減少緩激肽(Bradykinin)的水解，導致血管舒張、血容量減少、血壓下降，並且已被明確證實能減輕左心室肥厚的作用。但是，隨著緩激肽濃度增加，患者可能會發生嚴重的刺激性乾咳而導致不適；另外，服用ACEI還可能發生味覺異常、粒細胞減少、皮疹、發熱、及血管性水腫等副作用。
所以，亟待開發出一種能夠解決現心肌肥厚治療技術之缺陷、且又能夠充分發揮優異的醫療效果之組合物，特別是一種具有不同作用機制組合的心肌肥厚治療劑。
有鑑於此，本發明人等經由潛心研究用於解決傳統技術問題點的各種可能方案，進而開發出一種不但能夠改善上述習用技術之問題點，而且針對現有技術的不足，提供一種用於治療心肌肥厚之醫藥組合物。本發明的醫藥組合物係利用經由正丁烯苯酞預處理的幹細胞，並從遠端肌肉注射(四肢或臀部)即可有效降低心肌中的超氧化物含量、提升STAT3活性、及提升促進炎症消退之巨噬細胞M2的含量，進而逆轉心肌肥大，至此乃完成本發明。
換言之，本發明可以一種用於治療心肌肥厚之醫藥組合物，其係包含有幹細胞及藥學上可接受之載劑；其中該幹細胞係以正丁烯苯酞進行預處理反應而得。
根據本發明之一實施例，在該預處理反應中，該正丁烯苯酞的濃度為在7μg/mL至40μg/mL之範圍。
根據本發明之一實施例，該預處理反應的條件包含將幹細胞與該正丁烯苯酞在20~40℃之溫度範圍進行反應，並且另外，反應時間為在6小時~24小時之範圍。
根據本發明之一實施例，該幹細胞為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、脂肪幹細胞、及骨髓幹細胞中之至少一種。
另外，本發明還可以提供一種幹細胞用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其係施予一有效量之幹細胞至所需個體；其中該幹細胞係以正丁烯苯酞進行預處理反應而得。
根據本發明之一實施例，該有效量為在1×106~1×108個幹細胞之範圍；較佳為在1×106~1×107個幹細胞之範圍。
根據本發明之一實施例，該心肌肥厚是由自發性高血壓所引起。
根據本發明之一實施例，該幹細胞是經由遠端肌肉注射給予。
根據本發明之一實施例，該所需個體為人類、或哺乳類動物。
圖1A至圖1F為顯示實施例1中之急性期分析的結果；其中圖1A為各組大鼠之右側腿肌超氧化物含量比較圖、圖1B為各組大鼠之右側腿肌的 DHE染色的螢光量比較圖、圖1C為各組大鼠之心肌超氧化物含量比較圖、圖1D為各組大鼠之心肌DHE染色的螢光量比較圖、圖1E為各組大鼠之右側腿肌以抗人粒線體抗體進行免疫組織化學染色後的ADSCs數量比較圖、及圖1F為以RT-PCR分析各組大鼠之心肌中之Alu基因表達比較圖。圖中*表示相較於對照組(WKY)p<0.05；圖中†表示相較於以載體進行治療的載體組(veh)p<0.5；圖中‡表示相較於ADSC組(ADSC)‡P<0.05。(每組N=5)
圖2A至圖2B為顯示實施例1中在慢性期時遠程移植人類ADSC對心臟ROS和STAT3活化之影響的分析結果。其中圖2A為各組大鼠之心肌超氧化物含量比較圖、及圖2B為各組大鼠之心肌DHE染色的螢光量比較圖。圖中*表示相較於對照組(WKY)p<0.05；圖中†表示相較於以載體進行治療的載體組(veh)p<0.5；圖中‡表示相較於ADSC組(ADSC)‡P<0.05。(每組N=10)
圖3A至圖3C為顯示實施例1中在慢性期時STAT3的分析結果。其中圖3A為以西方墨點法分析p-STAT3(phospho-STAT3)含量的比較圖、圖3B為以ELISA分析STAT3之DNA結合活性的比較圖、及圖3C為以anti-p(tyr 705)-STAT3抗體進行免疫組織化學染色後分析STAT3核轉位程度的量化圖。圖中*表示相較於對照組(WKY)p<0.05；圖中†表示相較於以載體進行治療的載體組(veh)p<0.5；圖中‡表示相較於ADSC組(ADSC)‡P<0.05。(每組N=10)
圖4A及圖4B為顯示實施例1中在慢性期時遠程移植人類ADSC對心臟巨噬細胞的表型偏向M2型之影響的分析結果。其中圖4A為顯示載體組(Veh)與ADSC組(ADSC)以免疫組織化學染色分析巨噬細胞M1表達的量化比較圖、及圖4B為顯示載體組(Veh)與ADSC組(ADSC)以免疫組織化學 染色分析巨噬細胞M1表達的量化比較圖。圖中*表示相較於對照組(WKY)p<0.001。(每組N=5)
圖5A至圖5E為顯示實施例1中在慢性期時遠程移植人類ADSC對心臟巨噬細胞的表型偏向M2型之影響的分析結果。其中圖5A為各組大鼠心肌中之IL-6表達水平比較圖、圖5B為各組大鼠心肌中之IL-1β表達水平比較圖、圖5C為各組大鼠心肌中之iNOS表達水平比較圖、圖5D為各組大鼠心肌中之CD206表達水平比較圖、及圖5C為各組大鼠心肌中之IL-10表達水平比較圖。圖中*表示相較於對照組(WKY)p<0.05；圖中†表示相較於以載體進行治療的載體組(veh)p<0.5；圖中‡表示相較於ADSC組(ADSC)‡P<0.05。(每組N=10)
圖6A至圖6D為顯示實施例1中在慢性期時遠程移植人類ADSC對心肌肥厚和纖維化之影響的分析結果。其中圖6A為各組大心肌細胞截面積比較圖、圖6B為各組大鼠心肌中之BNP基因表達水平比較圖、圖6C為天狼星紅(Sirius red)染色後的纖維化面積定量比較圖、及圖6D為羥脯氨酸量含量分析之結果比較圖。圖中*表示相較於對照組(WKY)p<0.05；圖中†表示相較於以載體進行治療的載體組(veh)p<0.5；圖中‡表示相較於ADSC組(ADSC)‡P<0.05。(每組N=5)
圖7A至圖7C為顯示實施例2進行體外實驗的分析結果。其中圖7A為各組心肌超氧化物的含量比較圖、圖7B為各組STAT3的活性比較圖、及圖7C為各組IL-10表達水平比較圖。圖中*表示相較於ADSC組p<0.05；圖中†表示相較於BP/ADSC組p<0.5；圖中‡表示相較於BP/ADSC/SIN組‡P<0.05。(每組N=5)
以下，針對本發明的實施態樣列舉不同的具體實施例而更加詳盡地敘述與說明，以便使本發明的精神與內容更為完備而易於瞭解；然而，本項技藝中具有通常知識者應當明瞭本發明當然不受限於此等實例而已，亦可利用其他相同或均等的功能與步驟順序來達成本發明。
首先，對於本說明書中所使用的特定用語或名詞進行描述性的說明。
除非本說明書另有定義以外，在本文中所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在本文中，「治療(treatment或treating)」之用語係指對於具有某種醫療狀況、症狀、疾病、病症或其先期狀況的個體或患者，實施可達成藥學和/或生理效果的預防性、治癒性或緩和性之處置，藉以部分或完全減輕嚴重性、延遲發生進程、及/或抑制該醫療狀況之一或多個病徵、異常及/或疾病出現機率之行為。前述病徵、疾病、異常和/或醫療狀況可以是坐骨神經損傷。
在本文中，「有效量(an effective amount)」之用語係指對於患者直接或間施用(administered、administering、或administration)之醫學藥物，在經過適當的給藥期間後，能夠達到減緩心室肥大之效果、或者治療心室肥大之目的所施用之特定用量。
在本文中，前述之「醫學藥物」係指能透過局部和/或全身性作用而誘發所期待的藥學和/或生理反應之具有藥學上活性之物質，通常包括醫藥化合物(compound)、調配物(formulation)、組合物(composition)、藥劑(agent)、醫藥品(medicine or medicament)、或者藥學活性化合物的前驅藥(prodrug)、衍生物(derivative)、或類似物(analog)等。
在本文中，「個體(subject)」或「患者(patient)」可彼此交替使用。該「個體」或「患者」分別指可接受所述化合物和/或方法治療的動物，包括但不限於例如包含狗、貓、馬、羊、豬、牛等之任何的哺乳類動物，以及人類、非人類的靈長類。除非另有具體說明以外，該「個體」或「患者」可包括雄性與雌性兩種性別。又，適合接受本發明之醫藥組合物和/或方法治療之個體或患者，較佳者為人類。
在本文中，對於用以界定本發明範圍的數值與參數，本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差，因而大多是以約略的數量值來表示，然而於具體實施例中則盡可能精確呈現的相關數值。在本文中，「約」通常視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定，一般係指代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，例如，該實際數值為在一特定數值或範圍的±10%、±5%、±1%、或±0.5%以內。
本發明之揭示內容可以提供一種用於治療心肌肥厚之醫藥組合物，其係包含有幹細胞及藥學上可接受之載劑；其中該幹細胞係以正丁烯苯酞進行預處理反應而得。根據本發明的技術思想，在預處理反應中，正丁烯苯酞(μg)的濃度一般為在7μg/mL至40μg/mL之範圍；較佳為在7μg/mL至35μg/mL之範圍；更佳為在7μg/mL至30μg/mL之範圍；最佳為在7μg/mL至25μg/mL之範圍。該預處理反應的條件包含將幹細胞與該正丁烯苯酞在20~40℃之溫度範圍進行反應；較佳為在25~40℃之溫度範圍；更佳為在30~40℃之溫度範圍；最佳為在35~40℃之溫度範圍。另外，反應時間為在6小時~24小時之範圍；較佳為在7小時~24小時之範圍；更佳為在8小時~24小時之範圍；最佳為在10小時~24小時之範圍。
又，根據本發明的技術思想，該幹細胞為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、表皮幹細胞、肌肉幹細胞、脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、眼角膜幹細胞、肝臟幹細胞、及腸上皮幹細胞所選出中至少一種； 較佳為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、脂肪幹細胞、骨髓幹細胞、肝臟幹細胞、及腸上皮幹細胞所選出中至少一種；更佳為臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、脂肪幹細胞、及骨髓幹細胞所選出中至少一種；最佳為臍帶血幹細胞、脂肪幹細胞、及骨髓幹細胞所選出中至少一種。
以下，藉由實施例來說明本發明之特定實施態樣，但本發明之內容範疇並不受限於此等實施例而已。
又，本發明之實施例中所進行的細胞培養實驗及動物實驗是根據中國醫藥大學的實驗動物管理及使用指南進行(許可號：2018-043)，並經美國國家衛生研究院的實驗動物管理及使用指南(NIH Pbulication No.85-23，1996年修訂)確認。
《人類ADSCs之分離》
本發明之實施例中所使用的人類脂肪幹細胞(ADSCs)是購自市售試劑盒(Stempro human ADSC kit；Invitrogen，Carlsbad，CA，U.S.A)並由國璽幹細胞公司提供。該ADSCs是放置於含有10% FBS(Serana)、及1%青黴素/鏈黴素(Hyclone)低葡萄糖DMEM培養基(Invitrogen)中進行培養，並使用TrypLE Express(Invitrogen)進行繼代培養。將經繼代培養所得之細胞視為第一代，而在本實施中所使用的是第3-5代的ADSCs。這些ADSCs是相同的，且不含有內皮細胞或造血譜系(hematopoietic lineages)。又，該些培養的ADSCs具有間葉幹細胞表型：表現間葉幹細胞標誌CD90(>95%)，且不會表現造血標誌CD31及CD45(<2%)。
《BP預處理》
將購自Alfa Aesar的正丁烯基苯酞(n-butylidenephthalide, BP)溶於二甲基亞碸中，配置成濃度為7μg/ml的BP溶液。然後將1×106至1×107個ADSCs投入該BP溶液中16個小時，獲得經BP預處理的ADSCs。
在進行細胞移植前，先以PBS清洗細胞三次，藉以去除直接的藥物作用。
《實施例1》
將12週齡大且具有心臟肥大症狀的雄性原發性高血壓鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)隨機分成載體組、ADSC組、及BP/ADSC組共三組，其中載體組為注射30μl之PBS至SHR的右側腿肌、ADSC組為注射1×106個ADSCs(混合於30μl之PBS中)至SHR的右側腿肌、BP/ADSC組為注射1×106個經BP預處理的ADSCs(混合於30μl之PBS中)至SHR的右側腿肌。另外，選用相同週齡且血壓正常的雄性Wistar-Kyoto(WKY)大鼠作為對照組。
結果分析分成急性期及慢性期兩部分，急性期為在移植樣品後3天犧牲大鼠並取出其右側腿肌(即注射區)和心臟進行分析，慢性期則是在移植樣品56天後犧牲大鼠並取出其心臟進行分析。
接著，以下說明本實施例中之各項試驗的標準操作方法。
血液動力學測試
在飼養8週後，在早晨且溫度環境為22℃的暗室中使用尾袖系統(tailcuff system)(BP-98A,Softron Beijing,Bejing,China)量測清醒大鼠的動脈血壓，並將結果記錄於表3。
然後，使用Zoletil(50mg/kg)進行腹腔注射，將大鼠輕度麻醉並使用配備有14-MHz探針的GE Healthcare Vivid 7 Ultra-sound System(Milwaukee，WI)進行超聲波心動圖檢測，並從胸骨旁長軸切面視 圖(parasternal long-axis view)獲得左心室(LV)的M型超聲波心動圖，藉以獲得室間隔尺寸、左心室舒張末期直徑(LVEDD)、左心室收縮末期直徑(LVESD)、左心室後壁(left ventricular posterior wall)尺寸，並換算出左心室短縮分率(Fractional Shortening)。
然後，將大鼠犧牲並取出心臟，將心房及右心室剪除，並將左心室肌肉在冷生理食鹽水中沖洗後稱重，立即冷凍於液態氮中備用。
STAT3的西方墨點法分析
由前述保存於液態氮中的左心室游離壁(free wall)中取樣，使用針對p-STAT3(Tyr705)(Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)，總STAT3(Santa Cruz Biotechnology)和β-肌動蛋白(β-actin)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的抗體。將樣品均勻化，以BCA蛋白質分析試劑套組(Pierce,Rockford,Illinois)測定蛋白質濃度，取樣品20μg蛋白質通過8% SDS-PAGE進行分離，再轉漬到硝酸纖維膜上，再與上述抗體孵育後，使用5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate and nitroblue tetrazolium chloride(Sigma)偵測抗原抗體複合物，並使用密度掃描器偵測線性範圍內的曝光程度。實驗重複三次，以平均值表示結果。
人類Alu、IL-6、IL-1β、iNOS、CD206、IL-10、及BNP的即時RT-PCR分析
在本實施例中，使用TaqMan系統(Prism 7700 Sequence Detection System,PE Biosystems)對由左心室肌肉獲得的樣本進行RT-PCR試驗，分析樣本中之M1巨噬細胞(IL-6、IL-1β、iNOS)及M2巨噬細胞中之標記基因(CD206、IL-10)的表達。另外，由於心臟肥大的分子特徵是包含成人心臟中的B型排鈉利尿胜胜(B-type Natriuretic Peptide,BNP)之先天性心臟病基因的再激活，因此為了確認心臟肥大的基因表達，同時亦進行了BNP的RT-PCR分析。
在進行RT-PCT時，使用如下表1所示的引子序列在TaqMan系統中進行45次循環(95℃(10秒)→60℃(5秒)→75℃(10秒))的擴增。然後，繪製閥值循環相對於目標模板之對數的標準曲線，並以管家基因(housekeeping gene)cyclophilin的表達為基準，換算出各基因的表達水平。
Figure 108115906-A0305-02-0012-1
人類粒線體、Nitrotyrosine、CD68、iNOS、及IL-10的免疫組織化學染色分析、及超氧化物偵測
利用注射第三天後取得的大腿後肌及心肌樣品來確認ADSCs是否已成功植入組織中。然後，使用2-甲基丁烷(2-methylbutane)冷凍組織樣本，接著在最佳切割溫度化合物(Tissue-Tek,Torrance)中進行包埋，並利用切片機獲得5μm的切片。以PBTx(含0.1% Triton X-100的PBS)清洗切片，以含有1% BSA(Amresco)及1.5%正常山羊 血清(Vector laboratories)之PBTx在37℃下阻抗1小時。接著，將切片與初級抗體，抗-人類粒線體(1：100,Chemicon International)和抗-sarcomeric α-actinin抗體(1：100,Abcam,Cambridge,UK)於4℃下反應隔夜。
又，為了評估心肌細胞內是否產生超氧化物，使用將OCT-包埋之組織與DHE反應，使用原位(In situ)二氫乙錠(DHE；Invitrogen Molecular Probes，Eugene，OR，USA)螢光評估心肌細胞內超氧化物的生成，使用石蠟包埋組織(5μm)浸泡在含DHE的PBS(10mM)中，並保持在加濕容器、室溫、黑暗中孵育30分鐘，透過影像偵測紅色螢光信號可證明組織產生超氧自由基，並且以隨機圖像每平方毫米單位之密度輸出報告。為了最大限度地減少非特異性DHE氧化產物的干擾，在480nm至405nm的波長範圍進行激發並偵測紅色螢光。
在樣品植入第56天後，為了確認巨噬細胞極化的移位，將各組大鼠的左心室肌肉以免疫組織化學染色進行巨噬細胞M1及M2的分析。
將組織放入冷凍包埋劑(OCT)，放入冷凍降溫保持組織型態，在進行冷凍切片後，與針對CD68之抗體(所有巨噬細胞的標記物；Abcam，Cambridge，MA)，iNOS(M1之標記物；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA)和IL-10(M2c之標記物；R& D systems,Abingdon,UK)一起進行反應，並以同型相同直接共軛的抗體作為陰性對照組。以電腦化平面法(Image Pro Plus,Media Cybernetics,Silver Spring,Maryland)計算軌跡上的目標密度。在400x放大倍率下，隨機選擇10個領域來定性評估目標密度，且以標記面積與總面積的比值表示。
心肌細胞尺寸及心肌纖維化的型態分析
由於心臟肥大是反應性纖維化和心肌細胞肥大之結合，為了 避免僅測量心肌重量而可能發生其他非心肌細胞對於心臟肥大分析的干擾，因此在本實施例中量測心肌細胞的尺寸大小。
在樣品植入第56天後，將大鼠的左心室肌肉切片以10%福馬林固定並包埋在石蠟中，每個切片使用蘇木精(hematoxylin)、及曙紅(eosin)染色。切片的取樣位置是在左心室肌肉的中間部分，藉以排除左心室肌肉中不同區域的心肌細胞大小之差異。然後，為了保持分析結果的一致性，在觀察的過程中選擇垂直於切片平面、且具有清楚可見之細胞核及細胞膜、細胞輪廓清晰未破損的心肌細胞，進行心肌細胞橫截面面積的量測。
量測方法是使用電腦化平面法(Image Pro Plus,Media Cybernetics,Silver Spring,Maryland)：在400x放大倍率下，由不知道實驗處理過程的操作者從圖像分析系統中的數位影像選擇100個心肌細胞來進行分析。
另外，心臟纖維化的型態分析則是使用苯胺藍和膠原蛋白特異性染色劑天狼星紅(Sirius Red F3BA；Pfaltz & Bauer,Stamford,CT)對左心室冠狀部位的石蠟包埋切片(厚度5μm)進行染色。通過用自動圖像分析儀(Image Pro Plus,CA)對經由天狼星紅染色的切片進行定量形態測定來確定間質膠原蛋白部份。這些數值由至少2個研究者以單盲法方式進行評估。在400x放大倍率下，隨機選擇10個領域來定性評估標記區域的密度。此數值以標記面積與總面積的比值表示。
實驗室測量
利用Stegemann和Stalder改良的羥脯氨酸分析來確認組織膠原蛋白結果。將取自左心肌游離壁的樣品取出後立即置於液態氮中並保存於-80℃，直到要測量羥脯氨酸含量。以每組織重的羥基脯氨酸含量計算出結果
為了評估STAT3的DNA結合活性，製備心肌勻漿並使用市售套組TransAM STAT3 Transcription Factor Assay Kit(Active Motif)及其分析方法進行ELISA分析。
針對M2c巨噬細胞測定心肌中之IL-10的活性。將取自左心室游離壁的心肌組織在萃取緩衝液(50mM磷酸鉀緩衝液，pH 7.0；1mM EDTA；1mM乙二醇四乙酸；0.2mM苯甲烷磺酰氟；1μg/mL胃蛋白酶抑製劑；0.5μg/mL亮抑酶肽；10mM NaF；2mM Na3 VO4；和10mMβ-巰基乙醇)中均質化，並在4℃的溫度條件下以轉速14,000g離心30分鐘。然後，使用市售ELISA試劑盒(R & D Systems)測量心肌中膜結合的IL-10之分率。
使用光澤精(5μM bis-N-methylacridinium nitrate,Sigma,St.Louis,MO)增強之化學發光偵測來自心肌超氧化物的產生，如上所述。在減去背景活性後計算特異性化學發光信號，並以每毫克重每分鐘(cpm/mg)表示。
統計分析
分析結果以平均值±SD表示。使用SPSS統計分析套裝軟體(SPSS,version 19.0,Chicago,Illinois)進行統計分析。以ANOVA測試各組大鼠之間的差異。在顯著效應的情況下，將各組間的測量與Bonferroni's校正進行比較。P值<0.05代表統計具有意義。
接著，以下說明各項分析的測試結果。
人類ADSCs的特性
經由流式細胞術(Flow cytometry)分析後得知ADSCs對於CD73、CD90、及CD105呈現高度陽性，對於CD14、CD19、CD34、CD45、及HLA-DR則不表達。是以，在本發明中之實施例所培養的人類ADSCs的表型為CD73pos/CD90pos/CD105 pos/CD14neg/CD19neg/ CD34neg/CD45neg/HLA-DRneg。
這些ADSCs為相同的，且不含有內皮細胞或造血譜系，並且在移植前將ADSC以BP進行預處理16的小時不會導致細胞標記物的顯著變化。
急性期(3天)分析結果
急性期分析樣本取自使用移植樣品3天後各組大鼠的右側腿肌(移植區)與左心室肌肉。
ADSC移植對於在右側腿肌及心肌中之超氧化物的影響
將各組大鼠的右側腿肌與左心室肌肉樣本經由光澤精增強化學發光並偵測來自超氧化物的特異性化學發光信號，所得結果記錄於表2，並分別繪製成圖1A及圖1C。
另外，將各組大鼠的右側腿肌與左心室肌肉樣本分別進行DHE螢光染色，並以螢光顯微鏡拍照並分析樣本的紅色螢光量，所得結果記錄於表2，並分別繪製成圖1B及圖1D。
又，為了量化人類ADSCs植入大鼠體內的存活率，使用抗人粒線體抗體(anti-human mitochondria antibody)對各組大鼠的右側腿肌樣本進行染色，分析出樣本中的粒線體陽性細胞的比例後記錄於表2並繪製成圖1E。
由於移植樣品3天後，各組大鼠的左心室肌肉樣本無法經由抗人粒線體抗體染色偵測到幹細胞的存在，為避免體內免疫組織化學對於檢測少量細胞可能不夠靈敏之問題，因此利用PT-PCR分析心室肌肉樣本中Alu基因的表達(使用的引子序列如表3所示)，分析結果記錄如表2所示並繪製成圖1F。
Figure 108115906-A0305-02-0016-2
Figure 108115906-A0305-02-0017-3
由圖1A所示之右側腿肌樣本的特異性化學發光信號結果可知，載體組的超氧化物的含量明顯高於對照組的超氧化物含量(P<0.01)；而相較於載體組，ADSC組與BP/ADSC組的超氧化物含量皆顯著降低，其中又以BP/ADSC組的降低幅度最大。另外，由圖1B所示的DHE螢光染色分析結果圖亦可觀察到相應的結果。
同樣地，由圖1C所示之左心室肌肉樣本的特異性化學發光信號結果可知，載體組的超氧化物的含量明顯高於對照組的超氧化物含量(P<0.01)；而相較於載體組，ADSC組與BP/ADSC組的超氧化物含量皆顯著降低，其中又以BP/ADSC組的降低幅度最大。另外，由圖1D所示的DHE螢光染色分析結果圖亦可觀察到相應的結果。
具體而言，就右側腿肌中之超氧化物的降低效果而論，相較於載體組而言，ADSC組約降低21.68%，BP/ADSC組約降低45.45%，顯示BP/ADSC具有可高達ADSC的2.1倍左右的降低功效。其次，就左心室心肌中之超氧化物的降低效果而論，相較於載體組而言，ADSC組約降低17.28%，BP/ADSC組約降低23.05%，顯示BP/ADSC具有可高達ADSC的1.33倍以上的降低功效。從而，由上述結果可以知道：將ADSC或BP/ADSC植入體內均能夠有效降低因高血壓而提升的超氧化物含量，然而 BP/ADSC的降低效果遠高於ADSC的降低效果，而且，在施用投與方面，BP/ADSC因為不需要從心臟植入，只要從遠端(如右側腿肌)中植入即可，所以具有能夠減少患者風險的優異效果。
由圖1E所示之抗人粒線體抗體染色分析結果可知，從植入樣品的區域(右側腿肌)中觀察，ADSC組的粒腺體陽性細胞(mitochondria-positive cell)比例為7.6±1.3%，而BP/ADSC組的粒線體陽性細胞(mitochondria-positive cell)比例則提升至15.4±5.6%，具有顯著的提升(P<0.05)，顯示經BP將ADSC預處理後再植入可有效提升肌肉中之ADSCs的存活率。
另外，由圖1F所示的左心室肌肉樣本中之Alu基因表現量之結果可知，在對照組及載體組、ADSC組與BP/ADSC組的各左心室肌肉樣本中，Alu基因表現量幾近相等而沒有顯著差異，顯示從遠程移植(例如右側腿肌)的ADSC並沒有從注射部位顯著遷移到心臟中。
慢性期(56天)分析
慢性期分析樣本取自使用移植樣品56天後各組大鼠的左心室肌肉。各組的血液動力學鑑測資料如表3所示。
Figure 108115906-A0305-02-0018-4
在進行細胞移植前，SHR組具有相似的體重基準，而從表3 所示之結果可知，載體組、ADSC組、及BP/ADSC組的體重在細胞移植56天後相近，顯示受測者的體重不會因為細胞移植而發生顯著變化。
另外，就左心室的重量相對於脛骨長度的比值而論，載體組較對照組增加了69%，顯示載體組具有心臟肥大之症狀；相較於載體組而言，ADSC組與BP/ADSC組分別降低了11.6%及16.7%，顯示ADSC與BP/ADSC能夠有效降低因高血壓而造成的心臟肥大，而且BP/ADSC具有可高達ADSC之1.44倍的降低效果。
又，再比較其他血液動力學參數如血壓、及心跳之統計資料，發現載體組、ADSC組、與BP/ADSC組之間皆無顯著差異，顯示ADSC對於心臟肥大的治療是經由非血行動力(nonhemodynamic)作用。此外，各組大鼠在注射的部位周圍皆沒有局部感染或發炎症狀。
遠程移植人類ADSC對心臟ROS和STAT3活化的影響
將各組大鼠左心室肌肉樣本經由光澤精增強化學發光並偵測來自超氧化物的特異性化學發光信號，所得結果記錄於表4，並繪製成圖2A。
另外，將各組大鼠的右側腿肌與左心室肌肉樣本分別進行DHE螢光染色，並以螢光顯微鏡拍照並分析樣本的紅色螢光量，所得結果記錄於表4，並繪製成圖2B。
Figure 108115906-A0305-02-0019-5
由圖2A所示之左心室肌肉樣本的特異性化學發光信號結果可知，相較於載體組，ADSC組與BP/ADSC組的超氧化物含量皆顯著降 低(P<0.001)，其中BP/ADSC組的超氧化物含量更較ADSC組顯著降低幅度最大。具體而言，在慢性期分析中，就左心室肌肉之超氧化物的降低效果而論，相較於載體組而言，ADSC組約降低24.42%，BP/ADSC組約降低35.94%，顯示BP/ADSC具有可高達ADSC的1.5倍左右的降低功效。另外，由圖2B所示的DHE螢光染色分析結果圖可知，載體組的螢光強度比顯高於對照組；而相較於載體組，ADSC組與BP/ADSC組的螢光強度皆顯著降低，其中BP/ADSC組的螢光強度更較ADSC組顯著降低幅度最大，此結果與特異性化學發光信號結果相應。
另外，西方墨點法分析的結果如下表5及圖3A所示。由圖3A之結果，可知載體組中之p-STAT3(phospho-STAT3)相對於總STAT3的比例(p-STAT3/total STAT3)較對照組顯著降低(P<0.05)；ADSC組能夠將p-STAT3的比例提升至156±21%(P<0.01)，顯示使用ADSC能夠有效促進活化。另外，就對於p-STAT3活化的效果而論，BP/ADSC組(2.45±0.14%)具有可高達ADSC組(2.19±0.19%)之約1.12倍。
又，ELISA方法偵測STAT3之DNA結合活性(DNA-binding activity of STAT3)的結果如下表5及圖3B所示。由圖3B之結果可知，ADSC組(1.45±0.19)較載體組(1.05±0.12)提升約1.38倍，BP/ADSC組(1.76±0.14)較載體組(1.05±0.12)提升約1.68倍，顯示BP/ADSC組的STAT3之DNA結合活性明顯較ADSC組更高，約為ADSC組的1.22倍，此結果與以西方墨點法分析所得的結果相應。
另外，為了評估各組大鼠中的左心室肌肉中STAT3的活化程度，使用anti-p(tyr 705)-STAT3抗體進行免疫組織化學染色，並從螢光顯微鏡圖中分析STAT3核轉位程度，所得之量化數據(記錄於表5並繪製成圖3C。
由圖3C之結果可知，BP/ADSC組的STAT3核轉位程度顯 著高於載體組及ADSC組，此分析結果與前述西方墨點法分析及ELISA方法分析之結果相應。
Figure 108115906-A0305-02-0021-6
遠程移植人類ADSC對心臟巨噬細胞的表型偏向M2型的影響
為了探討人類ADSCs與宿主巨噬細胞在心肌中的相互作用，利用免疫組織化學染色鑑定不同表型的特異性標記物進行分析。巨噬細胞極化後的表型主要可分為M1及M2，其中巨噬細胞M1具有促炎性(pro-inflammatory)，而巨噬細胞M2能夠促進炎症消退，減輕炎症過程。
經由免疫組織化學染色結果顯示CD 68+巨噬細胞(CD68+ macrophage)被浸潤。與載體組相比，ADSC組中具有iNOS表達的CD 68+巨噬細胞(iNOS-expressing CD68+ macrophage)的比例顯著減少(載體組為12±4%、ADSC組為4±2%，P<0.05)，如表6及圖4A所示；又，與載體組相比，ADSC組中具有IL-10表達的CD 68+巨噬細胞(IL-10-expressing CD68+ macrophage)的比例顯著增加(載體組為5±3%、ADSC組為16±5%，P<0.05)，如表6及圖4B所示。
Figure 108115906-A0305-02-0021-7
另外，為了更進一步確認巨噬細胞表型轉變，利用RT-PCR 分析各組大鼠的左心房肌肉中之巨噬細胞M1型mRNA(IL-6、IL-1β、及iNOS)及巨噬細胞M2型mRNA(CD206、及IL-10)的表達水平，結果如表7所示，並繪製成圖5A至圖5E。
Figure 108115906-A0305-02-0022-8
由表7及圖5A至5E之結果可知，就巨噬細胞M1型的mRNA(IL-6、IL-1β、及iNOS)分析結果而論，ADSC組之IL-6的表達水平為1.52±0.19，較載體組(1.77±0.12)降低約14.12%、IL-1β的表達水平為1.68±0.1，較載體組(1.89±0.12)降低約11.11%、以及iNOS的表達水平為1.5±0.11，較載體組(1.69±0.09)降低約11.24%；又，BP/ADSC組之IL-6的表達水平為1.39±0.12，較載體組(1.77±0.12)降低約21.47%、IL-1β的表達水平為1.52±0.12，較載體組(1.89±0.12)降低約20.58%、以及iNOS的表達水平為1.38±0.08，較載體組(1.69±0.09)降低約18.34%。
再者，在IL-6的表達水平比較中，BP/ADSC組的降低程度約為ADSC組1.52倍、在IL-1β的表達水平比較中，BP/ADSC組的降低程度約為ADSC組1.85倍、以及在iNOS的表達水平比較中，BP/ADSC組的降低程度約為ADSC組1.63倍，顯示BP/ADSC組比ADSC組更能夠有效降低巨噬細胞M1的含量，進而降低發炎的機率。
另外，就巨噬細胞M2型的mRNA(CD206、及IL-10)分析結果而論，ADSC組之CD206的表達水平為1.98±0.18，較載體組(1.18±0.12)提升約1.68倍、以及IL-10的表達水平為1.88±0.19，較載體組(1.26±0.22)提升約1.49倍；又，BP/ADSC組之CD206的表達水平為2.16±0.16，較載體組(1.18±0.12)提升約1.83倍、以及IL-10的表達水平為2.38±0.15，較載體組(1.26±0.22)提升約1.89倍
再者，在CD206的表達水平比較中，BP/ADSC組的提升程度約為ADSC組1.1倍、在IL-10的表達水平比較中，BP/ADSC組的提升程度約為ADSC組1.27倍、，顯示BP/ADSC組比ADSC組更能夠有效提升巨噬細胞M2的含量，進而促進炎症消退，減輕炎症過程。
遠程人類ADSC移植對心肌肥厚和纖維化的影響
載體組、ADSC組、BP/ADSC組相對於對照組的心肌細胞截面積(Myocyte cross area)之比例如表8及圖6A所示。由圖6A之結果可知，載體組的心肌細胞明顯較對照組肥大，而ADSC組及BP/ADSC的心肌細胞的截面積較載體組小。更具體而言，ADSC組的心肌細胞截面積比例為1.38倍，較載體組減少了約13%，而BP/ADSC組的心肌細胞截面積比例為1.24倍，較載體組減少了約22%。另外，由此結果可知，BP/ADSC組縮小心肌細胞截面積的效果比ADSC組更好，約為ADSC組的1.69倍。
又，經由RT-PCR分析各組大鼠的左心房肌肉中BNP基因mRNA(病理性心臟肥大的標誌物)表達的結果如表8及圖6B所示。由圖6B之結果可知，載體組的BNP基因表達約為對照組的2.73倍(P<0.0001)，而ADSC組及BP/ADSC組的BNP基因表達則較載體組下降。更具體而言，ADSC組的BNP基因表達為0.98±0.11，較載體組減少了約31%，而BP/ADSC組的BNP基因表達為0.76±0.08倍，較載體組減少了約46%。另外，由此結果可知，BP/ADSC組抑制BNP基因表達的效果比ADSC組 更好，約為ADSC組的1.48倍，此結果與前述組織學結果一致。
以picrosirius(Sirius red)染色進行膠原蛋白面積分率分析及羥脯氨酸含量分析的結果(Collagen area fraction及Hydroxyproline content)如表8所示，並分別繪製成圖6C及圖6D。
從膠原蛋白面積分率(Collagen area fraction)的分析結果來看，ADSC組的膠原蛋白面積分率(Collagen area fraction)為0.53±0.08%，較載體組降低約30%，而BP/ADSC組的膠原蛋白面積分率為0.26±0.08%，較載體組降低約66%，並且BP/ADSC組的降低程度約為ADSC組2.2倍。
另外，羥脯氨酸含量分析結果來看，ADSC組的羥脯氨酸含量為1.67±0.11%，較載體組降低約16%，而BP/ADSC組的羥脯氨酸含量為1.42±0.1%，較載體組降低約28%，並且BP/ADSC組的降低程度約為ADSC組1.75倍，此結果趨勢亦與膠原蛋白面積分率分析結果趨勢一致，顯示BP/ADSC組能夠比ADSC組更顯著地減少心臟纖維化。
Figure 108115906-A0305-02-0024-9
超聲心動圖結果分析
超聲心動圖偵測結果如表9所示，並由表9所示之結果可知，相較於對照組，載體組的心臟顯示出結構變化，例如室間隔與左心室後壁 的尺寸增加，顯示出與心臟肥大的結果一致。
另外，由超聲心動圖確認使用ADSC進行治療心臟肥大是否會導致壁應力增加及心功能障礙，由表9所示的左心室舒張期尺寸(LVEDD)、左心室收縮期(LVESD)尺寸、及縮短分數(Fractional shortening)可知，載體組、ADSC組、及BP/ADSC組的統計結果皆無顯著差異，顯示使用ADSC進行治療心臟肥大並不會導致壁應力增加及心功能障礙。
Figure 108115906-A0305-02-0025-10
《實施例2》
由實施例1的結果可知，經由BP預處理後的ADSC能夠增加顯著心肌中巨噬細胞M2表型，但所涉及的機制上不清楚。為了確認BP的介入對於在巨噬細胞極化過程中ROS/STAT3信號傳遞的重要性，使用3-嗎啉代嘧啶(3-morpholinosydnonimine,SIN-1，過氧化亞硝酸鹽產生劑)或S3I-201(a STAT3抑制劑，3-(2,4-dichlorophenyl)-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1Hpyrrole-2,5-dione,Calbiochem,La Jolla,CA,USA)進行體外試驗。
相同地，將12週齡大且具有心臟肥大症狀的雄性原發性高血壓鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)隨機分ADSC組、BP/ADSC組、BP/ADSC/SIN組、及BP/ADSC/S3I組共四組，其中ADSC組為注射1×106個ADSCs(混合於30μl之PBS中)至SHR的右側腿肌中，而 BP/ADSC組、BP/ADSC/SIN組、及BP/ADSC/S3I組則分別注射1×106個經BP預處理的ADSCs(混合於30μl之PBS中)至SHR的右側腿肌中。
移植後3天犧牲大鼠並取出心臟，每個心臟灌注非循環改良Tyrode溶液(noncirculating modified Tyrode’s solution，其中含有117.0mM之NaCl、23.0mM之NaHCO3、4.6mM之KCl、0.8mM之NaH2PO4、1.0mM之MgCl2、2.0mM之CaCl2、及5.5mM之葡萄糖，在37℃達成平衡，並以含有95%之O2及5%之CO2的氣體混合物進行氧化反應。另外，BP/ADSC/SIN組所使用的非循環改良Tyrode溶液進一步含有37μM之SIN-1，BP/ADSC/S3I組所使用的非循環改良Tyrode溶液進一步含有25μM之S3I-201。灌注時間為30分鐘。
在實驗結束後，量測各組心臟中之左心室的ROS表達水平、p-STAT3的比例、和IL-10含量，測試方法與實施例1相同。
所得結果記錄於表10中並分別繪製成圖7A至7C。
Figure 108115906-A0305-02-0026-11
如圖7A至圖7C之結果可知，BP/ADSC/SIN組的p-STAT3/total STAT3為0.87±0.19，較BP/ADSC組降低約45%，以及BP/ADSC/SIN組的IL-10含量為563±98pg/mg，較BP/ADSC組降低約77%。由於SIN-1為過氧化亞硝酸鹽產生劑，此結果顯示超氧化物的介導對於p-STAT3、及IL-10之水平的作用。
另外，為了評估STAT3信號通路是否對於巨噬細胞M2c的極化至關重要，分析S3I-201對於巨噬細胞轉化為M2c的影響。由圖7A至圖7C之結果可知，BP/ADSC/S3I組的IL-10含量為493±104pg/mg，較BP/ADSC組降低約80%(P<0.05)。由於S3I-201為STAT3的抑制劑，顯示STAT3的活性對於IL-10之水平的作用。又，比較BP/ADSC組和BP/ADSC/S3I組的超氧化物水平發現沒有顯著差異，表示超氧化物的水平並未受到S3I-201作用的影響，可知ROS是調節STAT3活性的上游。
綜上所述，在如上所列舉的實施例中已經舉例而具體地說明本發明的內容了，然而本發明並非僅限定於此等實施方式而已。本發明所屬技術領域中具有通常知識者應當明白：在不脫離本發明的精神和範圍內，當可再進行各種的更動與修飾；例如，將前述實施例中所例示的各技術內容加以組合或變更而成為新的實施方式，此等實施方式也當然視為本發明所屬內容。因此，本案所欲保護的範圍也包括後述的申請專利範圍及其所界定的範圍。
無。

Claims (6)

  1. 一種幹細胞用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其係施予一有效量之幹細胞至所需個體；其中該幹細胞係為選自臍帶血幹細胞、周邊血幹細胞、神經幹細胞、脂肪幹細胞、及骨髓幹細胞中之至少一種，並以正丁烯苯酞進行預處理反應而得；以及該所需個體為人類、或哺乳類動物。
  2. 如請求項1所記載之幹細胞用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其中該醫藥組合物進一步包含藥學上可接受之載劑。
  3. 如請求項1所記載之幹細胞用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其中該有效量為在1×106~1×108個幹細胞之範圍。
  4. 如請求項1所記載之幹細胞用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其中該心肌肥厚是由自發性高血壓所引起。
  5. 如請求項1所記載之用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其中該幹細胞是經由遠端肌肉注射給予。
  6. 如請求項5所記載之用於製備治療心肌肥厚的醫藥組合物之用途，其中該遠端肌肉為四肢肌肉或臀部肌肉。
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