TWI688654B

TWI688654B - 用於核酸擴增的方法和系統

Info

Publication number: TWI688654B
Application number: TW103145571A
Authority: TW
Inventors: 李響
Original assignee: 大陸商卡尤迪生物科技（北京）有限公司
Priority date: 2013-12-25
Filing date: 2014-12-25
Publication date: 2020-03-21
Also published as: EP3087205A4; TW201538733A; AU2014372983C1; BR112016015132A8; CA2934589A1; US10465239B2; JP6723925B2; MX2016008447A; US20170306375A1; WO2015096763A1; AU2014372983B2; EP3087205A1; JP2017504356A; AU2014372983A1; BR112016015132A2; US9546389B2; EP3087205B1; US20160115513A1; ES2809566T3; WO2015096063A1

Abstract

本申請提供了用於擴增和分析核酸樣品的方法和系統。

Description

用於核酸擴增的方法和系統

交叉引用

本申請要求2013年12月25日提交的第PCT/CN2013/090425號專利合作條約申請的優先權，所述申請出於全部目的通過引用以整體併入本文。

核酸擴增方法允許從複雜混合物如生物樣品中有選擇地擴增和鑒定感興趣的核酸。為了檢測生物樣品中的核酸，通常對生物樣品進行處理，以從生物樣品的其他組分和其他可能幹擾核酸和/或擴增的其他物質中分離出核酸。在從生物樣品中分離出感興趣的核酸之後，可通過例如本領域已知的擴增方法，如基於熱迴圈的方法(例如，聚合酶鏈反應(PCR))，對感興趣的核酸進行擴增。在擴增感興趣的核酸之後，可以檢測擴增產物，並由終端使用者解讀檢測結果。然而，在核酸擴增之前從生物樣品中提取核酸可能是費時的，從而導致該過程在整體上的時間效率降低。

醫療點照護(POC)檢測具有在實驗室基礎設施較差的資源受限的條件下或者在接收實驗室結果延遲及對患者進行隨訪可能較複雜的偏遠地區提升傳染病的檢測和管理的潛力。POC檢測也能夠使現有水準的衛生保健設施更加能夠在單次訪視期間為患者提供樣品-回饋(sample-to-answer)結果。然而，POC方法和裝置的低效限制了所能夠實現的。例如，從複雜樣品類型(例如，生物樣品)製備核酸(例如，病原體的核酸)需要熟練技術人員在專門的實驗室空間中手動執行多個處理步驟及後續的檢測，而往往在幾小時甚至幾天之後才能出具結果的報告。

因此，需要用於分析來自複雜樣品類型的核酸的快速、準確的方法和裝置。此等方法和裝置例如可用於實現可經由其核酸而檢測的疾病的快速樣品-回饋檢測和管理。

本申請提供了用於核酸(如RNA和DNA)分子的高效擴增的方法和系統。可快速且高靈敏度地檢測所擴增的核酸產物。

在一個方面，本申請提供了一種擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。在一個實施方案中，該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)針對靶RNA的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以生成指示存在靶RNA的擴增DNA產物，每個迴圈包括：(i)將反應混合物在變性溫度下孵育少於或等於60秒的變性持續時間，隨後(ii)將反應混合物在延伸溫度下孵育少於或等於60秒的延伸持續時間，從而擴增靶RNA。在另一實施方案中，該方法包括：(a)接收已從受試者獲得的生物樣品；(b)提供包含生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和任選的去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶和(ii)針對靶RNA的引物組；(c)使反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物；(d)檢測(c)的擴增DNA產物的量；及，將關於擴增DNA產物的量的資訊輸出至接收者，其中用於完成(a)-(e)的時間量小於或等於約30分鐘。在一些實施方案中，該時間量小於或等於20分鐘，小於或等於10分鐘，或者小於或等於5分鐘。

在一些實施方案中，所述試劑進一步包含報告劑，該報告劑產生指示存在擴增DNA產物的可檢測信號。在一些實施方案中，可檢測信號的強度與擴增DNA產物或靶RNA的量成比例。在一些實施方案中，該報告劑是染料。在一些實施方案中，引物組包含一種或多種引物。在一些實施方案中，引物組包含用於產生與靶RNA互補的鏈的第一引物。在一些實施方案中，引物組包含用於產生與DNA產物互補的鏈的第二引物，該DNA產物與靶RNA的至少一部分互補。在一些實施方案中，靶RNA為病毒RNA。在一些實施方案中，該病毒RNA對於受試者是致病性的。在一些實施方案中，該病毒RNA選自HIV I、HIV II、埃博拉病毒、登革病毒、正粘病毒、肝炎病毒(hepevirus)，和/或甲型、乙型、丙型(例如，披甲RNA-HCV病毒)、丁型和戊型肝炎病毒。

在一些實施方案中，所述反應容器包括主體和蓋。在一些實施方案中，該蓋是可移除的。在一些實施方案中，該反應容器採取移液管頭(pipette tip)的形式。在一些實施方案中，該反應容器是反應容器陣列的一部分。在一些實施方案中，該反應容器陣列的反應容器部分可被流體處理裝置單獨訪問。在一些實施方案中，該反應容器包含兩個或更多個熱區(thermal zone)。在一些實施方案中，該反應容器是密封的，任選地是氣密密封的。

在一些實施方案中，變性溫度為約90℃至100℃，或約92℃至95℃。在一些實施方案中，延伸溫度為約35℃至72℃，或約45℃至65℃。在一些實施方案中，變性持續時間少於或等於30秒。在一些實施方案中，延伸持續時間少於或等於30秒。

在一些實施方案中，在提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器前，靶RNA未經歷濃縮。在一些實施方案中，當提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器時，生物樣品未經歷RNA提取。在一些實施方案中，該方法進一步包括在提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器之前或期間向該反應容器中加入裂解劑的步驟。在一些實施方案中，該裂解劑包含緩衝液。在一些實施方案中，在引物延伸反應的一個或多個迴圈期間，靶RNA從生物樣品中釋放。

在一些實施方案中，所述生物樣品是來自受試者的生物流體。在一些實施方案中，該生物樣品選自呼出氣、血液、尿液、糞便、唾液、腦脊液和汗液。

在一些實施方案中，DNA擴增經由聚合酶鏈反應進行。在一些實施方案中，該聚合酶鏈反應是巢式聚合酶鏈反應。在一些實施方案中，DNA擴增是線性擴增。在一些實施方案中，該擴增以小於50、小於40、小於30、小於20、小於10或小於5的迴圈閾值(Ct)產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的DNA產物。在一些實施方案中，該擴增在30分鐘或更短、20分鐘或更短或者10分鐘或更短的時段產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的DNA產物。在一些實施方案中，該擴增不是基於乳液的。

在一些實施方案中，所述接收者是治療醫生、製藥公司或受試者。在一些實施方案中，使反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物進行30個迴圈或更少，20個迴圈或更少，或者10個迴圈或更少。在一些實施方案中，檢測是光學檢測、靜電檢測或電化學檢測。在一些實施方案中，該方法包括提供包含生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑的反應容器。

在一些實施方案中，所述資訊作為報告而輸出。在一些實施方案中，該報告是電子報告。在一些實施方案中，該資訊輸出至電子顯示器。

在另一方面，本申請提供了一種擴增存在於從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的方法。該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)去氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任選的逆轉錄酶，和(ii)針對靶核酸的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應，以生成指示在生物樣品中存在靶核酸的擴增產物，每個系列包括兩個或更多個如下的迴圈：(i)在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育該反應混合物，隨後(ii)在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育該反應混合物，其中就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列。

在一些實施方案中，靶核酸是核糖核酸。在一些實施方案中，所述試劑對於與去氧核糖核酸擴增平行地進行逆轉錄擴增是必需的。在一些實施方案中，擴增產物是擴增的去氧核糖核酸產物。在一些實施方案中，生物樣品在(a)中未經純化。在一些實施方案中，該方法進一步包括使靶核酸在(b)之前經受一個或多個變性條件。在一些實施方案中，該一個或多個變性條件選自變性溫度分佈(profile)和變性劑。

在一些實施方案中，將生物樣品稀釋。這可能有助於使抑制最小化。在一些實施方案中，將生物樣品濃縮。這可能有助於提高或以其他方式改善靈敏度。

在一些實施方案中，該方法進一步包括使靶核酸在多個系列的引物延伸反應的第一系列與第二系列之間經受一個或多個變性條件。在一些實施方案中，就變性溫度與延伸溫度之間的緩變速率(ramping rate)、變性溫度、變性持續時間、延伸溫度和延伸持續時間中的至少任意一個、至少任意兩個、至少任意三個或至少任意四個而言，單個系列不同。在一些實施方案中，就變性溫度與延伸溫度之間的緩變速率、變性溫度、變性持續時間、延伸溫度和延伸持續時間而言，單個系列不同。

在一些實施方案中，所述多個系列的引物延伸反應包括第一系列和第二系列，第一系列包括超過10個迴圈，第一系列的每個迴圈包括(i)在約92℃-95℃下孵育反應混合物不超過30秒，隨後(ii)在約35℃-65℃下孵育反應混合物不超過1分鐘，第二系列包括超過10個迴圈，第二系列的每個迴圈包括：(i)在約92℃-95℃下孵育反應混合物不超過30秒，隨後(ii)在約40℃-60℃下孵育反應混合物不超過1分鐘。

在一些實施方案中，與在相當的變性和延伸條件下的單一系列的引物延伸反應相比，所述多個系列的引物延伸反應以較低的迴圈閾值產生指示在生物樣品中存在靶核酸的可檢測量的擴增產物。在一些實施方案中，該方法進一步包括，在(b)之前，將生物樣品在90℃至100℃的預加熱溫度下預加熱不超過10分鐘、2分鐘或1分鐘的預加熱時間。在一些實施方案中，預加熱溫度為92℃至95℃。在一些實施方案中，預加熱持續時間不超過約30秒。

在另一方面，本申請提供了一種用於擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的系統。在一個實施方案中，該系統包括：(a)輸入模組，其接收擴增生物樣品中的靶RNA的用戶請求；(b)擴增模組，其回應於該用戶請求而：在反應容器中接收反應混合物，該反應混合物包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑，該試劑包含(i)逆轉錄酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)針對靶RNA的引物組；及，使反應容器中的反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以生成指示存在靶RNA的擴增DNA產物，每個迴圈包括：(i)將反應混合物在變性溫度下孵育少於或等於60秒的變性持續時間，隨後(ii)將反應混合物在延伸溫度下孵育少於或等於60秒的延伸持續時間，從而擴增靶RNA；及(c)可操作地耦合至擴增模組的輸出模組，其中該輸出模組將關於靶RNA或DNA產物的資訊輸出至接收者。

在另一實施方案中，該系統包括：(a)輸入模組，其接收擴增生物樣品中的靶RNA的用戶請求；(b)擴增模組，其回應於該用戶請求而：(i)在反應容器中接收反應混合物，該反應混合物包含已從受試者獲得的生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和任選的去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑，該試劑包含：(1)逆轉錄酶，和(2)針對靶RNA的引物組；及(ii)使該反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物；(iii)檢測(ii)的擴增DNA產物的量；及(iv)將關於擴增DNA產物的量的資訊輸出至接收者，其中用於完成(i)-(iv)的時間量小於或等於約30分鐘；及(c)可操作地耦合至擴增模組的輸出模組，其中該輸出模組將資訊傳送至接收者。在一些實施方案中，該輸出模組是電子顯示器。在一些實施方案中，該電子顯示器包含使用者介面。在一些實施方案中，該輸出模組是可操作地耦合至電腦網路的通信介面。

在另一方面，本申請提供了一種用於擴增存在於從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的系統。該系統包括：(a)輸入模組，其接收擴增生物樣品中的靶核酸的用戶請求；(b)擴增模組，其回應於該用戶請求而：在反應容器中接收反應混合物，該反應混合物包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑，該試劑包含(i)DNA聚合酶和任選的逆轉錄酶，和(ii)針對靶核酸的引物組；及，使反應容器中的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應，以生成指示在生物樣品中存在靶核酸的擴增產物，每個系列包括兩個或更多個如下的迴圈：(i)在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育該反應混合物，隨後(ii)在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育該反應混合物，其中就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列；及(c)可操作地耦合至擴增模組的輸出模組，其中該輸出模組將關於核酸或擴增產物的資訊輸出至接收者。

在另一方面，本申請提供了一種包含機器可執行代碼的電腦可讀介質，該機器可執行代碼在被一個或多個電腦處理器執行時，實施擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。在一個實施方案中，該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)針對靶RNA的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以生成指示存在靶RNA的擴增DNA產物，每個迴圈包括：(i)將該反應混合物在變性溫度下孵育少於或等於60秒的變性持續時間，隨後(ii)將該反應混合物在延伸溫度下孵育少於或等於60秒的延伸持續時間，從而擴增靶RNA。

在另一實施方案中，該方法包括：(a)接收已從受試者獲得的生物樣品；(b)提供包含生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和任選的去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶，和(ii)針對靶RNA的引物組；(c) 使該反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物；(d)檢測(c)的DNA產物的量；及(e)將關於DNA產物的量的資訊輸出至接收者，其中用於完成(a)-(e)的時間量小於或等於約30分鐘。

在另一方面，本申請提供了一種包含機器可執行代碼的電腦可讀介質，該機器可執行代碼在被一個或多個電腦處理器執行時，實施擴增存在於從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的方法。在一個實施方案中，該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)DNA聚合酶和任選的逆轉錄酶，和(ii)針對靶核酸的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應，以自靶核酸生成擴增產物，每個系列包括兩個或更多個如下的迴圈：(i)在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育該反應混合物，隨後(ii)在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育該反應混合物，其中就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他系列。

本申請的另一方面提供了一種用於擴增從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的系統。該系統可包括電子顯示幕，該電子顯示幕包含顯示圖形元素的使用者介面，該圖形元素可被使用者訪問，以執行用以擴增生物樣品中的靶核酸的擴增方案。該系統也可包括電腦處理器，該電腦處理器耦合至電子顯示幕，並且被程式設計為在使用者選擇圖形元素時執行該擴增方案。該擴增方案可包括使包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應，以生成指示在生物樣品中存在靶核酸的擴增產物。每個系列的引物延伸反應可包括兩個或更多個如下的迴圈：在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育該反應混合物，隨後在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育該反應混合物。就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列可不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列。

在一些實施方案中，所述擴增方案可進一步包括為靶核酸選擇引物組。在一些實施方案中，所述試劑可包含去氧核糖核酸(DNA)聚合酶、任選的逆轉錄酶和針對靶核酸的引物組。在一些實施方案中，所述使用者介面可以顯示多個圖形元素。每個圖形元素可以與多個擴增方案中的給定擴增方案相關聯。在一些實施方案中，每個圖形元素可以與疾病相關聯。所述多個擴增方案中的給定擴增方案可指向測定受試者中疾病的存在。在一些實施方案中，該疾病可與病毒如RNA病毒或DNA病毒相關聯。在一些實施方案中，該病毒可選自人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、單核細胞增多症病毒、巨細胞病毒、SARS病毒、西尼祿熱病毒、脊髓灰質炎病毒、麻疹病毒、單純皰疹病毒、天花病毒、腺病毒和水痘病毒。在一些實施方案中，該流感病毒可選自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。在一些實施方案中，該腺病毒可以是55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。在一些實施方案中，該丙型肝炎病毒可以是披甲RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。在一些實施方案中，該疾病可與致病細菌(例如，結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis))或致病原生動物(例如，瘧原蟲(Plasmodium))相關。

在一些實施方案中，所述靶核酸可與疾病相關。在一些實施方案中，所述擴增方案可指向基於擴增產物的存在而測定疾病的存在。在一些實施方案中，該疾病可以與病毒(如RNA病毒或DNA病毒)相關。在一些實施方案中，該病毒可選自人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、單核細胞增多症病毒、巨細胞病毒、SARS病毒、西尼祿熱病毒、脊髓灰質炎病毒、麻疹病毒、單純皰疹病毒、天花病毒、腺病毒和水痘病毒。在一些實施方案中，該流感病毒可選自H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒和H5N1病毒。在一些實施方案中，該腺病毒可以是55型腺病毒(ADV55)或7型腺病毒(ADV7)。在一些實施方案中，該丙型肝炎病毒可以是披甲RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV)。在一些實施方案中，該疾病可以與致病細菌(如，結核分枝桿菌)或致病原生動物(例如瘧原蟲)相關。

根據下面的詳細描述，本申請的其他方面和優點對於本領域技術人員而言將變得顯而易見，其中僅示出和描述了本發明的說明性實施方案。將會認識到，本公開內容能夠包括其他的和不同的實施方案，並且其若干細節能夠在多個明顯的方面進行更改，所有這些都不背離本公開內容。相應地，附圖和描述將自然被視為是說明性的，而非限制性的。

援引併入

本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用併入本文，其程度如同具體地且單獨地指明每個單獨的出版物、專利或專利申請均通過引用而併入。

1‧‧‧樣品編號

2‧‧‧樣品編號

3‧‧‧樣品編號

4‧‧‧樣品編號

5‧‧‧樣品編號

6‧‧‧樣品編號

7‧‧‧樣品編號

8‧‧‧樣品編號

101‧‧‧電腦

102‧‧‧反應容器

103‧‧‧輸入裝置

104‧‧‧擴增模組

105‧‧‧熱迴圈儀

106‧‧‧檢測器

107‧‧‧輸入模組

108‧‧‧輸出模組

109‧‧‧終端接收者

110‧‧‧電腦網路介面

111‧‧‧印表機

112‧‧‧電子顯示器

2800‧‧‧電子顯示幕

2801‧‧‧使用者介面

2802‧‧‧圖形元素

2803‧‧‧圖形元素

2804‧‧‧圖形元素

2810‧‧‧電子顯示幕

2811‧‧‧使用者介面

2812‧‧‧圖形元素

2813‧‧‧圖形元素

2814‧‧‧圖形元素

本發明的新穎特徵在所附權利要求書中具體闡述。通過參考以下對其中利用到本發明原理的說明性實施方式加以闡述的詳細描述和附圖(在本文中也稱作“圖”)，將會獲得對本發明的特徵和優點的更好的理解，在附圖中：圖1為描繪了示例性系統的示意圖。

圖2A和2B為描繪了實施例1所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖3A和3B為描繪了實施例1所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖4A和4B為描繪了實施例2所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖5為描繪了實施例3所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖6A和6B為描繪了實施例4所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖7A和7B為描繪了實施例4所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖8A和8B為描繪了實施例4所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖9A和9B為描繪了實施例4所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖10A和10B為描繪了實施例4所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖11為描繪了實施例5所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖12為描繪了實施例5所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖13為描繪了實施例7所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖14為描繪了實施例9所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖15A和15B為描繪了實施例10所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖16A和16B為描繪了實施例10所述的示例性核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖17為描繪了實施例11所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖18為描繪了實施例12所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖19A和圖19B為描繪了實施例13所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖20為描繪了實施例14所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖21為描繪了實施例15所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖22A和圖22B為描繪了實施例17所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖23A、圖23B和圖23C為描繪了實施例18所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖24A和圖24B為描繪了實施例19所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖25A和圖25B為描繪了實施例19所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖26A和圖26B為描繪了實施例20所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖27為描繪了實施例21所述的核酸擴增反應的結果的曲線圖。

圖28A為具有示例性使用者介面的示例性電子顯示的示意圖。

圖28B為具有示例性使用者介面的示例性電子顯示的示意圖。

雖然在本文中已示出並描述了本發明的各個實施方案，但對於本領域技術人員顯而易見的是，這些實施方案僅以示例的方式提供。本領域技術人員在不背離本發明的情況下可想到許多變化、改變和替換。應當理解，可以採用本文所述的本發明實施方案的各種替代方案。

如在本說明書和權利要求書中所使用的，單數形式“一個”、“一種”和“該”包括複數的指代物，除非上下文明確地另有說明。例如，術語“一個細胞”包括多個細胞，包括其混合物。

如本文所使用的，術語“擴增(amplifying)”和“擴增(amplification)”可互換使用，並且通常指生成核酸的一個或多個拷貝或“擴增產物”。術語“DNA擴增”通常指生成DNA分子的一個或多個拷貝或“擴增的DNA產物”。術語“逆轉錄擴增”通常指經逆轉錄酶的作用從核糖核酸(RNA)範本生成去氧核糖核酸(DNA)。

如本文所使用的，術語“迴圈閾值”或“Ct”通常指熱迴圈過程中的迴圈，在該迴圈中由於擴增產物而導致的可檢測信號的增加達到統計學顯著的高於背景信號的水準。

如本文所使用的，術語“變性(denaturing)”和“變性(denaturation)”可互換使用，並且通常指雙鏈核酸的螺旋結構的完全或部分解旋，並且在一些情況下指單鏈核酸的二級結構的解旋。變性可包括病原體細胞壁或病毒外殼的失活，以及蛋白抑制劑的失活。可發生變性的條件包括“變性溫度”和“變性持續時間”，“變性溫度”通常指允許發生變性的溫度，“變性持續時間”通常指為發生變性而分配的時間量。

如本文所使用的，術語“延伸”通常指以範本引導的方式將核苷酸摻入核酸。延伸可借助於酶(諸如聚合酶或逆轉錄酶)而發生。可發生延伸的條件包括“延伸溫度”和“延伸持續時間”，“延伸溫度”通常指允許發生延伸的溫度，“延伸持續時間”通常指為發生延伸而分配的時間量。

如本文所使用的，術語“核酸”通常指任何長度的核苷酸(去氧核糖核苷酸(dNTP)或核糖核苷酸(rNTP))或其類似物的聚合形式。核酸可具有任何三維結構，並且可執行任何已知或未知的功能。核酸的非限制性實例包括DNA、RNA、基因或基因片段的編碼區或非編碼區、由連鎖分析確定的一個或多個基因座、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、短幹擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重組核酸、分支核酸、質粒、載體、分離的任意序列的DNA、分離的任意序列的RNA、核酸探針和引物。核酸可包含一種或多種修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸類似物。如果存在的話，對核苷酸結構的修飾可以在核酸組裝之前或之後進行。核酸的核苷酸序列可被非核苷酸組分中斷。核酸可在聚合後被進一步修飾，例如通過與報告劑偶聯或結合。

如本文所使用的，術語“引物延伸反應”通常指雙鏈核酸變性，引物與變性的核酸的一條或兩條鏈結合，隨後引物延伸。

如本文所使用的，術語“反應混合物”通常指包含對於完成核酸擴增(例如，DNA擴增、RNA擴增)所必需的試劑的組合物，此等試劑的非限制性實例包括對靶RNA或靶DNA具有特異性的引物組、由RNA的逆轉錄產生的DNA、DNA聚合酶、逆轉錄酶(例如，用於RNA的逆轉錄)、合適的緩衝劑(包括兩性離子緩衝劑)、輔因數(例如，二價和一價陽離子)、dNTP和其他酶(例如，尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)等)。在一些情況下，反應混合物還可包含一種或多種報告劑。

如本文所使用的，“報告劑”通常指產生可檢測信號的組合物，該信號的存在或不存在可用於檢測擴增產物是否存在。

如本文所使用的，術語“靶核酸”通常指在核酸分子的起始群體中的、具有某種核苷酸序列的核酸分子，其存在、量和/或序列或者其中一項或多項的變化需要進行測定。靶核酸可以是任何類型的核酸，包括DNA、RNA和它們的類似物。如本文所使用的，“靶核糖核酸(RNA)”通常指為RNA的靶核酸。如本文所使用的，“靶去氧核糖核酸(DNA)”通常指為DNA的靶核酸。

如本文所使用的，術語“受試者”通常指具有可測試或可檢測的遺傳信息的實體或介質。受試者可以是人或個體。受試者可以是脊椎動物，例如哺乳動物。哺乳動物的非限制性實例包括鼠、猿猴、人、家畜、競技動物(sport animal)和寵物。受試者的其他實例包括食物、植物、土壤和水。

在一個方面，本申請提供了一種擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)針對靶RNA的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以生成指示存在靶RNA的擴增DNA產物，每個迴圈包括：(i)將反應混合物在變性溫度下孵育少於或等於60秒的變性持續時間，隨後(ii)將反應混合物在延伸溫度下孵育少於或等於60秒的延伸持續時間，從而擴增靶RNA。

在另一方面，本申請提供了一種擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法。該方法包括：(a)接收已從受試者獲得的生物樣品；(b)提供包含生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和任選的去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶和(ii)針對靶RNA的引物組；(c)使反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物；(d)檢測(c)的擴增DNA產物的量；及(e)將關於擴增DNA產物的量的資訊輸出至接收者，其中用於完成(a)-(e)的時間量小於或等於約30分鐘。

在一個方面，本申請提供了一種擴增存在於從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的方法。該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)去氧核糖核酸(DNA)聚合酶和任選的逆轉錄酶，和(ii)針對靶核酸的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應以生成指示在生物樣品中存在靶核酸的擴增產物，每個系列包括兩個或更多個如下的迴圈：(i)在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育反應混合物，隨後(ii)在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育反應混合物，其中就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列。

在所述多個方面的任意方面，對來自從受試者獲得的生物樣品的核酸進行擴增。在一些情況下，該生物樣品直接從受試者獲得。直接從受試者獲得的生物樣品通常指這樣的生物樣品：其從受試者獲得後，除了用於從受試者採集生物樣品以供進一步處理的任意手段之外未進行進一步處理。例如，通過以下步驟直接從受試者獲得血液：進入受試者的循環系統，從受試者中取出血液(例如，通過針)，並使取出的血液進入貯器中。該貯器可包含試劑(例如，抗凝血劑)，以使得血液樣品可用於進一步的分析。在另一實例中，可使用拭子接近受試者的口咽表面上的上皮細胞。在從受試者獲得生物樣品後，可使含有生物樣品的拭子與流體(例如，緩衝液)接觸，以從拭子上收集生物流體。

在一些實施方案中，生物樣品在提供於反應容器中時尚未純化。在一些實施方案中，當生物樣品被提供至反應容器中時，生物樣品的核酸尚未提取。例如，當將生物樣品提供至反應容器中時，生物樣品中的RNA或DNA可能未從生物樣品中提取。此外，在一些實施方案中，在將生物樣品提供至反應容器中之前，存在於生物樣品中的靶核酸(例如，靶RNA或靶DNA)可能未經濃縮。

可從受試者獲得包含核酸的任何合適的生物樣品。生物樣品可以是固體物質(例如，生物組織)，或者可以是流體(例如，生物流體)。通常，生物流體可包括與活生物體相關的任何流體。生物樣品的非限制性實例包括從受試者的任何解剖學位置(例如，組織、循環系統、骨髓)獲得的血液(或血液的成分一例如，白細胞、紅細胞、血小板)、從受試者的任何解剖學位置獲得的細胞、皮膚、心臟、肺、腎臟、呼出氣、骨髓、糞便、精液、陰道液、來源於腫瘤組織的組織液、乳房、胰腺、腦脊液、組織、咽喉拭子、活檢物、胎盤液、羊水、肝臟、肌肉、平滑肌、膀胱、膽囊、結腸、腸、腦、腔液、痰、膿、微生物群(micropiota)、胎糞、乳汁、前列腺、食道、甲狀腺、血清、唾液、尿液、胃液和消化液、淚液、眼部液體、汗液、粘液、耳垢、油、腺體分泌物、脊髓液、毛髮、指甲、皮膚細胞、血漿、鼻拭子或鼻咽洗液、脊髓液、臍帶血、淋巴液和/或其他排泄物或身體組織。

可通過本領域中已知的任何手段從受試者獲得生物樣品。用於直接從受試者獲得生物樣品的手段的非限制性實例包括：進入循環系統(例如，經注射器或其他針靜脈內或動脈內進入)、收集分泌的生物樣品(例如，糞便、尿液、痰、唾液等)、外科手術(例如，活檢)、擦拭(例如，頰拭子、口咽拭子)、移液和呼吸。此外，可從受試者中期望的生物樣品所處的任何解剖部位獲得生物樣品。

在所述多個方面的任何方面，對靶核酸進行擴增以生成擴增產物。靶核酸可以是靶RNA或靶DNA。在靶核酸為靶RNA的情況下，靶RNA可以是任何類型的RNA，包括本文其他地方所述的RNA類型。在一些實施方案中，靶RNA是病毒RNA。在一些實施方案中，病毒RNA可能對於受試者是致病性的。致病病毒RNA的非限制性實例包括人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1、H3N2、H7N9或H5N1)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，披甲RNA-HCV病毒)、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、單核細胞增多症病毒、巨細胞病毒、SARS病毒、西尼祿熱病毒、脊髓灰質炎病毒和麻疹病毒。

在靶核酸為靶DNA的情況下，靶DNA可以是任何類型的DNA，包括本文其他地方所述的DNA類型。在一些實施方案中，靶DNA是病毒DNA。在一些實施方案中，病毒DNA可能對於受試者是致病性的。DNA病毒的非限制性實例包括單純皰疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒、7型腺病毒)和水痘病毒(例如，禽痘)。在一些情況下，靶DNA可以是細菌DNA。細菌DNA可來自對受試者為致病性的細菌，例如，結核分枝桿菌--一種已知會引起肺結核的細菌。在一些情況下，靶DNA可以是來自致病原生動物(例如，一種或多種可引起瘧疾的瘧原蟲類型的原生動物)的DNA。

在本發明的多個方面的任何方面，從受試者獲得的生物樣品與對於在反應容器中進行核酸擴增所必需的試劑一起提供以獲得反應混合物。可使用任何合適的反應容器。在一些實施方案中，反應容器包括主體，該主體可包括內表面、外表面、開口端和相對的封閉端。在一些實施方案中，反應容器可包括蓋。所述蓋可被配置為在其開口端與主體接觸，使得當進行接觸時該反應容器的開口端封閉。在一些情況下，所述蓋永久地與反應容器相關聯，使得其在打開和閉合配置下保持附接至反應容器。在一些情況下，所述蓋是可移除的，以便在反應容器打開時，蓋與反應容器分離。在一些實施方案中，反應容器可被密封，任選地氣密密封。

反應容器可具有不同的大小、形狀、重量和配置。在一些實例中，反應容器可以是圓形或橢圓形的管狀。在一些實施方案中，反應容器可以是矩形、正方形、菱形、圓形、橢圓形或三角形。反應容器可以是規則形狀或不規則形狀。在一些實施方案中，反應容器的封閉端可具有錐形、圓形或平的表面。反應容器類型的非限制性實例包括管、孔、毛細管、筒、皿、離心管或移液管頭。反應容器可由任何合適的材料構造，此等材料的非限制性實例包括玻璃、金屬、塑膠及其組合。

在一些實施方案中，反應容器是反應容器陣列的一部分。反應容器陣列尤其可用於自動化方法和/或同時處理多個樣品。例如，反應容器可以是由許多孔組成的微孔板的孔。在另一實例中，反應容器可容納在熱迴圈儀的熱塊的孔中，其中熱迴圈塊包括各自能夠接納樣品容器的多個孔。由反應容器組成的陣列可包括任何適當數目的反應容器。例如，陣列可包括至少2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、25、35、48、96、144、384個或更多個反應容器。反應容器陣列的反應容器部分也可以由流體處理裝置單獨訪問，使得該流體處理裝置可正確識別反應容器，並將適當的流體材料分配到反應容器中。流體處理裝置可用於將流體材料添加至反應容器中的自動化。

在一些實施方案中，反應容器可包含多個熱區。反應容器內的熱區可通過使反應容器的不同區域暴露於不同的溫度迴圈條件來實現。例如，反應容器可包括上部熱區和下部熱區。上部熱區能夠接收生物樣品和對於獲得用於核酸擴增的反應混合物所必需的試劑。該反應混合物隨後可經歷第一熱迴圈方案。在期望數目的迴圈之後，例如，反應混合物可緩慢地但連續地從上部熱區洩漏到下部熱區。在下部熱區，反應混合物隨後經歷與上部熱區的方案不同的第二熱迴圈方案的期望數目的迴圈。此等策略在採用巢式PCR擴增DNA時可能特別有用。在一些實施方案中，熱區可在反應容器內的熱敏分層材料的輔助下在反應容器內產生。在此等情況下，可利用熱敏分層材料的加熱將反應混合物從一個熱區釋放到下一個熱區中。在一些實施方案中，反應容器包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15個或更多個熱區。

在一些實施方案中，包含熱區的反應容器可用於在核酸擴增前處理生物樣品。例如，可在加入生物樣品和對於核酸擴增所必需的試劑之前將裂解劑加入到反應容器的第一熱區。當將生物樣品和試劑加入到包含裂解劑的反應容器中時，獲得能夠裂解該生物樣品內的種類(例如，細胞或病毒顆粒)的反應混合物。或者，可將裂解劑與生物樣品和試劑同時加入到反應混合物的第一熱區中。使第一熱區經受適合於裂解劑作用的溫度條件可用來在第一熱區中裂解生物樣品中的細胞和病毒顆粒，使得該生物樣品中的核酸釋放到反應混合物中。裂解之後，隨後可允許反應混合物進入反應容器的第二熱區，以供使用本文所述的擴增方法對釋放的核酸進行擴增。

在需要裂解劑的情況下，可使用本領域中已知的任何合適的裂解劑，包括可商購的裂解劑。裂解劑的非限制性實例包括Tris-HCl，EDTA，去汙劑(例如，Triton X-100、SDS)，溶菌酶，葡萄糖酶(glucolase)，蛋白酶E，病毒內溶素，外溶素(exolysin)，消解酶 (zymolose)，溶細胞酶(Iyticase)，蛋白酶K，來自噬菌體的內溶素和外溶素，來自噬菌體PM2的內溶素，來自粘草芽孢桿菌(B.subtilis)噬菌體PBSX的內溶素，來自乳桿菌原噬菌體Lj928、Lj965、噬菌體15 Phiadh的內溶素，來自肺炎鏈球菌噬菌體Cp-I的內溶素，無乳鏈球菌噬菌體B30的雙功能肽聚糖溶素，來自原噬菌體細菌的內溶素和外溶素，來自李斯特菌(Listeria)噬菌體的內溶素，穴蛋白(holin)-內溶素，細胞20裂解基因，holWMY沃氏葡萄球菌(Staphylococcus wameri)M噬菌體varphiWMY，沃氏葡萄球菌M噬菌體varphiWMY的Iy5WMY，及其組合。在一些情況下，緩衝液可包含裂解劑(例如，裂解緩衝液)。裂解緩衝液的一個實例是氫氧化鈉(NaOH)。

本領域已知的任何類型的核酸擴增反應均可用於擴增靶核酸並生成擴增產物。此外，核酸的擴增可以是線性的、指數式的或其組合。擴增可以是基於乳劑的或可以是非基於乳劑的。核酸擴增方法的非限制性實例包括逆轉錄、引物延伸、聚合酶鏈反應、連接酶鏈反應、解旋酶依賴性擴增、非對稱擴增、滾環擴增和多重置換擴增(MDA)。在一些實施方案中，擴增產物可以是DNA。在對靶RNA進行擴增的情況下，可通過RNA的逆轉錄來獲得DNA並且可利用隨後的DNA擴增來生成擴增的DNA產物。擴增的DNA產物可以指示在生物樣品中存在靶RNA。在對DNA進行擴增的情況下，可以使用本領域中已知的任何DNA擴增方法。DNA擴增方法的非限制性實例包括聚合酶鏈反應(PCR)、PCR的變型(例如，即時PCR、等位基因特異性PCR、裝配PCR、非對稱PCR、數字PCR、乳液PCR、撥出PCR(dial-out PCR)、解旋酶依賴性PCR、巢式PCR、暖開機PCR、反向PCR、甲基化特異性PCR、微引物PCR(miniprimer PCR)、多重PCR、巢式PCR、重疊-延伸PCR、熱非對稱交錯PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)、遞降PCR)以及連接酶鏈式反應(LCR)。在一些情況下，DNA擴增是線性的。在一些情況下，DNA擴增是指數式的。在一些情況下，DNA擴增採用巢式PCR來實現，其可改善檢測擴增的DNA產物的靈敏度。

在多個方面，本文所述的這些核酸擴增反應可平行進行。通常，平行的擴增反應是同時在同一反應容器內發生的擴增反應。平行的核酸擴增反應可以如下進行：例如，在反應容器中包括對於各個核酸擴增反應所必需的試劑以獲得反應混合物，並且使該反應混合物經受對於各個核酸擴增反應所必需的條件。例如，逆轉錄擴增和DNA擴增可如下平行地進行：在反應容器中提供對於這兩種擴增方法所必需的試劑以形成並獲得反應混合物，並使該反應混合物經受適於進行這兩種擴增反應的條件。由RNA的逆轉錄產生的DNA可以平行地進行擴增以產生擴增的DNA產物。任何合適數目的核酸擴增反應可以平行地進行。在一些情況下，平行地進行至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或更多個核酸擴增反應。

平行進行核酸擴增反應的優點可包括配合的核酸擴增反應之間的快速轉換。例如，可在平行核酸擴增的加熱階段從生物樣品中提取或釋放靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)。在靶RNA的情況下，例如，可加熱包含靶RNA的生物樣品並使靶RNA從生物樣品中釋放。所釋放的靶RNA可以立即開始逆轉錄(經由逆轉錄擴增)以產生互補DNA。然後可立即擴增該互補DNA，通常在數秒的量級上。靶RNA從生物樣品中釋放與靶RNA逆轉錄為互補DNA之間的短時間間隔可有助於使生物樣品中可能妨礙逆轉錄和/或DNA擴增的抑制劑的影響最小化。

在這些多個方面的任何方面，可使用針對靶核酸的引物組來進行核酸擴增反應。引物組通常包含一種或多種引物。例如，引物組可包含約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種引物。在一些情況下，引物組可包含針對不同的擴增產物或不同的核酸擴增反應的引物。例如，引物組可包含第一引物和與核酸鏈產物互補的第二引物，第一引物是生成與靶核酸的至少一部分互補的核酸產物的第一鏈所必需的，第二引物是生成與核酸產物第一鏈的至少一部分互補的核酸產物的第二鏈所必需的。

例如，引物組可針對靶RNA。引物組可包含可用于生成與靶RNA的至少一部分互補的核酸產物第一鏈的第一引物。在逆轉錄反應的情況下，核酸產物的第一鏈可以是DNA。引物組還可包含可用于生成與核酸產物第一鏈的至少一部分互補的核酸產物第二鏈的第二引物。在與DNA擴增平行進行的逆轉錄反應的情況下，核酸產物的第二鏈可以是與自RNA範本產生的DNA鏈互補的核酸(例如，DNA)產物的鏈。

如有需要，可以使用任何合適數目的引物組。例如，可以使用約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個引物組。當使用多個引物組時，一個或多個引物組可各自對應於特定的核酸擴增反應或擴增產物。

在一些實施方案中，使用DNA聚合酶。可以使用任何合適的DNA聚合酶，包括可商購的DNA聚合酶。DNA聚合酶通常指能夠以範本結合的方式將核苷酸摻入到DNA鏈中的酶。DNA聚合酶的非限制性實例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段，以及它們的變體、修飾的產物和衍生物。對於某種暖開機聚合酶，可能需要在94℃-95℃下2分鐘至10分鐘的變性步驟，這根據不同的聚合酶可能會改變熱分佈。

在一些實施方案中，使用逆轉錄酶。可使用任何合適的逆轉錄酶。逆轉錄酶通常指在與RNA範本結合時能夠將核苷酸摻入到DNA鏈中的酶。逆轉錄酶的非限制性實例包括HIV-1逆轉錄酶、M-MLV逆轉錄酶、AMV逆轉錄酶、端粒酶逆轉錄酶，以及它們的變體、修飾的產物和衍生物。

在多個方面，使用引物延伸反應來生成擴增產物。引物延伸反應通常包括以下的迴圈：將反應混合物在變性溫度下孵育一段變性持續時間，以及將反應混合物在延伸溫度下孵育一段延伸持續時間。

變性溫度可根據例如所分析的特定生物樣品、生物樣品中靶核酸的特定來源(例如，病毒顆粒、細菌)、所使用的試劑和/或所期望的反應條件而變化。例如，變性溫度可為約80℃至約110℃。在一些實例中，變性溫度可為約90℃至約100℃。在一些實例中，變性溫度可為約90℃至約97℃。在一些實例中，變性溫度可為約92℃至約95℃。在另外其他的實例中，變性溫度可為約80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃。

變性持續時間可根據例如所分析的特定生物樣品、生物樣品中靶核酸的特定來源(例如，病毒顆粒、細菌)、所使用的試劑和/或所期望的反應條件而變化。例如，變性持續時間可以少於或等於300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，變性持續時間可以不超過120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

延伸溫度可根據例如所分析的特定生物樣品、生物樣品中靶核酸的特定來源(例如，病毒顆粒、細菌)、所使用的試劑和/或所期望的反應條件而變化。例如，延伸溫度可為約30℃至約80℃。在一些實例中，延伸溫度可為約35℃至約72℃。在一些實例中，延伸溫度可為約45℃至約65℃。在一些實例中，延伸溫度可為約35℃至約65℃。在一些實例中，延伸溫度可為約40℃至約60℃。在一些實例中，延伸溫度可為約50℃至約60℃。在另外其他的實例中，延伸溫度可為約35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃或80℃。

延伸持續時間可根據例如所分析的特定生物樣品、生物樣品中靶核酸的特定來源(例如，病毒顆粒、細菌)、所使用的試劑和/或所期望的反應條件而變化。例如，延伸持續時間可以少於或等於300秒、240秒、180秒、120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。例如，延伸持續時間可以不超過120秒、90秒、60秒、55秒、50秒、45秒、40秒、35秒、30秒、25秒、20秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。

在所述多個方面的任何方面，可進行多個迴圈的引物延伸反應。可進行任何適當數目的迴圈。例如，進行的迴圈數可以少於約100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5個迴圈。進行的迴圈數可取決於，例如，獲得可檢測的擴增產物(例如，指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物)所必需的迴圈數(例如，迴圈閾值(Ct))。例如，獲得可檢測的擴增產物(例如，指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的DNA產物)所必需的迴圈數可以少於或為約100個迴圈、75個迴圈、70個迴圈、65個迴圈、60個迴圈、55個迴圈、50個迴圈、40個迴圈、35個迴圈、30個迴圈、25個迴圈、20個迴圈、15個迴圈、10個迴圈或5個迴圈。此外，在一些實施方案中，可檢測量的擴增產物(例如，指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的DNA產物)可以以小於100、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10或5的迴圈閾值(Ct)獲得。

擴增產生指示存在所擴增的靶核酸的可檢測量的擴增產物所需的時間可根據從中獲得靶核酸的生物樣品、將要進行的特定核酸擴增反應和所期望的擴增反應的特定迴圈數而變化。例如，靶核酸的擴增可在120分鐘或更短、90分鐘或更短、60分鐘或更短、50分鐘或更短、45分鐘或更短、40分鐘或更短、35分鐘或更短、30分鐘或更短、25分鐘或更短、20分鐘或更短、15分鐘或更短、10分鐘或更短、或者5分鐘或更短的時段產生指示存在靶核酸的可檢測量的擴增產物。

在一些實施方案中，靶RNA的擴增可在120分鐘或更短、90分鐘或更短、60分鐘或更短、50分鐘或更短、45分鐘或更短、40分鐘或更短、35分鐘或更短、30分鐘或更短、25分鐘或更短、20分鐘或更短、15分鐘或更短、10分鐘或更短、或者5分鐘或更短的時段產生指示存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物。

在一些實施方案中，可使反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應。所述多個系列中的單個系列可包括多個迴圈的特定引物延伸反應，該反應的特徵在於，例如，如本文其他地方所述的特定的變性和延伸條件。通常，例如，就變性條件和/或延伸條件而言，每個單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列。例如，就變性溫度、變性持續時間、延伸溫度和延伸持續時間中的任意一個、兩個、三個或全部四個而言，單個系列可不同於所述多個系列中的另一個單個系列。此外，多個系列可包括任何數目的單個系列，例如，至少約或約為2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個單個系列。

例如，多個系列的引物延伸反應可包括第一系列和第二系列。第一系列，例如，可包括超過十個迴圈的引物延伸反應，其中第一系列的每個迴圈包括(i)將反應混合物在約92℃至約95℃下孵育不超過30秒，隨後(ii)將反應混合物在約35℃至約65℃下孵育不超過約一分鐘。第二系列，例如，可包括超過十個迴圈的引物延伸反應，其中第二系列的每個迴圈包括(i)將反應混合物在約92℃至約95℃下孵育不超過30秒，隨後(ii)將反應混合物在約40℃至約60℃下孵育不超過約1分鐘。在這一具體實例中，第一和第二系列在它們的延伸溫度條件上不同。然而，該實例並非意在限制，因為可以使用不同延伸和變性條件的任意組合。

在一些實施方案中，緩變時間(即，熱迴圈儀從一個溫度轉變至另一溫度所花的時間)和/或緩變速率是擴增中的重要因素。例如，擴增產生指示存在靶核酸的可檢測量的擴增產物所需的溫度和時間可根據緩變速率和/或緩變時間而變化。緩變速率可影響用於擴增的溫度和時間。

在一些情況下，緩變時間和/或緩變速率在迴圈之間可以是不同的。然而在一些情況下，迴圈之間的緩變時間和/或緩變速率可以是相同的。緩變時間和/或緩變速率可基於正在處理的樣品進行調整。

在一些情況下，例如可以根據樣品的性質和反應條件來確定不同溫度之間的緩變時間。也可根據樣品的性質和反應條件來確定精確的溫度和孵育時間。在一些實施方案中，可使用多個熱迴圈將單個樣品處理(例如，使之經受擴增條件)多次，各個熱迴圈在例如緩變時間、溫度和/或孵育時間上不同。隨後可為該特定樣品選擇最好或最佳的熱迴圈。這提供了針對被測試的特定樣品或樣品組合裁量熱迴圈的穩健而高效的方法。

在一些實施方案中，靶核酸可在引物延伸反應啟示之前經受變性條件。在多個系列的引物延伸反應的情況下，靶核酸可在執行所述多個系列之前經受變性條件，或者可在所述多個系列之間經受變性條件。例如，靶核酸可在多個系列中的第一系列與第二系列之間經受變性條件。此等變性條件的非限制性實例包括變性溫度分佈(例如，一個或多個變性溫度)和變性劑。

進行多個系列的引物延伸反應的優點可能在於，與在相當的變性和延伸條件下的單一系列的引物延伸反應相比，多個系列的方法以較低的迴圈閾值產生指示在生物樣品中存在靶核酸的可檢測量的擴增產物。與在相當的變性和延伸條件下的單一系列相比，使用多個系列的引物延伸反應可將此等迴圈閾值減少至少約或大約1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。

在一些實施方案中，可在進行引物延伸反應之前預加熱生物樣品。預加熱生物樣品的溫度(例如，預熱溫度)和持續時間(例如，預熱持續時間)可根據例如所分析的特定生物樣品而變化。在一些實例中，可將生物樣品預加熱不超過約60分鐘、50分鐘、40分鐘、30分鐘、25分鐘、20分鐘、15分鐘、10分鐘、9分鐘、8分鐘、7分鐘、6分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、1分鐘、45秒、30秒、20秒、15秒、10秒或5秒。在一些實例中，可在約80℃至約110℃的溫度下預加熱生物樣品。在一些實例中，可在約90℃至約100℃的溫度下預加熱生物樣品。在一些實例中，可在約90℃至約97℃的溫度下預加熱生物樣品。在一些實例中，可在約92℃至約95℃的溫度下預加熱生物樣品。在另外其他的實例中，可在約80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃的溫度下預加熱生物樣品。

在一些實施方案中，對於進行核酸擴增所必需的試劑(包括對於進行平行核酸擴增所必需的試劑)還可包括產生可檢測信號的報告劑，該可檢測信號的存在或不存在指示擴增產物是否存在。可檢測信號的強度可與擴增產物的量成比例。在一些情況下，當擴增產物由與最初擴增的靶核酸不同類型的核酸所生成時，可檢測信號的強度可與最初擴增的靶核酸的量成比例。例如，在通過平行的逆轉錄和擴增從逆轉錄獲得的DNA來擴增靶RNA的情況下，對於這兩個反應所必需的試劑還可包括可產生可檢測信號的報告劑，該可檢測信號指示擴增的DNA產物和/或擴增的靶RNA的存在。可檢測信號的強度可與擴增的DNA產物和/或擴增的原始靶RNA的量成比例。報告劑的使用還使得即時擴增方法成為可能，包括用於DNA擴增的即時PCR。

報告劑可通過共價或非共價方式與包括擴增產物在內的核酸相連接。非共價方式的非限制性實例包括離子相互作用、範德華力、疏水相互作用、氫鍵鍵合及其組合。在一些實施方案中，報告劑可與初始反應物結合，並且報告劑水準的變化可用於檢測擴增產物。在一些實施方案中，報告劑可以僅在核酸擴增進行時是可檢測的(或不可檢測的)。在一些實施方案中，光學活性染料(例如，螢光染料)可用作報告劑。染料的非限制性實例包括SYBR綠，SYBR藍，DAPI，碘化丙啶(propidium iodine)，Hoeste，SYBR金，溴化乙錠，吖啶，原黃素、吖啶橙，吖啶黃，螢光香豆素(fluorcoumanin)，玫瑰樹堿，道諾黴素，氯喹，偏端黴素D，色黴素，胡米溴銨(homidium)，光輝黴素，多吡啶釕(ruthenium polypyridyl)，安麯黴素 (anthramycin)，菲啶和吖啶，溴化乙錠，碘化丙啶，碘化己啶(hexidium iodide)，二氫乙錠，乙錠同型二聚體-1和乙錠同型二聚體-2，單疊氮化乙錠(ethidium monoazide)和ACMA，Hoechst 33258，Hoechst 33342，Hoechst 34580，DAPI，吖啶橙，7-AAD，放線菌素D，LDS751，羥茋巴脒(hydroxystilbamidine)，SYTOX藍，SYTOX綠，SYTOX橙，POPO-1，POPO-3，YOYO-1，YOYO-3，TOTO-1，TOTO-3，JOJO-1，LOLO-1，BOBO-1，BOBO-3，PO-PRO-1，PO-PRO-3，BO-PRO-1，BO-PRO-3，TO-PRO-1，TO-PRO-3，TO-PRO-5，JO-PRO-1，LO-PRO-1，YO-PRO-1，YO-PRO-3，PicoGreen，OliGreen，RiboGreen，SYBR金，SYBR綠I，SYBR綠II，SYBR DX，SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(藍)，SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(綠)，SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)，SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(紅)，螢光素，異硫氰酸螢光素(FITC)，四甲基羅丹明異硫氰酸酯(TRITC)，羅丹明，四甲基羅丹明，R-藻紅蛋白，Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7，德克薩斯紅(Texas Red)，Phar-Red，別藻藍蛋白(APC)，Sybr綠I，Sybr綠II，Sybr金，CellTracker綠，7-AAD，乙錠同型二聚體I，乙錠同型二聚體II，乙錠同型二聚體III，溴化乙錠，傘形酮，曙紅，綠色螢光蛋白，赤蘚紅，香豆素，甲基香豆素，芘，孔雀綠，茋，螢光黃，級聯藍(cascade blue)，二氯三嗪胺螢光素，丹磺醯氯，螢光鑭系絡合物(如那些包括銪和鋱的絡合物)，羧基四氯螢光素，5和/或6-羧基螢光素(FAM)，5-(或6-)碘乙醯胺基螢光素，5-{[2(和3)-5-(乙醯基巰基)-琥珀醯基]氨基}螢光素(SAMSA-螢光素)，麗絲胺羅丹明B磺醯氯，5和/或6羧基羅丹明(ROX)，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，BODIPY螢光團，8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽，3,6- 二磺酸-4-氨基-萘二甲醯亞胺，藻膽蛋白，AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料，DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料，或其他螢光團。

在一些實施方案中，報告劑可以是在與擴增產物雜交時具有光學活性的序列特異性寡核苷酸探針。由於探針與擴增產物的序列特異性結合，寡核苷酸探針的使用可提高檢測的特異性和靈敏度。探針可連接至本文所述的任何光學活性報告劑(例如，染料)，並且還可包括能夠阻斷相關聯的染料的光學活性的猝滅劑。可用作報告劑的探針的非限制性實例包括TaqMan探針、TaqMan Tamara探針、TaqMan MGB探針或Lion探針。

在一些實施方案中，報告劑可以是RNA寡核苷酸探針，其包含光學活性染料(例如，螢光染料)和相鄰地位於探針上的猝滅劑。染料與猝滅劑的緊密靠近可阻斷染料的光學活性。探針可與待擴增的靶序列結合。一旦在擴增期間DNA聚合酶的外切核酸酶活性使探針斷裂，則猝滅劑與染料分離，而遊離的染料重新獲得其光學活性，該活性隨後可被檢測到。

在一些實施方案中，報告劑可以是分子信標(molecular beacon)。分子信標包括，例如，在髮夾構象的寡核苷酸的一端上連接的猝滅劑。在該寡核苷酸的另一端是光學活性染料，例如，螢光染料。在髮夾構型中，光學活性染料和猝滅劑足夠緊密地接近，使得猝滅劑能夠阻斷染料的光學活性。然而，一旦與擴增產物雜交，該寡核苷酸即呈線性構象並與該擴增產物上的靶序列雜交。寡核苷酸的線性化導致光學活性染料與猝滅劑的分離，從而使得光學活性恢復，並且可被檢測到。分子信標對擴增產物上的靶序列的序列特異性可改善檢測的特異性和靈敏度。

在一些實施方案中，報告劑可以是放射性種類。放射性種類的非限制性實例包括¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、Tc99m、³⁵S或³H。

在一些實施方案中，報告劑可以是能夠產生可檢測信號的酶。可檢測信號可通過酶對其底物的活性，或在酶具有多個底物的情況下對特定底物的活性來產生。可用作報告劑的酶的非限制性實例包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、I²-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、乙醯膽鹼酯酶和螢光素酶。

在多個方面，可檢測擴增產物(例如，擴增的DNA產物、擴增的RNA產物)。擴增產物(包括擴增的DNA)的檢測可採用本領域已知的任何合適的檢測方法來實現。所使用的檢測方法的具體類型可取決於，例如，具體的擴增產物，用於擴增的反應容器的類型，反應混合物中的其他試劑，報告劑是否包括在反應混合物中，以及在使用報告劑時所使用的報告劑的具體類型。檢測方法的非限制性實例包括光學檢測、光譜檢測、靜電檢測、電化學檢測等。光學檢測方法包括但不限於螢光測定法和紫外-可見光吸收。光譜檢測方法包括但不限於質譜法、核磁共振(NMR)波譜法和紅外光譜法。靜電檢測方法包括但不限於基於凝膠的技術，例如，凝膠電泳。電化學檢測方法包括但不限於在擴增產物的高效液相色譜分離後對擴增產物的電化學檢測。

在所述多個方面的任何方面，完成方法的要素所需的時間可根據該方法的具體步驟而變化。例如，用於完成方法的要素的時間量可為約5分鐘到約120分鐘。在其他實例中，用於完成方法的要素的時間量可為約5分鐘到約60分鐘。在其他實例中，用於完成方法的要素的時間量可為約5分鐘到約30分鐘。在其他實例中，用於完成方法的要素的時間量可以小於或等於120分鐘，小於或等於90分鐘，小於或等於75分鐘，小於或等於60分鐘，小於或等於45分鐘，小於或等於40分鐘，小於或等於35分鐘，小於或等於30分鐘，小於或等於25分鐘，小於或等於20分鐘，小於或等於15分鐘，小於或等於10分鐘，或者小於或等於5分鐘。

在一些實施方案中，可將關於擴增產物(例如，擴增的DNA產物)的存在和/或量的資訊輸出至接收者。關於擴增產物的資訊可經由本領域已知的任何適宜的方法輸出。在一些實施方案中，此等資訊可口頭提供給接收者。在一些實施方案中，此等資訊可在報告中提供。報告可包括任何數目的所期望的元素，該元素的非限制性實例包括關於受試者(例如，性別、年齡、種族、健康狀況等)的原始資料、經處理的資料(例如，圖形顯示(例如，圖、圖表、資料表、資料匯總)、確定的迴圈閾值、靶多核苷酸起始量的計算值)的資訊，關於是否存在靶核酸的結論，診斷資訊，預後資訊，疾病資訊，等等，及其組合。該報告可作為列印的報告(例如，硬拷貝)提供，或者可作為電子報告提供。在一些實施方案(包括其中提供電子報告的情況)中，此等資訊可經由電子顯示器(例如，電子顯示幕)輸出，諸如監視器或電視、可操作地與用於獲得擴增產物的單元連接的屏、平板電腦屏、移動裝置屏等。列印的報告和電子報告均可分別存儲於檔或資料庫中，使得它們可被訪問以供與以後的報告進行比較。

此外，可使用任何合適的通信介質(包括，例如，網路連接、無線連接或網際網路連接)將報告發送至本地或遠端位置的接收者。在一些實施方案中，可將報告發送至接收者的裝置，諸如個人電腦、電話、平板或其他裝置。該報告可線上觀看、保存在接收者的裝置上或列印。還可通過用於傳送資訊的任何其他合適的手段傳送報告，該手段的非限制性實例包括郵寄硬拷貝報告供接收和/或供接收者查看。

此外，可將此等資訊輸出至各種不同類型的接收者。此等接收者的非限制性實例包括從中獲得生物樣品的受試者、醫師、治療受試者的醫師、用於臨床試驗的臨床監視器、護士、研究人員、實驗室技術員、製藥公司的代表、醫療保健公司、生物技術公司、醫院、人類援助組織、醫療保健管理者、電子系統(例如，存儲例如受試者的醫療記錄的一台或多台電腦和/或一台或多台電腦伺服器)、公共衛生工作者、其他醫務人員和其他醫療設施。

在一個方面，本申請提供了一種實施根據本文所公開的任何方法的方法的系統。在另一個方面，本申請提供了一種用於擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的系統。該系統包括：(a)輸入模組，其接收擴增生物樣品中的靶RNA的用戶請求；(b)擴增模組，其回應於該用戶請求而：在反應容器中接收反應混合物，該反應混合物包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑，該試劑包含(i)逆轉錄酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)針對靶RNA的引物組；及，使反應容器中的反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以生成指示存在靶RNA的擴增DNA產物，每個迴圈包括：(i)將反應混合物在變性溫度下孵育少於或等於60秒的變性持續時間，隨後(ii)將反應混合物在延伸溫度下孵育少於或等於60秒的延伸持續時間，從而擴增靶RNA；及(c)可操作地耦合至該擴增模組的輸出模組，其中該輸出模組將關於靶RNA或DNA產物的資訊輸出至接收者。

在另一個方面，本申請提供了一種用於擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的系統。該系統包括：(a)輸入模組，其接收擴增生物樣品中的靶RNA的用戶請求；(b)擴增模組，其回應於該用戶請求而：(i)在反應容器中接收反應混合物，該反應混合物包含已經從受試者獲得的生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和任選的去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑，該試劑包含(1)逆轉錄酶，和(2)針對靶RNA的引物組；及(ii)使反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物；(iii)檢測(ii)的擴增DNA產物的量；及(iv)將關於擴增DNA產物的量的資訊輸出至接收者，其中用於完成(i)-(iv)的時間量小於或等於約30分鐘；及(c)可操作地耦合至該擴增模組的輸出模組，其中該輸出模組將所述資訊傳送至接收者。

在另一個方面，本申請提供了一種用於擴增存在於從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的系統。該系統包括：(a)輸入模組，其接收擴增生物樣品中的靶RNA的用戶請求；(b)擴增模組，其回應於該用戶請求而：在反應容器中接收反應混合物，該反應混合物包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑，該試劑包含(i)DNA聚合酶和任選的逆轉錄酶，和(ii)針對靶核酸的引物組；及，使反應容器中的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應，以生成指示在生物樣品中存在靶核酸的擴增產物，每個系列包括兩個或更多個如下的迴圈：(i)在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育該反應混合物，隨後(ii)在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育該反應混合物，其中就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列；及(c)可操作地耦合至該擴增模組的輸出模組，其中該輸出模組將關於靶RNA或DNA產物的資訊輸出至接收者。

在另一個方面，本申請提供了一種用於擴增從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸的系統。該系統可包括具有顯示圖形元素的使用者介面的電子顯示幕，該圖形元素可被使用者訪問，以執行用以擴增生物樣品中的靶核酸的擴增方案。該系統還可包括電腦處理器(包括如本文其他地方所述的具有電腦處理器的任何適宜的裝置)，其耦合至該電子顯示幕並被程式設計為在使用者選擇所述圖形元素時執行該擴增方案。該擴增方案可包括：使包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應，以生成擴增產物。該擴增產物可指示生物樣品中靶核酸的存在。此外，每個系列的引物延伸反應可包括兩個或更多個如下的迴圈：在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育反應混合物，隨後在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育反應混合物。就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列可不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列。

在一些實施方案中，靶核酸可與疾病相關。例如，該疾病可與RNA病毒或DNA病毒相關。病毒的實例在本文其他地方提供。在一些實施方案中，該疾病可與致病細菌(如，結核分枝桿菌)或致病原生動物(例如，如瘧疾中的瘧原蟲)(包括本文其他地方描述的此等病原體的實例)相關。在一些實施方案中，該擴增方案可指向基於擴增產物的存在來分析所述疾病的存在。

在一些情況下，使用者介面可以是圖形化使用者介面。此外，使用者介面可包括一個或多個圖形元素。圖形元素可包括圖像和/或文本資訊，如圖片、圖示和文本。圖形元素在使用者介面上可具有不同的尺寸和方向。此外，電子顯示幕可以是任何適宜的電子顯示器，包括本文其他地方描述的實例。電子顯示幕的非限制性實例包括監視器、移動裝置屏、膝上型電腦屏、電視、可擕式視頻遊戲系統屏和計算器屏。在一些實施方案中，電子顯示幕可包括觸控式螢幕(例如，電容式或電阻式觸控式螢幕)，使得在電子顯示幕的使用者介面上顯示的圖形元素可經由使用者觸摸電子顯示幕來選擇。

在一些實施方案中，該擴增方案可進一步包括為靶核酸選擇引物組。在此等情況下，引物組可以是為擴增靶核酸分子的一個或多個序列而特別設計的引物組。在一些實施方案中，該擴增方案可進一步包括選擇對靶核酸分子的一個或多個序列具有特異性的報告劑(例如，包含光學活性種類的寡核苷酸探針或本文其他地方所述的其他類型的報告劑)。此外，在一些實施方案中，該試劑可包括如本文其他地方所述的對於核酸擴增所必需的任何適宜的試劑，例如去氧核糖核酸(DNA)聚合酶、針對靶核酸的引物組以及(任選的)逆轉錄酶。

在一些實施方案中，使用者介面可顯示多個圖形元素。每個圖形元素可與多個擴增方案中的給定擴增方案相關聯。所述多個擴增方案中的每個方案可包括系列引物延伸反應的不同組合。然而，在一些情況下，使用者介面可顯示與同一擴增方案相關聯的多個圖形元素。具有多個各自與給定擴增方案相關聯的圖形元素的使用者介面的實例示於圖28A中。如圖28A所示，與電腦處理器相關聯的示例性電子顯示幕2800包括使用者介面2801。使用者介面2801包括圖形元素2802、2803和2804的顯示。各個圖形元素圖形元素可與特定的擴增方案相關聯(例如，“方案1(Prot.1)”針對圖形元素2802，“方案2(Prot.2)”針對圖形元素2803以及“方案4(Prot.4)”針對圖形元素2804)。一旦使用者選擇(例如，當電子顯示幕2800包括具有使用者介面的觸控式螢幕時，使用者觸摸)特定的圖形元素，與該圖形元素相關聯的特定擴增方案即可由關聯的電腦處理器來執行。例如，當使用者選擇圖形元素2803時，由關聯的電腦處理器來執行擴增“方案2”。儘管在圖28A的示例性使用者介面2801中僅示出三個圖形元素，但使用者介面可具有任何適當數目的圖形元素。此外，儘管圖28A的使用者介面2801中顯示的每個圖形元素僅與一個擴增方案相關聯，但使用者介面的每個圖形元素可與一個或多個擴增方案(例如，一系列的擴增方案)相關聯，使得關聯的電腦處理器在使用者與圖形元素交互後執行一系列的擴增方案。

在一些實施方案中，每個圖形元素和/或可與疾病相關聯，並且所述多個擴增方案中的給定擴增方案可指向測定受試者的疾病的存在。因此，在此等情況下，使用者可選擇圖形元素以便運行一個擴增方案(或一系列的擴增方案)從而分析特定的疾病。在一些實施方案中，該疾病可與病毒(例如，任何RNA病毒或DNA病毒，包括本文其他地方描述的此等病毒的實例)相關。病毒的非限制性實例包括人免疫缺陷病毒I(HIV I)、人免疫缺陷病毒II(HIV II)、正粘病毒、埃博拉病毒、登革病毒、流感病毒(例如，H1N1病毒、H3N2病毒、H7N9病毒或H5N1病毒)、肝炎病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(例如，披甲RNA-丙型肝炎病毒(RNA-HCV))、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、EB病毒、單核細胞增多症病毒、巨細胞病毒、SARS病毒、西尼祿熱病毒、脊髓灰質炎病毒、麻疹病毒、單純皰疹病毒、天花病毒、腺病毒(例如，55型腺病毒(ADV 55)、7型腺病毒(ADV 7))和水痘病毒。在一些實施方案中，該疾病可與致病細菌(例如，結核分枝桿菌)或致病原生動物(例如，瘧疾中的瘧原蟲)(包括本文其他地方描述的此等病原體的實例)相關。

具有多個各自與給定擴增方案相關聯的圖形元素的使用者介面的實例示於圖28B中。如圖28B所示，與電腦處理器相關聯的示例性電子顯示幕2810包括使用者介面2811。使用者介面2811包括圖形元素2812、2813和2814的顯示。各個圖形元素可與特定的疾病相關聯(例如，“埃博拉”針對圖形元素2812，“H1N1”針對圖形元素2813，以及“HepC(丙型肝炎)”針對圖形元素2814)，該疾病又與一個或多個指向特定疾病的擴增方案相關聯。一旦使用者選擇(例如，當電子顯示幕2810包括具有使用者介面的觸控式螢幕時，使用者觸摸)特定的圖形元素，關聯於該圖形元素的與該疾病相關聯的特定擴增方案即可由關聯的電腦處理器來執行。例如，當使用者與圖形元素2812交互時，由關聯的電腦處理器來執行一個或多個與分析埃博拉病毒相關聯的擴增方案。儘管在圖28B的示例性使用者介面2811中僅示出三個圖形元素，但使用者介面可具有各自對應於多種疾病的任何適當數目的圖形元素。此外，儘管圖28B的使用者介面2811中顯示的每個圖形元素僅與一種疾病相關聯，但使用者介面的每個圖形元素可與一種或多種疾病相關聯，使得關聯的電腦處理器在使用者選擇該圖形元素時執行一系列的擴增方案(例如，指向特定疾病的各單個擴增方案)。例如，圖形元素可對應於埃博拉病毒和H1N1病毒，使得該圖形元素的選擇導致關聯的電腦處理器執行針對埃博拉病毒和H1N1病毒兩者的擴增方案。

在多個方面，所述系統包括輸入模組，該輸入模組接收擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核酸(例如，靶RNA、靶DNA)的用戶請求。可使用能夠接收此等用戶請求的任何合適的模組。該輸入模組可包括，例如，包含一個或多個處理器的裝置。包含處理器(例如，電腦處理器)的裝置的非限制性實例包括：臺式電腦、膝上型電腦、平板電腦(例如，Apple^® iPad、Samsung^® Galaxy Tab)、蜂窩電話、智慧型電話(例如，Apple^® iPhone、Android^®支援的電話)、個人數位助理(PDA)、視頻遊戲控制台、電視、音樂播放設備(例如，Apple^® iPod)、視頻播放設備、尋呼機和計算器。處理器可與一個或多個控制器、計算單元和/或電腦系統的其他單元相關聯，或者在需要時植入固件中。如果在軟體中實施，則常式(或程式)可存儲於任何電腦可讀記憶體如RAM、ROM、閃速記憶體、磁片、雷射盤或其他存儲介質中。類似地，該軟體可經由任何已知的傳送方法輸送到裝置，該方法包括，例如，經通信通道，如電話線、網際網路、本地內聯網、無線連接等，或者經由可擕式介質，如電腦可讀磁片、閃盤驅動器等。各個步驟可作為各種區組、操作、工具、模組或技術來實施，後者又可以在硬體、固件、軟體或其任意組合中實施。當在硬體中實施時，這些區組、操作、技術等中的一些或全部可在例如定制積體電路(IC)、專用積體電路(ASIC)、現場可程式設計邏輯陣列(FPGA)、可程式設計邏輯陣列(PLA)等中實施。

在一些實施方案中，輸入模組被配置成接收進行靶核酸擴增的用戶請求。輸入模組可直接地(例如，通過輸入裝置，諸如由使用者操作的鍵盤、滑鼠或觸控式螢幕)或間接地(例如，通過有線或無線連接，包括經網際網路)接收用戶請求。輸入模組可經由輸出電子器件向擴增模組提供使用者的請求。在一些實施方案中，輸入模組可包括使用者介面(UI)，如圖形化使用者介面(GUI)，該使用者介面被配置成能夠使使用者提供擴增靶核酸的請求。GUI可包括文本、圖形和/或音訊成分。GUI可在電子顯示器上提供，該電子顯示器包括含有電腦處理器的裝置的顯示器。此等顯示器可包括電阻式或電容式觸控式螢幕。

使用者的非限制性實例包括從中獲得生物樣品的受試者、醫務人員、臨床醫生(例如，醫生、護士、實驗室技術員)、實驗室人員(例如醫院實驗室技術人員、研究科學家、藥學科學家)、臨床試驗的臨床監視者，或醫療保健行業中的其他用戶等。

在多個方面，所述系統包括擴增模組，該擴增模組用於回應於由輸入模組接收的使用者請求而對靶核酸或其部分進行核酸擴增反應。該擴增模組可以能夠執行本文所述的任何方法，並且可以包括流體處理裝置、一個或多個熱迴圈儀、用於接納一個或多個反應容器(例如，熱迴圈儀的熱塊的孔)的裝置、能夠檢測擴增產物的檢測器(例如，光學檢測器、光譜檢測器、電化學檢測器)以及用於向接收者輸出關於擴增產物(擴增的DNA產物)的存在和/或量的資訊(例如，原始資料，經處理的資料或本文所述的任何其他類型的資訊)的裝置中的任何裝置。在一些情況下，該擴增模組可包括具有如本文其他地方所述的電腦處理器的裝置，並且還可以能夠在適宜軟體的輔助下分析自檢測獲得的原始資料。此外，在一些實施方案中，該擴增模組可包括從輸入模組接收指令所必需的輸入電子器件並且可包括與輸出模組進行通信所必需的輸出電子器件。

在一些實施方案中，向反應容器提供材料、擴增核酸、檢測擴增產物和輸出資訊的一個或多個步驟可由擴增模組自動化操作。在一些實施方案中，自動化操作可包括使用一個或多個流體處理器和相關聯的軟體。可採用若干市售的流體處理系統來運行此等過程的自動化操作。此等流體處理器的非限制性實例包括來自Perkin-Elmer、Caliper Life Sciences、Tecan、Eppendorf、Apricot Design和Velocity 11的流體處理器。

在一些實施方案中，擴增模組可包括即時檢測儀器。此等儀器的非限制性實例包括即時PCR熱迴圈儀、ABI PRISM® 7000序列檢測系統、ABI PRISM® 7700序列檢測系統、Applied Biosystems 7300即時PCR系統、Applied Biosystems 7500即時PCR系統、Applied Biosystems 7900 HT快速即時PCR系統(均來自Applied Biosystems)；LightCycler^TM系統(Roche Diagnostics GmbH)；Mx3000P^TM即時PCR系統、Mx3005P^TM即時PCR系統和Mx4000®多重定量PCR系統(Mx4000® Multiplex Quantitative PCR System)(Stratagene,La Jolla,Calif.)；以及智慧迴圈儀系統(Smart Cycler System)(Cepheid，由Fisher Scientific分銷)。在一些實施方案中，擴增模組可包括另一種自動化儀器，例如，COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®系統(Roche Molecular Systems)、TIGRIS DTS系統(Hologic Gen-Probe,San Diego,CA)、PANTHER系統(Hologic Gen-Probe,San Diego, CA)、BD MAX^TM系統(Becton Dickinson)、GeneXpert系統(Cepheid)、Filmarray®(BioFire Diagnostics)系統、iCubate系統、IDBox系統(Luminex)、EncompassMDx^TM(Rheonix)系統、Liat^TM Aanlyzer(IQuum)系統、Biocartis的Molecular Diagnostic Platform系統、Enigma® ML系統(Enigma Diagnostics)、T2Dx®系統(T2 Biosystems)、Verigene®系統(NanoSphere)、Great Basin的Diagnostic System、Unyvero^TM系統(Curetis)、PanNAT系統(Micronics)或Spartan^TM RX系統(Spartan Bioscience)。

在各個方面，所述系統包含可操作地連接至擴增模組的輸出模組。在一些實施方案中，該輸出模組可包含具有如上所述的用於輸入模組的處理器的裝置。該輸出模組可包括如本文所述的輸入裝置，並且/或者可包括用於與擴增模組通信的輸入電子器件。在一些實施方案中，該輸出模組可以是電子顯示器，在一些情況下，該電子顯示器包括UI。在一些實施方案中，該輸出模組是可操作地耦合至電腦網路如網際網路的通信介面。在一些實施方案中，該輸出模組可使用任何合適的通信媒介(包括電腦網路、無線網路、本地內聯網或網際網路)將資訊至傳送至處於本地或遠端位置的接收者。在一些實施方案中，該輸出模組能夠分析從擴增模組接收到的資料。在一些情況下，該輸出模組包括能夠生成報告並將報告傳送至接收者的報告生成器，其中該報告包含如本文其他地方所述的關於擴增產物的量和/或存在的任何資訊。在一些實施方案中，該輸出模組可回應於從擴增模組接收到的資訊而自動地傳送資訊，例如以原始資料或由包含在擴增模組中的軟體進行的資料分析的形式。或者，該輸出模組可在接收使用者指令後傳送資訊。由輸出模區塊轉送的資訊可以經電子方式進行查看或者由印表機列印出來。

輸入模組、擴增模組和輸出模組中的一種或多種可包含在同一裝置中，或者可包含一種或多種相同的元件。例如，擴增模組也可包含輸入模組、輸出模組或兩者都包含。在其他實例中，包含處理器的裝置既可包含在輸入模組中也可包含在輸出模組中。使用者可使用該裝置來請求對靶核酸進行擴增，並且也可將該裝置用作將關於擴增產物的資訊傳送至接收者的工具。在一些情況下，包含處理器的裝置可包含在全部三種模組中，使得該包含處理器的裝置也可用於控制包含在擴增模組或任何其他模組中的儀器(例如，熱迴圈儀、檢測器、流體處理裝置)，對該儀器提供指令，並接收從該儀器返回的資訊。

用於根據本文所述方法擴增靶核酸的示例性系統示於圖1中。該系統包括既可充當輸入模組的一部分又可充當輸出模組的一部分的電腦101。用戶將包含準備進行核酸擴增的反應混合物的反應容器102放入擴增模組104中。該擴增模組包括熱迴圈儀105和檢測器106。輸入模組107包括電腦101和相關的輸入裝置103(例如，鍵盤、滑鼠等)，輸入裝置103可以接受用戶對反應混合物中的靶核酸進行擴增的請求。輸入模組107將使用者的請求通信至擴增模組104，並且核酸擴增在熱迴圈儀105中開始。隨著擴增進行，擴增模組的檢測器106對擴增產物進行檢測。關於擴增產物的資訊(例如，由檢測器獲得的原始資料)從檢測器106傳送回電腦101，電腦101也充當輸出模組108的元件。電腦101接收來自擴增模組104的資訊，對該資訊進行任何額外的操作，隨後生成包含經處理的資訊的報告。一旦報告生成，電腦101隨後經由電腦網路介面110通過電腦網路(例如，內聯網、網際網路)、經由印表機111以硬拷貝形式或者經由可操作地連接至電腦101的電子顯示器112將報告傳送至其終端接收者109。在一些情況下，電子顯示器112

在一方面，本申請提供了一種包含機器可執行代碼的電腦可讀介質，其被一個或多個處理器執行時，實施根據本文公開的任何方法的方法。在另一方面，本申請提供了一種包含機器可執行代碼的電腦可讀介質，其被一個或多個電腦處理器執行時，實施擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於與去氧核糖核酸(DNA)擴增平行地進行逆轉錄擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶，(ii)DNA聚合酶，和(iii)針對靶RNA的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以生成指示存在靶RNA的擴增DNA產物，每個迴圈包括(i)將反應混合物在變性溫度下孵育少於或等於60秒的變性持續時間，隨後(ii)將反應混合物在延伸溫度下孵育少於或等於60秒的延伸持續時間，從而擴增靶RNA。

在另一方面，本申請提供了一種包含機器可執行代碼的電腦可讀介質，其被一個或多個電腦處理器執行時，實施擴增存在於直接從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，該方法包括：(a)接收已從受試者獲得的生物樣品；(b)提供包含生物樣品和對於進行逆轉錄擴增和任選的去氧核糖核酸(DNA)擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)逆轉錄酶和(ii)針對靶RNA的引物組；(c)使反應混合物經歷多個迴圈的引物延伸反應，以產生指示在生物樣品中存在靶RNA的可檢測量的擴增DNA產物；(d)檢測(c)的DNA產物的量；及(e)將關於DNA產物的量的資訊輸出至接收者，其中用於完成(a)-(e)的時間量小於或等於約30分鐘。

在一方面，本申請提供了一種包含機器可執行碼的電腦可讀介質，其被一個或多個電腦處理器執行時，實施擴增存在於從受試者獲得的生物樣品中的靶核糖核酸(RNA)的方法，該方法包括：(a)提供包含生物樣品和對於進行核酸擴增所必需的試劑的反應容器，以獲得反應混合物，該試劑包含(i)DNA聚合酶和任選的逆轉錄酶，和(ii)針對靶核酸的引物組；及(b)使反應容器中的反應混合物經歷多個系列的引物延伸反應以由靶核酸生成擴增產物，每個系列包括兩個或更多個如下的迴圈：(i)在以變性溫度和變性持續時間為特徵的變性條件下孵育反應混合物，隨後(ii)在以延伸溫度和延伸持續時間為特徵的延伸條件下孵育反應混合物，其中就變性條件和/或延伸條件而言，單個系列不同於所述多個系列中的至少一個其他單個系列。

電腦可讀介質可採取許多形式，包括但不限於，有形(或非暫時性)存儲介質、載波介質或物理傳輸介質。非易失性存儲介質包括，例如，光碟或磁片，如任何電腦中的任何存放裝置等等，例如可用於實施計算步驟、處理步驟等。易失性存儲介質包括動態儲存裝置器，如電腦的主記憶體。有形傳輸介質包括同軸電纜；銅線和光纖，包括電腦系統內包含匯流排的導線。載波傳輸介質可採取電信號或電磁信號或者聲波或光波(如射頻(RF)和紅外(IR)資料通信過程中產生的那些)的形式。因此，電腦可讀介質的常見形式包括，例如：軟碟、柔性盤(flexible disk)、硬碟、磁帶、任何其他磁性介質、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光學介質、穿孔紙帶、任何其他具有孔洞圖案的物理存儲介質、RAM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存儲晶片或匣盒、傳輸資料或指令的載波、傳送此等載波的電纜或鏈路(link)、或電腦可從中讀取程式碼和/或資料的任何其他介質。這些電腦可讀介質形式中的許多可參與將一個或多個指令的一個或多個序列攜帶至處理器以供執行。

實施例實施例1：病毒儲備樣品和生物樣品中的核酸的擴增和檢測

進行擴增和檢測實驗，以比較從病毒標準樣品和生物樣品獲得的結果。使包含RNA病毒病原體的生物樣品和病毒病原體的標準樣品經受擴增條件，從而擴增病原體的RNA。對H3N2和H1N1(2007)流感病毒中的每一個進行一組實驗。各個生物樣品經由口咽拭子直接從受試者獲得。各個病毒標準樣品作為包含病毒的儲備溶液的系列稀釋液而獲得。H3N2和H1N1(2007)的濃度為106IU/mL。對於H5N1和H1N1(2007)，將1/2、1/20、1/200、1/2000和1/20000的稀釋液進行擴增。在各個實驗組中，陰性對照(例如，不包含病毒RNA的樣品)也進行擴增。

將5微升的每個樣品在具有進行病毒RNA的逆轉錄所必需的試劑和完成從逆轉錄獲得的互補DNA的擴增(例如，平行的核酸擴增)所必需的試劑的25μL反應管中合併。進行逆轉錄和DNA擴增所必需的試劑作為市售的預混合物(例如，Qiagen One-Step RT-PCR或One-Step RT-qPCR試劑盒)來提供，該預混合物包含逆轉錄酶(例如，Sensiscript和Omniscript轉錄酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaq DNA聚合酶)和dNTP。此外，該反應管還包含TaqMan探針，該探針包含用於檢測擴增的DNA產物的FAM染料。為了生成擴增的DNA產物，在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育各反應混合物，該方案包括在95℃下5分鐘，隨後在45℃下20分鐘，然後在95℃下2分鐘，並接著進行40個在95℃下5秒和在55℃下30秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

H3N2的擴增結果以圖形示於圖2中(圖2A對應於各個病毒標準樣品，圖2B對應於生物樣品)，而H1N1(2007)的擴增結果以圖形示於圖3中(圖3A對應於各個病毒標準樣品，圖3B對應於生物樣品)。所記錄的FAM染料的螢光相對於迴圈數作圖。

如圖2A所示，各個H3N2病毒標準樣品相對於陰性對照顯示可檢測信號，Ct值範圍為18至32。如圖2B所示，各個病毒H3N2生物樣品相對於陰性對照顯示可檢測信號，Ct值範圍為29-35。

如圖3A所示且除1/20000稀釋液外，各個H1N1(2007)病毒標準樣品相對於陰性對照顯示可檢測信號，Ct值範圍為24-35。如圖3B所示，各個H1N1(2007)生物樣品相對於陰性對照顯示可檢測信號，Ct值範圍為28-35。

總體而言，圖2和圖3中所示的資料表明，在低至50IU/mL的濃度下以及在4-log濃度範圍上，經由擴增的DNA產物可檢測到所測試的病毒，且具有良好的靈敏度，迴圈閾值不超過約40。此外，資料還表明，從獲自受試者的生物樣品中獲得的病毒RNA也可以以類似的方式進行檢測。

實施例2：病毒核酸在不同的緩衝液體系中的擴增和檢測

進行擴增和檢測實驗，以比較使用不同的緩衝液體系進行擴增而獲得的結果。針對兩種不同的緩衝液體系(S1和S2)進行一組實驗。S1緩衝液包含兩性離子緩衝劑和BSA，而S2緩衝液包含兩性離子緩衝劑和氫氧化鈉。使用一組作為包含病毒的儲備溶液的系列稀釋液而獲得的H5N1流感病毒標準樣品來完成針對每種緩衝液的實驗。H5N1的濃度為106IU/mL。對1/2、1/20、1/200、1/2000、1/20000、1/200000稀釋液和陰性對照進行擴增。

將5微升的每種樣品在具有進行病毒RNA的逆轉錄所必需的試劑和完成從逆轉錄獲得的互補DNA的擴增(例如，平行的核酸擴增)所必需的試劑的25μL反應管中合併。進行逆轉錄和DNA擴增所必需的試劑包括逆轉錄酶、DNA聚合酶、dNTP和適宜的S1或S2緩衝液。此外，該反應管還包含TaqMan探針，該探針包含用於檢測擴增的DNA產物的FAM染料。為了生成擴增的DNA產物，在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育各反應混合物，該方案包括在95℃下5分鐘，隨後在45℃下20分鐘，然後在95℃下2分鐘，接著進行40個在 95℃下5秒和在55℃下30秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

緩衝液體系S1的擴增結果以圖形示於圖4A中，而緩衝液體系S2的擴增結果以圖形示於圖4B中。所記錄的FAM染料的螢光相對於迴圈數作圖。

如圖4A所示，在緩衝液體系S1中擴增的各個病毒標準樣品相對於陰性對照顯示可檢測信號，Ct值範圍為25至36。如圖4B所示，在緩衝液S2中擴增的各個病毒標準樣品相對於陰性對照顯示可檢測信號，Ct值範圍為25-35。

總體而言，圖4中所示的資料表明，在低至50IU/mL的濃度下以及在5-log濃度範圍上，經由擴增的DNA產物可檢測到所測試的病毒，且具有良好的靈敏度，迴圈閾值不超過約40。此外，資料還表明，使用不同的緩衝液體系可獲得類似的擴增結果。

實施例3：血漿樣品中的乙型肝炎病毒(HBV)的擴增和檢測

進行擴增實驗，以確定用於檢測生物樣品中的靶核酸的擴增方法的穩健性。對包含不同濃度(例如，50感染單位/毫升(IU/mL)、200IU/mL、2000IU/mL、20000IU/mL)的乙型肝炎病毒(HBV)的稀釋的人血漿樣品分別進行擴增反應。HBV是經由RNA中間體進行複製的DNA病毒。HBV經由DNA病毒的直接PCR是可檢測的。除陰性對照的多個樣品(例如，不包含HBV的血漿)外，也對各個濃度下的多個樣品(n=2-4)進行了測試。

將2.5μL的每個樣品與進行RNA的逆轉錄所必需的試劑和完成從逆轉錄獲得的互補DNA的擴增(例如，平行的核酸擴增)所必需的試劑置於50μL反應管中以獲得反應混合物。進行逆轉錄和DNA擴增所必需的試劑作為市售的預混合物(例如，Qiagen One-Step RT-PCR或One-Step RT-qPCR試劑盒)來提供，該預混合物包含逆轉錄酶(例如，Sensiscript和Omniscript轉錄酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaq DNA聚合酶)和dNTP。此外，該混合物還包含TaqMan探針，該探針包含用於檢測擴增的DNA產物的FAM染料。該反應混合物還包含兩性離子緩衝劑和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)，以阻止在血漿中發現的擴增抑制劑的抑制效果。在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育各反應混合物，該方案包括在94℃下1分鐘，隨後在50℃下10分鐘，然後在94℃下2分鐘，接著進行50個在94℃下5秒和在58℃下35秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

擴增結果以圖形示於圖5中，而所確定的Ct值列表於表1中。在圖5中，所記錄的FAM染料的相對螢光單位(RFU)相對於迴圈數作圖。如圖5和表1所示，HBV在所測試的各個濃度下可以檢測到，迴圈閾值的範圍為28.99至39.39。通常，較高濃度的樣品對應於較低的迴圈閾值。

總體而言，圖5和表1中所示的資料表明，在低至50IU/mL(所測試的最低值)的濃度下，經由擴增的DNA產物可檢測到HBV，且具有良好的靈敏度，迴圈閾值不超過約40。儘管測試的最高濃度(20000IU/mL)比測試的最低濃度(50IU/mL)濃縮了400倍，但對於較低濃度而言，迴圈閾值僅高出約25%，這表明該擴增方案總體上是穩健的。

實施例4：在擴增生物樣品中的核酸前預加熱生物樣品以及一系列的擴增反應

進行擴增實驗，以確定預加熱生物樣品對檢測靈敏度的影響，並且還確定使用多個系列的擴增反應對檢測靈敏度的影響。

製備20份25μL的反應混合物，每份反應混合物包含1μL的致病種類、完成適當的核酸擴增反應(例如，RNA種類的逆轉錄和DNA擴增，以及DNA種類的DNA擴增)所必需的試劑和包含FAM染料的TaqMan探針。其中四份反應混合物包含H1N1(2007)(即，RNA病毒)，四份反應混合物包含H3N2(即，RNA病毒)，四份反應混合物包含H1N1(2009)、四份反應混合物包含結核菌(TB)(即細菌樣品)，而四份反應混合物包含阿留申病病毒(Aleutian disease virus，ADV)(即DNA病毒)。H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2和ADV致病種類來自從受試者獲得的口咽拭子。TB從細菌儲備物獲得。

使用預加熱和擴增方案的各種組合並將其匯總於表2中。對於各種致病種類的第一反應混合物，將致病種類在加入至反應混合物之前在95℃下預加熱10分鐘。在將致病種類加入至反應混合物之後，在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育該反應混合物，該方案包括在95℃下2分鐘，隨後進行40個在95℃下5秒和在55℃下30秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。這些反應混合物被稱為PH-1混合物。

對於各個致病種類的第二反應混合物，將致病種類在加入至反應混合物之前在50℃下預加熱30分鐘。在將致病種類加入至反應混合物之後，在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育該反應混合物，該方案包括40個在95℃下2分鐘，隨後進行在95℃下5秒和在55℃下30秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。這些反應混合物被稱為PH-2混合物。

對於各個致病種類的第三反應混合物，致病種類在加入至反應混合物之前不進行預加熱。在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育這些反應混合物，該方案包括在95℃下1分鐘，隨後在55℃下10分鐘，然後在95℃下2分鐘，接著進行40個在95℃下5秒和在55℃下30秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。這些反應混合物被稱為PTC-1混合物。

對於各個致病種類的第四反應混合物，致病種類在加入至反應混合物之前不進行預加熱。使這些反應混合物經歷包括多個系列的擴增反應的方案，各個系列包括變性和延伸條件的多個迴圈。在即時PCR熱迴圈儀中根據此方案孵育該反應混合物，該方案包括在95℃下1分鐘，隨後進行10個系列1(在95℃下5秒，在60-50℃下20秒(以1℃/步進下降)，及在60℃下10秒)的迴圈，然後在95℃下2分鐘，接著進行40個系列2(在95℃下5秒，在55℃下30秒)的迴圈。系列1和系列2在它們的延伸溫度和延伸持續時間上有所不同。在孵育期間進行擴增產物的檢測。這些反應混合物被稱為PTC-2混合物。

各種致病種類的結果以圖形示於圖6(H1N1(2007))、圖7(H3N2)、圖8(H1N1(2009))、圖9(TB)和圖10(ADV)中。圖6至圖10中的每一個中的A項表示對於反應混合物PH-1和PH-2獲得的結果，而圖6至圖10中的每一個中的B項表示對於反應混合物PTC-1和PTC-2獲得的結果。對各個實驗確定的Ct值匯總於表3中。對於PH-1和PH-2 ADV反應混合物無法確定Ct值，這與圖10A中所示的資料對應。

根據表3所示的數據，PH-1和PH-2反應混合物之間的Ct值非常相似，這表明可以在一系列條件下預加熱致病種類(或包含致病種類的生物樣品)，以獲得類似的檢測靈敏度。此外，PTC-1反應混合物具有與針對PH-1和PH-2反應混合物所確定的Ct值相似的Ct值。PTC-1與PH-1/PH-2方案相似，不同之處在於PTC-1不包括預加熱步驟。因此，PTC-1數據與PH-1/PH-2資料的比較表明：在將致病種類提供至反應混合物之前預加熱該致病種類對於以良好的靈敏度獲得結果可能不是必要的。然而，在使用TB和ADV樣品的一些情況下，預加熱可能比不進行預加熱更差。

然而，對於所測試的所有致病種類，PTC-2的Ct值比PH-1、PH-2或PTC-1中的任何一個的Ct值都低。PTC-1和PTC-2資料的比較表明：使反應混合物經歷多個系列的擴增反應(各個系列包括變性和延伸條件的多個迴圈)可以提高檢測靈敏度。

實施例5：樣品的多重化(Multiplexing)

進行擴增和檢測實驗，以基準化(benchmark)各種擴增方案並確定是否可以實現多重化。使包含RNA(例如，H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2)或DNA(例如，ADV、人博卡病毒(HBoV)病毒病原體或DNA細菌病原體(例如，TB))的生物樣品經受各種擴增條件。除了來自細菌儲備物的TB樣品外，各個生物樣品均經由口咽拭子直接從受試者獲得。將1微升的每個樣品在25μL反應管中與進行核酸擴增和檢測如本文所述的擴增產物所必需的試劑合併，以獲得反應混合物。

為了評估擴增方案的多重化能力，在即時PCR熱迴圈儀中根據擴增方案孵育三種反應混合物(各自包含H3N2、ADV或H3N2與ADV之混合物中的一種)，該擴增方案包括在94℃下2分鐘，在45℃下20分鐘，在94℃下1分鐘，隨後進行50個在94℃下5秒和在55℃下35秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

實驗結果以圖形示於圖11中並在以下示於表4中。如圖11所示，H3N2和TB當組合在一起時或在另一個不存在時都可以相似地被檢測到。當ADV不存在時，對於H3N2反應混合物記錄的Ct值為26.03，而當H3N2不存在時，對於ADV反應混合物記錄的Ct值為30.5。當H3N2和ADV合併為單一反應混合物時，得到26(H3N2)和30(ADV)的Ct值。合併的反應混合物與單一組分反應混合物相比，Ct值幾乎相同。結果表明：能以良好的靈敏度實現多重化，且可檢測RNA和DNA種類兩者。

在另一個評估擴增方案的多重化能力的實驗中，在即時PCR熱迴圈儀中根據擴增方案(包括在95℃下2分鐘，隨後進行40個在95℃下5秒和在55℃下30秒的迴圈)孵育三種反應混合物(各自包含H3N2、TB或H3N2與TB之混合物中的一種)。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

實驗結果以圖形示於圖12中並在以下示於表5中。如圖12所示，H3N2和TB當組合在一起時或在另一個不存在時都可以相似地被檢測到。當TB不存在時，對於H3N2反應混合物記錄到Ct值為32，而當H3N2不存在時，對於TB反應混合物記錄到Ct值為32。當H3N2和TB合併為單一反應混合物時，得到29(H3N2)和30(TB)的Ct值。合併的反應混合物與單一組分反應混合物相比，Ct值相似。結果表明：能以良好的靈敏度實現多重化，並且在多重化方案中，可檢測RNA和DNA種類兩者。

實施例6：多個系列的擴增反應的基準化

進行擴增和檢測實驗，以基準化包括多個系列的擴增反應的各種擴增方案。使包含RNA(例如，H1N1(2007)、H1N1(2009)、H3N2)或DNA(例如，ADV、人博卡病毒(HBoV)病毒病原體或DNA細菌病原體(例如，TB))的生物樣品經受各種擴增條件。除了來自細菌儲備物的TB樣品外，各個生物樣品均經由口咽拭子直接從受試者獲得。將1微升的每個樣品在25μL反應管中與進行核酸擴增和檢測如本文所述的擴增產物所必需的試劑合併，以獲得反應混合物。

在一組實驗中，使擴增混合物經歷包括兩個系列的擴增反應的擴增方案，各個系列包括不同的變性和延伸條件。在即時PCR熱迴圈儀中根據擴增方案孵育六份反應混合物(兩份包含H3N2，兩份包含ADV，兩份包含HBoV)，該擴增方案包括在94℃下1秒，隨後進行11個系列1(在94℃下1秒，並且在45℃下10秒)的迴圈，接著進行40個系列2(在95℃下5秒，並在55℃下30秒)的迴圈。在孵育過程中進行擴增產物的檢測。

實驗結果在以下示於表6中。如表6所示，所確定的Ct值的範圍為8.35至23。結果表明：包括多個系列的擴增反應的方案可用於實現良好的靈敏度。此外，結果還表明：採用包括多個系列的擴增反應的方案可檢測RNA和DNA種類兩者。

在另一組實驗中，使擴增混合物經歷包括三個系列的擴增反應的擴增方案，就其變性和/或延伸條件而言，各個系列彼此不同。在即時PCR熱迴圈儀中根據擴增方案孵育五份反應混合物(一份包含sH1N1(2007)，一份包含H3N2，一份包含pH1N1(2009)，一份包含ADV，且一份包含TB)，該擴增方案包括在94℃下1分鐘，隨後進行5個系列1(在94℃下5秒，以及在60-50℃下30秒(以1℃/步進下降))的迴圈，然後進行5個系列2(在94℃下5秒和在50℃下30秒)的迴圈，隨後在95℃下2分鐘，接著進行40個系列3(在95℃下5秒和在55℃下30秒)的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

實驗結果在以下示於表7中。如表7所示，所確定的Ct值的範圍為20至30。結果表明：包括多個系列的擴增反應的方案可用於實現良好的靈敏度。此外，結果還表明：採用包括多個系列的擴增反應的方案可檢測RNA和DNA種類兩者。

實施例7：多個系列的擴增反應的基準化

進行擴增和檢測實驗，以基準化包括多個系列的擴增反應的各種擴增方案。使包含H3N2的生物樣品經受各種擴增條件。各個生物樣品經由口咽拭子直接從受試者獲得。將1微升的每個樣品在25μL反應管中與進行核酸擴增和檢測如本文所述的擴增產物所必需的試劑合併，以獲得反應混合物。

使擴增混合物經歷擴增方案，一些方案包括擴增反應的三個不同第一系列之一和相同的第二系列，所述三個第一系列包括與第二系列不同的變性和延伸條件。第一系列和第二系列中的每一個包括多個迴圈。另一個實驗在沒有第一系列的情況下進行，其僅包括第二系列。在即時PCR熱迴圈儀中，根據以下表8中所示的擴增方案之一孵育四份包含H3N2的反應混合物中的每一份：

實驗結果以圖形示於圖13中並在以下列於表9中。如圖13所示，反應混合物3具有最高的Ct值(28.59)。其他包括多個系列的反應混合物具有範圍為8.5至26.5的較低值。結果表明：包括多個系列的擴增反應的方案可用於實現良好的靈敏度。此外，結果還表明：包括多個系列的擴增反應的方案與僅具有單一系列的方案相比可達到更佳的靈敏度。

實施例8：多個系列的擴增反應的基準化

進行擴增和檢測實驗，以基準化包括多個系列的擴增反應的各種擴增方案。使包含H3N2的生物樣品經受各種擴增條件。各個生物樣品經由口咽拭子直接從受試者獲得。將1微升的每個樣品在25μL反應管中與如本文所述進行核酸擴增和檢測擴增產物所必需的試劑合併，以獲得反應混合物。

使擴增混合物經歷擴增方案，一些方案包括擴增反應的六個第一系列之一和相同的第二系列，所述六個第一系列包括與第二系列不同的變性和延伸條件。另外六個實驗在沒有第一系列的情況下進行。在即時PCR熱迴圈儀中，根據以下表10中所示的擴增方案之一孵育十二份包含H3N2的反應混合物中的每一份：

實驗結果在以下列於表11中。Ct值範圍為14.53至27.28，且反應混合物2-5沒有檢測到產物。一般而言，未經歷多個系列的擴增反應的反應混合物或者不具有可檢測的產物，或者具有比經歷多個系列的擴增反應的反應混合物更高的Ct值。結果表明：包括多個系列的擴增反應的方案可用於實現良好的靈敏度。此外，結果還表明：包括多個系列的擴增反應的方案與僅具有單一系列的方案相比可達到更佳的靈敏度。在一些情況下，多個系列的擴增反應對於產生可檢測量的擴增產物可能是必需的。

實施例9：比較經純化的和未純化的樣品的結果

進行擴增和檢測實驗，以比較採用經純化的和未純化的樣品獲得的結果。使包含H1N1的經純化的和未純化的生物樣品經歷擴增方案。各個生物樣品經由口咽拭子直接從受試者獲得。將1微升的每個樣品在25μL反應管中與進行核酸擴增和檢測如本文所述的擴增產物所必需的試劑合併，以獲得反應混合物。產生三份反應混合物，其中兩份反應混合物包含通過柱純化或磁性純化之一純化的樣品。第三份反應混合物包含未純化的樣品。

在即時PCR熱迴圈儀中根據擴增方案孵育反應混合物，該擴增方案包括在94℃下2分鐘，在45℃下20分鐘，在94℃下1分鐘，隨後進行50個在94℃下5秒和在55℃下35秒的迴圈。在孵育過程中進行擴增產物的檢測。

實驗結果以圖形示於圖14中並在以下示於表12中。如表12所示，所確定的Ct值的範圍為27至31，且在未純化的樣品與通過各種手段純化的樣品之間是相似的。結果表明：樣品的純化對於達到類似的檢測靈敏度可能不是必要的。

實施例10：全血和唾液樣品的分析

對包含H3N2病毒的血液和唾液樣品進行擴增和檢測實驗。測試了四種不同的樣品。兩種樣品包含全血或唾液樣品之一，兩種樣品包含全血或唾液樣品之一的10倍稀釋液(在PBS中)。將這四種樣品中的每一種與進行病毒RNA的逆轉錄所必需的試劑和完成從逆轉錄獲得的互補DNA的擴增所必需的試劑合併。進行逆轉錄和DNA擴增所必需的試劑作為市售的預混合物(例如，Takara One-Step RT-PCR或One-Step RT-qPCR試劑盒)來提供，該預混合物包含逆轉錄酶(例如，Sensiscript和Omniscript轉錄酶)、DNA聚合酶(例如，HotStarTaq DNA聚合酶)和dNTP。此外，該反應管還包含TaqMan探針，該探針包含用於檢測擴增的DNA產物的FAM染料。為了生成擴增的DNA產物，在即時PCR熱迴圈儀中根據變性和延伸條件的方案孵育各反應混合物，該方案包括在45℃下20分鐘，隨後在94℃下2分鐘，接著進行42個在94℃下5秒和在55℃下35秒的迴圈。在孵育期間進行擴增產物的檢測。

H3N2的擴增結果以圖形示於圖15(圖15A對應於未稀釋的血液，圖15B對應於稀釋的血液)和圖16(圖16A對應於未稀釋的唾液，圖16B對應於稀釋的唾液)中。所記錄的FAM染料的螢光相對於迴圈數作圖。

如圖15和圖16所示，未稀釋的和經稀釋的血液和唾液反應混合物均顯示可檢測信號，Ct值的範圍為24-33。因此，圖15和圖16所示的資料表明：能以良好的靈敏度分析未稀釋的生物樣品，Ct值不大於約40。此外，資料還表明：在樣品的稀釋對於分析是必要的情況下，也可以以類似的方式檢測擴增產物。在一些情況下，如果來自樣品的抑制劑太多，稀釋可以為用於消除來自樣品(例如，全血)的抑制的另一種方式。

實施例11：巢式PCR

對含有H1N1病毒的樣品進行擴增和檢測實驗。測試了八個樣品。每個樣品均包括H1N1(2007)病毒儲備物。將樣品分別在PBS中按以下表13中所示的稀釋度進行稀釋。病毒儲備物的濃度為1x106IU/mL。為了生成擴增的DNA產物，根據變性和延伸條件的方案對包含給定樣品的反應混合物進行孵育。該方案包括：(i)在第一次運行中，將混合物在熱迴圈儀中在94℃下加熱1分鐘，隨後進行10或15個如下迴圈(如以下表13所示)：在94℃下5秒和在57℃下10秒；以及(ii)在第二次運行中，將混合物在熱迴圈儀中在94℃下加熱1分鐘，隨後進行35個如下迴圈：在94℃下5秒和在57℃下30秒。將1μL系列稀釋樣品添加至25μL反應體積的Takara One-step qPCR預混合物中。在第一次運行經過某些迴圈後，將來自於該反應的1μL添加至第二次運行的反應混合物中。H1N1的擴增結果以圖形示於圖17中。該圖顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。8個樣品(1-8)中的每一個的曲線圖均已在該圖中示出。具有可檢測信號的樣品具有表13所示的Ct值。

實施例12：埃博拉重組質粒的擴增和檢測

對人全血樣品進行擴增和檢測實驗，該樣品包含不同拷貝數的與薩伊埃博拉病毒(Zaire-EBOV)相對應的重組質粒。測試了八個樣品。其中六個樣品包含特定拷貝數(250000、25000、2500、250、 25和2.5個拷貝)的重組質粒，而兩個樣品(一個僅含有血液，一個僅含有水)作為對照樣品。在未進行樣品純化的情況下對全血樣品進行了分析。

將每個樣品與對於核酸擴增所必需的試劑(例如，DNA聚合酶、dNTP、引物、輔因數、合適的緩衝液、引物等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成反應混合物。按照樣品編號對各反應混合物的匯總(包括重組質粒的拷貝數)示於表14中。為了生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。所述兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行15個在95℃下1秒和在45℃下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行45個在95℃下5秒和在55℃下10秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線並獲得Ct值。該實驗的擴增曲線以圖形示於圖18中，每條曲線均用與表14中示出的樣品編號相對應的樣品編號標出。圖18所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。由示於圖18中的曲線獲得的Ct值匯總於表15中。

如圖18所示，除樣品6外，對於所有包含重組質粒的樣品，均經由擴增產物檢測到重組質粒。此外，在任一對照樣品(樣品7和8)中均未檢測到重組質粒。因此，圖18所示的結果表明，在一些情況下，使用多個系列的變性和延伸條件，並且在不進行樣品純化的情況下，可獲得25個質粒拷貝/反應(rxn)的檢測靈敏度。

實施例13：埃博拉病毒的擴增和檢測

對包含不同拷貝數的薩伊埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血樣品進行擴增和檢測實驗。一式兩份測試了八種樣品(重複組1和重複組2)，共16個樣品。其中六種樣品包含特定拷貝數(2500000、250000、25000、2500、250和25個拷貝)的假病毒，而兩種樣品(一種僅含有血液，一種僅含有水)作為對照樣品。在未進行樣品純化的情況下對全血樣品進行了分析。

將每個樣品與對於逆轉錄和核酸擴增所必需的試劑(例如，逆轉錄酶、DNA聚合酶、dNTP、輔因數、引物、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成30μL反應混合物。反應混合物按樣品編號的匯總(包括假病毒的拷貝數)示於表16中。為了由假病毒生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行15個在95℃下1秒和在45℃下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行45個在95℃下5秒和在55℃下10秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線並獲得Ct值。該實驗的擴增曲線以圖形示於圖19A(重複組1)和圖19B(重複組2)中，每條曲線均用與表16中示出的那些樣品編號相對應的樣品編號標出。圖19A和圖19B所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。由示於圖19A和圖19B中的曲線獲得的Ct值匯總於表17中，其中“Ct1”對應於重複組1，而“Ct2”對應於重複組2。

如圖19A和圖19B所示，對於所有包含假病毒的樣品(樣品1-6)，經由擴增產物在兩個重複組中均檢測到假病毒。此外，在任何對照樣品(樣品7和8)中均未檢測到假病毒。因此，圖19A和圖19B所示結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件在不進行樣品純化的情況下獲得25個病毒拷貝/反應的檢測靈敏度。

實施例14：埃博拉病毒的擴增和檢測

對包含不同拷貝數的薩伊埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血樣品進行擴增和檢測實驗。測試了八個樣品。其中六個樣品包含特定拷貝數(2500000、250000、25000、2500、250和25)的假病毒，而兩個樣品(一個含有20000個拷貝的假病毒陽性對照，一個僅含有水)作為對照樣品。在未進行樣品純化的情況下對全血樣品進行了分析。

將每個樣品與對於逆轉錄和核酸擴增所必需的試劑(例如，逆轉錄酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成30μL反應混合物。各反應混合物按樣品編號的匯總(包括假病毒的拷貝數)示於表18中。為了由假病毒生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行15個在95℃下1秒和在45℃下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行35個在95℃下5秒和在55℃下10秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線並獲得 Ct值。該實驗的擴增曲線以圖形示於圖20中，每條曲線均用與表18中示出的那些樣品編號相對應的樣品編號標出。圖20所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。由示於圖20中的曲線獲得的Ct值匯總於表19中。

如圖20所示，對於所有包含假病毒的樣品(樣品1-6)，包括包含陽性對照假病毒的樣品(樣品7)，經由擴增產物均檢測到假病毒。此外，在僅含水的對照樣品(樣品8)中未檢測到假病毒。因此，圖20所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件在不進行樣品純化的情況下獲得25個病毒拷貝/反應的檢測靈敏度。

實施例15：埃博拉病毒的擴增和檢測

對包含兩種拷貝數(250個拷貝/反應或25個拷貝/反應)之一的薩伊埃博拉病毒(Zaire-EBOV)假病毒的人全血樣品進行擴增和檢測實驗。對於總共八個樣品，每個全血樣品均使用四種試劑體系之一進行測試。每種試劑體系(B-1、B-2、B-3和B-4)均包含對於逆轉錄和核酸擴增所必需的試劑(例如，逆轉錄酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)。每種不同的試劑體系在試劑體系中含有不同濃度的多種組分。將每個全血樣品與其適當的試劑體系合併成30μL的反應混合物。各反應混合物按樣品編號的匯總(包括假病毒的拷貝數和試劑體系)在以下示於表20中。為了由假病毒生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行15個在95℃下1秒和在45℃下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行40個在95℃下5秒和在55℃下10秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線並獲得Ct值。該實驗的擴增曲線以圖形示於圖21中，每條曲線均用與表20中所示的那些樣品編號相對應的樣品編號標出。圖21所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。由示於圖21中的曲線獲得的Ct值匯總於表21中。

如圖21所示，對於所有樣品，包括含有25個拷貝/反應的樣品，經由擴增產物均檢測到假病毒。因此，圖21所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件，使用不同的試劑體系，且在不進行樣品純化的情況下，獲得25個病毒拷貝/反應的檢測靈敏度。

實施例16：薩伊埃博拉病毒的即時PCR檢測

使用本發明的一步(one-step)qPCR方法來分析患者血清樣品的薩伊埃博拉病毒。該樣品未經純化。該樣品包括九個薩伊埃博拉病毒陽性樣品和七個薩伊埃博拉病毒陰性樣品。使用Roche LC96即時PCR系統。

本實施例中用於分析樣品的程式示於表22中。

該一步qPCR方法的結果示於表23中。與經驗證的試劑和方法相比，該一步qPCR方法在測試薩伊埃博拉病毒方面顯示出100%的一致性。

實施例17：瘧疾的擴增和檢測

對包含未知濃度的瘧疾病原體的人全血樣品進行擴增和檢測實驗。完成了兩組實驗。在第一組實驗中，對人全血樣品的1：4稀釋液(在1X PBS中)完成了重複實驗；對包含全血和與瘧疾病原體相對應的質粒的樣品完成了實驗；並且對僅含水的對照完成了實驗。在第二組實驗中，對包含人全血樣品在1X PBS中的多個稀釋液(1：4、1：40、1：400、1：4000、1：40000和1：400000)的樣品與僅有血液和僅有水的對照樣品完成了實驗。在未進行樣品純化的情況下分析了全血樣品。

將每個樣品與對於核酸擴增所必需的試劑(例如，DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成30μL反應混合物。第一組實驗的反應混合物按樣品編號的匯總(包括稀釋度)示於表24中。第二組實驗的反應混合物按樣品編號的匯總(包括稀釋度)示於表25中。為了由瘧疾病原體生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行13個在95℃下1秒和在45℃下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行45個在95℃下5秒和在55℃下10秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線。第一組實驗的擴增曲線以圖形示於圖22A中，而第二組實驗的擴增曲線以圖形示於圖22B中。各條曲線分別用其在表24和表25中相應的樣品編號標出。圖22A和圖22B所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。

如圖22A所示，對於包含全血樣品(樣品1和2)的兩種反應混合物以及對於包含重組質粒的陽性對照(樣品3)，經由擴增產物檢測到瘧疾病原體。此外，在僅有水的對照樣品(樣品4)中未檢測到瘧疾病原體。因此，圖22A所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件在不進行樣品純化的情況下對瘧疾病原體進行檢測。

如圖22B所示，對於包含全血樣品(樣品1-6)的所有反應混合物，經由擴增產物檢測到瘧疾病原體。此外，在僅有水和僅有血液的對照樣品(樣品7和8)中未檢測到瘧疾病原體。因此，圖22B所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件且在不進行樣品純化的情況下，在高達1：400000的稀釋度下檢測病原體，包括瘧疾病原體。

實施例18：登革病毒的擴增和檢測

對從包含未知濃度的登革病毒的培養物中獲得的樣品進行擴增和檢測實驗。完成了三組實驗。在第一組實驗中，對未稀釋的培養物完成了重複實驗；對培養物的1：10稀釋液完成了實驗；並對僅有水的對照完成了實驗。在第二組實驗中，對培養物的多個稀釋液(未稀釋、1：10、1：100、1：1000、1：10000、1：100000和1：1000000)以及僅有水的對照樣品完成了實驗。在第三組實驗中，對培養物的多個稀釋液(未稀釋、1：10、1：100、1：1000和1：10000)以及僅有水的對照樣品完成了實驗。在未進行樣品純化的情況下分析了培養物樣品。

將2μL的每個樣品與對於逆轉錄和核酸擴增所必需的試劑(例如，逆轉錄酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成30μL反應混合物。關於反應混合物的匯總(包括稀釋度)，第一組實驗的示於表26中，第二組實驗的示於表27中，而第三組實驗的示於表28中。為了由病毒生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，在42℃下1分鐘，進行10個在95℃下5秒和在45℃下10秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行45個在95℃下5秒和在55℃下10秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線。第一組實驗的擴增曲線以圖形示於圖23A中，第二組實驗的擴增曲線以圖形示於圖23B中，而第三組實驗的擴增曲線以圖形示於圖 23C中。每條曲線分別用其在表26、表27和表28中相應的樣品編號標出。圖23A、圖23B和圖23C所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。由示於圖23A、圖23B和圖23C中的曲線獲得的Ct值分別示於表26、表27和表28中。

如圖23A所示，對於包含病毒的三種反應混合物(樣品1-3)，經由擴增產物檢測到病毒。此外，在僅有水的對照樣品(樣品4)中未檢測到病毒。因此，圖23A所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的延伸和變性條件檢測登革病毒。

如圖23B所示，對於包含登革病毒並且未稀釋(樣品1)或稀釋至最高達1：1000(樣品2、3和4)的反應混合物，經由擴增產物檢測到病毒。然而，未確定1：1000反應混合物(樣品4)的Ct值。在較高稀釋度(樣品5、6和7)或在僅有水的對照樣品(樣品8)中均未檢測到病毒。因此，圖23B所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件並在不進行樣品純化的情況下，在最高達1：1000的稀釋度時檢測到病毒，其中在最高達1：100的稀釋度時可產生Ct值。

如圖23C所示，對於包含登革病毒並且未稀釋(樣品1)或稀釋至最高達1：1000(樣品2、3和4)的反應混合物，經由擴增產物檢測到病毒。然而，未確定1：1000反應混合物的Ct值。在較高稀釋度(樣品5)或在僅有水的對照樣品(樣品6)中均未檢測到病毒。因此，圖23C所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的變性和延伸條件並在不進行樣品純化的情況下，在最高達1：1000的稀釋度時檢測到病毒，其中在最高達1：100的稀釋度時可產生Ct值。

實施例19：單核苷酸多態性(SNP)的檢測

對包含特定基因型的細胞色素P450 2C19、CYP2C19*2(具有 “GA”基因型)或CYP2C19*3(具有“GG”基因型)的人口咽拭子或血液樣品進行擴增和檢測實驗。進行了兩組實驗一一組針對從人口咽拭子獲得的樣品且一組針對從血液獲得的樣品。在第一組實驗中，在未進行樣品純化的情況下分析了從人口咽拭子獲得的七個不同的樣品。在第二組實驗中，在未進行樣品純化的情況下分析了五個不同的血液樣品。

將每個樣品與對於核酸擴增所必需的試劑(例如，DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及兩種報告劑(例如，用於檢測核酸擴增的包含FAM染料的寡核苷酸探針，用於檢測“GA”基因型的包含德克薩斯紅染料的寡核苷酸探針)合併成反應混合物。為了產生擴增產物，使各反應混合物經歷熱迴圈方案，該方案包括在95℃下5分鐘，隨後進行50個在95℃下5秒和在49℃下10秒的迴圈。在熱迴圈過程中，記錄來自報告劑的信號以產生擴增曲線。第一組實驗(人口咽拭子)的擴增曲線以圖形示於圖24A(對應於FAM寡核苷酸探針的信號)和圖24B(對應於德克薩斯紅寡核苷酸探針的信號)中。第二組實驗(血液樣品)的擴增曲線以圖形示於圖25A(對應於FAM寡核苷酸探針的信號)和圖25B(對應於德克薩斯紅寡核苷酸探針的信號)中。圖24A、圖24B、圖25A和圖25B所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。每條曲線均用其在表29(口咽拭子實驗)或表30(血液實驗)中相應的反應混合物編號標出。由擴增曲線確定的Ct值也與確定的基因型一起示於表29或表30中。在圖24B或圖25B中，在觀察到來自德克薩斯紅的信號的擴增曲線中，確定相應的反應混合物具有“GA”基因型。此外，在圖24B或圖25B中，在未觀察到來自德克薩斯紅的信號的擴增曲線中，確定相應的反應混合物具有“GG”基因型。

如圖24A所示，對於含有從口咽拭子獲得的樣品的每種反應混合物均觀察到擴增產物，表明發生了核酸的擴增。然而，如圖24B所示，僅在一些含有從口咽拭子獲得的樣品的反應混合物(反應混合物1、4、6和7)中觀察到擴增產物，這些反應混合物對應於“GA”基因型。在其他反應混合物(反應混合物2、3和5)中，未觀察到擴增產物，這些反應混合物對應於“GG”基因型。使用從口腔拭子樣品提取的DNA通過擴增和檢測實驗驗證了圖24A和24B所示的結果(資料未示出)。因此，圖24A和圖24B所示的結果表明，在一些情況下，可通過即時擴增在不進行樣品純化的情況下檢測從口咽拭子獲得的樣品中的SNP。

如圖25A所示，對於含有從血液獲得的樣品的每種反應混合物均觀察到擴增產物，表明發生了核酸的擴增。然而，如圖25B所示，僅在一些含有從血液獲得的樣品的反應混合物(反應混合物1、2和5)中觀察到擴增產物，這些反應混合物對應於“GA”基因型。在其他反應混合物(反應混合物3和4)中，未觀察到擴增產物，這些反應混合物對應於“GG”基因型。使用核酸測序驗證了圖25A和25B所示的結果。因此，圖25A和圖25B所示的結果表明，在一些情況下，可通過即時擴增在不進行樣品純化的情況下檢測從血液獲得的樣品中的SNP。

實施例20：55型腺病毒(ADV55)和7型腺病毒(ADV7)的擴增和檢測

對從口咽拭子獲得的包含不同拷貝數的55型腺病毒(ADV55)或未知濃度的7型腺病毒(ADV7)的樣品進行擴增和檢測實驗。完成了兩組實驗一一組針對具有ADV55的樣品且一組針對采有ADV7的實驗。在第一組實驗中，在未進行樣品純化的情況下完成了採用包含不同拷貝數(1、10、100、1000、10000和100000個拷貝)的ADV55的樣品的六個不同實驗，並一起完成了陰性對照實驗。在第二組實驗中，在未進行樣品純化的情況下，完成了採用包含未知拷貝數的ADV7的樣品的八個不同實驗。

將每個樣品與對於核酸擴增所必需的試劑(例如，DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成反應混合物。對第一組實驗的反應混合物的匯總(包括ADV55的拷貝數)示於表31中。為了由病毒生成擴增產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行20個在95℃下1秒和在45℃ 下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行35個在95℃下5秒和在60℃下34秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線並獲得Ct值。第一組實驗的擴增曲線以圖形示於圖26A中，每條曲線均用與表31中示出的那些反應混合物編號相對應的反應混合物編號標出。第二組實驗的擴增曲線以圖形示於圖26B中並且相應的Ct值示於表32中。擴增曲線被標記為使得圖26B中的擴增曲線與表32所示的反應混合物編號相對應。圖26A和圖26B所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。

如圖26A所示，對於所有包含含有病毒的樣品的反應混合物(反應混合物1-6)，經由擴增產物均檢測到ADV55。此外，在陰性對照反應混合物(反應混合物7)中未檢測到病毒。因此，圖26A所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的延伸和變性條件，在不進行樣品純化的情況下且在多種稀釋水準下檢測ADV55病毒。

如圖26B所示，對於所有反應混合物經由擴增產物均檢測到ADV7。因此，圖26B所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的延伸和變性條件且在不進行樣品純化的情況下檢測ADV7病毒。

實施例21：披甲RNA丙型肝炎病毒(RNA-HCV)的擴增和檢測

對包含不同拷貝數的披甲RNA丙型肝炎病毒(RNA-HCV)的血漿樣品進行擴增和檢測實驗。在未進行樣品純化的情況下完成了採用包含不同拷貝數(10、100和500個拷貝)的RNA-HCV的樣品的三個不同實驗，並一起完成了針對陰性對照的實驗。

將每個樣品與對於逆轉錄和核酸擴增所必需的試劑(例如，逆轉錄酶、DNA聚合酶、引物、dNTP、輔因數、合適的緩衝液等)以及報告劑(例如，包含FAM染料的寡核苷酸探針)合併成反應混合物。反應混合物的匯總(包括RNA-HCV的拷貝數)示於表33中。為了由病毒生成擴增的DNA產物，使各反應混合物經受兩個系列的變性和延伸條件。這兩個系列如下：(i)在第一系列中，進行20個在95℃下1秒和在45℃下1秒的迴圈，隨後在95℃下1分鐘；及(ii)在第二系列中，進行55個在95℃下5秒和在60℃下34秒的迴圈。在第二系列期間，記錄來自於報告劑的信號從而產生擴增曲線。第一組實驗的擴增曲線以圖形示於圖27中，每條曲線用與表33中示出的反應混合物編號相對應的編號標出。圖27所示的結果顯示了作為迴圈數的函數的所記錄的相對螢光單位(RFU)。

如圖27所示，對於所有包含含有病毒的樣品的反應混合物(反應混合物1-3)，經由擴增產物均檢測到RNA-HCV。此外，在陰性對照反應混合物(反應混合物4)中未檢測到RNA-HCV。因此，圖27所示的結果表明，在一些情況下，可使用多個系列的延伸和變性條件在不進行樣品純化的情況下檢測RNA-HCV。也可達到10個拷貝/反應的檢測靈敏度。

儘管本文中已經示出並描述了本發明的優選實施方案，但對本領域技術人員而言顯而易見的是，這些實施方案僅僅是以示例的方式提供的。本領域技術人員在不背離本發明的情況下，現將想到大量變化、改變和替代。應當理解，本文描述的本發明實施方案的各種替代方案可用于實施本發明。目的在於，用以下權利要求限定本發明的範圍，由此涵蓋在這些權利要求範圍內的方法和結構及其等同物。