TWI681054B - 癌症對ｈｅｃ１活性調節因子反應之生物標記 - Google Patents

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Abstract

所使用之組合物和方法係作為與Hec1抑制劑一起治療腫瘤疾病相關的生物標誌物和方法。Hec1(HEC)、Rb(RB1)及/或p53(TP53)之基因狀態及/或表現量可作為對Hec1抑制劑治療之敏感性的生物標記。此外，Hec1抑制劑與細胞毒性藥物結合使用時，能表現出協同效應。

Description

癌症對HEC1活性調節因子反應之生物標記
本發明係關於鑑定和使用判斷增生性疾病對於分子標靶治療劑之靈敏度的生物標記，特別是對於HEC1抑制劑與細胞毒性劑組合物者。
在2012年美國有超過160萬個新癌症診斷病例，且有約580,000人死於癌症。癌症是目前美國第二個最常見的致死病因，其致死疾病首位為心臟病。雖然在過去的十年中，各種新的癌症治療方法已被開發，在1999年和2006年之間，所有診斷出癌症的5年相對生存率為68%，估計死亡率在肺癌之男性和女性分別為28%和26%，女性乳癌是15%，前列腺癌是11%。這些統計資料說明我們現在迫切需要改善的現有的治療方法。
個人化醫療有革命性的試驗及除錯過程，因此目前的醫學治療和改善患者的反應率可利用生物標誌物，以更有效地預測病人對藥物的反應，並減少花費在無效的治療上的時間，促進疾病治療的演進。在某些情況下，這種做法可更加有針對性，從而更有效地治療，強調生物標記客製化之病患治療方案的潛在利益，提高治療成功率。
舉例而言，在第47屆美國臨床腫瘤學會會議(2011年6月)，Tsimberidou等人從MD安德森癌症中心(Anderson Cancer Center)提出了一份報告，其敘述在175例帶有基因畸變的病患中，成功以目標為BRAF、PIK3CA、mTOR、BRAF、MEK、multikinases、KIT或EGFR做治療。這項研究說明，有針對性的治療反應率為27%，而不相符的治療的患者反應率為5%。Duffy and Crown(Clinical Chemistry, 2008,54(11)：1770-1779)曾發表其他標誌物，其對個人化醫療上對治療有改善效果。此文及其他外部引用之全部內容係經本文引用，而可併入本文所討論的範疇。當所引用文獻之詞語定義或所使用的術語，與本文所提不一致時 或有矛盾時，則該詞語的定義系依照本文所提供，而不適用於引用文獻的定義。
錯誤的染色體分離，以及有絲分裂增殖失調是腫瘤疾病的特點。然而，儘管有越來越多的腫瘤標記，但是仍然缺乏針對主軸和著絲粒的調控或控制有絲分裂關卡的藥物適用指標性標記。舉例而言，Hec1則為紡錘體檢驗點之關鍵要角，在癌症和細胞分裂過程高度表現，有助於確保染色體正確分離。近期有研究發表一些潛在有力的Hec1抑制劑，(請參WO 2011/115998 to Lau and Huang；Qiu et al in J.Med.Chem.,2009,52(6)：1757-1767；Wu et al in Cancer Res.,2008 Oct 15,68(20)：8393-9)。同時，至少有一些化合物已表現出了令人期待的結果，然而，目前以這類化合物治療成功的案例仍未增加。
因此，目前亟需開發對Hec1活性的調製子具反應的癌症生物標記。
本發明旨在提供一種關於癌症疾病治療之分子標記及方法，其中該疾病係以Hec1抑制劑治療之。更具體地，本發明已發現Hec1(HEC)、Rb(RB1)及/或p53(TP53)之基因狀態及/或表現量量可作為對於Hec1抑制劑治療之敏感性預測的生物標記，其中該狀態係以原生型(wild-type)與不足及/或缺少之突變基因表現作比較。
因此，本發明實施目的之一在於判斷用於確定增生性疾病，如：癌症，對於Hec1抑制劑或Hec1標靶化合物之敏感度的生物標記。因此，擬提供一判斷病患體內之增生性疾病及/或癌症細胞對於Hec1抑制劑之敏感度，包含判斷病患樣本中Hec1、Rb及p53之一或多項的狀態及/或表現量之步驟。前述判斷步驟包含形成一可被偵測的複合物，以取得一測試結果。在一些實施例中，前述測試結果中所含Hec1、Rb及p53之一或多項狀態及/或表現量，可與一非癌症細胞的對照結果做比較。
本發明之又一實施例旨在提供一種篩選一病患及/或評估一病患是否患有一具可以Hec1抑制劑治療的增生性或癌症疾病的方法，其包含判斷一病患樣本中Hec1、Rb及p53之一或多項之狀態及/或表現量之步 驟。前述判斷可包含形成一可被偵測的複合物，以取得一測試結果。在一些實施例中，前述測試結果中所含Hec1(HEC)、Rb(RB1)及p53(TP53)之一或多項狀態及/或表現量，可與一對照細胞做比較以判斷敏感度。前述敏感度可來提供一評估或篩選結果。
本發明之一些實施例可判斷Hec1的表現量；在這些實施例中，表現量的增加可做為一癌症細胞或增生性細胞對於Hec1抑制劑的敏感度指標。在本發明其他實施例中，可判斷Rb及p53至少其一的狀態；在這些實施例中，Rb及/或p53的缺少或是Rb及/或p53的突變可作為一癌症細胞或增生性細胞對於Hec1抑制劑的敏感度指標。可透過Hec1、Rb及/或p53之核酸編碼定量來判斷Hec1、Rb及p53之狀態及/或表現量，其可透過將Hec1、Rb及/或p53之核酸編碼定序或雜交或或前述方法之結合。另外，Hec1、Rb及/或p53之狀態及/或表現量可透過將Hec1蛋白、Rb蛋白及p53蛋白定量及/或定序。在本發明一些實施例中，Hec1、Rb及/或p53核酸和蛋白皆被使用。
本發明再一實施例中，提供一種評估一病患是否患有一具Hec1抑制劑潛在治療性之癌症疾病的方法，其包含：判斷病患樣本中癌症疾病之分子型態及判斷Hec1、Rb及p53至少其一之表現量的分子型態。前述判斷可包含形成一可被偵測的複合物，以取得一評估結果。在這樣的實施例中，與一對照結果相對較高的Hec1表現量，或是與一對照結果相對有突變或缺少Rb及/或p53的存在，係代表癌症細胞對Hec1抑制劑的適用指標。在這些實施例中，癌症疾病包含，但不限於乳癌、肺癌、大腸癌及肝癌。
本發明之又一實施例中，提供一種治療對於Hec1抑制劑敏感之癌症細胞的方法，其透過將前述癌症細胞與一Hec1抑制劑，與一可達到對於抑制前述癌症細胞生長具協同效果之有效劑量的第二化療劑結合。其中前述Hec1抑制劑包含，但不限於：N-(4-(4-異丙氧基-2,6-二甲基)噻唑-2-基)異煙酰胺(100951)、N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(101001)、2-氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(101015)、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基氧基)-2,6-二甲基 苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(110095)，及其鹽類。前述Hec1抑制劑可為自由鹼基形式或其鹽類形式。前述實施例可使用具細胞毒性及/或化療藥物如紫杉醇(taxol)、阿黴素(doxorubicin)和托泊替康(topotecan)，然而，亦可考慮使用其他適用之具細胞毒性及/或化療藥物。
本發明之再一實施例中，提供一種用於治療對於多種藥物具抗藥性(或對伊馬替尼(imatinib)具抗藥性)之癌症細胞的方法，其包含將前述癌症細胞與一可達到對於抑制前述癌症細胞生長之有效劑量的Hec1抑制劑結合。在本發明一些實施例中，Hec1抑制劑可與一第二化療劑及具細胞毒性劑一起使用。適合之Hec1抑制劑包含，但不限於：N-(4-(4-異丙氧基-2,6-二甲基)噻唑-2-基)異煙酰胺(100951)、N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(101001)、2-氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(101015)、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(110095)，及其鹽類。前述Hec1抑制劑可為自由鹼基形式或其鹽類形式。前述實施例可使用具細胞毒性及/或化療藥物如紫杉醇(taxol)、阿黴素(doxorubicin)和托泊替康(topotecan)，然而，亦可考慮使用其他適用之具細胞毒性及/或化療藥物。
本發明標之各種物件、態樣、面向及優點，將透過以下的較佳實施例及附圖之描述而更加明確，其中相同的附圖標示代表類似的組件。
圖1係顯示GI50s對於Hec1抑制化合物及Hec1表現的關係。圖1A顯示在異步培養細胞株中，總蛋白量中的Hec1蛋白表現量。Hec1蛋白的表現量進行了定量分析，其表現量與HeLa細胞中的表現量以相對%表示，並將之分為對Hec1抑制劑非常敏感(GI50<50nM)、中度敏感(50nM<GI50<100nm)、些微敏感(100nm GI50<1μM)、或抗敏感(GI50>10μM)。圖1B顯示相對於總RNA中的Hec1RNA表現量。以相對 於HeLa表現量之%表示之，並圖形化蛋白表現量的相關性。圖1C顯示出被分為對Hec1抑制劑為敏感(GI50<300μM)或抗敏感(GI50>300μM)的癌症細胞數據。圖1D顯示出利用4個Hec1化合物類似物(100951，101001，101015，110095)所進行之細胞株篩選試驗中，所收集的log10 GI50數據，並根據對Hec1蛋白表現量而繪製之。利用長尾T試驗來判斷顯著性(所有測試藥物之P-value值為4.3 x10-17)。圖1E顯示Hec1RNA表現量占總RNA表現量之%，以及Hec1蛋白表現量占總蛋白表現量之%，之間的關聯性。
圖2顯示在不同腫瘤細胞株和肺癌和乳腺癌的亞型之人類患者樣本中，Hec1的表現量。圖2A和圖2B顯示分別從GEO資料庫中取得的GSE8894和GSE14814之人肺癌腫瘤之Hec1(NDC80)表現量，其對數表現強度；結果顯示，Hec1在鱗狀癌症細胞中高度表現量。圖2C顯示從GEO資料庫取得的GSE20685之乳腺癌腫瘤樣本中，Hec1(NDC80)的表現量，其表現強度以對數來表示，結果顯示Hec1在第I型中高度表現。
圖3顯示出以siRNA剔除Rb之腫瘤細胞中，對於Hec1抑制性化合物之敏感性。圖3A顯示出由原生型Rb轉殖的MDA-MB-231細胞以對照siRNA或siRNA標靶Rb(siRb)轉殖後，其對於Hec1抑制化合物101001之剔除效果的敏感度(以GI50而言)。也同時顯示了轉殖細胞中Rb RNA的表現量。圖3B顯示所選之具原生型Rb(231，MDA-MB-231，K562，ZR-75-1，T47D，A549，HCT116)或具突變型Rb(HeLa細胞)細胞株中，經2個中的1個Rb siRNA轉殖後，其細胞的敏感性如圖3A所示，其表示方式為相對於非藥物處理的細胞之生長抑制%。將轉殖後的細胞裂解物以免疫轉漬法觀察Rb，其結果如下方相應的抑制圖。
圖4顯示以siRNA剔除p53之腫瘤細胞中，對於Hec1抑制性化合物 之敏感性。圖4A顯示原生型p53轉殖的A549,HCE116細胞以對照siRNA或siRNA標靶Rb(sip53)轉殖後，其對於Hec1抑制化合物101001之剔除效果的敏感度(以GI50而言)。細胞敏感度以GI50表示之。同時也顯示了轉殖細胞中Rb RNA的表現量。圖4B顯示所選之具原生型p53(A549,HCT116,ZR-75-1,U2OS)或具突變型p53(HeLa細胞)細胞株中，經2個不同的p53 siRNA轉殖後，其細胞的敏感性如圖4A所示，其表示方式為相對於非藥物處理的細胞之生長抑制百分比。將轉殖後的細胞裂解物以免疫轉漬法觀察p53，其結果如下方相應的抑制圖。
圖5顯示在對藥物有反應的細胞(GI50<10uM)及非對藥物有反應的細胞中(GI50>10uM)，Hec1抑制劑作用下，p73磷酸化的引發、細胞凋亡標記的活化及抗細胞凋亡標記向下調節之差異。肌動蛋白表現量係為對照。圖5A顯示以免疫轉漬法，觀察在對藥物有反應之HeLa細胞及非對藥物有反應的A549細胞中，在不同時間點以200nM選擇性Hec1抑制化合物處理後，受到Hec1抑制化合物(200nM)影響之磷酸化p73(P-p73)的表現。圖5B顯示以免疫轉漬法觀察在對藥物有反應的HeLa細胞中，Hec1抑制化合物(1μM)對於細胞凋亡標記caspase3,PRAP及抗細胞凋亡標記Mcl-1,XIAP, Bcl-2之影響。圖5C顯示以免疫轉漬法觀察在非對藥物有反應之A549細胞中，所選Hec1抑制化合物及紫杉醇對於細胞凋亡標記caspase3,PRAP及抗細胞凋亡標記Mcl-1,XIAP,Bcl-2之影響。圖5D顯示以免疫轉漬法觀察在非對藥物有反應之A549細胞中，Hec1抑制化合物101001對於細胞凋亡標記caspase3,PRAP及抗細胞凋亡標記Mcl-1,XIAP,Bcl-2之影響。
圖6顯示在對藥物有反應的細胞(GI50<10uM)及非對藥物有反應的細胞中(GI50>10uM)，以Hec1抑制劑作用下，差分細胞週期調節之Hec1及Nek2蛋白表現，及差分向下調節之Nek2蛋白的表現。圖6A顯示出以 免疫轉漬法觀察，同步處理對藥物有反應之細胞(HeLa，MDA-MB-468，HCT116)，以及在不同時間點處理非對藥物有反應之細胞(A549)下，Hec1和Nek2的表現量。肌動蛋白係作為載樣控制組。圖6B顯示出以免疫轉漬法觀察，與DMSO對照處理和以不同濃度Hec1抑制性化合物處理對藥物有反應之細胞(HeLa，HCT116)，以及在不同時間點處理非對藥物有反應之細胞(A549)，其Nek2表現量。圖6C顯示DMSO控制組或Hec1抑制性化合物在不同時間下，HeLa細胞中細胞週期素B1和cyclin D1的免疫轉漬表現。肌動蛋白係作為載樣控制組。
在圖中所闡述的實施例在本質上是用以說明，而非用於限制本發明之申請專利範圍。此外，附圖之個別特徵將可透過本發明而有更詳盡的描述。
根據近期發現的一種小分子，其可選擇性地及/或專一性地作用在Hec1/Nek2傳遞路徑，發明人已開發出了各種改進Hec1抑制劑的標的，Hec1為在各種人類癌症中過度表現量的著絲粒成員。這些化合物使發明人去觀察在腫瘤細胞中，Hec1、Rb和p53對Hec1抑制劑藥物的敏感性。
細胞依靠正常調節整個細胞週期來控制有絲分裂的正常運行。癌細胞中有絲分裂過程的管制失當與異常紡錘體的形成和染色體分離的過程有關。在快速分裂的細胞中Hec1表現量最多，而非在終端分化細胞中。在全基因組表現量譜中觀察到Hec1在腦，肝，乳腺癌和肺癌的腫瘤細胞中表現量增加，而在子宮頸癌、大腸癌、乳癌、肺癌細胞株，以及結直腸癌及胃癌組織中則為過度表現量。因此，迅速分化的細胞中，經轉殖細胞株，和癌組織中Hec1不同的表現量，代表Hec1可能為人類癌症治療很好的標靶對象。同樣地，透過與Hec1表現量和IC50相關的統計分析，可支持Hec1作為用於癌症治療的標靶。
Hec1與視網膜母細胞瘤基因(Rb)有關，在在細胞週期中G2-M期扮演重要角色。更具體而言，在G2-M期的Rb會於蛋白磷酸酶1α交互作用，該磷酸酶為動粒(kinetochore)功能上不可缺少的一員。在細 胞週期中G1-S期Rb磷酸化係與G2-M期的細胞週期蛋白的誘導和降解有關。Rb在G2-M期還直接調節了染色體分離以及與Hec1交互作用。當細胞缺乏功能性Rb，則不能完成正確的有絲分裂，這種細胞有絲分裂會造成超倍性(hyperploidy)。這些關聯性說明了Rb基因可能與有絲分裂步驟與Hec1有關。
P53蛋白是一種多功能蛋白質，具各結構域，包含特定的複合結構，可與DNA，RNA，蛋白質和細胞代謝交互作用。在癌症中p53基因多為突變型，主要是錯讀突變而導致單一氨基酸被替換。這種突變的p53蛋白被歸類到不同的結構群。例如，p53蛋白可被定性為「熱點」，在DNA結合區域內的突變可被歸類為DNA的接觸突變或構型突變。突變的p53在整個癌症過程中通常為高度表現(包括進行性或遠端轉移)，此意味著它可能與具有增益功能(GOF)屬性。這樣的GOF屬性使得突變的p53可與染色質上的點作用，此點與原生型p53與染色質交互作用的點不同，且各種的轉錄因子可分別調降或抑制多抗藥性基因1(multi-drug resistance 1 gene)或caspase-3基因。原生型p53失去活性後，則對多種化療藥物，包含順鉑、卡鉑、紫杉醇都表現出敏感度增加。
基於上述考慮和其他理由，本發明人現在已發現，可透過Hec1(HEC)、Rb(RB1)及/或p53(TP53)的狀態及/或表現量來準確並可靠地預測細胞對Hec1抑制劑的敏感性。這有利於進行早期識別癌症患者是否可受益於Hec1抑制劑的治療，也可更有效地治療病患的疾病，即便其仍處於早期階段。
更具體地，本發明人已經發現，Hec1表現量與腫瘤細胞對Hec1抑制劑治療敏感性正相關，且Rb和/或p53的剔除、失調或功能障礙與腫瘤細胞對Hec1抑制劑治療敏感性正相關呈正相關。因此，這樣的相關性可能不只預測Hec1抑制劑可成功治療腫瘤細胞和組織，而且可知道某些癌症的對於Hec1抑制劑為敏感或具抗性的。
舉例而言，於后更詳細地說明，一些腫瘤細胞株和腫瘤細胞具有相對高的Hec1的表現量(例如，癌Hep3B/肝細胞癌、HeLa細胞/子宮頸癌、T47D/惡性腫瘤、胸膜癌、侵入性、性導管癌)，可能對於Hec1抑制劑治療有的高度敏感性，而其他的細胞株基本上Hec1表現量較低或沒 有表現(例如，淋巴細胞白血病MOLT-4/急性，N87/胃癌)，可能對Hec1抑制劑治療會顯著地較不敏感(或具抗藥性)。
這樣的敏感度差異可能對於分類或對單一類型或類別的癌症治療有幫助。例如，乳癌的分子子類型可分為I-VI型，但只有I和IV表現出顯著的Hec1表現量，因此對Hec1抑制劑治療可能是較敏感的。同樣的，癌症患者被判定所屬類型或類別時，可能代表其對Hec1抑制劑的敏感性，並可依此提高治療效率。
有鑑於此，本發明實施例之一為一種選擇使用Hec1抑制劑治療之增殖性疾病患的方法(可選擇性與細胞毒性劑組合使用)，其中，會先根據先前所得知的Hec1表現量及/或狀態做選擇。在較佳實施例中，Hec1的表現量及/或狀態，係透過將原生型Hec1(HEC)的基因及突變Hec1(HEC)基因，或透過測定缺乏、不足(相對於健康人體)或剔除Hec1基因(HEC)的表現量定量而得。同樣地，可理解的是，這樣的定量可包括從病患樣品中取得之表現量及/或轉譯後修飾的Hec1。例如，可以透過將特定對象之原生型Hec1表現量與健康人體之表現量進行比較而得知。此外，對照樣本也可以為對腫瘤有或無反應者，此反應指對最典型Hec1抑制劑的治療的反應。在這種情況下，若控制組代表對於治療有反應的腫瘤，則與對照組相比，其具有較高的原生型Hec1(HEC)基因表現量，並可預測可能對治療有較高反應性。相反的，若控制組表示對治療有抗性的腫瘤，低其個體之Hec1表現量與對照相比較低，則可預測其可能對治療有抵抗性。
本發明另一實施例方法中(特別指，但不必要，相對於對照組，其受試者之Hec1(HEC)的表現量較高)，患者被選用以Hec1抑制劑做治療，此實施例之病患具有適用以Hec1抑制劑治療之增殖性疾病。其特徵在於，此類病患的篩選係根據(至少部分是)Rb狀態的特徵或確定。Rb的狀態可以透過來自受試樣本之原生型Rb基因(RB1)、突變的Rb基因(RB1)、缺乏/不足/剔除的Rb基因(RB1)，及/或表現量、及/或轉譯後修飾的Rb來做判定。如前所述，應該理解的是，減少或缺乏Rb蛋白的表現量，或具有失調及/或機能障礙的Rb(RB1)，可能代表腫瘤細胞對Hec1抑制劑治療具反應性。因此，可以依照受試者之Rb(RB1)狀態的不足/突變/刪除，來判斷是否適用於Hec1抑制劑做治療來篩選患者群。
同樣地，在本發明又一實施例中，具增殖性疾病的患者以Hec1抑制劑治療(選擇性地與細胞毒性劑一起使用)，此治療方法包括以下步驟：確定受試者之增殖性疾病的敏感性，再依照所確定之p53基因狀態或特徵，給予Hec1抑制劑進行治療。此方法可能包括下列步驟，透過將樣本中原生型p53基因(TP53)的基因及突變型p53基因(TP53)，或透過測定缺乏、不足(相對於健康人體)或剔除p53(TP53)的表現量、及/或轉譯後修飾的p53定量，而確定p53基因狀態。因此，可根據患者之p53基因(TP53)之不足/突變/剔除狀態，來篩選以Hec1抑制劑治療的患者群。
應當理解的是，Hec1、Rb和p53基因的狀態和表現量已超出其作為單獨指標之用途，可組合以作為用篩選出可用Hec1抑制劑治療的患者群。例如，Hec1基因型、Hec1表現量、Rb的基因型、Rb蛋白的表現量、p53基因型及/或p53的表現量，皆可單獨或以任意組合，以作為腫瘤性疾病或細胞株對於Hec1抑制劑化合物之敏感度的指標。
應當理解的是，Hec1、Rb和p53基因和基因產物的檢測、定量及/或鑑定，可包含一個基因或基因產物標示或標記，及/或可檢測之複合體的形成。這種標示可為直接或間接標示。例如，一個基因或基因產物(如RNA或蛋白質)可以直接透過修飾其組合物，以使其可被檢測，例如，將一可檢測的部分連結到基因及/或基因產物上，以形成可檢測複合物。同樣的，也可透過與其具有一可檢測的部分之結合配偶體(例如，互補的核酸序列、互補的核酸序列類似物、配位體或抗體)結合，進行基因或基因產物的間接標記，以形成一可檢測複合物。或者，一個基因或基因產物(例如，來自患者樣本)，可透過其自身能力來取代具有一可檢測的部分之基因類似物，或一從結合配偶體(例如，互補的核酸序列、互補的核酸序列類似物、配位體或抗體)上帶有可檢測的部分之基因類似物，從而調整為一可被檢測之複合物。合適的可檢測部分包括，但不限於，螢光分子、磷光發光性分子、發光分子、酶、金屬、生物素及/或生物素類似物、量子點、微粒、放射性核素、核酸及/或核酸類似物、同位素質量標籤、旋標籤、正電荷或負電荷或其組合。
在本文中，所有已知的基因型及/或Hec1、Rb及/或p53核酸和蛋白質產物的定量方式，皆被認為適用於本發明。特別合適的方法包 括(但不限於)DNA定序、重複數目檢定(copy number determination)，單倍型測定，RNA測序，定量PCR、RT-PCR、Q-RT-PCR、digital PCR、南方及/或北方雜交、螢光原位雜交、基因片分析，液相雜交/量化，電流分析(amperometric)及/或熒光定量、免疫測定確定，及/或其他任何適用判定基因及/或基因產物的方法。可替換地，或其他，可使用細胞學或組織病理學分析，其為定量分析單-Hec1、Rb及/或p53特定的狀態的方法。
應當理解的是，使用Hec1抑制劑進行治療時，所有已知的Hec1抑制劑皆被視為適用於本發明，且應優先選擇描述在WO 2011/115998和co-pending U.S.provisional application64/564,773的Hec1治療劑。因此，其它使用的化合物，特別優先選擇的Hec1抑制劑包括N-(4-(4-異丙氧基-2,6-二甲基)噻唑-2-基)異煙酰胺(100951)，N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(101001)，2-氟-N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(101015)，N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(110091)，N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基硫基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙酰胺(110095)，和(110096)。
我們還假設Hec1抑制劑可以與一或多種細胞毒性劑共同使用，例如具有抗腫瘤代謝物、拓撲異構酶topoisomerase I或II抑制劑、及/或微管活性劑。所有這些已知的試劑已被認為適用於本發明。對於這類試劑的用量，可參考目前公知的給藥劑量，或稍低於已知劑量。
令人驚訝的是，當所使用的Hec1抑制劑及一或多種細胞毒性劑共同給藥時，我們觀察到其與特定化合物具協同活性，在後面會更詳細地描述細節。最有利的是，Hec1抑制劑和紫杉醇，阿黴素和托泊替康組合使用中，也具有協同活性。可以預期的是，協同作用在細胞及/或組織的細胞及/或組織對等於或小於100nM的Hec1抑制劑濃度較敏感(表9至表11中)，此敘述並非用以限制本發明的範疇。
同樣顯著的是，所使用的Hec1抑制劑化合物還對被認為對藥物具抗藥性的各種細胞株表現出顯著的活性，從而提供了一個作為治療難以治癒細胞和組織的新方法(表8)。此外，我們還觀察到，具有活性的 Hec1抑制劑，會引起有反應之細胞的凋亡反應(GI50<1μM)，但不會引起非敏感細胞的凋亡反應(GI50>1μM)(圖5)。
實驗例 材料與方法
細胞培養：A549、MDA-MB231、K562，和HCT116腫瘤細胞株之提供者為Y.S.Lee博士(生物技術開發中心，新北市，台灣)。T47D及ZR-75-1細胞株係來自BCRC(生物資源保存及研究中心，台灣)。細胞株係初步培養於所建議的培養基中，之後培養在37℃之含有5%CO2的空氣中，及含有10%牛胎兒血清及低血糖(1g/L)的Dulbecco's Modified Eagle's(DME)培養基中。
藥物靈敏度：將細胞株培養以適當栽種數量培養在%孔板中，以含有低葡萄糖與10%FBS的DME進行培養，再以指定藥物處理24小時後，進行藥物敏感性篩選。將藥物添加於三重複孔盤中，再將細胞含有藥物的培養基處理96小時後，再使用CellTiter96®水性非放射性細胞增殖測定系統(Promega,Madison,WI 53711 USA)以MTS實驗測定細胞存活率。MTS測定係根據製造商的說明來進行。使用Bio-Tek的340分光光度計(Bio-Tek,Winooski,VT 05404)和光學讀數進行光密度測定，然後再以Excel處理(Microsoft,Redmond,WA 98052-7329)和GraphPad Prism 5線性回歸軟體(GraphPad Software,La Jolla,CA 92037 USA)，以確定濃度反映曲線，再計算相對GI50s值。GI50值指使50%細胞的生長受到抑制的濃度。藥物對細胞的生長抑制試驗之%中，其計算公式為：[1-(試驗值)/(對照值)]×100，這些值被用來繪製濃度-反應曲線，然後再用線性回歸軟件分析之。
協同作用：對選定的藥物進行測定，並以Hec1抑制劑用計算出的GI50s濃度用於協同檢測。將細胞以藥物處理24小時後，以適當栽種數量培養在96孔板中，以含有低葡萄糖與10%FBS的DME進行培養。 將Hec1抑制劑及所選藥物以所確定的GI50濃度加至三重複孔盤中，並將細胞培養在藥物處理的培養基96小時後，測定細胞存活率。使用CellTiter96®水性非放射性細胞增殖測定系統(Promega,Madison,WI 53711 USA)以MTS實驗測定細胞存活率。MTS測定係根據製造商的說明來進行。使用Bio-Tek的340分光光度計(Bio-Tek,Winooski,VT 05404)和光學讀數進行光密度測定，然後再以Excel處理(Microsoft,Redmond,WA 98052-7329)和GraphPad Prism 5線性回歸軟體(GraphPad Software,La Jolla,CA 92037 USA)，以確定濃度-反應曲線，再計算相對GI50s值。協同效應係透過索引值組合來計算，使用算式為CI(組合索引)=(CA,X/ICx,A)+(CB,X/ICx,B)，其中，CA,X和CB,X是所使用達到x%的藥物效果的藥物A和藥物B濃度組合。ICx,A和ICx,B為達到相同的效果之單劑的濃度。
基因沉默：將細胞以適當的細胞數目培養在96孔板中並經siPort NeoFx轉殖法(Life Technologies,Carlsbad,California 92008 USA)根據製造商的說明進行轉殖，培養24小時後，以藥物處理之。細胞在藥物處理的培養基中培養48小時後，以MTS實驗分析之。使用對照siRNA(Life Technologies,Carlsbad,California 92008；Cell Signaling Technology,Danvers,MA 01923 USA；and Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA.95060 USA)，Rb siRNA(#1：Life Technologies,Carlsbad,California 92008 USA；#2：Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA.95060 USA)p53 siRNA(#1：Cell Signaling Technology,Danvers,MA 01923 USA；#2：Cell Signaling Technology,Danvers,MA 01923 USA)。細胞以藥物處理24小時後，在MTS實驗前與藥物共同培養48。MTS法的進行係根據製造商的說明(Promega,Madison,WI 53711 USA)。
免疫轉漬：將培養細胞之細胞裂解物以放射免疫沉澱法檢測(RIPA)，緩衝液(50mM的Tris-鹽酸，pH7.4的150mM NaCl，1%NP40，0.25%DOC，0.1%SDS，1mM的NaVO4，1mM EDTA的1ug/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml的胃酶抑素)或2.5倍的樣品緩衝液(50mM的Tris-鹽酸，PH值6.8，1%SDS，2.5%的BME，7.5%甘油，溴酚藍)。將組織標本浸漬在RIPA緩衝液中，用均化器破碎之，再離心以純化之。接著將樣品進行SDS-PAGE電泳，轉漬到免疫轉漬膜上，並與第一抗體培養在3%BSA的 TBST中，再用辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase)共軛的次級抗體及增強的化學發光進行(Millipore,Billerica,MA 01821 USA)蛋白質檢測。以下抗體係用於西方轉漬法：抗-Rb的單株抗體1F8(Abcam,Cambridge,MA 02139-1517 USA)，抗p53單株抗體(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA.95060 USA)，抗-β-肌動蛋白單株抗體AC-15(Sigma Aldrich,St.Louis,MO,USA)。
實時螢光定量PCR：以快速RNA小量製備試劑盒(Quick-RNA miniPrep kit,Zymo Research,Irvine,CA 92614 USA)來抽離全部RNA。依照製造商之說明。以ABI PRISM7500(Life Technologies,Carlsbad,California 92008 USA)，再用One Step SYBR ExTaq qRT-PCR kit(Takara-Bio,Shiga,Japan)進行反轉錄和實時定量PCR。用於GAPDH的引子序列：5'-GGTTTACATGTTCCAATATGATTCCA-3'(正向)5'-ATGGGATTTCCATTGATGACAAG-3'(反向)。Rb的引子序列為：的5'-GCAGTATGCTTCCACCAGGC-3'(正向)，5'-AAGGGCTTCGAGGAATGTGAG-3'(反向)。p53引子序列為：5'-GCCCCCAGGGAGCACTA-3'(正向)，5'-GGGAGAGGAGCTGGTGTTG的-3'(反向)。
臨床標本之基因表現量：自GSE資料庫中取得HEC基因表現資料，以2為底的對數分析基因表現量強度。
以下敘述提供了大量本發明標的物之示例性實施例。雖然各實施例中，僅表示本發明單一要件之組合，本發明範疇包括所有可能之公開的組合元素。因此，如果一個實施例中包括的要件為A，B和C，而第二實施例的包括要件為B和D，則本發明之標的物也被認為是包括的A，B，C或D的其他組合，即使其他剩餘的組合沒有被明確的揭露出來。此外，除非文義規定，否則本文中所提之任何範圍應解釋為包括其端點，且開放式端點應解釋為包括具商業實用之值。同樣地，除非上下文表示矛盾，否則本文表中所有的值應視為包括其中間值。
Hec1表現和細胞對於Hec1抑制劑的敏感度之間的關聯：各種腫瘤細胞株與其對Hec1抑制劑敏感度的特性之間的關聯顯示於表1中。顯而易見的，細胞對於Hec1抑制劑的敏感度不同。在此處，經Hec1 抑制劑(101001)處理的細胞係作為指標，並分析其增殖和代謝活性。表1的所列篩選的細胞株為了增加GI50，以及將之依照對Hec1抑制劑的敏感性之作分組。
Figure 101143435-A0202-12-0016-1
Figure 101143435-A0202-12-0017-2
為了釐清對於Hec1抑制劑具抗藥性之具抗性細胞株的可能機制，以Hec1抑制劑101001處理之敏感且具抗性細胞株中，觀察Hec1蛋白及RNA表現量。進行類似的研究，透過Hec1蛋白表現量量，來釐清細胞株對第二Hec1抑制劑110095為敏感(GI50<300nm)，具抗性(GI5->300nm)。異步培養之細胞株裂解物及其總蛋白以免疫轉漬觀察Hec1的表現量。將Hec1蛋白的表現量進行定量並以相對於HeLa細胞的表現量%表現之(圖1A)。同樣地，收集和分析異步培養的細胞株中總RNA，並以定量實時PCR分析其與HeLa細胞Hec1相對表現量(圖1B)。對Hec1抑制劑101001具抗藥性之細胞株(GI50>10uM)A549和MDA-MB-361中，Hec1表現量低，9個中有7個為非常敏感的細胞株(GI50<50nm)，其Hec1表現量高於K562，其為最低GI50的細胞。同樣的，相對於具抗藥性之細胞株，對Hec1抑制劑110095相對較敏感的細胞株有較高的Hec1蛋白表現量，且具有統計學意義(P值<0.0001)(圖1C)。圖1D為以4個不同的Hec1抑制劑研究中，也顯示出類似的結果。將4個Hec1化合物的類似物(100951，101001，101015和110095)進行細胞株篩選試驗，收集GI50對數數據，並將之依照Hec1蛋白表現量繪製收集的數據，再以2-tail t test 檢視P值的意義。P值為4.32914X10-17，明顯的表示，臨床試驗中，Hec1的表現量可有效地作為Hec1抑制劑的生物標誌物。總體而言，表現量係與Hec1抑制劑的敏感性呈正相關。在HeLa細胞中的其他研究中，顯示Hec1蛋白質和RNA的表現量(總蛋白和總RNA量)之間的關係表示於圖1E中，其為近似線性圖。此結果有利的顯示出，在臨床試驗中，Hec1蛋白表現量或Hec1 RNA表現量可以有效地作為Hec1抑制劑的生物標誌物。
在臨床腫瘤樣品類型和亞類型中Hec1表現量：全基因組表現圖譜顯示，在乳房、肺、肝、腦細胞中Hec1表現量增加，Hec1的表現量係與腫瘤的分級和預後有關。收集並分析臨床癌症患者組織樣本及其Hec1表現量。數據顯示在某些癌症的類型和子類型中，會有更顯著提升的Hec1表現量。圖2A和圖2B顯示從GEO資料庫的數據GSE8894(圖2A)和GSE14814(圖2B)之HEC(NDC80)表現量，將腺癌和鱗狀細胞癌肺癌患者的腫瘤樣本，與正常組織其相對強度以2為底之對數分析之。在兩個數據庫中，鱗狀細胞癌之平均HEC(NDC80複合)基因表現量都升高。在結腸癌細胞中也發現相似的Hec1表現升高情形。同樣的，從GEO數據庫GSE20685所得各種分子亞型乳腺癌腫瘤樣本分析Hec(NDC80複合)的表現量，相對於正常組織的表現量強度之基底為2的對數表示之。HEC在乳癌分子型I中過度表現，顯示在其基因的表現量譜中(圖2C)。從乳癌分子亞型病人取出之乳腺癌腫瘤樣本中，其Hec1蛋白表現量也被釐清，並總結於表2中。分子亞型I和IV中，其Hec1蛋白的表現量提升。不同分類乳癌分子亞型之性質列於表1中，其顯示了篩選的細胞株中視網膜母細胞瘤(Rb)和p53之基因和蛋白質的狀態，並列出了增加GI50之細胞株。這些結果有強烈地說明，類型和/或分子亞型的腫瘤或腫瘤細胞株可能是一個作為在Hec1抑制劑臨床試驗中，選擇適當病人的關鍵指標。
Figure 101143435-A0202-12-0019-3
Hec1抑制劑的敏感性，與細胞中Rb和p53狀態的相關性研究：Hec1被發現其與視網膜母細胞瘤蛋白Rb的有交互作用。這說明了本藥物篩選系統中(表1)，腫瘤細胞株中的Rb狀態可能和Hec1抑制劑的敏感性之間有關聯。令人驚訝的是，本細胞株中的Rb和p53狀態的態樣可能說明了，當突變形式的Rb和/或突變形式的p53基因存在可能為必要要件。如表3中所示，將突變/異常的Rb作為一個單一生物標記，比突變/異常的p53基因作為生物標記要不重要，其P值分別為0.3和<0.005。
Figure 101143435-A0202-12-0020-4
相似的結果顯示於表4中，作為一個生物標記，突變的Rb其P值為0.6，而突變的p53其P值<0.007。
Figure 101143435-A0202-12-0021-5
為了進一步釐清這些腫瘤抑制基因在細胞中與Hec1抑制劑的敏感性關聯，以siRNA來選擇性剔除或減少所選細胞株中Rb和p53表表現，並觀察其對於Hec1抑制劑的敏感性的影響。令人驚訝的是，Rb的剔除會引發幾種癌症細胞對Hec1抑制劑的敏感度，包括攜帶原生Rb的細胞株(MDA-MB-231、K562、ZR-75-1、T47D，HCT116)，但並無影響帶有突變Rb的細胞株(HeLa細胞)(圖3A-3B)。圖3A顯示出了原生RbMDA-MB-231以Rb的siRNA(siRb)和對照siRNA轉殖後，用Hec1抑制劑101001處理之；細胞敏感度以G I50(μM)表示之。經Rb RNA轉殖後細胞的定量實時PCR結果也顯示，在Rb的siRNA處理後，細胞表現量出現顯著的下降。圖3B顯示，所選siRb轉殖至細胞株中，包含原生Rb細胞株(MDA-MB-231、K562、ZR-75-1，T47D、A549、HCT116)或突變Rb細胞株(HeLa細胞)結果如3A所示；細胞敏感度係以相對非藥物處理的細胞的生長抑制度百分比表示之。以免疫轉漬分析從轉殖細胞的細胞裂解液中收集和分析Rb蛋白量；轉漬顯示出下面相應的抑制圖。肌動蛋白被作為一個載樣控制組。
在攜帶原生p53細胞中(A549、HCT116、ZR-75-1，U2OS)，p53的沉默會誘導類似增敏作用，但令人驚訝的是，這並不會影響細胞突變 型p53(MDA-MB-231、HeLa細胞)，其如圖4A-4B所示。圖4A顯示，將原生p53細胞(A549、HCT116)和突變(MDA-MB-231)細胞，以p53的siRNA(sip53)轉殖後，以Hec1抑制化合物101001處理後的結果。分析細胞活性和細胞敏感性，以GI50(NM)表示之。透過定量實時PCR，也以分析了轉殖細胞中的RNA中p53 RNA的表現量。從sip53處理後的細胞中，其降低的GI50可看出，sip53處理後細胞與原生p53之敏感性增加，但在突變的p53細胞中並沒有觀察到此現象。類似地，圖4B顯示出，以p53 siRNA轉殖後之原生p53細胞株(A549、HCT116、ZR-75-1、U2OS)結果，或以p53 siRNA轉殖後之突變型p53(HeLa細胞)結果如圖4A所示。細胞敏感度以相對於非藥物處理的細胞生長抑制之百分比表示之。經p53轉殖的細胞裂解物，其免疫轉漬結果如下面相應抑制圖所示。總結而言，這些結果表明，受損Rb和p53之癌細胞對於Hec1抑制劑更加敏感，其訊息傳遞路徑尚未明朗，這可以提供做為新的生物記，用來引導臨床上Hec1抑制劑治療患者的選擇。
因此，應可理解的是，根據本發明標的物之三個生物標記可依照對於Hec1抑制劑敏感性，來選選擇細胞株和臨床患者。Hec1的表現量增加，突變的Rb和/或突變型p53，可能成為腫瘤和細胞株的指標中適用於Hec1抑制劑的指標。這些因子可單一或任何組合地用來預測。令人驚訝的是，合併的三個生物標記之組合的P值為<0.0001(表3)。這些結果，提供一個更能代表患者對Hec1抑制劑有反應的臨床研究的設計指標。
Hec1抑制劑相對於目前細胞毒性藥物之效果：腫瘤細胞對Hec1抑制劑的敏感性，和目前用於治療癌症(依據GI50)之細胞毒性藥物，其有效性顯示於表5-7中。表5總結了GI50s乳癌衍生細胞株對Hec1抑制劑101001和幾個細胞毒性藥物(紫杉醇，阿黴素，托泊替康，和索拉非尼)的敏感度。表6表示為一群肝癌細胞衍生細胞株株之類似數據。同樣的，表7總結的的其他癌來源的細胞株對Hec1抑制劑101001和紫杉醇，阿黴素和托泊替康之GI50s。在大多數情況下，在所選細胞株中，Hec1抑制劑(即有一個較低的GI50)比細胞毒性劑更為有效。令人驚訝的是，Hec1的抑制劑，對於幾個抗藥的細胞株也是有效的，包括抗紫杉醇細胞株Mex-SA/Dx5和NCl/ADR-Res和抗格列衛細胞株K562R，其顯示於表8 中。這些結果提供了Hec1抑制劑作為替代細胞毒性藥物(例如，紫杉醇、阿黴素、托泊替康和Gleevec，或其組合)之治療的基礎。
Figure 101143435-A0202-12-0023-6
Figure 101143435-A0202-12-0023-40
Figure 101143435-A0202-12-0023-41
Figure 101143435-A0202-12-0024-10
Hec1抑制劑及細胞毒性藥物的協同效應：合併治療是一種很有前景的方法，可更有效地治療癌症患者。我們可針對目前抗癌藥物之尚未釐清的其他途徑，或根據更好的臨床應用而將之納為目前治療藥物。如上所述，單一的藥物研究結果強烈表示，在這種組合療法中Hec1抑制劑可能是有效的。為釐清Hec1抑制劑的可能的臨床治療方法，將Hec1抑制劑和幾個可用於癌症治療的細胞毒性藥物進行協同試驗。以對Hec1抑制劑有反應癌症細胞用來進行篩選，以Hec1抑制劑及抗癌藥物適當濃度混和比例之混合物處理後，再評比其細胞活性。從上述GI50s記算出組合指數(CI)，以代表加成(CI=約1)，協同(CI<1)，拮抗(CI>1)效果。表9總結了一些癌症衍生細胞株中，共同加入Hec1抑制劑110001及細胞毒性藥物後，其協同作用的研究結果。表10總結Hec1抑制劑110095進行類似研究結果。同樣地，表11總結了Hec1抑制劑100951(0951)，101001(1001)，101015(1015)和110095(0095)和白血病，子宮頸癌，乳癌，肝癌細胞株之細胞毒性藥物之組合指數(CI)的值。目前已確定Hec1抑制劑(即CI<1)在許多細胞中，與紫杉醇，阿黴素和托泊替康具有協同效應。這說明Hec1抑制劑可做為新的治療方法，當添加到目前的細胞毒性藥物時，可用來治療腫瘤疾病或抑制腫瘤細胞株的生長。
Hec1抑制劑引發細胞死亡的機制：P53被認為是調節細胞 週期中G1和G2期一個重要的調節因子，並控制對異常增殖的訊號和壓力反應的細胞凋亡。由於大多數對Hec1抑制劑敏感的細胞株，本發明人都發現具突變型p53，因此可以推測，p53基因無關的凋亡途徑，可能參與在Hec1抑制劑引發的細胞死亡路徑中。P73是p53成員之一，其可調控細胞凋亡，並在p53缺失的細胞中取代p53的功能。因此，P73是一個潛在標靶分子，可調控Hec1抑制劑引發的細胞凋亡。為了研究這個問題，攜帶突變型p53蛋白之對藥物有反應的細胞株(HeLa細胞)和抗藥物細胞株(A549)皆以不同時間長度進行Hec1抑制劑110095的處理。將磷酸化p73基因表現結果以免疫轉漬法呈顯，在處理過的細胞中發現，Hec1抑制劑會引發時間依賴性磷酸化p73，且在藥物治療48小時後達到高峰值(圖5A)。這種磷酸化說明了，Hec1抑制劑可能至少部分地會透過調節p73基因活性來引發細胞死亡。
同樣地，以1μM之Hec1抑制劑110091(91)，110093(93)、110095(95)處理24或48小時的HeLa細胞中(圖5B)，其裂解物以免疫轉漬法觀察細胞凋亡標記caspase3和PARP，以及抗凋亡標記XIAP、MCL-1和Bcl-2的表現量。肌動蛋白則作為一個載樣控制組。同樣用Hec1抑制劑100951(0951)、101001(1001)、101015(1015)、110078(0078)和110079(0079)處理A549細胞，其結果如圖5C所示。
Figure 101143435-A0202-12-0026-11
利用相似研究來看不同Hec1抑制劑，其結果表示示於圖5D中，說明Hec1抑制劑101001對HeLa細胞和A549細胞株的治療結果。在具藥物反應之細胞(HeLa細胞)中，Hec1抑制劑會導致凋亡caspases的活化(圖5B，圖5D)。同樣處理具抗性的細胞株(A549)，並沒有表現出這樣的反應(圖5C，圖5D)。這說明了在突變的p53細胞(HeLa細胞)中，Hec1抑制劑能引發p73基因活化並引起p73基因-依賴凋亡，引發藥物引起的細胞死亡。
Figure 101143435-A0202-12-0027-12
Hec1抑制劑不同的反應機制：細胞週期中，Hec1和Nek2是受到調控的，且其在G2/M期的表現量會最高。由於在一些細胞株中，對於Hec1抑制劑不太敏感，可能是因為在不同細胞對Hec1抑制劑的反應中，Hec1/Nek2路徑有不同的調節。
Figure 101143435-A0202-12-0028-13
為了研究這種可能性，將藥物有反應的細胞(HeLa細胞，MDA-MB-468、HCT116)和抗藥性細胞(A549)1(G1)、27(G27)、32(G32)、和48(G48)小時進行細胞飢餓試驗，並同步觀察Hec1和NEK2的表現量。Hec1和NEK2的表現量模式明顯具有差異，這表明調控Hec1/Nek2途徑具有差異(圖6A)。將細胞以Hec1化合物110095以指示濃 度處理48小時，再經過免疫轉漬法觀察NEK2表現量(圖6B)。hec1抑制劑處理後，會導致敏感細胞株的NEK2降解，但這種現象還並無發生在抗藥性細胞株中(A549)(圖6B)。這說明了對Hec1抑制劑敏幹或對Hec1抑制劑具抗藥性的細胞株中，其調節(或利用)Hec/Nek2的途徑是不相同的。此外，將對藥物具有反應的細胞(HeLa細胞)以Hec1抑制劑110095(095)以不同的時間處理後，以免疫轉漬法觀察其週期素B1和cyclin D1表現量(圖6C)。Hec1抑制劑處理對藥物具反應的細胞中，其細胞週期素B1和cyclin D1表現量下降。這說明了不同的細胞株有不同的細胞週期的傳遞路徑，使得所選細胞株可躲避Hec1化合物引發的細胞死亡。調節機制或細胞週期路徑(例如，Hec1/Nek2路徑，及/或釐清細胞週期蛋白B1和cyclin D1調節路徑)的釐清，可提供分辨腫瘤疾病及/或細胞株是否對Hec1抑制劑具敏感性。
Hec1的表現量也被證明與腫瘤的分級和預後有關。例如，在乳癌預後時，Hec1代表預測其治療效果不佳。預後的重要預測指標包含單因子分析，如細胞週期素B1、BUB1、HEC，共11個基因特徵。這強調了的Hec1小分子抑制劑在乳癌患者應用上的潛在重要性。腫瘤類型和子類型可能會影響臨床上病患選擇的指標，以選擇對Hec1抑制劑更敏感的患者進行治療，如Hec1基因表現量升高的癌症類型和子類型，可能會更適合Hec1抑制劑(如上圖中乳癌分子型I和IV)。
在功能上，Hec1是細胞有絲分裂中著絲粒一個部分，在許多癌症中都過度表現量，並影響腫瘤的表型。在正常細胞和轉殖細胞中，hec1的表現量在細胞週期中是被嚴格調控的，但在腫瘤細胞株中，動粒招引的Hec1會增加。正如先前所了解的，視網膜母細胞瘤基因(Rb)的沉默會增加Hec1 mRNA和蛋白的表現量。在乳癌細胞株MCF7、T47D和ZR-75-1中，Rb的剔除及和RB/E2F靶基因的分解也被認為會增加DNA損傷劑的敏感度劑量。Rb基因缺陷的癌細胞由於Hec1的表現量增加，而增加了非整倍體和染色體不穩定的可能性，因此，在具突變基因型的Rb腫瘤細胞中，Hec1抑制劑的敏感性增加。Rb及/或相關基因可作為臨床上選擇對於Hec1抑制劑治療選擇會有反應的患者及/或細胞株的研究設計之指標。
雖然RB和p53蛋白的表現量和Hec1的抑制劑之藥物篩選 細胞株的GI50s說明了，突變的RB或突變的p53是對Hec1抑制劑敏感性增加因子，但此現象並不顯著因一般是缺少p53或增益功能敏感之突變型p53細胞。例如MDA-MB-361細胞並不表現p53蛋白，其被認為對Hec1抑制劑沒有反應(即GI50>10uM)。原生p53基因是一種腫瘤抑制基因，可以保護細胞免於異常增殖。雖然早期的研究中，錯誤認為定細胞突變型p53形式和誤判p53為癌症基因，後來的研究顯示，突變型p53蛋白之大量過量表現是癌症標誌，且其與腫瘤的進展而表現更多。在這種情況下，突變型p53的過度表現量會導致高度致瘤細胞。同樣地，人類的熱點突變型p53表現量與小鼠一樣會使腫瘤基因組不穩定性增加，並伴隨著非整倍體異常的中心體擴增，及不可逆的染色體易位。這說明了，在Hec1抑制劑的抑制機制中，p53基因突變本身也會發揮活化作用。p53及/或相關的基因分型，可提供一個選擇對Hec1抑制劑有反應之臨床患者和/或細胞株的研究設計指標。
如前所述，突變型p53存在與腫瘤的進展為增益函數(GOF)效果。許多突變型p53之GOF的效果與其將p53家族蛋白(如p63和p73)的去活化能力相關。P73可以取代p53基因缺少細胞中p53的基因功能。如前所述，以Hec1抑制劑來篩選並識別細胞株的敏感度，顯示出最敏感的細胞株具有突變型p53。這說明了，Hec1藥物所引發的細胞死亡可能會透過一或多個p53基因的獨立途徑來傳導。已知突變型p53細胞會發生壞損的p73/p63引發的細胞凋亡。在突變型p53的腫瘤細胞中，p73和p63無法招引其靶基因，且突變型p53、p73基因和p63基因之蛋白複合物的存在會對腫瘤細胞的化療敏感性產生負面影響。發明人推測，藥物引發的細胞死亡中，Hec1抑制劑可能引起P73調控的細胞凋亡。對此，本發明人進一步推測Hec1抑制劑引發細胞死亡的機制之一可能涉及將突變型p53和p73的一或多個交互作用中斷，以引發p73基因的活化，致使p73基因引發的凋亡。 有趣的是，細胞以Hec1抑制劑處理後，會引發細胞凋亡caspase標記物和p73基因的磷酸化，顯著說明了P73調控的細胞凋亡路徑被活化。然而仍可能會其他不同之p53功能扮演在各種細胞環境中，Hec1，Hec1的抑制劑，和p53之間的關係仍未被完全闡明。其他化合物，組合物，和實驗可參考WO 2011/115998，其意包括在本發明範疇內。
顯而易見的，除了已經描述的部分，有其他更多的不脫離本發明的概念，本領域的技術人員在本領域中可據以實施。因此本發明的範疇不被申請專利範圍所限制。此外，在解釋本說明書和申請專利範圍中，所有的術語應盡可能廣泛且與上下文一致的方式解釋之。特別是，術語“包含”和“包括”應被解釋為非獨占的元件，部件或步驟，指示引用的元素，部件，或步驟，可能包含未明確引用的其他元件，部件，或步驟之使用或其組合。凡本說明書的申請專利範圍是指選自A，B，C...N之群組中的任何之一，文字解釋應僅從群組中單一元素解釋之，而不是A加N或B加N等。
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<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> GAPDH前置引子
<400> 1
Figure 101143435-A0202-12-0032-14
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> GAPDH反置引子
<400> 2
Figure 101143435-A0202-12-0032-15
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> Rb前置引子
<400> 3
Figure 101143435-A0202-12-0033-16
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(21)
<223> RB反置引子
<400> 4
Figure 101143435-A0202-12-0033-17
<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(17)
<223> p53前置引子
<400> 5
Figure 101143435-A0202-12-0033-18
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成DNA
<220>
<221> Misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> p53反置引子
<400> 6
Figure 101143435-A0202-12-0034-19

Claims (15)

  1. 一種判斷癌症細胞對於Hec1抑制劑之敏感度的方法，包含：提供一含有一癌症細胞或一群癌症細胞之樣本；形成一Hec1可被偵測的複合物和一p53可被偵測的複合物，其中Hec1和p53來自前述樣本；以前述可被偵測的複合物來判斷Hec1之表現量及p53之狀態，以取得一測試結果；以及將前述測試結果中所含Hec1之表現量及p53之狀態與一非癌症細胞的對照結果做比較，相對於非癌症細胞的對照結果，當在測試結果中包含Hec1的表現量指出提升基因產物的表現量，並且在測試結果中包含p53的狀態指出突變或缺少p53基因，以判斷前述癌症細胞對Hec1抑制劑之敏感度；其中，所述Hec1抑制劑選自由以下化合物所組成之群組：N-(4-(4-異丙氧基-2,6-二甲基)噻唑-2-基)異煙醯胺、N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙醯胺、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙醯胺、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基硫基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙醯胺及其鹽類。
  2. 一種判斷癌症細胞對於Hec1抑制劑之敏感度的方法，其包含：提供一含有一癌症細胞或一群癌症細胞之樣本；形成一Hec1可被偵測的複合物、一p53可被偵測的複合物及一Rb可被偵測的複合物，其中Hec1、p53和Rb來自前述樣本；以前述可被偵測的複合物來判斷Hec1之表現量及p53和Rb之狀態，以取得一測試結果；以及將前述測試結果中所含Hec1之表現量及p53和Rb之狀態與一非癌症細胞的對照結果做比較，相對於非癌症細胞的對照結果，當在測試結果中包含Hec1的表現量指出提升基因產物的表現量，並且在測試結果中包含p53的狀態指出突變或缺少p53基因，以及在測試結果中包含Rb的狀態指出突變或缺少Rb基因，以判斷前述癌症細胞對Hec1抑制劑之敏感度；其中，所述Hec1抑制劑選自由以下化合物所組成之群組：N-(4-(4-異丙氧基-2,6-二甲基)噻唑-2-基)異煙醯胺、N-(4-(4-(4-甲氧基苯氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙醯胺、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基氧基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙醯胺、N-(4-(4-(5-(2-甲氧基乙氧基)吡嗪-2-基硫基)-2,6-二甲基苯基)噻唑-2-基)異煙醯胺及其鹽類。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述判斷Hec1表現量的步驟包含Hec1之核酸編碼定量。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述判斷Hec1表現量的步驟包含將Hec1之核酸編碼定序或雜交或前述方式之結合。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述判斷Hec1表現量的步驟包含Hec1蛋白之定量。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述判斷p53狀態的步驟包含p53之核酸編碼定量。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述判斷p53狀態的步驟包含將p53之核酸編碼定序或雜交或前述方式之結合。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述判斷p53狀態的步驟包含p53蛋白之定量。
  9. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述判斷Rb狀態的步驟包含Rb之核酸編碼定量。
  10. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述判斷Rb狀態的步驟包含將Rb之核酸編碼定序或雜交或前述方式之結合。
  11. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中前述判斷Rb狀態的步驟包含Rb蛋白之定量。
  12. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述癌症細胞為乳癌細胞。
  13. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述癌症細胞為肺癌細胞。
  14. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之方法，其中前述癌症細胞為大腸癌細胞。
  15. 如申請專利範圍第項或第2項所述之方法，其中前述癌症為肝癌細胞。
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