TWI679979B - 關於去氧膽酸及其多形體之組成物及方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供去氧膽酸(DCA)之多形體形式，合成DCA及其中間體之改良方法，以及採用如本文所提供之DCA的組成物及脂肪移除方法。

Description

關於去氧膽酸及其多形體之組成物及方法 〔相關申請案之交叉參考〕
本申請案根據35 U.S.C.119(e)主張2011年9月22日申請之美國臨時申請案第61/538,084號、2011年11月10日申請之美國臨時申請案第61/558,375號、2012年6月14日申請之美國臨時申請案第61/659,920號及2012年6月14日申請之臺灣申請案第TW 101121290號之權益，該等申請案中之每一者藉此以全文引用的方式併入本申請案中。
本文提供去氧膽酸(DCA)之多形體形式，合成DCA及其中間體的改良方法，以及採用如本文所提供之DCA的組成物及脂肪移除方法。因此，在某些態樣中，本發明提供DCA多形體，較佳令人驚訝地為水及熱穩定性DCA結晶無水多形體。在其他態樣中，本發明進一步提供經純化之DCA組成物以及適用於DCA純化之方法及組成物，其中DCA較佳具有至少99%之純度。在其他態樣中，本發明提供關於合成DCA的製備之化合物、組成物及方法。
快速移除體脂肪為由來已久的想法，且據稱許多物質可實現該等結果，不過幾乎沒有物質已經顯示出結果。雖然自從二十世紀50年代起已提出順勢療法及美容主張，但出於安全性及療效考慮，「美塑療法(Mesotherapy)」或用於移除脂肪之可注射劑的使用未在醫學從業者中得到廣泛認可。美塑療法最初在歐洲設想為一種利用含有用於治療局部醫學及美容病狀之化合物的混合 物之皮膚注射劑的方法。雖然美塑療法傳統上用於疼痛緩解，但其美容應用，尤其脂肪及脂肪團移除近來已在美國受到關注。一種用於局部脂肪減少之此類經報導之治療在巴西較為普及且使用磷脂醯膽鹼注射劑，該治療已被錯誤地認為與美塑療法同義。儘管其作為一種傳說的「脂肪溶解」注射劑受到關注，但幾乎不存在關於此等美容治療之安全性及療效資料。參見Rotunda,A.M.及M.Kolodney,Dermatologic Surgery 32：,465-480(2006)(「Mesotherapy and Phosphatidylcholine Injections：Historical Clarification and Review」)。
近來公開之文獻報導了膽汁酸(DCA)及其鹽當活體內注射至脂肪沈積物中時具有脂肪移除特性。參見WO 2005/117900及WO 2005/112942以及US2005/0261258、US2005/0267080、US2006/127468及US20060154906，該等文獻中之每一者均以全文引用的方式併入本文中)。注射至脂肪組織中之去氧膽酸鹽經由細胞溶解機制降解脂肪細胞。因為注射至脂肪中之去氧膽酸鹽藉由曝露於蛋白質而快速失活，接著快速返回腸內容物，所以在空間上含有其作用。由於此賦予臨床安全性之衰減效應，脂肪移除典型地需要4-6個階段。此無需外科手術之局部脂肪移除不僅對與病理性局部脂肪沈積物相關的治療性治療(例如HIV治療中之醫學干預所難免的血脂異常)有利，而且對無外科手術中固有之伴隨風險的美容脂肪移除(例如脂肪抽吸術)有利。參見Rotunda等人，Dermatol.Surgery 30：1001-1008(2004)(「Detergent effects of sodium deoxycholate are a major feature of an injectable phosphatidylcholine formulation used for localized fat dissolution」)及Rotunda等人，J.Am.Acad.Dermatol.(2005：973-978)(「Lipomas treated with subcutaneous deoxycholate injections」)，均以全文引用的方式併入本文中。美國專利第7,622,130號及第7,754,230號描述使用DCA用於脂肪移除。
另外，許多重要類固醇在類固醇之C環上具有12-α-羥基-取代基。該等化合物包括例如膽汁酸，諸如DCA、膽酸、石膽酸及其類似物。迄今 為止，該等化合物典型地自牛及綿羊來源回收，該等來源在成本有效的基礎上提供備用的膽汁酸來源。然而，隨著近來發現諸如病原性蛋白顆粒(prions)可染汙此類來源，用於自植物來源或合成的起始物質合成膽汁酸之替代性方法已變得愈來愈重要。舉例而言，只要紐西蘭的動物繼續保持隔離且另外不含可觀測的病原體，根據美國監管制度，來自該等動物之DCA為供人類使用之膽汁酸來源。該等嚴格條件對合適的哺乳動物來源的膽汁酸之量施加限制且不排除膽汁酸將不含該等病原體之可能性。美國專利公開案第8,242,294號係關於含有少於1ppt 14C之DCA。
仍需合適量之膽汁酸(諸如DCA)，較佳用於人類投藥。因此，亟需提供用於製備及純化DCA之方法。
此外，當用於人類投藥時，結晶劑(如DCA)隨時間推移在各種所製造之DCA批次中保持其多形體及化學穩定性、溶解度及其他物理化學特性為重要的。若物理化學特性隨時間及批次變化，則有效劑量之投藥變得有問題且可引起毒副作用或無效投藥。因此，重要的是選擇穩定、可再生性製造且具有有利於用於對人類投藥的物理化學特性的結晶劑形式。對於諸如DCA之化合物，其溶劑化多形體可含有不合人類投藥需要之量的有機溶劑。然而，自DCA晶體移除該等殘餘溶劑可能有問題。因此，該等溶劑用於使DCA結晶、尤其用於製備原料藥或有效藥劑成分(active pharmaceutical ingredient，API)之用途為不可預知的且受限的。
此外，該技術仍不能預測將具有所需特性之組合且將適用於人類投藥之通常試劑(且詳言之為DCA)的結晶形式，且不能預測如何將該試劑製備成此類結晶形式。
本文提供去氧膽酸(DCA)之多形體形式，合成DCA及其中間 體之改良方法，以及採用如本文所提供之此類DCA的組成物及脂肪移除方法。
因此，在一個態樣中，本發明提供DCA多形體，較佳令人驚訝地為水穩定性及熱穩定性DCA結晶無水多形體。
本文提供DCA之結晶多形體，諸如本文所特性化之形式A、B、C及D之多形體。加熱時，觀測到以下多形體形式轉化：C→B→D→A，表明形式A為熱力學最穩定的多形體。然而，意外的是，當形式A及形式B在環境溫度下在約1：1.2 v/v乙醇(EtOH)/水中製成漿料時，形式A轉化成形式C，但形式B不轉化。
基於在熱解重量分析(thermogravimetric analysis，TGA)中40℃與160℃之間觀測到的2.4%水損失，預期形式C中每莫耳DCA含有半莫耳之弱結合水。因為形式A、形式B及形式D中無一者在其TGA中表明任何實質性水損失，且因為半水合物形式C在加熱時轉化成形式B，且形式B在加熱時進一步轉化成形式D及形式A，所以形式A、形式B及形式D為無水多形體形式。基於差示掃描熱量測定(differential scanning calorimetry，DSC)，形式A似乎為非溶劑合物(ansolvate)，因為其在DSC中展示單一吸熱峰(參見圖6)。
在一個具體實例中，本文所提供之結晶無水DCA多形體具有形式A。在另一具體實例中，形式A多形體藉由在15.0 °2θ處之粉末X射線繞射峰或藉由選自8.9、10.7、14.0、15.0、16.2及19.1 °2θ之1個、2個或3個PXRD峰特性化。在另一具體實例中，形式A多形體藉由實質上如圖1中所示之PXRD圖案特性化。在另一具體實例中，形式A藉由174℃下之吸熱峰(在±2℃內)特性化，如藉由差示掃描熱量測定所量測。在另一具體實例中，形式A藉由在低於(174±2)℃處之吸熱峰或高於高達300℃之溫度處之吸熱峰的溫度下實質上不存在熱事件來特性化，如藉由差示掃描熱量測定所量測。
在另一具體實例中，本文中所提供之結晶無水DCA多形體具有 形式B。在一個具體實例中，形式B多形體藉由在7.4°2θ處之粉末X射線繞射(PXRD)峰或藉由選自6.7、7.3、7.4、8.4、9.3、11.2、12.9、13.9、14.4、14.6、14.8、15.8、16.0、16.9及17.8°2θ之1個、2個或3個PXRD峰特性化。在另一具體實例中，形式B多形體藉由實質上如圖2中所示之PXRD圖案特性化。在另一具體實例中，形式B藉由135℃下之吸熱峰(在±2℃內)特性化，如藉由差示掃描熱量測定所量測。
在另一態樣中，本發明提供DCA之結晶水合多形體C。在另一具體實例中，形式C多形體藉由在15.8°2θ處之粉末X射線繞射峰或藉由選自6.6、7.3、7.4、9.6、9.9、12.6、13.0、13.2、13.9、14.2、15.1、15.6、15.8、16.4、17.0、17.1及17.6°2θ之1個、2個或3個PXRD峰特性化。在另一具體實例中，形式C多形體藉由實質上如圖3中所示之PXRD圖案特性化。在另一具體實例中，形式C藉由低於100℃下之廣泛轉變來特性化，如藉由差示掃描熱量測定所量測。在另一具體實例中，形式C多形體藉由對應於TGA分析中在40℃至140℃之溫度下約2.4%質量損失的轉變來特性化。
在另一具體實例中，本文所提供之結晶無水DCA多形體具有形式D。在另一具體實例中，形式D多形體藉由在10.0°2θ處之粉末X射線繞射(PXRD)峰或藉由選自7.0、7.4、10.0、14.2、15.3、15.8、16.6及17.3°2θ之1個、2個或3個PXRD峰特性化。在另一具體實例中，形式D多形體藉由實質上如圖5中所示之PXRD圖案特性化。在另一具體實例中，形式D藉由156℃下之吸熱峰(在±2℃內)來特性化，如藉由差示掃描熱量測定所量測。
在另一態樣中，本發明提供DCA多形體，較佳為與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑混合之DCA結晶無水多形體。在一個具體實例中，DCA多形體具有形式B。在另一具體實例中，DCA多形體為形式A或形式D。在另一具體實例中，經混合之多形體實質上不包括水合多形體，較佳不包括多形體形 式C。在另一具體實例中，經混合之組成物包含約0.1% w/v至約2% w/v，或較佳約0.5% w/v至約1.5% w/v DCA。在另一具體實例中，經混合之組成物為適用於皮下注射之水性調配物。在另一具體實例中，至少一種醫藥學上可接受之賦形劑及/或載劑選自由水、緩衝液及防腐劑組成之群。
在另一態樣中，本文提供將一種DCA多形體形式轉化成另一形式的方法。在一個具體實例中，在真空(例如約50mm Hg)下，在低於135℃、較佳低於100℃之溫度下，更佳在約40℃下加熱形式C多形體以提供形式B多形體。
在本文所提供之各種組成物、方法及方法態樣及具體實例內，在一個具體實例中，本文所用之DCA為非微生物及/或非哺乳動物DCA。在一個具體實例中，該DCA(其本質上為合成的)包括側鏈：
Figure TWI679979B_D0001
或其酯，該側鏈或其酯合成性併入至DCA分子中。在另一具體實例中，該合成的DCA為不與任何膽酸混合的DCA。如本文所用，「非微生物」係指非利用微生物製備的DCA。在一較佳具體實例中，「非微生物」DCA並非使用膽酸製備。如本文所用，「非哺乳動物」係指非自哺乳動物來源分離的DCA，該等哺乳動物之非限制性實例包括綿羊及牛。在另一具體實例中，本文所用之非微生物及/或非哺乳動物DCA含有小於1ppt，較佳小於0.9ppt 14C。
在其他態樣中，本發明進一步提供經純化之DCA組成物以及適用於DCA純化之方法及組成物，其中該DCA較佳具有至少99%之純度。針對DCA之結晶及純化，評估各種溶劑系統。雖然DCM/MeOH適用於提供經純化之DCA，但移除自DCM/MeOH結晶的DCA中之二氯甲烷(DCM)具有問題；因此，最初自DCM/MeOH純化之DCA較佳再結晶以得到具有較少殘餘有機溶劑之晶體形式。
為此，DMSO結晶顯示高含量之殘餘DMSO。丙酮結晶顯示DCA回收不良。亦測試作為結晶溶劑之EtOH/水、甲基乙基酮(MEK)/正庚烷及異丙醇(IPA)/正庚烷。MEK/正庚烷系統提供純化及回收，但殘餘MEK無法移除。IPA/正庚烷系統提供純化、回收及容積效率，但殘餘IPA無法移除。鑒於其他溶劑系統之失敗，意外地發現，EtOH/水系統提供良好的純化、容積效率，且回收含有高達0.54% DS-DCA之粗DCA而無殘餘溶劑問題。
在其他態樣中，本發明提供關於合成DCA的製備之化合物、組成物及方法。此等方法、組成物及中間體之一種優勢為其包括內部3,9類固醇縮酮，該內部3,9類固醇縮酮根據本發明容易獲得且在無需額外官能基保護的情況下在17位酮基處經受烯化作用。本文中所提供之方法的另一優勢為在各種條件下128之改良的烯丙位氧化提供129。在某些條件下，發現其中將氧化不足之烯丙醇128a氧化成129之兩步法優於一步法。本文亦提供用於移除脂肪沈積物之醫藥組成物及採用本發明之組成物及多形體移除脂肪沈積物之方法。
在本發明之化合物態樣之一中，本發明提供選自由以下組成之群的化合物：
Figure TWI679979B_D0002
其中P為羥基保護基。
在本發明之化合物態樣中之另一者中，本發明提供式DS-DCA之化合物：
Figure TWI679979B_D0003
或其C1-C6烷基酯或鹽，該鹽包括(但不限於)醫藥學上可接受之鹽。在一個具體實例中，本發明提供與DCA或其C1-C6烷基酯或鹽混合之DS-DCA、其C1-C6烷基酯或鹽。在一個具體實例中，DS-DCA為非微生物及/或非哺乳動物DS-DCA。在另一具體實例中，DS-DCA具有小於1ppt之14C含量。在另一具體實例中，本發明提供含有小於0.5% w/w，較佳小於0.1% w/w，更佳小於0.05% w/w之DS-DCA的DCA。
在本發明之組成物態樣之一中，本發明提供包含下式化合物：
Figure TWI679979B_D0004
及2碳烯化試劑(2 carbon olefination reagent)之組成物。
在本發明之組成物態樣中之另一者中，本發明提供包含下式化合物：
Figure TWI679979B_D0005
 第三丁基過氧化氫及CuI之組成物。在一個具體實例中，該組成物不含次氯酸根(OCl(-))。
在本發明之組成物態樣中之另一者中，本發明提供包含下式化合物：
Figure TWI679979B_D0006
其中R1為視情況經1-3個鹵基(較佳為氟)及/或烷氧基取代之C1-C6烷基，或為視情況經1-3個C1-C3烷基、鹵基(較佳為氟)及/或烷氧基取代之芳基，及氫化催化劑之組成物，該催化劑較佳為鈀、鉑或此類其他金屬，或其各自之氧化物或氫氧化物，經碳、氧化鋁或此類其他支撐物支撐。在一些具體實例中，該組成物進一步包含氫氣。在一些具體實例中，該組成物進一步包含溶劑，較佳在氫化催化劑存在下不與氫氣反應之任何惰性溶劑，諸如二甲基甲醯胺、二甲基乙醯胺、C1-C4醇、乙酸乙酯、四氫呋喃及其類似物。
在本發明之組成物態樣中之另一者中，本發明係有關包含DCA或其鹽、及一或多種C1-3醇與去離子水之混合物的組成物。在一較佳具體實例中，C1-3醇為乙醇。在一更佳具體實例中，乙醇與水以約1：1至約5：1 v/v之比率存在。
在本發明之方法態樣之一中，本發明提供一種氧化類固醇的12-位亞甲基之方法，該亞甲基鄰近於△-9,11-烯，該方法包含在某些條件下使含有亞甲基之類固醇與第三丁基過氧化氫及CuI接觸以提供12-羥基△-9,11-烯類固醇及視情況存在之12-酮基△-9,11-烯類固醇。在一個具體實例中，該方法進一步包含在某些條件下使12-羥基△-9,11-烯類固醇與氯鉻酸吡錠接觸以提供12-酮基△-9,11-烯類固醇。
在本發明之方法態樣中之另一者中，本發明提供一種製備DCA：
Figure TWI679979B_D0007
或其鹽之方法，該方法包含： (i)在氫化條件下在包含MeOH之溶劑中使式121化合物：
Figure TWI679979B_D0008
與H2接觸以形成式121a化合物：
Figure TWI679979B_D0009
 (ii)在烯烴形成條件下使式121a化合物與2碳烯化試劑接觸以提供式121b化合物：
Figure TWI679979B_D0010
 (iii)在縮酮水解條件下使式121b化合物與酸之水溶液接觸以提供式121c化合物：
Figure TWI679979B_D0011
 (iv)使式121c化合物與還原劑接觸以提供式121e化合物：
Figure TWI679979B_D0012
 (v)將式121e化合物轉化成式121f化合物，其中P為羥基保護基：
Figure TWI679979B_D0013
 (vi)在脫水條件下接觸化合物121f以提供式126化合物：
Figure TWI679979B_D0014
 (vii)在路易斯酸(Lewis acid)催化劑存在下使化合物126與式HCCCO2R之丙炔酸烷酯或式H2CCHCO2R之丙烯酸烷酯接觸以提供式127a化合物，其中R為視情況經1-3個芳基取代之烷基，且
Figure TWI679979B_D0015
係指單鍵(如獲自丙烯酸酯)或雙鍵(如獲自丙炔酸酯)：
Figure TWI679979B_D0016
 (viii)在氫化條件下使式127化合物與H2接觸以形成式128化合物：
Figure TWI679979B_D0017
 (ix)在烯丙位氧化條件下使式128化合物與氧化劑接觸以提供式128a或式129之化合物，或化合物128a與129之混合物：
Figure TWI679979B_D0018
 (x)視情況，較佳當式128a化合物大量存在於混合物中時，在氧化條件下使該混合物與氧化劑接觸以提供式129化合物；(xi)在氫化條件下使式129化合物與氫氣接觸以提供視情況與式130a化合物混合之式130化合物：
Figure TWI679979B_D0019
 (xii)視情況，較佳當式130a化合物以大量混合時，在氧化條件下使與式130a化合物混合之式130化合物與氧化劑接觸以提供式130化合物；(xiii)使式130化合物與還原劑接觸以提供式131化合物：
Figure TWI679979B_D0020
 (xiv)在脫除保護基條件下使式131化合物之經保護醇及羧酸酯基團脫除保護基以提供DCA或其鹽。
在一個具體實例中，包含MeOH之溶劑為MeOH。在另一具體實例中，2碳烯化試劑包含EtPPh3Br及第三丁氧化物。在另一具體實例中，步驟(iv)中之還原劑為硼氫化物，較佳為NaBH4。在另一具體實例中，P為R2-CO-，其中R2為C1-C6烷基或芳基，其中該烷基及該芳基視情況經1-3個芳基、C1-C6烷氧基及/或鹵基取代。在另一具體實例中，路易斯酸催化劑為EtAlCl2。在另一具體實例中，脫水條件包含與酸或與亞硫醯氯接觸。在另一具體實例中，氫化條件包含採用負載型Pd、Pt或Rh催化劑。在另一具體實例中，步驟(ix)中之氧化係使用氫過氧化物及Cu(I)鹽執行。在另一具體實例中，步驟(x)中之氧化係使用氯鉻酸吡錠(PCC)，較佳在無水條件下執行。在另一具體實例中，步驟(xii)中之視情況氧化係用PCC執行。在另一具體實例中，步驟(xiii)中之還原係用LiAl(OCMe3)3H執行。在另一具體實例中，脫除保護基係用鹼性水溶液執行。
在本發明之方法態樣中之某些其他態樣中，本發明提供關於立體選擇性還原含有3-酮基及4,5-烯不飽和的類固醇以提供3-α-羥基及5-β-H類固醇或其3-酯之方法。在一個此類態樣中，本發明提供一種合成方法，其包含在某些條件下使下式化合物：
Figure TWI679979B_D0021
與氫化催化劑及氫氣接觸以提供下式化合物：
Figure TWI679979B_D0022
預期存在於本發明所用化合物中之9-羥基及17-酮基可適當經保護或衍生化。舉例而言，可保護羥基以形成酯(-OCOR1)或矽烷基醚(-OSi(R1)3)，其中各R1獨立地為視情況經1-3個鹵基(較佳為氟)及/或烷氧基取代之C1-C6烷基，或為視情況經1-3個C1-C3烷基、鹵基(較佳為氟)及/或烷氧基取代之芳基。
在本發明之脂肪移除方法態樣之一中，本發明提供一種用於減少個體中之皮下脂肪沈積物的方法，該方法包含在某一條件下向個體中之脂肪沈積物局部投予有效量之結晶無水形式(較佳為形式B)DCA以溶解脂肪沈積物，該結晶無水形式與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑混合。如本文所用，醫藥學上可接受之賦形劑包括醫藥學上可接受之鹼，諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀。
下文中揭示本發明之此等及其他態樣以及具體實例。
圖1說明DCA之形式A多形體的PXRD圖案。
圖2說明DCA之形式B多形體的PXRD圖案。
圖3說明DCA之形式C多形體的PXRD圖案。
圖4說明形式C至形式B DCA之熱轉化的PXRD堆疊圖。
圖5說明DCA之形式D多形體的PXRD圖案。
圖6說明DCA之形式A多形體DSC圖案。
定義
在本發明中，藉由鑑別引文來參考各種公開案、專利及公開之專利說明書。此等公開案、專利及公開之專利說明書的揭示內容藉此以引用的方式併入本發明中以更充分地描述本發明所涉及之目前先進技術。
如本文所用，某些術語可具有以下所定義之含義。如本說明書及申請專利範圍中所用，除非上下文另外清楚地指示，否則單數形式「一(a/an)」及「該」包括單數及複數個提及物。因此，例如提及「一溶劑」包括複數種相同或不同溶劑。
除非另外指明，否則本說明書及申請專利範圍中所用之表示成分的量、反應條件等等的所有數字均應理解為在所有情況中皆經術語「約(about)」修飾。因此，除非相反地指出，否則在以下說明書及隨附申請專利範圍中所闡述之數值參數為近似值。各數值參數應至少根據所報導之有效數位之數字且藉由應用一般捨位技術來解釋。在某些情況下，如熟練技術人員將顯而易見，「約」當用於包括範圍之數值名稱(例如溫度、時間、量及濃度)之前時表示可變化(+)或(-)10%、5%或1%的近似值。
如本文所用，術語「包含(comprising)」欲意謂化合物、組成物、製程及方法包括所述要素，但不排除其他要素。「基本上由......組成」當用於限定組成物及方法時，應意謂排除對化合物、組成物、製程或方法具有任何基本重要性的其他要素。「由......組成」應意謂排除用於所主張的化合物或組成物及實質性製程或方法步驟之其他成分之超過微量的要素。經此等轉換術語中之每一者限定的具體實例在本發明之範疇內。因此，意欲該等製程方法、組成物及化合物可包括額外步驟及組分(包含)，或者包括不重要的額外步驟及化合物或組成物(基本上由...組成)，或者意欲僅所述步驟或化合物或組成物(由...組成)。
如本文所用，類固醇骨架及其中之環的編號遵循通用慣例：
Figure TWI679979B_D0023
應理解除非另外說明，否則骨架僅代表碳原子之位置。在兩個相鄰碳原子之間的一或多個鍵可為雙鍵，且一或多個碳原子可視情況經取代。
如本文所用之術語「△(或delta)-9,11-烯類固醇」或「△-9,11-烯化合物」係指在9與11碳原子之間具有雙鍵之類固醇化合物，其由以下骨架表示：
Figure TWI679979B_D0024
如本文所用，即使無特定指定，在B、C、D環接面處之立體化學亦為天然類固醇中最常見的立體化學，亦即：
Figure TWI679979B_D0025
術語「2碳烯化試劑」係指用Me-CH=部分置換酮基之氧的烯化試劑。
術語「酸(acid)」係指能夠供予H+的試劑或作為電子對接受體之「路易斯酸」。路易斯酸包括諸如鹵化烷基鋁(例如Et2AlCl及MeAlCl2)之有機金屬試劑。
術語「烷氧基(alkoxy)」係指-O-烷基，其中烷基如上文所定義。非限制性實例包括甲氧基、乙氧基、異丙氧基、丙氧基、第三丁氧基、異丁氧基、丁氧基及其類似基團。
術語「烷基(alkyl)」係指具有1至10個碳原子之單價飽和脂族烴基(亦即C1-C10烷基)或具有1至6個碳原子之單價飽和脂族烴基(亦即C1-C6烷基)或具有1至4個碳原子之單價飽和脂族烴基。以非限制性實例來說明，此術語包括直鏈及分支鏈烴基，諸如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、異丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、異丁基((CH3)2CHCH2-)、第二丁基((CH3)CH3CH2)CH-)、第三丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)及新戊基((CH3)3CCH2-)。
術語「烯丙位氧化(allylic oxidation)」係指氧化雙鍵之α位，較佳藉由在彼α位併入羥基、-OOH、-OO-烷基及側氧基中之一或多者。較佳地，該氧化作用併入羥基，且更佳地併入側氧基。
術語「芳基(aryl)」係指具有6-10個環碳原子的單價芳環。芳基之實例包括苯基及萘基。
術語Cx(其中x為整數)當置於一基團之前時係指彼基團含有x個碳原子。
術語「脫水條件(dehydrating condition)」係指移除相鄰碳原子上之羥基及氫原子以提供烯烴的條件。脫水條件亦包括將羥基轉化成離去基，諸如氯、溴、甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基、三氟甲磺酸酯基或-OS(O)Cl。脫水(dehydration)或脫水(dehydrating)例如藉由脫水試劑或簡單地藉由加熱來實現。該等非限制性條件包括用酸、亞硫醯氯及其類似物處理。
術語「鹵基(halo)」係指氟、氯、溴及/或碘。
術語「氫化條件(hydrogenation conditions)」係指用於引入H2 至一或多個雙鍵的條件及催化劑，較佳使用氫化催化劑。氫化催化劑包括基於鉑族金屬之催化劑(鉑、鈀、銠及釕以及其氧化物及氫氧化物)，諸如Pd/C及PtO2。
術語「羥基保護基(hydroxy protecting group)」係指能夠保護化合物之羥基(-OH)且在脫除保護基條件下釋放羥基的基團。常見之該等基團包括醯基(其與羥基之氧原子形成酯)，諸如乙醯基、苯甲醯基；及與羥基之氧原子形成醚的基團，諸如甲醚、烯丙醚、炔丙醚、苯甲醚、甲氧基苯甲醚及甲氧基甲醚、矽烷基醚等。羥基保護基在有機合成領域中為吾人所熟知。根據本發明可採用之合適的非限制性羥基保護基及其他保護基以及用於其脫除之條件描述於諸如Protective groups in organic synthesis，第3版，T,W.Greene及P.G.M.Wuts編，John Wiley & Sons,Inc.,New York,N.Y.,U.S.A.,1999及其後續版本之書籍中且對一般熟習此項技術者將為熟知的，該文獻以全文引用的方式併入本文中。
術語「烯化試劑(olefination reagent)」係指執行烯化，亦即與酮反應形成烯烴的試劑。術語「烯烴形成條件(olefin forming conditions)」係指進行該等轉化之條件。該等試劑之實例包括維蒂希(Wittig)及維蒂希霍納(Wittig Horner)試劑，且該等條件之實例包括維蒂希及維蒂希霍納烯化條件。
術語「縮酮(ketal)」係指在一分子中具有兩個-ORx基團附著至同一碳原子上的基團，其中Rx代表烴基。如熟練技術人員所熟知，縮酮易於在溫和條件下於酸之水溶液中酸性水解。
術語關於分子之「氧化」係指自該分子移除電子。以此方式，例如可添加氧至分子中或可自分子移除氫。例如藉由氧化劑及以電化學方式實現氧化。術語「氧化條件(oxidizing conditions)」係指用於氧化分子之合適條件，包括如本文所揭示之微生物氧化。
術語「氧化劑(oxidizing agent)」係指能夠氧化分子的試劑，且 包括(但不限於)「鉻氧化劑」及「銅氧化劑」。以此方式，可添加氧至分子中或可自分子移除氫。僅舉例而言，氧化劑包括雙環氧乙烷、臭氧、二-第三丁基三氧化物、氧氣、四氯醌、二氯二氰基苯醌、過酸(諸如過羧酸)、瓊斯試劑(Jones reagent)、烷基氫過氧化物(諸如第三丁基過氧化氫，視情況與CuI及次氯酸鹽一起使用)、次氯酸鹽、氯鉻酸吡錠、CrO3及Cu(II)或Cu(III)化合物或其混合物。可一起使用一種以上氧化劑用於氧化化合物，其中一種氧化劑，較佳為含有金屬之氧化劑(諸如鉻或銅氧化劑)可以催化量使用。較佳氧化劑為氫過氧化物及亞銅鹽，諸如第三丁基過氧化氫及CuI。
術語「醫藥學上可接受」係指對於活體內(較佳對於人類)投藥安全且無毒。
術語「醫藥學上可接受之鹽」或「其鹽」係指DCA之醫藥學上可接受之鹽，該等鹽衍生自此項技術中所熟知之各種有機及無機相對離子，且包括(僅舉例說明)鈉、鉀、鈣、鎂、銨及四烷基銨鹽。
術語「還原(reducing)」係指添加一或多個電子至分子中，且例如使氫添加至分子中，且包括氫化條件。術語「還原劑」係指在氧化-還原反應中可供予電子的試劑，且例如使氫添加至分子中。術語「還原條件」係指用於使電子及/或氫添加至分子中之合適條件，包括氫化條件。合適之還原劑包括(但不限於)鋰、鈉、鉀、鋁汞齊、氫化鋰鋁、硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、氫化鋰三-第三丁氧基鋁、氫化二第三丁氧基鋁、三乙基硼氫化鋰及其類似物。
當適當使用諸如沈澱、過濾、結晶、蒸發、蒸餾及層析之習知技術時，可分離且純化較佳具體實例之各種起始物質、中間體及化合物。可使用習知方法，諸如藉由熔點、質譜、核磁共振及各種其他光譜分析來執行此等化合物之特性化。
本發明之化合物、組成物及方法之某些非限制性實例示意性說明 於下文中。
Figure TWI679979B_D0026
化合物121a(獲自120在甲醇中之氫化)經受維蒂希反應以得到粗121b(典型地55-68% 121b，具有約1% E-異構物及35-48%含磷雜質)。乙酸萃取性純化產物得到121b(產率為101%，純度90.8%(相應高效液相層析(HPLC)之曲線下面積，或簡言之AUC)，具有1.9% E-異構物及5.5%含磷雜質)。矽膠純化產物得到121b(產率為120%，純度90.8%(AUC)，具有1.9% E-異構物及5.1%含磷雜質)。使用更受阻的鹼2,6-二甲基吡啶替代吡啶使得更緩慢脫水形成126(在0℃下在6.5小時之後轉化率低於9%；在環境溫度下在15小時之後轉化率為43%，但具有許多雜質)。為了移除使二氯甲烷中之121f溶液脫水之硫酸鎂，在脫水步驟之前，證實額外亞硫醯氯(0.3當量)驅動反應完成(在1.1當量之情況下，反應含有15-19%未反應之121f；添加0.3當量，反應不含未反應之121f且具有典型的反應特徵)。
在標準條件下對126進行之5-g規模的烯(ene)反應得到呈黏稠液體狀之127a[5.95g，95.0%，90.3%(AUC)，藉由GC-MS，PCI批號D-170-190a]。在標準條件下在23psi氫氣壓下使127a氫化以在反應逐漸完成之後得到呈白色固體狀之粗128[5.5g，92%，84.5%(AUC)，藉由GC-MS]。
再結晶129之樣品的殘餘金屬分析顯示2ppm Cu及81ppm Cr；因此，不涵蓋用於金屬修復之額外步驟。在TBHP(2.5當量)存在下在50℃下，乙腈中之碘化亞銅負載減少(自0.7當量至0.35當量)使得氧化耗時過長(與17小時相比，至完成需48小時)。進行20-g氧化；在用亞硫酸氫鈉溶液中止且用鹽水洗滌之後獲得128a/129b於乙腈中之靜止水潤濕溶液。此舉用於測試產物在此溶液中之直接氧化以致力於減少加工。與PCC及活性MnO2之反應未產生氧化；與過硫酸氫鉀反應時，主要產物為新化合物(藉由HPLC)而非129。當乙腈溶液經脫水時，PCC為成功的，但活性MnO2及過硫酸氫鉀反應不反應(藉由TLC)。使用CAD，129得到良好的劑量-反應曲線。128及128a均可使用CAD系統(RRT 1.85及1.36)來偵測；128a顯示為雙重峰，可能歸因於醇之差向異構物。
根據關於立體選擇性還原類固醇二烯以提供DCA之態樣，下文使用CH3CO-作為R1CO-基團示意性說明本發明之說明性組成物及方法。根據本發明且基於熟練技術人員已知之合成方法，可採用各種R1及R2(參見以上)基團。參見例如PCT申請公開案第WO 2011/075701號及美國專利申請公開案第2008/0318870號，該等公開案中之每一者均以全文引用的方式併入本文中。
Figure TWI679979B_D0027
如熟練技術人員將顯而易見，當執行步驟1時17-酮基可經保護為例如縮酮，且隨後脫除保護基。對於執行步驟1，亦可使用以下方法及試劑。
例如，在乙酸酯/酯官能基存在下可分解之任何正交保護基。說明性實例包括某些苯甲基類型之保護基、其他矽烷基保護基及縮醛保護基。亦預期可在不保護第三C-9醇的情況下進行動力學控制之烯醇化。又，保護基之選擇可確定是否需要獨立脫除保護基。若使用苯甲基類型之基團，則此基團應在氫化期間移除，氫化為合成中之下一步驟。
可用各種動力學鹼(如LDA、鈉或KHMDS等)進行烯醇化。亦預期在Ac2O或AcCl存在下，如吡啶、三乙胺、嗎啉、胡尼希鹼(Hunig's base)、碳酸酯鹼、氫氧化物(取決於C-9醇經保護或未經保護)等鹼可提供所需產物。
通常，可使用包括氟陰離子(F-)之任何試劑。氟離子用於脫除 基於矽之保護基。若使用上文所提及之其他保護基之一，則將需要其他脫除保護基試劑。視保護基而定，其他可能試劑為氫化、酸或無(若首先未保護C-9醇)。
對於執行最後步驟(步驟7)，亦可使用如熟練技術人員所熟知之以下方法及試劑：TEMPO/漂白劑、TEMPO/過硫酸氫鉀、Pd/C及過氧化物、過氧化物、MnO2及PCC、SeO2及PCC、MnO2及另一氧化劑、SeO2及另一氧化劑、漂白劑與tBuOOH、鉻氧化劑等。若一個步驟經由12-羥基烯丙醇進行，則12-羥基可遵循各種熟知試劑及方法經氧化。
如熟練技術人員將顯而易見，以上流程中所用之溶劑為說明性的，且亦可使用熟練技術人員所熟知之其他溶劑。
實施例
在下文及本說明書中別處之實施例中，以下縮寫具有所指示之含義。若一縮寫未經定義，則其具有其公認含義。
通用：氧敏感及濕氣敏感材料之所有操作均在氬氣或氮氣氛圍下用標準之火焰乾燥雙頸燒瓶進行。使用矽膠(60-120目)執行管柱層析。在Merck Kiesinger 60 F254(0.25mm)板上執行分析型薄層層析(TLC)。藉由UV光(254nm)或藉由用硫酸(5%)及大茴香醛(3%)於乙醇中之溶液炭化來觀測各光點。
裝置：在Varian Mercury-Gemini 200(1H NMR，200MHz；13C NMR，50MHz)或Varian Mercury-Inova 500(1H NMR，500MHz；13C NMR，125MHz)光譜儀上記錄質子及碳-13核磁共振譜(1H NMR及13C NMR)，其中溶劑共振作為內部標準(1H NMR，CHCl3在7.26ppm處或DMSO在2.5ppm處及DMSO-H2O在3.33ppm處；13C NMR，CDCl3在77.0ppm處或DMSO在39.5ppm處)。1H NMR資料報告如下：化學位移(δ，ppm)、多重性(s=單峰，d=雙重峰，t=三重峰，q=四重峰，br=寬峰，m=多重峰)、耦合常數(Hz)及積分。在JASCO-460+型號上操作紅外光譜(FT-IR)。用Perkin Elmer API-2000光譜儀使用ES+模式獲得質譜。使用LAB-INDIA熔點量測裝置來測定熔點且未進行校正。使用具有PDA偵測器之SHIMADZU-2010型號記錄HPLC層析圖。採用JASCO-1020在589nm處測定比旋光度且未進行校正。
DSC、TGA、XRPD及DVS資料可使用以下儀器及程序來收集且 已經收集。
差示掃描熱量測定分析(DSC)
對樣品「本身」進行DSC分析。樣品在鋁盤中稱重，用穿孔蓋覆蓋，接著捲曲。分析條件為30℃至200-350℃，以10℃/min勻變。
熱解重量分析(TGA)
對樣品「本身」進行TGA分析。樣品在氧化鋁坩堝中稱重，且自30℃至200-350℃且以10℃/min之勻變速率進行分析。
X射線粉末繞射(XRPD)
分析樣品「本身」。將樣品置於Si歸零超微量樣品固持器上。使用10mm照射寬度執行分析，且以下參數設定在硬體/軟體內：
在分析之後，使用X'Pert HighScore Plus軟體用以下參數將資料自可調整轉化成固定狹縫：固定發散狹縫尺寸：1.00°，1.59mm
動態蒸氣吸咐(DVS)
在25℃下藉由在10%相對濕度(RH)之步驟中自40%至90% RH執行吸附掃描且在-10% RH之步驟中自85%至0% RH執行解吸掃描，對10-15mg材料進行濕氣吸咐實驗。自10%至40% RH(在25℃下)進行第二次吸附掃描以測定自乾燥狀態至起始濕度的濕氣吸收。使樣品在各點處平衡四小時或直至達到漸進重量。在等溫吸咐掃描之後，在60℃下於0% RH下乾燥樣品四小時以得到乾重。在濕氣吸咐及乾燥之後執行XRPD分析以測定材料之固體形式。
化學品：除非另有註釋，否則使用市售試劑而無需純化。自鈉/二苯甲酮蒸餾乙醚及THF。使用實驗室級無水DMF、市售DCM、乙酸乙酯及己烷。
實施例1：結晶DCA多形體之特性化及穩定性
A.乾燥實驗
在40℃下在真空下評估形式C至形式B的轉化。在真空下在40℃下乾燥2個不同批次的215mg及134mg形式C。2小時後，XRPD分析表明兩種材料均轉化成形式B。乾燥後之材料的卡爾費雪(Karl Fisher)分析顯示少於0.1%水。在真空下在40℃下乾燥另一形式C批次持續18小時且XRPD分析顯示全部轉化成形式B。
形式C之TGA分析表明40℃非最佳乾燥溫度，且50℃之更高乾燥溫度加速乾燥及形式轉化。更高乾燥溫度之一個問題為形式B之穩定性。然而，形式B晶體在高達70℃下意外地穩定以致延長加熱。為了評估DCA形式B在50℃ 及70℃下之穩定性，在50℃及70℃下乾燥2批形式C持續2小時。XRPD分析表明至形式B之形式轉化完全。進一步乾燥樣品24小時且保留用於HPLC分析。HPLC分析顯示在乾燥24小時之後無降解。
用去離子水(DI水)及EtOH執行另一乾燥研究以評估在50℃下乾燥之形式B DCA的穩定性。使DCA樣品(2.0g)與去離子水及EtOH合併。隨後在真空下在50℃下乾燥樣品一段延長的時間。藉由HPLC分析樣品，且結果表明形式B DCA當在EtOH及水存在下乾燥時穩定。
來自乾燥研究之樣品的KF及XRPD分析顯示無水形式B含有低於0.9%之水且水合形式C含有超過1.9%之水。藉由XRPD每隔20分鐘分析在約45℃下於真空下形式C至形式B的形式轉化。圖4圖解說明在加熱時形式C轉化成形式B。
B.漿料穩定性
為了在漿料條件下評估形式穩定性，在環境溫度下及在50℃下，形式A及B以約1：1.2 v/v EtOH/水製成漿料。意外的是，在環境溫度下，藉由XRPD發現形式B未顯示任何形式轉化；在50℃下製成的漿料在2小時後得到形式C。
C.濕度應力
在95%相對濕度(RH)下在環境溫度下儲存約15mg形式B批次。即使在10天之後，XRPD分析仍顯示未轉化成形式C。此意外的形式B濕度/溫度穩定性由以下實驗進一步證明。在95%相對濕度(RH)及環境溫度下，且在75% RH及40℃下儲存形式B樣品。即使在11天之後，XRPD仍表明無形式轉化。KF顯示視批次及儲存條件而定，水含量以不同程度增加。水含量之增加在初始水吸咐時期之後似乎達到平線區。
D.形式C製備
根據當前工廠程序以0.15g規模進行基線結晶。因此，148mg DCA形式B溶解於EtOH(1.57mL)及水(0.178mL)中，精緻過濾且添加水(4.44mL)。殘餘DCA溶液經EtOH(0.4mL)及水(0.044mL)沖洗且添加至反應中。所得漿料在環境溫度下攪拌16小時且過濾，得到140mg固體，該固體在不乾燥的情況下藉由XPRD分析且發現為形式C。
E.形式轉化
經由漿料實驗觀測形式B至形式C的轉化：約217mg DCA形式B與1.5mL EtOH/水(1：2.37 v/v)混合。在攪拌下在50℃下加熱混合物2小時且過濾等分試樣以分離濕固體用於XRPD分析。在4小時之後分離樣品且XRPD顯示材料保持為形式B。
經由加熱觀測形式B至形式A的轉化：20mg DCA形式B在氧化鋁坩堝中稱重且以10℃/min之勻變速率自30℃加熱至150℃，接著在150℃下保持30分鐘。材料在儀器上快速冷卻至環境溫度且藉由XRPD分析。XRPD結果顯示完全轉化成形式A。
經由加熱觀測形式B至形式D之轉化：19mg DCA形式B在氧化鋁坩堝中稱重且以10℃/min之勻變速率自30℃加熱至135℃，接著在135℃下保持30分鐘。材料在儀器上快速冷卻至環境溫度且藉由XRPD分析。XRPD結果顯示完全轉化成形式D。
實施例2：自化合物120經由縮酮121a製備化合物126
A.合成121a
Figure TWI679979B_D0032
以150-g規模進行氫化。在3小時內氫化完全且用氮氣置換氫氣氛圍。
B.合成及純化121b(參考：實驗D-168-165、D-168-167、D-168-174)
Figure TWI679979B_D0033
使用來自基於甲醇之氫化的121a批次執行甲基第三丁基醚(MTBE)的維蒂希反應，作為此材料之使用-測試。此外，比較移除含磷雜質之三種潛在方法(用乙酸或矽膠處理121b，及實際上使121e結晶)。
在N2氛圍下，第三丁醇鉀(5.29g，1.5當量)添加至溴化乙基三苯基鏻(20.98g，1.8當量)於MTBE(60mL)中之溶液中，且在室溫下攪拌該紅橙色溶液2.5小時。經5分鐘添加121a(10.0g，PCI批號-111)於MTBE(40mL)中之溶液且在室溫下攪拌所得反應混合物17.5小時，藉由GC-MS分析發現此時121b：E-異構物之比率為98.4：1.6(參見表1)，認為反應完全。
經布氏漏斗(Buchner funnel)過濾反應混合物且用MTBE(3×100mL)洗滌濾餅。在蒸發至乾燥之後，殘餘物溶解於庚烷(200mL)中，饋入冰乙酸(50mL)且劇烈攪拌。添加水(25mL)以分離各層且用水(50mL)洗滌有機層以移除任何殘留乙酸。濃縮後，分離121b[10.50g，101%，90.8%(AUC)，藉由GC-MS，含有1.9%(AUC)的異構物，PCI批號D-168-165e]。
若欲選擇乙酸純化(而非在121e時純化)，則應預期庚烷層之額外乙酸萃取將能夠移除所有含磷雜質。
注意：I為121b之假定E-異構物。
注意：A、B、C為含磷雜質。
以10-g規模重複維蒂希反應，但使用MTBE/庚烷(1：1)作為溶劑系統。此將允許在維蒂希反應結束時在純化之前無任何溶劑交換的情況下經由二氧化矽漿料進行純化，因此使得製程更流線型。當反應完全時，經布氏漏斗過濾混合物且用1：1 MTBE/庚烷(3×100mL)洗滌濾餅。添加矽膠(20g)至經合併之濾液中，攪拌3小時，接著藉由過濾移除矽膠，用1：1 MTBE/庚烷(3×100mL)洗滌此濾餅。濃縮後得到呈油狀之121b[12.47g，120%(濕溶劑)，90.8%(AUC)，藉由GC-MS，含有2.2%(AUG)異構物，PCI批號D-168-167c](參見表2)。含磷雜質之總含量類似於乙酸純化[藉由GC-MS，5.1%對比5.5%(AUC)]。
在添加121a至葉立德(ylide)中期間觀測到8℃放熱量。在反應完成時得到121b：E-異構物之比率為98.2：1.7(參見表3)。經布氏漏斗過濾反應混合物且用MTBE(3×500mL)洗滌濾餅。濃縮濾液以得到粗121b[90.64g，175%，68.6%(AUC)，藉由GC-MS，PCI批號D-168-174c]。此粗物質不經任何進一步純化而直接用於水解步驟。
C.自121b一鍋合成121e(參考：實驗D-168-171、D-118-178)
自121b直接合成121e
Figure TWI679979B_D0037
使用較少當量之硼氫化鈉且用水替換甲醇作為共溶劑以試圖使反應逐漸完成成流線型，來研究自121b一鍋合成121e。
在環境溫度下用THF(15體積，300mL)及2M HCl(5體積，100mL)攪拌一部分經庚烷/乙酸純化之121b[20.0g，86.1%(AUG)，藉由GC-MS，PCI批號D-168-162a]。雖然在16小時之後剩餘5.4%(AUC)的121b， 但用6M NaOH鹼化至pH 12以使反應混合物繼續反應。有機層經分離且返回至反應燒瓶中。硼氫化鈉(0.5當量，1.14g)溶解於經鹼化之水(1體積，20mL，pH 10，使用6M NaOH)中。藉由TLC監測反應，三小時後約完成一半(比用1.5當量硼氫化物使用甲醇作為共溶劑時更慢)。
添加額外硼氫化鈉(0.5當量)且攪拌隔夜後藉由TLC發現反應完全。分離反應混合物之水層且藉由TLC確認其不含產物後捨棄水層。濃縮有機層至乾燥，接著再溶解於MTBE(550mL)中。用1M鹽酸(250mL)及水(250mL)洗滌該有機層。酸洗不產生任何氫氣。濃縮有機層，隨後追加甲醇(100mL)，得到呈白色黏性固體狀之粗121e(24.05g)，該固體由甲醇(120mL)及水(22ml)再結晶以得到呈白色粉末狀之121e[13.60g，自121b 71%，96.1%(AUG)，藉由RI HPLC，PCI批號D-168-171e]。
如先前執行水解步驟但在逐漸完成之前維持2天。
D.水解121b(參考：實驗D-173-88)
在環境溫度下攪拌121b(6.2g，PCI批次D-168-167c)、THF(50mL)、MTBE(50mL)及2M HCl(50mL)之混合物持續24小時；GC-MS表明基本上不反應。當攪拌停止時，反應混合物容易分離成兩層。隨後加熱反應混合物至回流持續16小時；GC-MS表明121b：121c之比率約為60：40以及形成二者之若干異構物。使用MTBE/THF混合物進行水解似乎不提供任何優勢。
E.自121e合成126
Figure TWI679979B_D0038
F.在DMAP存在下脫水以促進肩峰雜質之形成(參考：實驗D-170-179)
為了闡明在GC-MS層析圖中引起肩峰之雜質的結構，使用DMAP作為鹼以2.0-g規模重複自121e直接合成126。此等條件先前已產生藉由GC-MS發現含有7.6%(AUC)肩峰之126。懷疑此雜質為126之△-8異構物。
在2,6-二甲基吡啶存在下脫水(參考：實驗D-170-184)：檢查更受阻的芳族鹼對121f在二氯甲烷中脫水以製備126之作用。實驗詳情概述如下。在0℃下用亞硫醯氯(1.1當量)及2,6-二甲基吡啶(3.5當量)處理121f(0.25g)於二氯甲烷中之溶液。由於3.5小時後僅形成6.4%之126，故當與吡啶相比時該反應慢得多。額外亞硫醯氯(1.5當量)及3.5當量2,6-二甲基吡啶(3.5當量)並不顯著提高脫水速率(6.5小時後形成8.6%之126)。允許在環境溫度下攪拌反應混合物的確提高了脫水速率但伴隨形成雜質。15小時之後，反應混合物含有42.9%(AUC)126，3.5%相應E異構物及34.2% 121f；亦存在肩峰雜質(1.7%)。因此，在測試條件下，作為用於使121f脫水之鹼，2,6-二甲基吡啶不提供優於吡啶之優勢。
在無MgSO4脫水步驟的情況下合成126(參考：實驗D-170-191)：為了在使二氯甲烷中之121f溶液脫水之前除去硫酸鎂乾燥步驟，檢查脫水步驟(以補償任何殘餘水)中過量試劑之使用。在室溫下使用二氯甲烷(45mL)中之乙酸酐(1.1當量)、三乙胺(2.0當量)及DMAP(0.1當量)進行121e之乙醯化(3.0g)。一小時後，121e完全消耗且藉由GC-MS偵測到95.8%(AUC)之121f。反應混合物相繼用水(25mL)、0.5M HCl(25mL)、水(25mL)及飽和鹽水溶液(25mL)洗滌，接著分成兩部分。
第一部分在0℃下用亞硫醯氯(1.1當量)及吡啶(2.5當量)處理。1.75小時後，反應得到71.9%(AUC)之126以及19.0%(AUC)之121f。添加亞硫醯氯(0.3當量)及吡啶(0.5當量)；0.75小時後認為反應完全，未偵測到121f。 反應含有88.2%(AUC)之126，4.0%(AUC)之相應E異構物及3.3%(AUC)之肩峰。
第二部分在0℃下用亞硫醯氯(1.1當量)及吡啶(3.0當量)處理。2小時之後，反應得到76.7%(AUC)之126及14.9%(AUC)之121f。添加亞硫醯氯(0.3當量)且在1小時內反應完全，未偵測到121f。反應含有86.2%(AUC)之126，與4.0%(AUC)相應E異構物及3.4%(AUC)肩峰(藉由GC-MS)一起形成。
可在反應過程期間使用所添加之過量試劑進行脫水直至完全。
G.在126上之烯反應以製備127a(參考：實驗D-170-187)
Figure TWI679979B_D0039
在0℃下在氮氣氛圍下，經15分鐘之時間添加丙烯酸甲酯(2.38當量)至126(5.0g)於二氯甲烷(75mL)中之溶液中。在0℃下攪拌反應混合物持續1小時之後，經1小時之時間饋入二氯化乙基鋁(3.0當量，甲苯中之1.8M溶液)且在環境溫度下攪拌反應混合物。24小時之後，藉由GC-MS偵測到86.2%(AUC)之127a以及1.9% 126。反應混合物傾入冰水(200mL)中且用二氯甲烷(100mL)萃取。有機層用水(50mL)、飽和NaHCO3溶液(50mL)、飽和鹽水溶液(50mL)洗滌，且經無水MgSO4脫水。濃縮所得溶液以得到10.0g殘餘物(D-170-190)。以上殘餘物溶解於己烷(50mL)中且穿過二氧化矽床，用10% EtOAc/己烷(200mL)洗滌。濃縮濾液以得到5.95g呈黏性液體狀之[95.0%，90.3%(AUC)，藉由GC-MS，PCI批號D-170-190a]127a，其直接用於後一反應中。
H.合成128(參考：實驗D-170-197)
Figure TWI679979B_D0040
如下進行氫化。在23psi下使127a(5.95g)、10%鈀/碳(0.6g)、乙酸乙酯(34mL)及甲醇(16)之混合物氫化16小時，當認為反應完全時，藉由GC-MS偵測到83%(AUC)之128。反應混合物經矽藻土過濾且用EtOAc(100mL)洗滌。濃縮濾液以得到5.5g(92.0%，84.5%(AUC)，藉由GC-MS)呈白色固體狀之粗128。
實施例3：化合物128之烯丙位氧化
Figure TWI679979B_D0041
以下所報導之所有反應皆藉由HPLC(折射率(RI)及UV方法)監測且使用128之新批次進行。
A.製備128a
用還原性碘化亞銅負載氧化(參考實驗D-169-170)
在50℃下使用2.5當量TBHP，但與上週之反應相比僅使用一半的量之碘化亞銅(0.35當量)來進行128(2-g規模)之氧化。針對128之消耗監測反應。反應明顯更慢且因此推薦在此等條件下碘化亞銅之化學計算量保持為0.7當量。
B.按比例增多128a
為製備一批用於第二階段之試驗性氧化的粗128a，如下進行128之氧化(參考：實驗D-173-85)。在50℃下，以10等份經9小時添加TBHP(16ml，2.5當量)至128(20g)、碘化亞銅(6.0g，0.7當量)及乙腈(280ml)之混合物中；再加熱反應混合物7小時。經冷卻之混合物用飽和亞硫酸氫鈉(25ml)中止，接著用飽和鹽水(4×50mL)洗滌以得到粗128a[批次D-173-85A，61.7%(AUC)128a，29.8% 129及2.9% 128，KF約為25%)之乙腈溶液。
C.測試128a之氧化
在乙腈中對粗128a進行一系列氧化。典型地在環境溫度下用各氧化劑(1當量)處理128a(以濕乙腈溶液之濃度計約0.3g輸入量)持續16小時。對於使用無水乙腈之反應，在再溶解於乙腈中之前將先前實驗中分離之乙腈溶液濃縮至脫水且追加乙腈以移除殘餘水。發現PCC僅對經脫水之乙腈溶液起作用(藉由TLC監測反應-未逐漸完成)。活性二氧化錳不引起反應(如藉由TLC所監測)。過硫酸氫鉀在濕條件下引起反應但形成為主要組分之新產物(可能反應條件之濕潤允許一些過硫酸氫鉀溶解且反應)。因此可能在無水乙腈中使用PCC執行二次氧化。
D.追蹤129中之殘餘金屬
提供再結晶129之一個批次(批次D-169-165-3)的樣品，用於藉由ICP-OES進行殘餘金屬分析。結果為2ppm Cu及81ppm Cr。因此意欲根據此方法，將不需要方法額外步驟以移除殘餘金屬。
E.用於偵測129之CAD TM HPLC方法的發展
建立電霧式偵測(charged aerosol detection，CADTM)HPLC用於偵測DCA。129之滯留時間一致地為15.87分鐘。如關於CAD偵測器將預期，129之劑量反應研究顯示針對log(面積回應)對log(濃度)之良好線性擬合。測定經層析之128a的滯留時間為21.6分鐘(RRT 1.36)；此峰似乎為雙重峰，可能歸因於醇之差向異構物。128之滯留時間經測定為29.4分鐘(RRT 1.85)。兩批128給出相同滯留時間。操作129之樣品且其純度為87.2%(AUC)，具有1.75 C-20差向異構物(RRT 1.19)；此包括再結晶129(純度96.3%，具有3.7% c-20差向異構物)之樣品中不存在之肩峰。亦包括來自129再結晶(純度33.8%)之母液的HPLC用於參考。
實施例4：化合物129至DCA之轉化
在以下流程10中，提供用於自化合物129合成及純化DCA之流 程。
Figure TWI679979B_D0044
A.化合物129至化合物130之轉化：方法A1
添加10% Pd/C(900mg)至化合物129(2.0g，4.5mmol)於EtOAc(150mL)中之溶液中，且所得漿料在巴爾氏(Parr)裝置(50psi)中在50℃下氫化16小時。此時，藉由TLC測定反應已完成。經Celite®之小塞子過濾混合物且在真空下移除溶劑，提供呈白色固體狀之化合物130(1.6g，80%產率)。
TLC：大茴香醛炭化，130之Rf=0.36。
TLC移動相：含20% EtOAc之己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ=4.67-4.71(m,1H),3.66(s,3H),2.45-2.50(t,J=15Hz,2H),2.22-2.40(m,1H),2.01(s,3H),1.69-1.96(m,9H),1.55(s,4H),1.25-1.50(m,8H),1.07-1.19(m,2H),1.01(s,6H),0.84-0.85(d,J=7.0Hz,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ=214.4,174.5,170.4,73.6,58.5,57.4,51.3,46.4,43.9,41.2,38.0,35.6,35.5,35.2,34.8,32.0,31.2,30.4,27.4,26.8,26.2,25.9,24.2,22.6,21.2,18.5,11.6。
質量(m/z)=447.0[M++1],464.0[M++18]。
IR(KBr)=3445、2953、2868、1731、1698、1257、1029cm-1。
m.p.=142.2-144.4℃(EtOAc/己烷混合物)。
[α]D=+92(c=1%，在CHCl3中)。
ELSD純度：96.6%；滯留時間=9.93(Inertsil ODS 3V,250×4.6mm,5μm,ACN：含0.1% TFA之水(90：10)
方法A2
10% Pd/C(9g於180mL乙酸乙酯中)之漿料添加至化合物129(36g，81mmol)於EtOAc(720mL)中之溶液中，且在45-50℃下用氫氣(50psi)處理所得漿料16小時。(可使用總計1080mL溶劑)。此時，藉由HPLC測定反應已完成(NMT 1%化合物129)。混合物經Celite®(10g)過濾且用乙酸乙酯(900mL)洗滌。在低於50℃下經由真空蒸餾濃縮濾液至其體積之50%。在25-35℃下向經濃縮之溶液中添加氯鉻酸吡錠(20.8g)且在25-35℃下攪拌混合物2小時，此時藉由HPLC發現反應完成(烯丙醇含量為NMT 1%)。
若化合物129之含量超過5%，則可進行以下方法。經Celite®(10g)過濾反應物質且用乙酸乙酯(360mL)洗滌。相繼用水(3×460mL)、飽和鹽水(360mL)洗滌濾液。有機相經硫酸鈉(180g)脫水，過濾且用乙酸乙酯(180mL)洗滌。在低於50℃下經由真空蒸餾濃縮體積達50%。轉移溶液至潔淨且乾燥的高壓釜中。添加10%鈀/碳(9g於180mL乙酸乙酯中)之漿料。用氫氣加壓至50psi且在45-50℃下攪拌反應混合物16小時。
藉由HPLC發現化合物129完全消耗(化合物129之含量為NMT1%)時，經Celite®(10g)過濾反應混合物，且用乙酸乙酯(900mL)洗滌濾餅。在低於50℃下經由真空蒸餾濃縮溶劑至脫水。添加甲醇(150mL)且在低於50℃下經由真空蒸餾濃縮至脫水。添加甲醇(72mL)至殘餘物中且在10-15℃下攪拌混合物15-20分鐘，過濾且用甲醇(36mL)洗滌濾餅。在45-50℃下在熱風乾燥器中乾燥該白色固體8小時至LOD為NMT 1%以提供化合物230(30g，83.1%產率)。
B.化合物130至化合物131.a之轉化
方法B1
在環境溫度下，氫化鋰三-第三丁氧基鋁(1M，22.4mL，22.4mmol)之THF溶液逐滴添加至化合物130(2.5g，5.6mmol)於THF(25mL)中之溶液中。在另外攪拌4-5小時之後，藉由TLC測定反應已完成。藉由添加HCl水溶液(1M，10mL)中止反應，且用EtOAc(30mL)稀釋混合物。分離各相且有機相依序用水(15mL)及飽和鹽水溶液(10mL)洗滌。有機相隨後經無水Na2SO4(3g)脫水且過濾。在真空下濃縮濾液且所得固體藉由管柱層析[29mm(W)×500mm(L)，60-120目二氧化矽，50g]，用EtOAc/己烷(2：8)[5mL洗提份，在大茴香醛炭化下藉由TLC監測]洗提來純化。合併含有產物之洗提份且在真空下濃縮以提供呈白色固體狀之化合物131.a(2.3g，91%)。
TLC：大茴香醛炭化，131.a之Rf=0.45，且130之Rf=0.55。
TLC移動相：含30% EtOAc之己烷。
1H NMR(500MHz,CDCl3)：δ=4.68-4.73(m,1H),3.98(s,1H),3.66(s,3H),2.34-2.40(m,1H),2.21-2.26(m,1H),2.01(s,3H),1.75-1.89(m,6H),1.39-1.68(m,16H),1.00-1.38(m,3H),0.96-0.97(d,J=5.5Hz,3H),0.93(s,3H),0.68(s,3H)。
13C NMR(125MHz,CDCl3)：δ=174.5,170.5,74.1,72.9,51.3,48.1,47.2,46.4,41.7,35.8,34.9,34.7,34.0,33.5,32.0,30.9,30.8,28.6,27.3,26.8,26.3,25.9,23.4,22.9,21.3,17.2,12.6
質量(m/z)=449.0[M++1],466.0[M++18]。
IR(KBr)=3621、2938、2866、1742、1730、1262、1162、1041cm-1。
m.p=104.2-107.7℃(EtOAc)。
[α]D=+56(c=1%，在CHCl3中)。
ELSD純度：97.0%；滯留時間=12.75(Inertsil ODS 3V,250×4.6mm,5μm,ACN：水(60：40)
方法B2
在0-5℃下經1小時將氫化鋰三-第三丁氧基鋁(1M，107.6mmol)之THF溶液添加至化合物130(30.0g，67mmol)於無水THF(300mL)中之溶液中。在5-10℃下另外攪拌4小時之後，藉由HPLC測定反應已完成(NMT 1%之化合物130)。使反應冷卻至0-5℃且藉由添加4N HCl(473mL)來中止。分離各相。水層用DCM(2×225mL)萃取且合併之有機相依序用水(300mL)及飽和鹽水溶液(300mL)洗滌。隨後在低於50℃下藉由真空蒸餾濃縮有機相至脫水。添加甲醇(150mL)至殘餘物中且在低於50℃下藉由真空蒸餾濃縮至脫水。隨後添加水(450mL)至殘餘物中且攪拌混合物15-20分鐘，過濾且用水(240mL)洗滌濾餅。在35-40℃下在熱風乾燥器中乾燥白色固體6小時以提供化合物131.a(30g，99.6%)。
C.化合物131.a至粗DCA之轉化：在維持溫度低於20℃下，向131.a於MeOH(4體積)及THF(4體積)中之溶液中添加NaOH(4.0當量)於去離子水(5M)中之溶液。20小時之後在20-25℃下之HPLC分析表明剩餘<0.5% AUC之131.a及兩種中間體。認為反應完成，用去離子水(10體積)稀釋且濃縮至約10體積。使樣品與2-MeTHF(2×10體積)共沸且藉由1H NMR分析，指示MeOH不再存在。富水相用2-MeTHF(2×10體積)洗滌且藉由HPLC分析，指示剩餘0.3% AUC之醇雜質。水相用2-MeTHF(10體積)稀釋且使用2M HCl(約4體積)調節至pH=1.7-2.0。分離各相且用去離子水(2×10體積)洗滌2-MeTHF相。2-MeTHF相經矽藻土過濾且用2-MeTHF(2體積)洗滌濾餅。蒸餾2-MeTHF濾液至約10體積且與含有StatsafeTM 5000(3×10體積)之正庚烷共沸，減至約10體積。藉由1H NMR分析混合物，指示相對於正庚烷剩餘<5mol%之2-MeTHF。在20-25℃下使漿料保持最少2小時且過濾。濾餅用正庚烷(2×10體積)洗滌且在真空下在Nütsche過濾 器上用N2調節最少1小時以提供呈白色固體狀之DCA-粗物質。純度=94.6%(藉由HPLC)。對DS-DCA進行HPLC分析(NMT 5% AUC)。
D. DCA之再結晶
DCA-粗物質用含2mol% MeOH之CH2Cl2(25體積)稀釋且加熱至35-37℃持續1小時。使漿料冷卻至28-30℃且過濾。用CH2Cl2(5體積)洗滌濾餅且在真空下在40℃下乾燥以提供DCA。對DS-DCA進行HPLC分析(NMT 0.15% AUC)。
DCA溶解於10%去離子水/EtOH(12體積)中，經矽藻土精緻過濾且用10%去離子水/EtOH(3體積)洗滌。將所得15體積濾液添加至去離子水(30體積)中且得到稀薄的白色漿料。使漿料保持24小時，過濾，用DI水(20體積)洗滌且在真空下在40℃下乾燥以提供純DCA。對CH2Cl2、EtOH、正庚烷、MeOH及MeTHF進行OVI分析以確保各溶劑低於ICH準則。進行KF分析(NMT 2.0%)。純度=99.75%(藉由HPLC)。來自DCA-粗物質之產率=59%。
實施例5：純化含有低含量的DS-DCA之DCA
在EtOH/H2O中測試DCA之結晶以評估DCA之回收及純化程度。添加約0.50g之DCA(0.54%曲線下面積(AUC)之DS-DCA)至14個小瓶中。如以下列表，在70℃下在攪拌下添加不同體積之EtOH及去離子水(水#1，10% v/v之EtOH量，以避免形成潛在酯)以溶解物質，得到澄清溶液。添加額外去離子水(水#2)直至觀測到混濁。在70℃下加熱混合物，接著在70℃下使用針筒過濾器(13mm，0.45μm，PVDF Durapore)將混合物精緻過濾至預加熱之小瓶中。內容物冷卻至60℃且添加約5mg(1wt%)之形式C晶種至各小瓶中。結晶條件及結果列表如下。
晶種在實驗TTO-A-35-1至TTO-A-35-5中保持未溶解，但在TTO-A-35-6至TTO-A-35-9及TTO-A-39-1至TTO-A-39-5中溶解。內容物冷卻至55℃。約5mg(1wt%)之晶種添加至TTO-A-35-6至TTO-A-35-9及TTO-A-39-1至TTO-A-39-5中。該等晶種在批次TTO-A-35-6至TTO-A-35-8中保持，但在批次TTO-A-35-9及TTO-A-39-1至TTO-A-39-5中溶解。內容物冷卻至50℃。約5mg(1wt%)之晶種添加至TTO-A-35-9及TTO-A-39-1至TTO-A-39-5中。該等晶種在TTO-A-39-1至TTO-A-39-5中保持，但在批次TTO-A-35-9中溶解。內容物冷卻至45℃且約5mg(1wt%)之晶種(批次02110037)添加至TTO-A-35-9中。晶種保持未溶解。
所有實驗均以10℃/h冷卻至20℃且攪拌隔夜。添加最終部分之去 離子水(水#3)且攪拌混合物3小時。過濾固體且XRPD分析顯示所有固體皆為形式C。在真空下在65℃下乾燥60小時之後，XRPD顯示所有固體均轉化成形式B。HPLC分析結果列表於上文中且描述如下。
當EtOH為4.5mL且水#3之量小於3.9mL時，DS-DCA含量自0.54% AUC減少至<0.15% AUC。當水#3在1.0-3.9mL處時，回收達到最高含量且即使添加更高量之水反溶劑，回收仍保持不變。當水#3少於1.0mL時，回收降低。此等結果表明當使用DCA批次31DJG054A(含有0.54% AUC DS-DCA)時，實驗TTO-A-39-5為DS-DCA移除及回收之最穩固條件。在實驗TTO-A-35-6至TTO-A-35-9中，添加額外水且結果與高水比率使純化退化的觀測結果一致。
在針對精緻過濾協定具有較小變化之情況下以5g DCA規模重複實驗TTO-A-39-5(TTO-A-43)，且在不執行精緻過濾及接種的情況下以1g規模重複實驗TTO-A-39-5(TTO-A-44)。如下文所述，HPLC分析顯示5g實驗以及1g實驗成功純化，表明接種及精緻過濾步驟非純化之關鍵步驟且可跳過以進一步簡化製程。
TTO-A-43：添加DCA(5.0g，0.54% AUC之DS-DCA)至40mL小瓶中且在70℃下溶解於含10%水之EtOH(35mL，7體積)中。溶液經針筒過濾器(13mm，0.45μm，PVDF Durapore)過濾至配備有攪拌棒之250mL圓底燒瓶中。加熱溶液至70℃。用15mL含10%水之EtOH沖洗小瓶且過濾至燒瓶中。在維持溫度高於60℃下，緩慢添加DI水(30mL)(約15分鐘完成添加)。溶液冷卻至60℃且添加1.5mL DI水中呈漿料狀之形式C晶種(50mg或1wt%，批次02110037)。觀測到略混濁之溶液。批料以10℃/h冷卻至環境溫度且使之攪拌隔夜。隨後經由加料漏斗經30分鐘之時間緩慢添加去離子水(20mL)。在環境溫度下攪拌所得溶液3小時且過濾。藉由XRPD分析固體且在真空中在62℃下乾燥，得到DCA，產率為92.4%(4.62g)。XRPD圖案表明形式C至形式B的多形體 轉化。HPLC分析顯示99.75% AUC純度，僅含有0.06% AUG之DS-DCA。
TTO-A-44：添加DCA(1.0g，0.54% AUC之DS-DCA)至40mL小瓶中。在攪拌下添加EtOH(9.0mL)及DI水(0.9mL)以溶解固體且加熱至70℃以獲得澄清溶液。添加DI水(6.0mL)且觀測到混濁。以10℃/h冷卻至20℃且攪拌隔夜。經30分鐘添加去離子水(4.0mL)。內容物攪拌3小時且過濾。藉由XRPD分析固體且在真空中在62℃下乾燥，得到DCA，產率為83.2%(0.83g)。XRPD圖案表明形式C至形式B的多形體轉化。HPLC分析顯示99.80% AUC純度，僅含有0.06% AUC之DS-DCA。

Claims (6)

  1. 一種結晶去氧膽酸(DCA)無水多形體，其特徵在於該無水多形體呈形式D，其具有選自7.0、7.4、10.0、14.2、15.3、15.8、16.6及17.3°2θ之至少3個粉末X射線繞射(PXRD)峰。
  2. 如申請專利範圍第1項之無水多形體，其特徵在於實質上如圖5所示的PXRD圖案。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之無水多形體，其特徵在於如藉由差示掃描熱量測定所量測之156℃±2℃下之吸熱峰。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項之無水多形體，其與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑混合。
  5. 如申請專利範圍第3項之無水多形體，其與至少一種醫藥學上可接受之賦形劑混合。
  6. 一種如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之無水多形體之用途，其係用於製造用於減少個體中之皮下脂肪沈積物的藥品，其中在某一條件下向個體中之脂肪沈積物局部投予該藥品以溶解該脂肪沈積物，且其中該藥品另外包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。
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