TWI673364B - 一種檢測鮑氏不動桿菌之方法及其使用之試劑 - Google Patents

Abstract

本發明係有關於一種檢測鮑氏不動桿菌之方法及其使用之試劑，所述檢測方法包括先將一樣本與含有0.5-3.0mM吲哚(indole)之試劑混合以形成一混合溶液；以及測量混合溶液是否由無色吲哚轉化為藍色靛青(indigo)，若混合溶液轉化為藍色靛青表示樣本係存在鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)；藉此，可達到快速確認樣本中有無包含鮑氏不動桿菌之目的。

Description

一種檢測鮑氏不動桿菌之方法及其使用之試劑

本發明係有關於一種檢測鮑氏不動桿菌之方法及其使用之試劑，尤其係指一種透過顏色的變化快速檢測樣本是否具有鮑氏不動桿菌之方法，其係藉由鮑氏不動桿菌所特有之黃素蛋白加氧酶(flavoprotein oxygenase)將一特定濃度之吲哚(indole)轉化為藍色的靛青(indigo)。

按，鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)，簡稱AB菌，是一種革蘭氏陰性致病菌，可在人體糞便(Clin Microbiol Infect.2005 Apr；11(4)：329-32)或根圍(rhizosphere)(Microbiol Res.2010 Oct 20；165(8)：627-38)中被發現。鮑氏不動桿菌亦為常見的院內感染病菌，受鮑氏不動桿菌感染而引起的症狀包括：菌血症、敗血症、肺炎、腦膜炎等疾病，嚴重時甚至導致病患死亡。近年來由於抗生素的濫用，鮑氏不動桿菌逐漸對許多抗生素產生抗藥性，導致病患難以被有效醫治。據此，為了能有效察覺環境是否受到鮑氏不動桿菌汙染，或及早檢測出病患是否受到鮑氏不動桿菌感染，相關學者皆投入相當心力研發檢驗鮑氏不動桿菌之方法。

舉例而言，中華民國專利公告第I252257號即揭示一種「鑑定不動桿菌之寡核苷酸生物晶片」，其係提供一種鑑定不動桿菌菌 種之DNA序列及含有該序列寡核苷酸探針的生物晶片，主要原理係根據不動桿菌16S-23S核糖體核酸基因間隔區(intergenic spacer region,ITS)之種特異性，針對各不動桿菌菌種設計出具有專一性的寡核苷酸探針，用以鑑定不動桿菌屬(包括醋酸鈣不動桿菌(Acinetobacter calcoaceticus)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)、魯氏不動桿菌(Acinetobacter lwoffii)等)之菌種；以及中華民國專利公告第I306508號亦揭示一種「快速檢測鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之方法與用於此方法的引子」，主要係提供對鮑氏不動桿菌的16S-23S rRNA基因間隔區(ITS)所含部分序列具有專一性的引子(primers)，以及利用此專一性的引子進行快速檢測之方法：藉由檢測樣品經複合聚合酶鏈鎖反應(multiplex-polymerase chain reaction；multiplex-PCR)及對PCR產物進行DNA電泳後，是否檢測出一段鮑氏不動桿菌獨具的208鹼基對(base pair)長度的片段，藉此達到快速判斷此菌株存在與否的目的。然而，上述檢測方法除了需要培養菌株之外，尚需以聚合酶連鎖反應(PCR)增殖目標微生物DNA，再以寡核苷酸微矩陣的方式檢測PCR產物，具有耗時且成本較高之缺失。爰此，如何發展出可專一性且快速檢測鮑氏不動桿菌之方法，以快速且正確的鑑定鮑氏不動桿菌，便成為此相關領域發明人思及之方向。

吲哚(indole)為氨基酸色氨酸(tryptophan)的衍生物，是一種有毒的信號分子，可以抑制細菌生長。為了克服吲哚誘導的毒性，許多細菌發展出一套酵素防禦系統，以將吲哚轉化成無毒性且不溶於水的靛青(indigo)。鮑氏不動桿菌亦具有將吲哚轉化成靛青的能力，但目前仍然不知道鮑氏不動桿菌的生長情形是否也會受到吲哚影響。

根據申請人的研究發現，吲哚若超過一特定濃度會抑制野生 型(wild-type)鮑氏不動桿菌的生長，若低於特定量濃度，鮑氏不動桿菌的生長情形則穩定不受影響，這意味著鮑氏不動桿菌可以利用特殊生存機制氧化吲哚。藉此，申請人欲以此發展為一套具專一性且快速檢測鮑氏不動桿菌的方法。

今，發明人即是鑑於上述現有之檢測鮑氏不動桿菌的方法於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種檢測鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之方法及其使用之試劑，藉由鮑氏不動桿菌所特有之黃素蛋白加氧酶(flavoprotein oxygenase)，將一特定濃度以下之吲哚(indole)轉化為藍色的靛青(indigo)；據此，可透過顏色的變化快速檢測樣本是否具有鮑氏不動桿菌。

為了達到上述實施目的，本發明一種活體外檢測鮑氏不動桿菌之方法，其包括：將一樣本與一試劑混合以形成一混合溶液，並於溫度37℃作用16小時；以及測量混合溶液是否由無色吲哚轉化為藍色靛青，若混合溶液轉化為藍色靛青表示樣本係存在鮑氏不動桿菌。上述試劑較佳係包括濃度為0.5-3.0mM的吲哚，更佳係濃度為3.0mM的吲哚，且試劑亦可包括M9基本培養液(M9 minimal medium)；試劑較佳係於pH 7.2-8.5作用，更佳係於pH 8.0作用。

本發明亦提供一種用於檢測鮑氏不動桿菌之試劑，其包括濃度為0.5-3.0mM的吲哚，用以檢測樣本中的鮑氏不動桿菌；所述試劑較佳係包括濃度為3.0mM的吲哚，且試劑亦可包括M9基本培養液，較佳係於pH 7.2-8.5作用，更佳係於pH 8.0作用。

本發明亦提供一種吲哚之用途，係用於活體外專一性檢測鮑氏不動桿菌，其中吲哚之濃度較佳係0.5-3.0mM，更佳係3.0mM，且吲哚之作用pH值為7.2-8.5。

於本發明之一實施例中，樣本可例如為已經分離純化之細菌菌落、生物檢體或環境檢體。所述生物檢體又可例如為人體或動物之血液、血清、傷口切片、尿液、糞便、其他體液及其任意組合所組成之群組；所述環境檢體又可例如為飲水、土壤、食物、粉末及其任意組合所組成之群組。

於本發明之一實施例中，鮑氏不動桿菌係由編碼為黃素蛋白加氧酶之去氧核糖核酸序列SEQ ID NO：1將吲哚轉化為靛青，其中黃素蛋白加氧酶之胺基酸序列如SEQ ID NO：2。

第一圖：不同濃度吲哚對於鮑氏不動桿菌的生長分析圖。

第二圖：吲哚與靛青對於鮑氏不動桿菌的生長比較圖。

第三圖：IifC蛋白質表達及純化的電泳分析圖。

第四圖：IifC蛋白質的酵素活性分析圖。

第五圖：鮑氏不動桿菌野生株和突變株對於吲哚轉化成靛青的影響比較圖。

第六圖：不同濃度吲哚對於鮑氏不動桿菌將吲哚轉化成靛青的影響比較圖。

第七圖：本發明具體實施例編號1-7菌株的檢測分析圖。

第八圖：本發明具體實施例編號8-14菌株的檢測分析圖。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示 之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明其一目的為提供一種活體外檢測鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之方法，其包括：將一樣本(可例如為已經分離純化之細菌菌落、生物檢體或環境檢體)與一試劑混合作用一段時間，較佳而言係於溫度37℃作用約16小時以形成一混合溶液；以及測量混合溶液是否由無色吲哚(indole)轉化為藍色靛青(indigo)，若混合溶液轉化為藍色靛青表示樣本係存在鮑氏不動桿菌。較佳而言，上述試劑係包括濃度為0.5-3.0mM的吲哚，若吲哚轉化為靛青表示樣本係存在鮑氏不動桿菌。由於吲哚濃度越高，觀察到的顏色變換越顯著，因此較佳而言，試劑係包含濃度為3.0mM的吲哚，且試劑較佳係於pH 7.2-8.5環境下作用(更佳係於pH 8.0作用)，其係因為鮑氏不動桿菌所特有之黃素蛋白加氧酶(flavoprotein oxygenase)在此pH範圍具有最佳酵素活性，故在此條件下更可達到快速檢測之目的。另，所述生物檢體可例如為人體或動物之血液、血清、傷口切片、尿液、糞便、其他體液及其任意組合所組成之群組；所述環境檢體可例如為飲水、土壤、食物、粉末及其任意組合所組成之群組，在此不加以限制。

本發明另一目的為提供一種用於檢測鮑氏不動桿菌之試劑，其包括濃度為0.5-3.0mM的吲哚，用以檢測樣本中的鮑氏不動桿菌；較佳而言，試劑中所含吲哚的濃度為3.0mM，且亦可包括M9基本培養液(M9 minimal medium)；較佳而言，試劑係於pH 7.2-8.5環境下作用，更佳係於pH 8.0作用。

本發明又一目的為提供一種吲哚之用途，係用於活體外專一性檢測鮑氏不動桿菌，其中吲哚之濃度較佳可例如為0.5-3.0mM，更佳可例如為3.0mM，且吲哚之作用pH值為7.2-8.5；所述鮑氏 不動桿菌係藉由編碼(encode)為黃素蛋白加氧酶之去氧核糖核酸序列SEQ ID NO：1將吲哚轉化為靛青，上述黃素蛋白加氧酶之胺基酸序列如SEQ ID NO：2。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

簡言之，本發明人找到一個具有專一性的蛋白質作為檢測依據，此蛋白質係由鮑氏不動桿菌的iifC基因(如序列表所呈SEQ ID NO：1去氧核糖核酸序列)編碼產生的黃素蛋白加氧酶(flavoprotein oxygenase)，其胺基酸序列如SEQ ID NO：2，藉由黃素蛋白加氧酶在特定吲哚濃度下可將吲哚轉化為靛青，以避免鮑氏不動桿菌死亡，將此發展為一套單一步驟且具高靈敏度的檢測平台，藉此達到快速確認樣本中有無包含鮑氏不動桿菌之目的。

實施例一：檢測吲哚對於鮑氏不動桿菌生長的影響

為了檢測吲哚對於鮑氏不動桿菌生長的影響，將野生型鮑氏不動桿菌ATCC19606培養於LB培養液12小時，取出1ml培養液進行離心並去除上清液；再將沉澱團塊(pellet)回溶於500μl的M9基本培養液(M9 minimal medium；Amresco,Solon,OH)中。接著，將溶液移轉至含有50ml M9基本培養液的培養瓶(flask)中，在37℃，200rpm進行培養16小時，其中M9基本培養液含有不同濃度(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5及5mM)的吲哚(SIGMA-ALDRICH)。本實驗吲哚係溶於無水乙醇(absolute ethanol)中，且乙醇的最終濃度為0.1%，係作為此環境中唯一的碳源。最後，藉由波長600nm量測各組別的吸光值，每組實驗至少進行三重複，以得知鮑氏不動桿菌的生長情形。

結果請參閱第一圖，隨著吲哚的濃度越高，OD600的吸光值越低，尤其在吲哚的濃度為3.5mM時吸光值急遽降低，代表鮑 氏不動桿菌的生長顯著受到抑制。可知，鮑氏不動桿菌在吲哚濃度為3.0mM以下仍可穩定生長，但吲哚濃度超過3.0mM則會抑制鮑氏不動桿菌的生長。

為了比較吲哚與靛青對於鮑氏不動桿菌生長的影響，將野生型鮑氏不動桿菌ATCC19606於LB培養液培養12小時，取出1ml培養液進行離心並去除上清液；再將沉澱團塊(pellet)回溶於500μl的M9基本培養液(M9 minimal medium；Amresco,Solon,OH)中。接著，將溶液移轉至含有50ml M9基本培養液的培養瓶(flask)中，在37℃，200rpm進行培養16小時，其中M9基本培養液含有5mM吲哚或靛青(Fluka)。本實驗吲哚係溶於無水乙醇(absolute ethanol)中，且乙醇的最終濃度為0.1%，係作為此環境中唯一的碳源。最後，將培養液進行序列稀釋，並取出一滴10μl的稀釋培養液至LB洋菜膠(agar)以計數鮑氏不動桿菌的生長情形，每組實驗至少進行三重複。

結果請參閱第二圖，相較於控制組，濃度為5mM的吲哚顯著抑制鮑氏不動桿菌的生長，但相同濃度為5mM的靛青對於鮑氏不動桿菌的生長則不具抑制作用。

實施例二：純化IifC蛋白質與進行酵素活性分析

根據實施例一之發現，申請人進一步耗費相當時間探討造成吲哚轉化為靛青的調控機制。結果發現與鮑氏不動桿菌中的iif操作組(operon)有關，此操作組係包含iifA、iifB、iifC、iifD、iifE基因和調節子iifR基因，且其中由iifC基因(如SEQ ID NO：1)編碼產生的黃素蛋白加氧酶(SEQ ID NO：2)為吲哚轉化靛青的重要基因與蛋白質。

(1)建構IifC蛋白質表達載體

為了建構IifC蛋白質表達質體(plasmid)，利用IifCF(SEQ ID NO：3)與IifCR(SEQ ID NO：4)引子對進行PCR以擴增鮑氏不動桿菌中的iifC基因片段；再利用限制酶BamHI與PstI切割PCR產物，並接合至BamHI與PstI切割過的pQE-80L表現質體(Qiagen)以產生pQE80L-IifC質體；接著，將此表現質體pQE80L-IifC轉型(transform)至Escherichia coli CY15000(tnaA基因突變株，係購自E.coli Genetic Stock Center(CGSC7682))，以得到表達質體E.coli CY15000(pQE80L-IifC)。

(2)純化IifC蛋白

將表達質體E.coli CY15000(pQE80L-IifC)於37℃培養在LB培養液中，直到OD600的吸光值達0.4；加入1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)於培養液以誘導重組蛋白表達。待培養液於20℃震盪培養4小時之後，取出培養液離心並去除上清液，再將沉澱團塊(pellet)儲存於-20℃以待使用。利用染劑Coomassie blue G250染色之後，藉由10% SDS-PAGE進行蛋白質表現的檢測。接著，將重組IifC蛋白質進行純化：先將IifC蛋白質於37℃震盪培養，使蛋白質充分表現為可溶形式(soluble form)；經過超音波震盪破壞細胞並離心以去除細胞碎片之後，將所得的澄清蛋白質溶液(粗萃物)裝載至陰離子交換基質(Q-Sepharose High Performance anion-exchange matrix)的2.6×40cm管柱(填充有含5mM EDTA的10mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.0)，然後利用梯度濃度線性上升的氯化鉀洗脫蛋白質。本實驗使用之蛋白質純化方法已為習知技藝，詳細步驟亦可參考Antoni Van Leeuwenhoek.2012 May；101(4)：881-90，容在此不加以贅述。

結果請參閱第三圖，圖中分別顯示細菌萃取物在ITPG誘導前(lane 1)、誘導後(lane 2)以及純化後(lane 3)的IifC蛋白質表現情形，純化後的IifC蛋白質幾乎呈現同質性(homogeneous)。

(3)酵素活性分析

利用含有5.0mM吲哚的不同pH值緩衝溶液進行IifC蛋白質的酵素活性分析，緩衝溶液分別為pH值介於6.0-7.5的100mM磷酸鉀與pH值介於8.0-9.5的100mM Tris-HCl緩衝溶液。有關酵素活性分析相關方法亦為習知技藝，詳細步驟可參考Antoni Van Leeuwenhoek.2012 May；101(4)：881-90，容在此不加以贅述。

結果請參閱第四圖，IifC蛋白質在pH值介於7.2-8.5的範圍內有較佳酵素相對活性約60%以上，在pH值8.0具有最佳之酵素相對活性。顯然，IifC蛋白質在鹼性環境下作用具有較佳酵素活性。

實施例三：檢測鮑氏不動桿菌野生株和不同突變株對於吲哚轉化成靛青的影響

為了確認iifC和iifR基因的功能，進行互補實驗；先利用電穿孔法(electroporation)將pComIifC與pComIifR質體分別轉型(transform)至iifC突變株(△iifC)與iifR突變株(△iifR)，以產生△iifC(pComIifC)與△iifR(pComIifR)互補菌株。將野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606與上述四種突變株培養於LB培養液12小時，取出0.5ml培養液進行離心並去除上清液；再將沉澱團塊(pellet)回溶於500μl的M9基本培養液(M9 minimal medium；Amresco,Solon,OH)中。接著將溶液移轉至含有50ml M9基本培養液的培養瓶中，M9基本培養液含有3mM的吲哚(SIGMA-ALDRICH)、0.1%無水乙醇，以及100μg/ml氨苄青黴素(ampicillin)、12.5μg/ml氯黴素(chloramphenicol)與50μg/ml卡納黴素(kanamycin)；在37℃，200rpm進行培養16小時，之後觀察各組是否轉化為藍色靛青。

(1)建構iifC突變株

利用等位基因交換(conjugation-mediated allelic exchange)建構iifC突變株，為了交換等位基因先建構自殺質體(suicide plasmid)，以pOXY-iifC：：KAN-2作為模板並利用OxyF(SEQ ID NO：5)與OxyR(SEQ ID NO：6)引子對進行PCR，其中pOXY-iifC：：KAN-2的轉位子(transposon)插入區域係介於iifC基因ATG起始位下游400與401個核苷酸位置。將PCR產物接合至pBSL181質體主鏈(backbone)(R6K γ oir與mob基因)，再將pBSL181質體主鏈利用磷酸化PCR引子對BslF(SEQ ID NO：7)與BslR(SEQ ID NO：8)以pBSL181作為模板進行PCR，以產生pBiifC：：KAN-2質體。將pBiifC：：KAN-2質體轉型至E.coli S17-1 λ pir以產生大腸桿菌供體菌株(E.coli donor strain)，並與野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606進行接合作用(conjugation)。將500μl隔夜培養的E.coli S17-1 pir(pBiifC：：KAN-2)培養液與野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606混合，以10,000×g離心5分鐘；利用500μl接合緩衝溶液(10mM MgSO₄)清洗所得的沉澱團塊(pellet)兩次，再回溶於30μl接合緩衝溶液，並塗佈於置放在LB洋菜膠(agar)上的0.45μm孔徑濾紙(S-PAK membrane；Millipore Inc,Bedford,MA)。將培養皿放置37℃培養6小時，之後移除濾紙並利用含有100μg/ml氨苄青黴素(ampicillin)、12.5μg/ml氯黴素(chloramphenicol)與40μg/ml卡納黴素(kanamycin)的LB洋菜膠(agar)篩選接合菌株(transconjugant)。利用BslF與BslR引子對並以iifC突變株的染色體作為模板進行PCR。最後將PCR產物定序以確定iifC基因是否受到EZ-Tn5<KAN-2>轉位子(transposon)所破壞。

(2)建構iifR突變株

利用與上述相同方法建構iifR突變株，為了交換等位基因先建構自殺質體(suicideplasmid)，利用野生株鮑氏不動桿菌 ATCC19606的染色體作為模板，並利用IifRF(SEQ ID NO：9)與IifRR(SEQ ID NO：10)引子對進行PCR以擴增iifR基因。將PCR產物接合至pJET1.2載體(vector)(Fermentas Thermo FisherScientific Inc.；Wilmington,DE)以產生pJiifR質體，再定序並篩選出具有轉位子(transposon)插入於iifR基因ATG起始位下游186與187個核苷酸位置之pJacR：：KAN-2。接著，以pJacR：：KAN-2作為模板並利用IifRF與IifRR引子對進行PCR；將PCR產物接合至pBSL181質體主鏈(backbone)(R6K γ oir與mob基因)，以產生pBiifR：：KAN-2質體。再將pBiifR：：KAN-2質體轉型至E.coli S17-1 λ pir以產生大腸桿菌供體菌株(E.coli donor strain)，與野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606進行接合作用(conjugation)。後續篩選步驟如建構iifC突變株之方法所述。

(3)互補iifR突變株

為了擴增全長iifR基因，利用野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606的染色體作為模板，並利用cIifRF(SEQ ID NO：11)與cIifRR(SEQ ID NO：12)引子對進行PCR；將含有iifR啟動子(promoter)下游487bp的PCR產物接合至pJET1.2載體(Fermentas)以產生pJCiifR質體，再利用DNA定序以確認iifR基因插入pJCiifR質體。接著，將含有iifR啟動子區域的限制酶BamHI切割片段與來自pJCiifR質體的iifR基因接合至BamHI切割過的pMMB67EH質體，以產生pComIifR互補質體(complementing plasmid)。利用電穿孔法(electroporation)將pComIifR互補質體轉型(transform)至鮑氏不動桿菌iifR突變株(△iifR)；最後再以含有500μg/ml氨苄青黴素(ampicillin)的LB洋菜膠(agar)篩選轉型菌株(transformant)。

(4)互補iifC突變株

利用與上述相同方法建構iifC互補菌株，主要係藉由 overlapping PCR方式產生iif啟動子(promoter)區域與iifC基因融合。先利用野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606的染色體作為模板，並利用cIifCF(SEQ ID NO：13)與cIifCR(SEQ ID NO：14)引子對進行PCR以擴增出iifC基因，再利用cIifPF(SEQ ID NO：15)與cIifPR(SEQ ID NO：16)引子對進行PCR以擴增出iif啟動子區域。接著，藉由overlapping PCR方式並利用cIifPE與cIifCR引子對純化並接合兩個PCR產物，再將得到的PCR產物選殖(clone)至pJET1.2載體(Fermentas)以產生pJCiifC質體。將含有iif啟動子區域的限制酶BamHI切割片段與來自pJCiifC質體的iifC基因接合至BamHI切割過的pMMB67EH質體，以產生pComIifC互補質體(complementing plasmid)。利用電穿孔法(electroporation)將pComIifC互補質體轉型(transform)至鮑氏不動桿菌iifC突變株(△iifC)；最後再以含有500μg/ml氨苄青黴素(ampicillin)的LB洋菜膠(agar)篩選轉型菌株(transformant)。

結果請參閱第五圖，野生株鮑氏不動桿菌ATCC19606在吲哚濃度為3mM環境下，確實會將無色吲哚轉化成藍色靛青，而iifC突變株(△iifC)與iifR突變株(△iifR)則失去將吲哚轉化成靛青的能力；若將iifC及iifR分別補回iifC突變株與iifR突變株形成△iifC(pComIifC)與△iifR(pComIifR)互補菌株，則恢復株鮑氏不動桿菌將吲哚轉化成靛青的能力。

實施例四：利用本發明之方法檢測不同菌株

為了檢測吲哚對於鮑氏不動桿菌生長的影響，將野生型鮑氏不動桿菌ATCC19606培養於LB培養液12小時，取出1ml培養液進行離心並去除上清液；再將沉澱團塊(pellet)回溶於500μl的M9基本培養液(M9 minimal medium；Amresco,Solon,OH)中。接著，將溶液移轉至含有50ml M9基本培養液的培養瓶(flask)中， 在37℃，200rpm進行培養16小時，其中M9基本培養液含有不同濃度(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4及4.5mM)的吲哚(SIGMA-ALDRICH)。本實驗吲哚係溶於無水乙醇(absolute ethanol)中，且乙醇的最終濃度為0.1%，係作為此環境中唯一的碳源。最後，觀察有無靛青產生。

結果請參閱第六圖，鮑氏不動桿菌在吲哚濃度為3.0mM以下仍可穩定生長，並可將無色吲哚轉化為藍色靛青，尤其以吲哚濃度為3.0mM時將吲哚轉化為藍色靛青的情形最顯著；但吲哚濃度超過3.0mM則會抑制鮑氏不動桿菌的生長。

實施例五：利用本發明之方法檢測不同菌株

將鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii ATCC 19606)、克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniaeBCRC 15627)、奇異變形桿菌(Proteus mirabilisBCRC 10725)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundiiBCRC 12291)、沙雷氏桿菌(Serratia marcescensBCRC 10768)、斯氏普羅威登斯菌(Providencia stuartiiBCRC 13998)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosaATCC 27853)、耶爾辛氏腸炎桿菌(Yeasinia enterocoliticaBCRC10807)、沙門氏桿菌(Salmonella typhimuriumCN258)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC25923)、糞腸球菌(Enterococcus faecalisATCC 29212)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)臨床菌株、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)臨床菌株、嗜水性產氣單孢菌(Aeromonas hydrophila)臨床菌株與微球菌(Micrococcussp.)臨床菌株分別培養於LB培養液12小時，取出1ml培養液進行離心並去除上清液；再將沉澱團塊(pellet)回溶於500μl的M9基本培養液(M9 minimal medium；Amresco,Solon,OH)中。接著，將溶液移轉至含有50ml M9基本培養液的培養瓶(flask)中，在37℃，200rpm進行培養16 小時，其中M9基本培養液含有3mM的吲哚(SIGMA-ALDRICH)。本實驗吲哚係溶於無水乙醇(absolute ethanol)中，且乙醇的最終濃度為0.1%，係作為此環境中唯一的碳源。最後，藉由波長600nm量測各系菌的吸光值，並觀察有無靛青產生。

結果請參閱表一、第七圖與第八圖，鮑氏不動桿菌在含有3mM吲哚的培養液中可順利生長，且同時具有將無色吲哚轉化為藍色靛青的現象，而綠膿桿菌在3mM吲哚的培養液中雖有生長，但無法產生藍色靛青。由此可知，本發明之方法確實具有專一性。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明係針對測鮑氏不動桿菌對於吲哚所特有之反應濃度研發一套檢測方法，相較於習知檢測方法，本發明僅需使用特定濃度以下的吲哚檢測樣本是否轉化為靛青，搭配特定濃度以上的吲哚檢測該樣本是否存活，即可得知是否為測鮑氏不動桿菌。

2.本發明係取得樣本培養，並於活體外檢測是否存在鮑氏不動桿菌，不需要特定標準菌株進行比對，亦不需要進行PCR即可達成檢驗目的，因此可大幅降低檢驗成本。

綜上所述，本發明之檢測鮑氏不動桿菌之方法及其使用之試劑，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明之相關技術內容已於2015年9月3日由國際期刊PLoS One所接受，並於2015年9月21日公開發表；爰此，申請人於新穎性優惠期間內提出申請，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

<110> 許鴻猷

<120> 一種檢測鮑氏不動桿菌之方法及其使用之試劑

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1239

<212> DNA

<213> 鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)

<223> iifC

<400> 1

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> 鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)

<223> IifC蛋白質

<400> 2

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> IifCF引子

<400> 3

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> IifCR引子

<400> 4

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> OxyF引子

<400> 5

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> OxyR引子

<400> 6

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> BslF引子

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> BslR引子

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> IifRF引子

<400> 9

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> IifRR引子

<400> 10

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> cIifRF引子

<400> 11

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> cIifRR引子

<400> 12

<210> 13

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> cIifCF引子

<400> 13

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> cIifCR引子

<400> 14

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> cIifPF引子

<400> 15

<210> 16

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> cIifPR引子

<400> 16

Claims (9)

1. 一種活體外檢測鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)之方法，其包括：將一樣本與一試劑混合以形成一混合溶液，以及測量該混合溶液是否由無色吲哚轉化為藍色靛青(indigo)，若該混合溶液轉化為藍色靛青表示該樣本係存在鮑氏不動桿菌；其中，該試劑由0.5-3.0mM的吲哚與M9基本培養液所組成，且該鮑氏不動桿菌係由編碼為黃素蛋白加氧酶(flavoprotein oxygenase)之去氧核醣核酸序列SEQ ID NO：1以及由SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12擴增之iifR基因，將該無色吲哚轉化為藍色靛青。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該試劑係包含濃度為3.0mM的吲哚。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該樣本與該試劑係於溫度37℃作用16小時。
4. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之方法，其中該試劑之作用pH值為7.2-8.5。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該樣本為已經分離純化之細菌菌落、生物檢體或環境檢體。
6. 一種用於檢測鮑氏不動桿菌之試劑，其係由濃度為0.5-3.0mM的吲哚(indole)以及M9基本培養液所組成，用以檢測樣本中的鮑氏不動桿菌。
7. 如申請專利範圍第6項所述之試劑，係包括濃度為3.0mM的吲哚，且該試劑之作用pH值為7.2-8.5。
8. 一種吲哚(indole)之用途，係用於活體外專一性檢測鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)，其中該吲哚之濃度係0.5-3.0mM，且該吲哚之作用pH值為7.2-8.5，其中該鮑氏不動桿菌係由編碼為黃素蛋白加氧酶(flavoprotein oxygenase)之去氧核糖核酸序列SEQ ID NO：1以及由SEQ ID NO：11與SEQ ID NO：12擴增之iifR基因，將該吲哚轉化為靛青(indigo)。
9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該吲哚之濃度係3.0mM。