TWI660043B - 人工纖維小體、利用其分解纖維素及生產酒精之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種纖維素的分解方法，包含：建立重組噬菌體，其
係藉由修改噬菌體的基因組，使該噬菌體的表面表達：與分解酶具有親和性的接合胜肽，及與細胞之表面之錨定位具有親和性的錨定胜肽；使分解酶接觸重組噬菌體；以及使纖維素接觸該分解酶。
Description
本發明係關於纖維素的分解方法，特別是關於利用具有噬菌體支架之纖維小體分解纖維素之方法及利用其生產酒精之方法。
習知的生質酒精製程中，聯合生物轉化製程(consolidated bioprocessing,CBP)係為目前最優秀的製程，藉由整合生產過程中的所有反應於同一菌株(例：釀酒酵母)中，可大幅降低生產成本及需求。其中，於厭氧熱纖梭菌(C.thermocellum)中發現的纖維小體被視為CBP程序發展中的關鍵技術之一。
纖維小體(cellulosome)主要以蛋白支架結構為主體，並於支架結構結合複數種纖維素分解酶，以使整體形成具有多種分解功能的複合體，不僅克服了以往透過轉殖技術將分解酶表達於細胞表面卻受限制的困境，更被證實複合體相較於同樣數量的分解酶具有更高的酶活性。然而，纖維小體的構造十分複雜，自然界中又僅於發酵產能不足的厭氧菌中發現其存在，故人工合成纖維小體並藉由細胞表面表達技術使其表達於具有高發酵產能的釀酒酵母表面實為目前最重要的發展趨勢。
自然界中所發現的纖維小體，單一小體可連結約96個纖維素分解酶，而習知文獻所載之人工合成纖維小體可連結約達63個纖維素分解酶，相較於天然的纖維小體仍有產能上的差距。
鑒於以上不足，本發明提供一種以重組噬菌體作為蛋白支架的纖維小體，藉由自組裝方式可於單一噬菌體表面連結上百至上千個纖維素分解酶，並錨定於釀酒酵母表面，不僅克服目前分解產能的問題，更可藉由噬菌體本身極短的複製周期，得到可高速生產的人工纖維小體，提供高效率的纖維素分解平台。
根據上述理由，本發明提供一種纖維素的分解方法，包含：建立重組噬菌體，其中重組噬菌體係藉由修改噬菌體的基因組，使該噬菌體的表面表達：與分解酶具有親和性的接合胜肽，及與細胞之表面之錨定位具有親和性的錨定胜肽；使分解酶接觸重組噬菌體；以及使纖維素接觸該分解酶。
較佳地，接合胜肽與1至3000個酶連接。
較佳地，分解酶係內切型纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶、纖維雙糖分解酶或其組合。
較佳地，分解酶表達SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或其組合。
較佳地，錨定位係表達SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或其組合，且與前述分解酶表達的序列不重複。
較佳地，噬菌體係選自λ噬菌體及絲狀噬菌體。
較佳地，細胞係選自酵母菌。
藉由上述提供的纖維素分解方法，本發明亦提供將其用於生產生質酒精的方法，用以包含：建立重組噬菌體，其中該噬菌體包含接合胜肽及錨定胜肽；將分解酶接合至接合胜肽；將錨定胜肽錨定於酵母菌的表面之錨定位；使分解酶分解纖維素以得到醣類；以及使酵母菌發酵醣類以得到生質酒精。
此外，本發明更提供一種用於上述纖維素分解方法及生質酒精的生產方法的人工纖維小體，包含：重組噬菌體，其表面表達與分解酶具有親和性的接合胜肽；以及與酵母菌的表面之錨定位具有親和性的錨定胜肽；以及接合於重組噬菌體表面之接合胜肽的纖維素分解酶。
綜上所述，本發明提供具有噬菌體支架並接合酶之人工纖維小體，其相較於未接合的酶，具有更高的纖維素分解活性。因此，本發明亦提供利用該人工纖維小體有效率地分解纖維素之方法，以及利用該方法有效率地生產生質酒精之用途。
S11、S12、S13、S20、S30‧‧‧步驟
RP-BGL-SH3‧‧‧接合於重組噬菌體表面且具有SH3結構域的纖維雙糖分解酶
BGL-SH3‧‧‧具有SH3結構域的纖維雙糖分解酶
RP-celA-SH3‧‧‧接合於重組噬菌體表面且具有SH3結構域的內切型纖維素分解酶
celA-SH3‧‧‧具有SH3結構域的內切型纖維素分解酶
RP-EC-SH3‧‧‧接合於重組噬菌體表面且具有SH3結構域的外切型纖維素分解酶
EC-SH3‧‧‧具有SH3結構域的外切型纖維素分解酶
第1圖呈現本發明中一實施例的流程圖。
第2圖呈現本發明中一實施例之重組噬菌體的結構示意圖。
第3圖呈現本發明中一實施例之重組噬菌體錨定於酵母菌表面的型態示意圖。
第4圖呈現本發明中一實施例的生物反應系統的示意圖。
第5圖及第6圖呈現本發明中一實施例的螢光顯微鏡照片。
第7A至7C圖呈現本發明中一實施例之酵素活性比較圖。
習知技術中，人工製造的纖維小體通常係將分解酶直接接合於蛋白支架，以模仿天然纖維小體的結構，然而，可接合的酶數量皆無法達到與天然的纖維小體相當的數量，導致分解能力不如預期。在本發明中，蛋白支架上接合分子量較小的胜肽，再使胜肽與分解酶連接，克服了立體障礙及其他不利因素，使單一蛋白支架上可接合大量的分解酶。此外，發明人更選用噬菌體為主幹作為人工纖維小體的蛋白支架，藉由基因重組技術使噬菌體表面表達大量的胜肽，進而增進分解酶的接合量。
在本發明中，人工纖維小體的建立可使用重組酵母菌及重組噬菌體。其建立方式包含使重組酵母菌表達錨定結構域；以及使重組噬菌體的蛋白質外膜表面表達與纖維素酶具有親和性的接合胜肽，並於重組噬菌體的尾端表面表達對應重組酵母菌表達的錨定結構域的錨定胜肽；且藉由大腸桿菌製造大量纖維素酶。將重組噬菌體、重組酵母菌、以及纖維素酶共培養，即可使纖維素酶與表達在重組噬菌體表面的接合胜肽接合，形成人工纖維小體，同時重組噬菌體可藉由錨定胜肽和重組酵母菌之錨定結構域的親和性固定於重組酵母菌
表面。如此一來，當生質原料中的纖維素接觸到人工纖維小體，人工纖維小體可藉由其高密度的纖維素酶進行高效率的纖維素分解，再者，分解產生的六碳醣可直接被所錨定的重組酵母菌利用於發酵反應，以生產生質酒精。
為使上述目的、技術特徵以及實際實施後之增益性更為明顯易懂，於下文中將係以較佳之實施範例輔佐對應相關之圖式來進行更詳細之說明。
在本發明的一實施例中，流程如圖式第1圖所示。
在步驟S11中，建立重組噬菌體，並藉由大腸桿菌(E.coli)快速且大量地生產。重組噬菌體RP的建立係藉由修改噬菌體的基因組，使該噬菌體的表面表達與特定酶具有親和性的接合胜肽、以及與特定細胞表面之錨定位具有親和性的錨定胜肽。具體而言，噬菌體可為λ噬菌體及絲狀噬菌體，較佳地為絲狀噬菌體，如M13、f1、fd噬菌體或其他適用於習知的噬菌體展示(phage display)技術的種類，接合胜肽可選用任何與所選用的纖維素分解酶具有親和性的配體，而錨定胜肽可選用任何與重組酵母菌表達的錨定位具有親和性的配體。
在步驟S12中，建立重組酵母菌，並藉由大腸桿菌快速且大量地生產。重組酵母菌的建立係藉由修改酵母菌的基因組，使該酵母菌的表面表達錨定位。具體而言，酵母菌可為任何常用於酒精發酵的酵母菌，例如：Schizosaccharomyces屬、Saccharomycodes屬、Hanseniaspora屬酵母菌等；而錨定位可為任何對應於本發明的重組噬菌體的錨定胜肽具有親和性的錨定結構域。另外，重組酵母菌亦可因應需求同時使其表達五碳醣的分解酶，使其具有五碳醣的分解能力。
在步驟S13中，建立重組大腸桿菌，並藉由大腸桿菌分泌表達大量的欲複製的酶，例如：纖維素分解酶。以複製纖維素分解酶為例，重組大腸桿菌的建立係藉由修改大腸桿菌的基因組，使該大腸桿菌可合成纖維素分解酶並分泌至胞外，並使合成的纖維素分解酶表達與重組噬菌體表達之接合胜肽具有親和性的對應域，使其與接合胜肽具有親和性。大腸桿菌本身因具有快速分裂的特性，可在短時間內大量製造纖維素分解酶。在本發明生產生質酒精的方法中，纖維素分解酶可為內切型纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶或纖維雙糖分解酶，較佳地可為內切型纖維素葡萄糖分解酶(celA)、纖維雙糖分解酶(BGL)、外切型纖維素分解酶(EC)或其他具有類似功能的酶。此外，可建立單一組重組大腸桿菌，使該單一組重組大腸桿菌同時分泌表達內切型纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶或纖維雙糖分解酶，或者可建立三組重組大腸桿菌，使其分別表達內切型纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶或纖維雙糖分解酶。較佳地，纖維素分解酶與本發明的重組噬菌體表達的接合胜肽具有親和性。
在步驟S20中，將重組噬菌體、重組酵母菌及重組大腸桿菌共培養以形成生物反應系統。生物反應系統可為任何能使重組噬菌體、重組酵母菌及重組大腸桿菌共存並持續生長的環境，加入生質原料至生物反應系統中後，生產生質酒精並提取。
在步驟S30中，加入生質原料至生物反應系統中。具體而言，生質原料可為任何具有纖維素的原料，例如：大麥、小麥、燕麥、稻米、甜菜、甜高粱、木薯、以及甘藷等糧食原料；或者非糧食原料，例如：麥稈、稻稈、玉米稈等；或者農業、都市和建築廢棄物，如廚餘、報紙、木屑、廢木材等；
或者成長快速的纖維質作物，如芒草、狼尾草、柳枝稷；或者易於採集的原料，如海藻等。
以下將以一示例性實施例搭配上述步驟S11~S13、S20及S30以描述本發明。
對應步驟S11，建立表面表達接合胜肽及錨定胜肽的重組M13噬菌體。為便於描述，以下步驟皆以接合胜肽選用SH3配體，而錨定胜肽選用PDZ配體為示例進行描述，但實際實施並不限於此。。在M13噬菌體的基因中，將SH3配體的基因(SEQ ID NO：2)插入在PVIII蛋白的基因序列中，以及將PDZ配體(SEQ ID NO：1)的基因插入在PIII蛋白的基因序列中。在設計重組質體時，PIII蛋白必須保留完整的結構而使M13噬菌體保留感染性，使其能藉由感染大腸桿菌進而快速複製。重組噬菌體最終結構如第2圖所示，具有PDZ配體的PIII蛋白位於重組噬菌體的尾端，而具有SH3配體的PVIII蛋白位於長桿狀的部分。此外，重組噬菌體依照本身PIII及PVIII蛋白的數量產生對應數量的SH3配體及PDZ配體，正常的M13噬菌體可具有約3~5個PIII蛋白及約2700個PVIII蛋白，故較佳地重組噬菌體可具有約3~5個SH3配體及約2700個PVIII配體。重組噬菌體放大後供後續使用。上述接合胜肽及錨定胜肽的選擇可互換，或可選用其他不同的配體或其組合，例如：GBD配體(SEQ ID NO：3)、SH2配體(SEQ ID NO：4)等，但接合胜肽及錨定生態不使用重複的配體。
對應步驟S12，建立表面表達錨定位的重組酵母菌。舉例而言，承上述步驟S11的例子，酵母菌選用Saccharomyces屬的S.cerevisiae酵母菌，在選用PDZ配體為錨定胜肽的情況，錨定位選用與重組噬菌體的PIII結構域表達的
PDZ配體具有親和性的PDZ結構域。藉由將PDZ結構域的基因(SEQ ID NO：5)插入S.cerevisiae酵母菌的基因中，使S.cerevisiae酵母菌的表面表達PDZ結構域，得到重組酵母菌。重組噬菌體，並經由培養放大後供後續使用。應被理解的是，在選用其他錨定胜肽時，可搭配不同的結構域錨定位，例如：GBD配體搭配GBD結構域(SEQ ID NO：7)、SH2配體搭配SH2結構域(SEQ ID NO：8)等。
對應步驟513，建立具有分泌表達纖維素分解酶能力的重組大腸桿菌。藉由將內切型纖維素分解酶的基因(SEQ ID NO：9)、外切型纖維素分解酶的基因(SEQ ID NO：10)及纖維雙糖分解酶的基因(SEQ ID NO：11)分別與SH3結構域的基因(SEQ ID NO：6)插入大腸桿菌的基因中，使大腸桿菌具有分泌表達與SH3配體具有親和性，亦即具有SH3結構域的內切型纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶以及纖維雙糖分解酶的能力，得到重組大腸桿菌。重組大腸桿菌經由培養放大後供後續使用。同前述，在選用其他錨定胜肽時，可搭配不同的結構域錨定位。
對應步驟S20，將重組噬菌體、重組酵母菌及重組大腸桿菌混合於同一培養系統中，以作為生產生質酒精的生物反應系統。培養過程中，重組大腸桿菌可分泌大量的內切型纖維素分解酶、外切型纖維素分解酶以及纖維雙糖分解酶，使其分散於生物反應系統中。重組噬菌體藉由其表面表達的SH3配體與上述纖維素分解酶的親和性，於相互接觸時使纖維素分解酶接合至重組噬菌體的表面上。理論而言，重組噬菌體具有約2700個SH3配體，應可接合約2700個纖維素分解酶至其表面上。然而，根據各重組噬菌體實際表達的SH3配體數量差異，實際接合的位置、角度及立體空間的分配、以及生物反應系統中兩者的
數量及濃度關係，接合的纖維素分解酶的數量可能因此而變動。重組噬菌體接合的纖維素分解酶可為1~3000個，較佳地為100~2000個。另一方面，重組噬菌體亦藉由其表面表達的PDZ配體與重組酵母菌表面表達的PDZ結構域的親和性，於相互接觸時使重組噬菌體錨定至重組酵母菌的表面上。理論而言，每個重組酵母菌表面可錨定對應於其表面表達的PDZ結構域的數量的重組噬菌體。然而同樣地，根據實際錨定的位置、角度及立體空間的分配、以及生物反應系統中兩者的數量及濃度關係，錨定的重組噬菌體的數量可能因此而變動。上述接合及錨定的過程皆為生物反應系統中在培養過程中自發性發生的流程，最終，重組噬菌體、重組酵母菌及重組大腸桿菌所生產的纖維素分解酶可自組裝而成為一個整體，如第3圖所示，其結構可視為重組酵母菌表面具有以重組噬菌體為蛋白支架，並與纖維素分解酶組合而成的人工纖維小體，擬似自然界中天然表面表達纖維小體的厭氧嗜熱菌T.saccharolyticum，藉由表面的纖維小體分解纖維素後，再將分解的產物轉由纖維小體所錨定的細菌本體以續行發酵反應以生產酒精。然而，相較於天然的T.saccharolyticum，本發明的人工纖維小體上接合更大量的纖維素分解酶，因而具有更高效的纖維素分解能力。
對應步驟S30，加入生質原料至生物反應系統中，以生產生質酒精。生物反應系統內的物質轉化及供應流程如第4圖所示，加入艾維素®微晶纖維素(Avicel® PH)及羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose)至生物反應系統中作為生質原料，使重組噬菌體表面接合的纖維素分解酶分解生質原料的纖維素以得到六碳醣，而此六碳醣可由重組噬菌體錨定的重組酵母菌運用於發酵反應中，將六碳醣轉化為酒精。此外，此六碳醣亦可作為生物反應系統中的重組大
腸桿菌及重組酵母菌的能量來源，使其分別得以持續生產纖維素分解酶及生產酒精。而在重組噬菌體為非溶菌型重組噬菌體時，例如本發明例示性實施例的重組M13噬菌體，可持續利用重組大腸桿菌進行複製放大。
整體而言，上述所載之生物反應系統同時具有纖維素分解能力及六碳糖發酵能力，也能因應需求而修改使其同時具有五碳醣的分解能力。此外，生物反應系統中的重組大腸桿菌可自產纖維素分解酶，且其所需的能量可由纖維素分解後產生的六碳醣供給，以致於整個生物反應系統中無需提供外加能量，僅需持續供應足量的生質原料，即可永續運作。
以下，將測試上述實施例中重組噬菌體表面接合的纖維素分解酶的活性數據，佐證本發明的纖維素分解方法可達到足量的纖維素分解效果，達到有效生產生質酒精的目的。
如第5圖所示，當插入PDZ結構域的序列至重組酵母菌的基因時，以Alexa Fluor 488螢光染料進行標記。第5圖A部分顯示未重組的酵母菌在顯微鏡亮視野下的照片；而C部分顯示重組酵母菌在顯微鏡亮視野下的照片。第5圖B部分顯示與A部分相同視野下激發Alexa Fluor 488螢光染料的波長觀察的結果，並未見到任何螢光訊號，表示並無PDZ結構域；然而第5圖D部分，亦即顯示與C部分相同視野下激發Alexa Fluor 488螢光染料的觀察結果，明顯觀察到綠色螢光，顯示PDZ結構域確實表達於重組酵母菌的表面。
如第6圖所示，以Syto 9螢光染料標記重組噬菌體。第6圖A部分顯示重組噬菌體RP與未重組酵母菌混合，並移除未錨定的重組噬菌體後在顯微鏡亮視野下的照片；而C部分顯示重組噬菌體與重組酵母菌混合，並移除未錨定
的重組噬菌體後在顯微鏡亮視野下的照片。第6圖B部分顯示與A部分相同視野下激發Syto 9螢光染料的波長觀察的結果，並無綠色螢光訊號，表示重組噬菌體並未錨定於未重組酵母菌上；而D部分顯示與部分相同視野下激發Syto 9螢光染料的觀察結果，明顯觀察到綠色螢光，顯示由重組噬菌體確實錨定於重組酵母菌上。
表1顯示具有SH3結構域的纖維雙糖分解酶(BGL-SH3)及接合於重組噬菌體表面且具有SH3結構域的纖維雙糖分解酶(RP-BGL-SH3)的活性比較。表1中Et為酶濃度；Vmax為最大反應速率；kcat為反應常數；KM為米氏常數。RP-BGL-SH3及BGL-SH3兩者活性係藉由比較kcat/KM之數據，亦即催化效率而得。根據表1及第7A圖的結果，藉由初始速率對觀察4-硝基苯-B-D-吡喃葡萄糖苷(4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside，pNPG)的濃度變化得知RP-BGL-SH3的催化效率約為BGL-SH3的2.33倍，顯示即便存在相同濃度的BGL-SH3，有無接合於噬菌體表面上可造成纖維素分解的催化效率差異達到約2.33倍。
表2顯示具有SH3結構域的內切型纖維素分解酶(celA-SH3)及接合於重組噬菌體表面且具有SH3結構域的內切型纖維素分解酶(RP-celA-SH3)的活性比較，其中各參數代號與表1相同。根據表2及第7B圖的結果，藉由觀察初始速率對羧甲基纖維素(Carboxymethyl cellulose，CMC)的濃度變化得知
RP-celA-SH3的催化效率約為celA-SH3的1.81倍，顯示即便存在相同濃度的celA-SH3，有無接合於噬菌體表面上可造成纖維素分解的催化效率差異達到約1.81倍。
表3顯示具有SH3結構域的外切型纖維素分解酶(EC-SH3)及接合於重組噬菌體表面且具有SH3結構域的外切型纖維素分解酶(RP-EC-SH3)的活性比較，其中測量方法與各參數代號與表1相同。根據表3及第7C圖的結果，藉由觀察初始速率對磷酸溶脹纖維素(Phosphoric acid swollen cellulose，PASC)的濃度變化得知RP-EC-SH3的催化效率約為celA-SH3的1.57倍，顯示即便存在相同濃度的EC-SH3，有無接合於噬菌體表面上可造成纖維素分解的催化效率差異達到約1.57倍。
綜上所述，所得的結果皆證實本發明之具有噬菌體支架之人工纖維小體即便於相同酶濃度下仍可使纖維素的分解效率大幅提升。再者，利用本
發明之人工纖維小體分解纖維素，並用於生產生質酒精，理應在相同酶濃度下使纖維素的分解效率大幅提升。況且，本發明之人工纖維小體更藉由錨定至重組酵母菌表面並與重組大腸桿菌共培養，形成完整的聯合生物轉化製程，是以本發明能確實突破現有聯合生物轉化製程的產能限制。
雖然本發明已以上述實施例具體描述本發明之纖維素分解方法、生質酒精生產方法及用於其之纖維小體，然而具本發明所屬技術領域之通常知識者應理解，可在不違背本發明之技術原理及精神下，對實施例作修改與變化。因此本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所述。
<110> 國立清華大學長春人造樹脂廠股份有限公司長春石油化學股份有限公司
<120> 人工纖維小體、利用其分解纖維素及生產酒精之方法(ARTIFICIAL CELLULOSOME HAVING BACTERIOPHAGE SCAFFOLD,METHOD OF DECOMPOSING CELLULOSE AND MANUFACTURING ALCOHOL USING THE SAME)
<160> 11
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<212> PRT
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<212> DNA
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<220>
<223> 纖維雙糖分解酶(BGL)
<400> 11
Claims (8)
- 一種纖維素的分解方法，包含：建立一重組噬菌體，其中該重組噬菌體係藉由修改一噬菌體的一基因組，使該噬菌體的表面表達：至少一種接合胜肽，係與至少一種分解酶具有親和性；及至少一種錨定胜肽，係與一細胞之表面之一錨定位具有親和性；使該至少一種分解酶接觸該重組噬菌體；以及使一纖維素接觸該分解酶；其中，該接合胜肽及該錨定胜肽係與表達SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或其組合之錨定位具有親和性，且該接合胜肽與該錨定胜肽不同；以及其中，該至少一種分解酶包含一內切型纖維素分解酶、一外切型纖維素分解酶、一纖維雙糖分解酶或其組合。
- 如申請專利範圍第1項所述之分解方法，該至少一種接合胜肽與1至3000個該至少一種分解酶連接。
- 如申請專利範圍第1項所述之分解方法，該至少一種分解酶表達SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或其組合。
- 如申請專利範圍第3項所述之分解方法，其中該錨定位表達的序列與該至少一種分解酶表達的序列不重複。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之分解方法，其中該噬菌體包含λ噬菌體或絲狀噬菌體。
- 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之分解方法，其中該細胞包含酵母菌。
- 一種生質酒精的生產方法，包含：建立一重組噬菌體，其中該重組噬菌體包含至少一種接合胜肽及至少一種錨定胜肽；將至少一種分解酶接合至該至少一種接合胜肽；將該至少一種錨定胜肽錨定於一酵母菌的表面之一錨定位；使該至少一種分解酶分解一纖維素，以得到一醣類；以及使該酵母菌發酵該醣類，以得到一生質酒精；其中，該接合胜肽及該錨定胜肽係與表達SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或其組合之錨定位具有親和性，且該接合胜肽與該錨定胜肽不同；以及其中，該至少一種分解酶包含一內切型纖維素分解酶、一外切型纖維素分解酶、一纖維雙糖分解酶或其組合。
- 一種人工纖維小體，包含：一重組噬菌體，其表面表達：至少一種接合胜肽，係與至少一種分解酶具有親和性；及至少一種錨定胜肽，係與一細胞的表面之一錨定位具有親和性；以及至少一種纖維素分解酶，其接合於該重組噬菌體表面表達的該至少一種接合胜肽；其中，該接合胜肽及該錨定胜肽係與表達SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或其組合之錨定位具有親和性，且該接合胜肽與該錨定胜肽不同；以及其中，該至少一種分解酶包含一內切型纖維素分解酶、一外切型纖維素分解酶、一纖維雙糖分解酶或其組合。
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2017
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Patent Citations (3)
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