TWI650123B - 含Ｏｍｅｇａ－３脂肪酸及ｏｍｅｇａ－６脂肪酸之組成物及其用於增進內源性活化型維生素Ｂ６合成之用途 - Google Patents
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本發明係關於一種包含特定比例的omega-3脂肪酸及omega-6脂肪酸之脂肪酸組成物，及其用於增進內源性活化型維生素B6合成的應用。
Description
本發明係關於一種包含特定比例的omega-3脂肪酸及omega-6脂肪酸之脂肪酸組成物，用於增進體內活化型維生素B6合成。更特別地，本發明係關於一種包含10%-25%之omega-3 EPA、5%-15%之omega-3 DHA且總omega-3脂肪酸與omega-6之比例為1：1-3：2的脂肪酸組成物，用於增進體內活化型維生素B6合成。
許多疾病維生素B6代謝異常，導致病患血漿中活化型維生素B6磷酸吡哆醛之濃度顯著低於健康人。已知血漿中磷酸吡哆醛(此為活化型維生素B6,PLP)濃度過低是罹患心血管疾病之獨立危險因子之一。維生素B6有助於促進體內同半胱氨酸走向轉硫反應，在健康人中提升體內活化型維生素B6可幫助細胞清除同半胱氨酸。缺乏維生素B6會造成高血同半胱氨酸症，高血同半胱氨酸亦另一個心血管疾病之危險因子。維生素B6也被建議用於在緩解改善經前綜合症、癲癇以及懷孕期間的噁心和嘔吐(Merrill AH,Jr.,Henderson JM.Annu Rev Nutr 7：137-156,1987；Bassler KH.Int J Vitam Nutr Res 58：105-118,1988；Niebyl JR,Goodwin TM.Am J Obstet Gynecol 186：S253-S255,2002)，顯示提升體內維生素B6本身即具有額外健康助益。基於此，透過保健配方促進維生素B6活化或是其生合成、或是避免維生素B6流失對人類健康有明顯助益。
維生素B6代謝中，運輸型維生素B6 Pyridoxal(PL)會透過吡哆醛激酶(Pyridoxal kinase；PDXK)轉變成活化型Pyridoxal phosphate(PLP)，而PLP會透過吡哆醛磷酸酶(Pyridoxal phosphatase；PDXP)代謝成PL進出細胞，或是進一步降解成終代謝產物
pyridoxic acid。血漿低磷酸吡哆醛濃度為罹患心血管疾病之獨立危險因子(Cheng CH,Lin PT,Liaw YP et al.Nutrition 24：239-244,2008；Serfontein WJ,Ubbink JB,De Villiers LS,Rapley CH,Becker PJ.Atherosclerosis 55：357-361,1985；Iqbal MP,Ishaq M,Kazmi KA et al.Nutr Metab Cardiovasc Dis 15：100-108,2005)。風濕性關節炎病患血漿PLP與發炎因子C-反應蛋白濃度呈逆相關，在動物實驗當中，發炎反應會直接導致維生素B6缺乏(Chiang EP,Bagley PJ,Selhub J,Nadeau M,Roubenoff R.Am J Med 114：283-287,2003)，顯示人類疾病狀態可能造成維生素B6異常因而增加心血管疾病風險。研究發現維生素B6的PLP在缺血性心臟病具有保護心臟的作用(Dhalla NS,Takeda S,Elimban V.Clin Chem Lab Med 51：535-543,2013)，因此，維持充足維生素B6的至關重要。此外，先前之研究指出，高濃度的吡哆醇(PN)或吡哆醛(PL)能夠於活體外抑制實驗動物或人類之癌細胞生長，或對癌細胞具有毒殺作用(Shultz TD,Santamaria AG,Gridley DS,Stickney DR,Slater JM.Anticancer Res 8：1313-1318,1988；Yanaka N,Ohata T,Toya K,Kanda M,Hirata A,Kato N.Mol Nutr Food Res 55：635-643,2011；Gridley DS,Stickney DR,Shultz TD.J Clin Lab Anal 3：95-100,1989；Minamino M,Oka T,Kanouchi H.Biosci Biotechnol Biochem 79：124-129,2015)。Gridley等人表示，每日攝取高量維生素B6可抑制經第2型單純疱疹病毒轉形之細胞所誘導的腫瘤生長，並增強BALB/c小鼠的免疫力(Gridley DS,Stickney DR,Nutter RL,Slater JM,Shultz TD.J Natl Cancer Inst 78：951-959,1987)。此等研究指出高劑量之維生素B6具有抑制腫瘤增生之可能用途。
在本研究室尚未發表的活體外細胞研究發現，特定的omega-3(ω3)-脂肪酸會增進PDXK活性，促進維生素B6活化；特定的ω3脂肪酸甚至還能夠同時抑制PDXP活性、減少維生素B6降解(Chiang et al unpublished work)。但我們同時也發現並非所有ω3-fatty acid都有相同效果。我們由此發展出不同fatty acid組合的配方，並針對如何有效提升維生素B6調整配方。在in vivo實驗中，我們先測定市售大豆油、玉米油和魚油當中的不同脂肪酸含量分
佈，再根據活體外細胞研究結果，調配多組含不同ω3-及ω3-fatty acids比例之新配方，並進一步進行活體外及活體內測試，找出理想的配方範圍，最後在小鼠模式中測試，不同配方對於活體內增進維生素B6活化之功效。
ω-3脂肪酸(Omega-3 fatty acids)又稱n-3脂肪酸，是一類不飽和脂肪酸，最重要的3種為：α-亞麻酸(α-Linolenic acid,ALA)(存在於植物中的油)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)(這二種發現存在於海洋動植物油中)。魚油富含omega-3多元不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid；PUFA)，包含兩種主要成分eicosapentaenoic acid(EPA)和docosahexaenoic acid(DHA)，此二種人體無法自行合成，因此是必需脂肪酸。魚油的生理功能包含幫助脂肪代謝、降低三酸甘油脂、抑制血栓形成、降血壓並減少血中發炎物質對血管的傷害，因此可以間接降低心血管疾病的發生(Calder PC,Am J Clin Nutr 83：1505S-1519S,2006；Massaro M,Scoditti E,Carluccio MA,De CR.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 79：109-115,2008；)。
目前雖有研究顯示缺乏B6會影響脂肪酸代謝，造成omega-6花生四烯酸(arachidonic acid；AA)、omega-3脂肪酸中EPA/ALA和DHA/ALA降低，增加omega-6亞麻油酸(linoleic acid；LA)(Bertrandt J,Klos A,Debski B.Nahrung 48：99-103,2004)。n-6的多不飽和脂肪酸(PUFA)會促進發炎反應而n-3的PUFA則與抗發炎效果相關，B6異常會造成n-3/n-6下降(Zhao M,Lamers Y,Ralat MA et al.J Nutr 142：1791-1797,2012)。但截至目前，尚無文獻已指出omega-3多元不飽和脂肪酸或魚油可能對於維生素B6生合成代謝有所影響，亦無研究顯示，特定ω3-脂肪酸比例的補充會直接促進B6生合成。
本發明基於以上之目的，本發明首先提出含特定比例的omega-3脂肪酸及omega-6脂肪酸之改良配方，並於活體內的實驗證實，能有效提升體內活化型維生素B6合成。
於是，本發明之一方面係關於，一種用於增進體內活化型維生素B6合成之脂肪酸組成物，其特徵在於該組成物之總脂肪酸中包含30~32% omega-6脂肪酸及21~44% omega-3脂肪酸，且總omega-6脂肪酸與總omega-3脂肪酸之比例為1：1-2：3。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之總omega-3脂肪酸中二十碳五烯酸(EPA)與二十二碳六烯酸(DHA)之含量比為至少為3：2。於本發明之一項具體實施態樣，所述之總omega-3脂肪酸中omega 3 EPA與omega3 DHA之含量比為3：2-2：1。
於本發明之一較佳具體實施態樣，所述之總omega-3脂肪酸包含10%-25%之omega-3 EPA及5%-15%之omega-3 DHA。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之omega-6脂肪酸之來源為大豆油。於本發明之其他具體實施態樣，所述之omega-3脂肪酸之來源為魚油。
圖1係顯示補充實施例一不同omega-3配方之脂肪酸組成物的小鼠血漿中(圖1A)及肝臟中(圖1B)活化型維生素B6磷酸吡哆醛濃度的變化。數據是以實驗組數值相對于對照組之百分比之平均值±標準誤表示。粗體P值<0.05代表於統計學上有顯著差異。
圖2係顯示補充實施例二不同omega-3配方之脂肪酸組成物的小鼠血漿中(圖2A)及肝臟中(圖2B)活化型維生素B6磷酸吡哆醛濃度的變化。數據是以實驗組數值相對于對照組之百分比之平均值±標準誤表示。粗體P值<0.05代表於統計學上有顯著差異。
圖3係顯示補充實施例三不同omega-3配方之脂肪酸組成物的小鼠血漿中(圖3A)及肝臟中(圖3B)活化型維生素B6磷酸吡哆
醛濃度的變化。數據是以實驗組數值相對于對照組之百分比之平均值±標準誤表示。粗體P值<0.05代表於統計學上有顯著差異。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
特定的脂肪酸對於維生素B6代謝酵素有不同層面的顯著影響
本研究室尚未發表的in vitro pilot研究發現，ω3-ALA,ω3-EPA,ω3-DHA及代謝中間產物ω3-DPA及ω6-AA會促進維生素B6代謝酵素PMPO的活性，此酵素主要是形成不同形式的活化行維生素B6-PMP。其中ω3-ALA及ω6-AA雖然影響PMPO活性，但是並不促進維生素B6活化酵素PDXK活性(Chiang at al unpublished work)。另一方面，ω3-EPA、ω3-DHA以及其代謝中產物ω3-DPA不僅會促進PMPO活性，還會進一步促進維生素B6酵素PDXK的活性達31~91%，顯示這些ω3-fatty acids及其代謝物還可能具有幫助維生素B6活化的潛力。
接著我們更進一步發現，ω3-EPA及ω6 AA會抑制維生素B6降解酵素PDXP的活性，而ω6 LA則有促進PDXP活性的趨勢。在同樣條件下ω6-LA則不影響維生素B6代謝酵素PMPO,PDXK的活性。我們由上述各種實驗推斷特定的ω3或ω6 fatty acid成分將會在in vivo有有促進B6合成或是減少維生素B6降解的潛力，尤其其中ω3-EPA同時具有能夠促進維生素B6活化並減少降解，同時具有幫助維生素在細胞內被利用以及保護維生素B6降解，針對維護提升B6活化利用是理想的潛力配方成份之一。其次ω3-DPA及ω3-DHA雖不會減少降解但因其仍具促進維生素B6活化的潛力。其次ω6-AA雖不具有活化B6潛力但是可能減少維生素B6降解流失。至於ω6-LA則都不會顯著影響維生素B6代謝酵素。
特定的脂肪酸對於紅血球細胞內維生素B6代謝的
影響
由以上研究我們先找出的具潛力之特定fatty acids後，第二階段進行in vitro實驗，將紅血球與不同的脂肪酸共同培養，利用細胞內本身原有的維生素B6前驅物當作受質，發現ω3-EPA及代謝產物ω3-DPA確實會增加細胞內活化形式B6-PLP含量，成功驗證上述之假說(即特定fatty會活化維生素B6酵素或減少維生素B6降解而增加維生素B6利用率)。但是，ω3-DHA與紅血球共培養後，並不影響細胞內維生素B6的分佈。同時，根據活體外分析(in vitro assay)及活體外培養分析(in vitro incubation assay)還發現，ω6-LA會透過活化PDXP，而將維生素B6轉化成運輸PL形式的維生素B6，因此有可能會對於細胞維持維生素B6活化有影響。
實施例一、管餵含脂肪酸配方A系列對於增加小鼠肝臟和血漿中活化型維生素B6磷酸吡哆醛有顯著的影響
八週齡雌性小鼠(C57BL/6)共28隻。小鼠豢養於過濾飼養籠中，維持控溫(20~25℃)、控濕、並固定光照/黑暗週期(光照12h/黑暗12h)的條件下生長。以實驗用囓齒動物飼料配方(AIN-93M)餵予小鼠至八週齡後，根據體重將小鼠均勻分為對照組與試驗組。試驗組分成兩組：配方A和配方B。管餵三周後犧牲，測量肝臟和血漿中PLP的含量，評估魚油對於小鼠體內組織中維生素B6濃度狀態之影響。組織以酸均質化萃取後，以含有semicarbazide與甘胺酸之衍生劑衍生過濾後以HPLC分析定量，血漿先以semicarbazide與甘胺酸之衍生劑衍生後再以酸萃取後過濾以HPLC分析定量。
配方說明：參考配方(X)，總脂肪酸組成含53%的ω6脂肪酸和6%ω3脂肪酸。配方A1,A2其總脂肪酸組成含32% omega-6和21~39% omega-3，微調出含不同程度ω3脂肪酸，其中EPA佔10~22%，DHA佔5~14%，ALA佔2.9~5.4%。配方B1,B2其總脂肪酸組成含32% ω6脂肪酸和24~43% ω3-脂肪酸，微調出含不同程度ω3脂肪酸，其中EPA佔3~6% DHA佔15~30%，ALA佔5.9~6.1%。詳細組成如下表1所示。
1.數據以平均值±SD表示
2.**為統計上具顯著差異(p<0.001)
在本究中，餵食含omega-3脂肪酸新配方的小鼠中，不管餵食配方A還是配方B與X組相比皆顯著增加血漿中PLP達86%和54%，如圖1A所示。配方A相較X組，可顯著增加肝臟PLP達35%；配方B與X組相比則沒有影響，如圖1B所示。
實施例二、管餵含脂肪酸配方C系列對於增加小鼠肝臟和血漿中活化型維生素B6磷酸吡哆醛有顯著的影響
八週齡雌性小鼠(C57BL/6)共28隻。小鼠豢養於過濾飼養籠中，維持控溫(20~25℃)、控濕、並固定光照/黑暗週期(光照12h/黑暗12h)的條件下生長。以實驗用囓齒動物飼料配方(AIN-93M)餵予小鼠至八週齡後，根據體重將小鼠均勻分為對照組與試驗組。試驗組分成兩組：配方C和配方D。三周後犧牲，測量肝臟和血漿中PLP的含量，評配方對於小鼠體內組織中維生素B6濃度狀態之影響。組織以酸均質化萃取後，以含有semicarbazide與甘胺酸之衍生劑衍生過濾後以HPLC分析定量，血漿先以semicarbazide與甘胺酸之衍生劑衍生後再以酸萃取後過濾以HPLC分析定量。
配方說明：參考配方(Y)，其總脂肪酸組成含52%的ω6脂肪酸和6%ω3脂肪酸。配方C1,C2，總脂肪酸組成，30% omega-6和27~44% omega-3，含微調出含不同程度ω3脂肪酸其中EPA佔15~25%，DHA佔9~18%,，ALA佔2.9~3.2%。配方D1,D2，其總脂肪酸組成含39% omega-6和31~51% omega-3，含微調出含不同程度ω3脂肪酸EPA佔4~8%，DHA佔18~41%，ALA佔1.8~8.1%。詳細組成如下表3所示。
在本研究中，餵食含omega-3新配方的小鼠中，其餵食配方C相較Y組顯著增加血漿PLP達46%；配方D與Y組相比
有30%增加趨勢(p<0.1)。如圖2(B)。餵食配方C相較Y組有31%趨勢增加肝臟PLP；配方D與Y組相比則沒有影響，如圖3(B)所示。
實施例三、管餵含脂肪酸配方E增加小鼠血漿中活化型維生素B6磷酸吡哆醛的濃度
四~五週齡的小鼠(C57BL/6)豢養於過濾飼養籠中，維持控溫(20~25℃)、控濕、並固定光照/黑暗週期(光照12h/黑暗12h)的條件下生長。根據體重將小鼠均勻分為對照組與試驗組，試驗組分成四組，27週後犧牲，測量肝臟和血漿中PLP的含量，評估魚油對於小鼠體內組織中維生素B6濃度狀態之影響。組織以酸均質化萃取後，以含有semicarbazide與甘胺酸之衍生劑衍生過濾後以HPLC分析定量，血漿先以semicarbazide與甘胺酸之衍生劑衍生後再以酸萃取後過濾以HPLC分析定量。
配方說明：參考配方(Z)，其總脂肪酸組成含54%的omega-6和7.3% omega-3，其中含7.2% ALA，不含EPA、DHA。配方U，含高量飽和脂肪酸>53%，其中EPA佔1.3%，DHA佔2%，ALA佔1.1%。配方E，其總脂肪酸組成含3.5% omega-6脂肪酸和37% omega-3脂肪酸，其中EPA佔23%，DHA佔13%含0.6%ALA。詳細組成如下表5所示。
在本研究中，餵食配方U與Z組小鼠相比並不會影響血漿中PLP，表示飲食富含特定omega-3脂肪酸與omega-6脂肪酸之比例對於促進B6之效果具有專一性，並非其單純體代以他油類即可達到。而配方E與Z組相比，會顯著增加血漿PLP分別達55%和48%，如圖3A所示。而肝臟PLP則沒有顯著影響，如圖3B所示。換算人體每日每公斤體重之攝取量，EPA攝取量為0.19gm/kg/天，DHA攝取量為0.46gm/kg/天。
由以上實例中我們發現，從促進B6活化的觀點來看，並非單增加總omega-3 fatty acid就可達到相同效果，而需要特定理想之組合比例。例如配方E中，總omega-3脂肪酸比例高達37%，雖可使血漿中PLP濃度提高48%，但是並未有效促進肝臟維生素B6活化，但若在混有omega-6脂肪酸的高EPA劑量(EPA>DHA)，如實施例一配方A和實施例二配方C，不僅能達到促進PLP之效果，甚至在肝臟的效果更好，更能證實促進B6生成的
效果應是與較高比例EPA有關。此外，本發明之含特定配方比例脂肪酸的組成物對於增進維生素B6活化之效果，並非吃純魚油即可達到。同時強調並非配方魚油含量愈高效果愈好。當比較配方中大豆油與魚油含量比例為1：1，以及大豆油與魚油比含量比例為2：3時，無論是血中B6或是肝臟中B6活化程度，對於提升活化型維生素B6之效果，前者(大豆油與魚油含量比例為1：1)較後者(大豆油與魚油含量比例為2：3)均具有更佳效果，顯示此增進維生素B6活化的效果，並非僅藉由提升魚油含量就可達到最佳效果。因此本發明發現，含有EPA>DHA之配方其效果較為理想，當在既有的大豆油中再添加特定的omega-3脂肪酸，使得總脂肪酸中含30~32% omega-6脂肪酸和21~44% omega-3脂肪酸，其中omega-3比例又以EPA>DHA(至少3：2)者效果較理想，即EPA佔10~25%、DHA佔5~16%。在此範圍下可減少昂貴成分量，不但能達到原本促進體內維生素B6活化的目的，亦能減省補充品的成本增加效益。
關於增進維生素B6活化對健康促進已有許多研究證實。本研究中的血中活化型維生素B6濃度上升高達近46-86%，同時肝臟中B6活化型是增加達30%。根據文獻，在健康人類中維生素B6之活化型濃度增加達30%以上可顯著改善周邊白血球細胞對T細胞有絲分裂的反應(Kwak HK,Hansen CM,Leklem JE,Hardin K,Shultz TD.J Nutr 132：3308-3313,2002)，協助維持免疫功能。於本研究中，血中濃度增加幅度達46-86%，同時還會增加肝臟B6活化型式達>30%。因此，本發明之脂肪酸組成物可以有效增加體內維生素B6之合成，不僅能應用做為健康人提升維生素B6之增進劑，亦可應用於缺血性患者體內活化型維生素B6之促進劑，預防由於體內活化維生素B6缺乏所引起的疾病，提升健康。
Claims (5)
- 一種脂肪酸組成物用於製備增進體內活化型維生素B6合成之醫藥組成物的用途，其特徵在於該組成物之總脂肪酸中包含30~32% omega-6脂肪酸及21~44% omega-3脂肪酸，且總omega-6脂肪酸與總omega-3脂肪酸之比例為1：1-2：3。
- 如請求項1所述之用途，其中該總omega-3脂肪酸中omega-3二十碳五烯酸(EPA)與omega-3二十二碳六烯酸(DHA)之含量比為3：2-2：1。
- 如請求項1或2所述之用途，其中該總omega-3脂肪酸包含10%-25%之omega-3 EPA及5%-15%之omega-3 DHA。
- 如請求項1所述之用途，其中該omega-6脂肪酸之來源為大豆油。
- 如請求項1所述之用途，其中該omega-3脂肪酸之來源為魚油。
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