TWI639614B - 核苷酸類似物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供利用去氧核苷三磷酸之方法、組成物、混合物及套組，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷(methylenedisulfide)作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置及可逆式連接至該去氧核苷之核鹼基的可檢測標識物。此等化合物提供未來定序技術之新的可能性，包括但不限於以合成定序。

Description

核苷酸類似物 相關申請案之交叉參考
本申請案主張在2015年11月6日申請之美國臨時專利申請案第62/251,884號及在2016年4月26日申請之美國臨時專利申請案第62/327,555號之權益，將該等併入本文以供參考。
本發明提供利用去氧核苷三磷酸之方法、組成物、混合物及套組，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置及可逆式連接至去氧核苷之核鹼基的可檢測標識物。此等化合物提供未來定序技術之新的可能性，包括但不限於以合成定序。
DNA定序為現代生物技術中最重要的分析方法之一。對目前的定序技術之詳細評論於M.L.Metzker之Nature Reviews 2010,11,31[1]及C.W.Fuller等人之Nature Biotechnology 2009,27,1013[2]中提供。
熟知的定序方法為以合成定序(SBS)方法。根據此方法，核苷三磷酸係以3'OH-保護基(特別為酯和醚)可逆式阻斷。酯的實例為鏈烷酸酯，如乙醯基、磷酸酯和碳酸酯。核苷三磷酸通常包含在鹼基上的標識物。
在使用可逆式3'OH-阻斷之核苷三磷酸的逐步方式中經酶合成預定序列的聚核苷酸之方法由Hiatt和Rose說明(美國專利第5,990,300號)[3]。除了酯、醚、甲腈、磷酸酯、磷醯胺、碳酸酯、胺甲酸酯、硼酸酯、糖、胺基磷酸酯(phosphoramidate)、苯基亞磺酸酯(phenylsulfenate)、硫酸酯及碸以外，彼等亦揭示硝酸酯作為可裂解的3'OH-保護基。去保護可以化學或酶方式進行。對硝酸酯基團既沒有揭示合成程序，亦沒有揭示去保護條件及酶併入數據。所主張之去阻斷溶液較佳地含有二價陽離子，如Co2+，及生物緩衝液，如Tris。未揭示3'OH-阻斷之含有標識物的核苷三磷酸。
Buzby(US 2007-0117104)[4]揭示用於SBS之核苷三磷酸，其在3'-羥基上受到可逆式保護且攜有在鹼基上的標識物。標識物係經由可裂解的連結子連接，諸如二硫化物連結子或光可裂解的連結子。連結子係由至多約25個原子所組成。除了羥胺、醛、烯丙胺、烯、炔、醇、胺、芳基、酯、醚、甲腈、磷酸酯、碳酸酯、胺甲酸酯、硼酸酯、糖、胺基磷酸酯、苯基胺磺酸酯(phenylsulfanate)、硫酸酯、碸和雜環以外，3'OH-保護基亦可為硝酸酯。
為了達成更長的讀取長度及更好精確度的核酸定序所 需要的是具有可裂解的保護基及可裂解的連結子之核苷酸類似物，其在裂解後沒有留下反應性殘留物[5]。
本發明提供利用去氧核苷三磷酸之方法、組成物、混合物及套組，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置及可逆式連接至去氧核苷之核鹼基的可檢測標識物。在一個實施態樣中，本發明設想核苷酸類似物，其具有包含二硫甲烷之可逆式保護基及在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛(oxymethylenedisulfide)連結子。此等化合物提供未來定序技術之新的可能性，包括但不限於以合成定序。
在混合物方面，本發明於一個實施態樣中設想去氧核苷三磷酸，其包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子及以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置，該去氧核苷三磷酸係在與一或多個額外的定序試劑之混合物中，該定序試劑包括但不限於緩衝液、聚合酶、引子、模板及類似者。在套組方面，本發明於一個實施態樣中設想定序套組，其中定序試劑一起提供於單獨的容器中(或混合物中)，該套組包括去氧核苷三磷酸連同在定序中使用此等試劑之用法說明，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置。
不意欲使本發明受限於任何特別的聚合酶。本發明設 想具有增強核苷酸衍生物併入的工程化(例如突變)聚合酶。例如，Tabor,S.和Richardson,C.C.((1995)Proc.Natl.Acad.Sci(USA)92：6339[6])說明在水生棲熱菌(T.aquaticus)DNA聚合酶中以酪胺酸代替苯基丙胺酸667及其具有以DNA聚合酶鑑定二去氧核苷酸的效應。在一個實施態樣中，本發明設想缺少3'-5'外核酸酶活性(命名為外-)之聚合酶。例如，9°N聚合酶之外-變體係由Perler等人之1998 US 5756334[7]及Southworth等人之1996 Proc.Natl Acad.Sci USA 93：5281[8]說明。另一聚合酶實例為Pfu DNA聚合酶之A486Y變體(Evans等人之2000.Nucl.Acids.Res.28：1059[9])。另一實例為Tsp JDF-3 DNA聚合酶之A485T變體(Arezi等人之2002.J.Mol.Biol.322：719[10])。WO 2005/024010 A1關於基序A區之修飾及9°N DNA聚合酶，將其特此併入本文以供參考[11]。
在方法方面，本發明設想兩種方法：合成去氧核苷三磷酸之方法，該去氧核苷三磷酸包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子及以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置，以及利用去氧核苷三磷酸之方法，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置。
在一個實施態樣中，本發明關於(a)具有以包含二硫甲烷(例如通式-CH2-SS-R)作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O之核苷三磷酸；及(b)彼等經標識之類似物，其中 標識物係經由可裂解的二硫甲醛連結子(-OCH2-SS-)附著至核鹼基。此等核苷酸可用於以合成定序(SBS)核酸之技術中。在一個實施態樣中，本發明關於以包含二硫甲烷(例如-CH2-SS-R)作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O之核苷酸的合成、去保護條件或酶併入。
在一個實施態樣中，本發明關於去氧核苷三磷酸，其包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子及以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O。在一個實施態樣中，該核苷之核鹼基為非天然。在一個實施態樣中，該核苷之非天然核鹼基係選自包含下列之群組：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在一個實施態樣中，包含二硫甲烷之該基團為-CH2-SS-R，其中R係選自包含下列之群組：烷基和經取代之烷基。在一個實施態樣中，該可檢測標識物係經由可裂解的二硫甲醛連結子(例如式-OCH2-SS-)附著至該核鹼基。在一個實施態樣中，該可檢測標識物為螢光標識物。在一個實施態樣中，在式(-CH2-S-S-R)中的R可能為烷基或烯丙基。
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的去氧核苷三磷酸： 其中B為核鹼基，及R係選自包含下列之群組：烷基和經取代之烷基。在一個實施態樣中，該核鹼基為天然核鹼 基(胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤、胸嘧啶和尿嘧啶)。在一個實施態樣中，該核鹼基為選自包含下列之群組的非天然核鹼基：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在類似物的例子中，可檢測標識物亦可包括在核鹼基與該可檢測標識物之間的連結子分段。
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸： 其中B為核鹼基，R係選自包含下列之群組：烷基和經取代之烷基，及L1和L2為連接基團。在一個實施態樣中，該核鹼基為天然核鹼基類似物。在一個實施態樣中，該核鹼基為選自包含下列之群組的非天然核鹼基類似物：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在類似物的例子中，可檢測標識物亦可包括在核鹼基與該可檢測標識物之間的連結子分段。在一個實施態樣中，L1和L2係獨立地選自包含下列之群組：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N和-N=N-、烷基、芳基、支鏈烷基、支鏈芳基或彼等之組合。較佳的是L2不為〝-S-〞。在一個實施態樣中，本發明設想成為在鹼基上的胺或在鹼基上的羥基之L1。在一個實施態樣中，該標識物係選自由下列所組成之群組：螢光團染料、 能量轉移染料、質量標籤(mass-tag)、生物素和半抗原。在一個實施態樣中，該標識物為可檢測標識物。
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中D係選自由下列所組成之群組：二硫化烯丙基和經二硫化物取代之烯丙基；B為核鹼基；A為附著基團；C為可裂解的部位核心；L1和L2為連接基團；及Label為標識物。
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中D係選自由下列所組成之群組：疊氮化物、二硫化烷基、經二硫化物取代之烷基；B為核鹼基；A為附著基團；C為可裂解的部位核心；L1和L2為連接基團；及Label為標識物(例如可檢測部分)。在一個實施態樣中，該核鹼基為選自由下列所組成之群組的非天然核鹼基類似物：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在一個實施態樣中，該附著基團A為選自由下列所組成之群組的化學基團：炔丙基、羥甲基、環外胺、炔丙胺和炔丙基羥基。在一個實施態樣中，該可裂解的部 位核心係選自由下列所組成之群組：、和，R1和R2係獨立地選自烷基。在一個實施態樣中，L1係選自由下列所組成之群組：-CONH(CH2)x-、-CO-O(CH2)x-、-CONH-(OCH2CH2O)x-、-CO-O(CH2CH2O)x-和-CO(CH2)x-，其中x為0至10，但更佳為從1至6。在一個實施態樣中，L2係選自由下列所組成之群組：-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xCONH(CH2CH2O)y(CH2)zNH-、和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自獨立地選自0至10，但更佳為從1至6。在一個實施態樣中，該標識物係選自由下列所組成之群組：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：，其中該標識物為染料。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： 。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的去氧核苷三磷酸：其中B為核鹼基。
在一個實施態樣中，本發明關於包含DNA聚合酶及至少一種去氧核苷三磷酸之套組，該去氧核苷三磷酸包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子、以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O。在一個實施態樣中，該核鹼基為天然核鹼基類似物。在一個實施態樣中，該核苷之核鹼基為非天然。在一個實施態樣中，該核苷之非天然核鹼基係選自包含下列之群組：7-去氮雜 鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。
在一個實施態樣中，本發明關於包含核酸模板連同與該模板雜交之引子、DNA聚合酶及至少一種去氧核苷三磷酸之反應混合物，該去氧核苷三磷酸包含核鹼基、標識物和糖、在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子，該糖包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O，其中該核苷另外包含與該核苷之核鹼基共價結合之可檢測標識物。
在一個實施態樣中，本發明關於進行DNA合成反應之方法，其包含步驟a)提供核酸模板連同與該模板雜交之引子、DNA聚合酶、至少一種去氧核苷三磷酸，該去氧核苷三磷酸包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子與以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O，及b)使該反應混合物接受能使DNA聚合酶催化引子延伸反應的條件。在一個實施態樣中，該DNA聚合酶催化引子延伸反應為定序反應的一部分。在一個實施態樣中，該可檢測標識物係藉由暴露於還原劑而自該核鹼基移除。不意欲使本發明受限於一種型式的還原劑。可使用能夠還原二硫化物鍵之任何適合的還原劑實施本發明。在一個實施態樣中，還原劑為膦[12]，例如三苯基膦、三丁基膦、三羥甲基膦、三羥丙基膦、三乙氧羰基膦(TCEP)[13，14]。在一個實施態樣中，該還原劑為TCEP。在一個實施態樣中，該可檢測標識物及3'-OCH2- SS-R基團係藉由暴露於攜有硫醇之化合物而自該核鹼基移除[15]，以進行以二硫為底質之連結子及終止(保護)基團的裂解，此等含硫醇化合物包括(但不限於)半胱胺酸、半胱胺、二硫琥珀酸、二硫蘇糖醇、2,3-二巰基-1-丙烷磺酸鈉鹽、二硫丁胺[16]、內消旋-2,5-二巰基-N,N,N',N'-四甲基己二醯胺、2-巰基乙烷磺酸酯和N,N'-二甲基,N,N'-雙(巰基乙醯基)-肼[17]。反應可以內含的硒醇(selenol)進一步催化[18]。另外，亦可出於此目的而使用硼氫化物，諸如硼氫化鈉[19](以及抗壞血酸[20])。另外，亦已知用於二硫化物鍵裂解之酶方法，諸如二硫化物和硫還原酶，且可由本發明化合物使用[21]。
在一個實施態樣中，本發明關於分析DNA序列之方法，其包含步驟：a)提供核酸模板連同與該模板雜交之引子，以形成引子/模板雜交複合物，b)加入DNA聚合酶及第一去氧核苷三磷酸，該第一去氧核苷三磷酸包含核鹼基、在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子與以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O，c)使該反應混合物接受能使DNA聚合酶催化引子延伸反應的條件，以產生經改質之引子/模板雜交複合物，及d)檢測在該經改質之引子/模板雜交複合物中的該去氧核苷三磷酸之該第一可檢測標識物。在一個實施態樣中，該方法另外包含步驟：e)自該經改質之引子/模板雜交複合物移除該可裂解的保護基及隨意地移除該可檢測標識物，及f)重複步驟b)至e)至少一次。在一個實施態樣中，可裂解的含 二硫甲醛連結子為疏水性且具有大於0之logP值。在一個實施態樣中，可裂解的含二硫甲醛連結子為疏水性且具有大於0.1之logP值。在一個實施態樣中，可裂解的含二硫甲醛連結子為疏水性且具有大於1.0之logP值。在一個實施態樣中，該方法另外包含在重複步驟b)期間添加第二去氧核苷三磷酸，其中該第二去氧核苷三磷酸包含第二可檢測標識物，其中該第二可檢測標識物不同於該第一可檢測標識物。在一個實施態樣中，該第二去氧核苷三磷酸之核鹼基不同於該第一去氧核苷三磷酸之核鹼基。在一個實施態樣中，在步驟b)中使用至少4個經不同標識於3'-O之經二硫甲烷封端之去氧核苷三磷酸化合物的混合物，該去氧核苷三磷酸化合物代表A、G、C和T或U之類似物。在一個實施態樣中，在步驟b)中使用至少4個經不同標識於3'-O之經二硫甲烷封端之去氧核苷三磷酸化合物的該混合物，該化合物具有下列結構： 在一個實施態樣中，亦用於步驟b)中的該混合物另外包含具有下列結構的未經標識於3'-O之經二硫甲烷封端之去氧核苷三磷酸化合物：、、和。在一個實施態樣中，步驟e)係藉由將該經改質之引子/模板雜交複合物暴 露於還原劑來進行。在一個實施態樣中，該還原劑為TCEP。在一個實施態樣中，該可檢測標識物係藉由暴露於攜有硫醇之化合而自該核鹼基移除，以進行以二硫為底質之連結子及終止(保護)基團的裂解，此等含硫醇化合物包括(但不限於)半胱胺酸、半胱胺、二硫琥珀酸、二硫蘇糖醇、2,3-二巰基-1-丙烷磺酸鈉鹽、二硫丁胺、內消旋-2,5-二巰基-N,N,N',N'-四甲基己二醯胺、2-巰基-乙烷磺酸酯和N,N'-二甲基,N,N'-雙(巰基乙醯基)-肼。
不意欲使本發明受限於特定的定序平台。然而，較佳的儀器為QIAGEN's GeneReader DNA定序系統(GR)。在一個實施態樣中，DNA序列係以合成定序(SBS)方法測定。在一個實施態樣中，每一定序循環係由八個步驟所組成：延伸(Extend)1、延伸2、清洗1、添加成像溶液、成像、清洗2、裂解及清洗3。成像循環期間收集的數據係以得到誤差率、產出值及適用的定相校正值之分析軟體處理。
可設想以相同或類似的方法可能改進一般其他的SBS平台(亦即在類似的條件下操作的任何以合成定序方法)以及特定的SBS平台之性能，諸如來自Illumina之HiSeq和miSeq平台；Roche 454；Ion Torrent PGM和Proton平台；及PacificBio平台。
不意欲使本發明僅受限於一種型式的定序。在一個實施態樣中，該去氧核苷三磷酸(包含核鹼基、標識物與糖、在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子，該 糖包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O)可用於焦磷酸定序中。
在一個實施態樣中，本發明關於包含核鹼基與糖之去氧核苷三磷酸，該核鹼基包含經由可裂解的二硫甲醛連結子附著之可檢測標識物，該糖包含以包含二硫甲烷基團作為可裂解的保護基封端之3'-O。在一個實施態樣中，該核苷係在與聚合酶之混合物中。在一個實施態樣中，該核苷之核鹼基為非天然。在一個實施態樣中，該核苷之非天然核鹼基係選自包含下列之群組：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在一個實施態樣中，包含二硫甲烷基團之該基團具有式-CH2-SS-R，其中R係選自包含下列之群組：烷基和經取代之烷基。在一個實施態樣中，該混合物另外包含引子。在一個實施態樣中，該引子係與核酸模板雜交。在一個實施態樣中，該可檢測標識物為螢光標識物。在一個實施態樣中，將該核酸模板固定。
在一個實施態樣中，本發明關於製備3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷之方法，其包含：a)提供5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷，其中該5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷包含核鹼基與糖，及ii)甲基硫甲基供體；及b)在產生3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷的條件下處理該5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷。在一個實施態樣中，該甲基硫甲基供體為DMSO。在一個實施態樣 中，該條件包含酸性條件。在一個實施態樣中，該5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷包含在該核苷的核鹼基上之保護基。在一個實施態樣中，該3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷係以管柱層析術純化。
在一個實施態樣中，本發明關於製備3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷之方法，其包含：a)提供i)3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷，及ii)R-SH，其中R包含烷基或經取代之烷基；及b)在產生3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷的條件下處理該3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷。在一個實施態樣中，該R-SH為乙硫醇。在一個實施態樣中，該條件包含鹼性條件。
在一個實施態樣中，本發明關於製備3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷之方法，其包含：a)提供3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷；及b)在產生3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷的條件下處理該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷。在一個實施態樣中，該條件包含將該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷暴露於NH4F。
在一個實施態樣中，本發明關於製備3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷之三磷酸根的方法，其包含：a)提 供3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷；及b)在產生3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷之三磷酸的條件下處理該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷。在一個實施態樣中，該條件包含將該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷暴露於(MeO)3PO與POCl3及Bu3N。在一個實施態樣中，該方法另外包含步驟c)移除該核鹼基保護基。在一個實施態樣中，該保護基包含N-三氟乙醯基-胺基炔丙基保護基。在一個實施態樣中，該N-三氟乙醯基-胺基炔丙基保護基係藉由溶劑分解而移除，以產生5'-O-(三磷酸根)-3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5-(胺基炔丙基)-2'-去氧核苷。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於其中結構如下之化合物：。
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中R係選自由下列所組成之群組：烷基、經取代之烷基、烯丙基、經取代之烯丙基；B為核鹼基；A為附著基團；C為可裂解的部位核心；L1和L2為連接基團；及Label為標識物。 在一個實施態樣中，該核鹼基為選自由下列所組成之群組的非天然核鹼基類似物：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在一個實施態樣中，該附著基團A為選自由下列所組成之群組的化學基團：炔丙基、羥甲基、環外胺、炔丙胺和炔丙基羥基。在一個實施態樣中，該可裂解的部位核心係選自由下列所組成之群組：、和，其中R1和R2係獨立地選自烷基。在一個實施態樣中，其中L1係選自由下列所組成之群組：-CONH(CH2)x-、-COO(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x為0至10，但是更佳為從1至6。在一個實施態樣中，其中L2係選自由下列所組成之群組：-NH-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)yO(CH2)zNH-、-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自獨立地選自0至10，但是更佳為從1至6。在一個實施態樣中，該標識物係選自由下列所組成之群組：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：，其中該標識物為染料，且其中R係選自由下列所組成之群組：烷基、經取代之烷基、烯丙基、經取代之烯丙基。在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構： ，其中該標識物為染料。
在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：
在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：
在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中D係選自由下列所組成之群組：疊氮化物(-N3)、二硫化烷基(-SS-R)和經二硫化物取代之烷基，B為核鹼基，A為附著基團，C為可裂解的部位核心，L1和L2為連接基團，及Label為標識物。在一個實施態樣中，該核鹼基為天然核鹼基。在一個實施態樣中，該核鹼基為選自由下列所組成之群組的非天然核鹼基類似物：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在一個實施態樣中，該附著基團(A)為選自由下列所組成之群組的化學基團：炔丙基、羥甲基、環外胺、炔丙胺和炔丙基羥基。在一個實施態樣中，該可裂解的(C)部位核心係選自由下列所組成之群組：、、和，其中R1和 R2係獨立地選自烷基。在一個實施態樣中，該可裂解的部位核心係選自由下列所組成之群組：、和，其中R1和R2係獨立地選自烷基。在一個實施態樣中，L1係選自由下列所組成之群組：-CONH(CH2)x-、-CO-O(CH2)x-、-CONH-(OCH2CH2O)x-、CO-O(CH2CH2O)x-和-CO(CH2)x-，其中x為0至100。在一些實施態樣中，x為0至10，但是更佳為從1至6。在一個實施態樣中，L2係選自由下列所組成之群組：、-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xCONH(CH2CH2O)y(CH2)zNH-和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-，其中x、y和z各自獨立地選自0至10，但是更佳為從1至6。在一個實施態樣中，L2係選自由下列所組成之群組：-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-、其中x、y和z各自獨立地選自0至100。在一個實施態樣中，x、y和z各自獨立地選自0至10，但是更佳為從1至6。在一個實施態樣中，該標識物係選自由下列所組成之群組：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物：。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸 對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物：。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物：在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物：。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物：。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 。在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物： 在一個實施態樣中，化合物具有下列結構及其他類似的核苷酸對應物：
在一個實施態樣中，本發明設想未經標識之化合物。 在一個實施態樣中，該化合物具有下列結構：，其中R係選自由下列所組成之群組：烷基、經取代之烷基、烯丙基、經取代之烯丙基；及B為核鹼基。在一個實施態樣中，化合物具有結構(B又為核鹼基)：。在一個實施態樣中，化合物具有結構(B又為核鹼基)：。在一個實施態樣中，化合物具有結構(B又為核鹼基)：。在一個實施態樣中，化合物具有結構(B又為核鹼基)： 。在一個實施態樣中，化合物具有結構(B又為核鹼基)：。在一個實施態樣中，該核鹼基為選自由下列所組成之群組的非天然核鹼基類似物：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。
在一個實施態樣中，本發明關於使用3'-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇核苷作為中間物及DMTSF和二甲基二硫作為硫來源來合成3'-OCH2-SSMe核苷酸類似物之方法，如圖43中所示。
在一個實施態樣中，本發明關於根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：，其中D係選自由下列所組成之群組：疊氮化物、二硫化烷基、經二硫化物取代之烷基、二硫化烯丙基和經二硫化物取代之烯丙基；B為核鹼基；連結子包含可裂解的含二硫甲醛部位核心。在一個實施態樣中，該可裂解的部位核心係選自由下列所組成之群組：、、和，其中R1和R2係獨立地選自烷基；及 Label為標識物。在一個實施態樣中，該連結子為疏水性。在一個實施態樣中，該連結子具有大於0之logP值。在一個實施態樣中，該連結子具有大於0.1之logP值。在一個實施態樣中，該連結子具有大於0.5之logP值。在一個實施態樣中，該連結子具有大於1.0之logP值。
定義
為了加速瞭解本發明，在下文定義許多術語。本文所定義之術語具有熟習本發明相關領域之一般技術者共同瞭解的義意。諸如〝a〞、〝an〞及〝the〞之術語不意欲指為僅單一實體，但包括可用於例證之特定實例的一般類別。使用本文術語學說明本發明特定的實施態樣，但是彼等的使用不限定本發明，除了在申請專利範圍中所概述以外。
如本文所使用的〝氫〞意指-H；〝羥基〞意指-OH；〝酮基〞意指=O；〝鹵基〞係獨立地意指-F、-Cl、-Br或-I；〝胺基〞意指-NH2(參見下文關於含有術語胺基之基團(例如烷基胺基)的定義)；〝羥胺基〞意指-NHOH；〝硝基〞意指-NO2；〝亞胺基〞意指=NH(參見下文關於含有術語亞胺基之基團(例如烷基亞胺基)的定義)；〝氰基〞意指-CN；〝疊氮基〞意指-N3；〝巰基〞意指-SH；〝硫基〞意指=S；〝磺醯胺基〞意指-NHS(O)2-(參見下文關於含有術語磺醯胺基之基團(例如烷基磺醯胺基)的定義)； 〝磺醯基〞意指-S(O)2-(參見下文關於含有術語磺醯基之基團(例如烷基磺醯基)的定義)；及〝矽基〞意指-SiH3(參見下文關於含有術語矽烷基之基團(例如烷基矽基)的定義)。
如本文所使用的〝亞甲基〞意指其中碳原子與兩個氫原子鍵結之化學種類。-CH2-基團被認為是標準的亞甲基。在鏈或環中的亞甲基促成其大小及親脂性。在此上下文中，去氧基亦指亞甲基。2,3-去氧基化合物特別與2,3-亞甲基相同(2,3-亞甲基醣苷=2,3-二去氧基醣苷)。
關於下文基團的下列括號下標進一步如下定義基團：〝(Cn)〞定義在基團中實際的碳原子數目(n)；〝(Cn)〞定義可在基團內的碳原子最大數目(n)；(Cn-n')定義在基團內的碳原子最小數目(n)及最大數目(n')二者。例如，〝烷氧〞代表具有從1至10個碳原子(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個或可於其中衍生的任何範圍(例如3-10個碳原子))的那些烷氧基。同樣地，〝烷基(C2-10)〞代表具有從2至10個碳原子(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個或可於其中衍生的任何範圍(例如3-10碳原子))的那些烷基。
當不以〝經取代〞修飾物使用時，則術語〝烷基〞係指具有飽和碳原子作為附著點、直鏈或支鏈、環、環狀或非環狀結構、無碳-碳雙鍵或參鍵及沒有除了碳和氫以外的原子之非芳族單價基團。基團-CH3(Me)、-CH2CH3(Et)、-CH2CH2CH3(n-Pr)、-CH(CH3)2(iso-Pr或i-Pr)、-CH(CH2)2(環丙基) 、-CH2CH2CH2CH3(n-Bu)、-CH(CH3)CH2CH3(二級丁基或Sec-Bu)、-CH2CH(CH3)2(異丁基或i-Bu)、-C(CH3)3(三級丁基或t-Bu)、-CH2C(CH3)3(新戊基)、環丁基、環戊基、環己基、環己基甲基為烷基的非限制性實例。術語〝經取代之烷基〞係指具有飽和碳原子作為附著點、直鏈或支鏈、環、環狀或非環狀結構、無碳-碳雙鍵或參鍵及至少一個原子獨立地選自由N、O、F、Cl、Br、I、Si、P和S所組成之群組的非芳族單價基團。下列的基團為經取代之烷基的非限制性實例：-CH2OH、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2SH、-CF3、-CH2CN、-CH2C(O)H、-CH2C(O)OH、-CH2C(O)OCH3、-CH2C(O)NH2、-CH2C(O)NHCH3、-CH2C(O)CH3、-CH2OCH3、-CH2OCH2CF3、-CH2OC(O)CH3、-CH2NH2、-CH2NHCH3、-CH2N(CH3)2、-CH2CH2Cl、-CH2CH2OH、-CH2CF3、-CH2CH2OC(O)CH3、-CH2CH2NHCO2C(CH3)3和-CH2Si(CH3)3。
術語〝可裂解的二硫甲醛連結子〞及〝可裂解的含二硫甲醛連結子〞意謂著表明連結子包含二硫甲醛基團且不被認為僅受限於二硫甲醛基團，反而是可含有不僅是該基團的連結子，例如參見圖25中的化合物。同樣地，術語〝二硫甲醛部位核心〞及〝含二硫甲醛部位核心〞意謂著表明部位核心包含二硫甲醛且不被認為僅受限於二硫甲醛基團，反而是可含有不僅是該基團的連結子。
術語〝核酸〞通常係指DNA或RNA二者，不論其是否為擴增、經合成產生、RNA之反轉錄產物或天然生成之產物。核酸通常為單或雙鏈分子且由天然生成核苷酸所 組成。雙鏈核酸分子可具有3'-或5'-突出端且確切而言不需要或假定在其整個長度上完全為雙鏈。此外，核酸可由非天然生成核苷酸及/或對天然生長核苷酸之修飾物所組成。在本文列示出實例，但不限於：分別以5'或3'核苷酸之磷酸化以容許接合或防止外核酸酶降解/聚合酶延伸；用於共價和近共價附著之胺基，硫醇，炔或生物素修飾物；螢光團和猝滅劑；在核苷酸之間的硫代磷酸酯、膦酸甲酯，胺基磷酸酯和磷酸三酯鍵聯以防止降解；甲基化；及經修飾之鹼基或核苷，諸如去氧肌苷、5-溴-dU、2'-去氧尿苷、2-胺基嘌呤、2',3'-二去氧胞苷、5-甲基-dC、鎖定核酸(LNA's)、iso-dC和-dG鹼基、2'-O-甲基RNA鹼基和經氟修飾之核苷。
術語〝互補〞通常係指在適當的溫度和離子緩衝條件下在兩個核苷酸的鹼基之間形成有利的熱力學穩定性和特異性配對之能力。此配對取決於各核苷酸的氫鍵結特性。其最基本的實例為胸嘧啶/腺嘌呤與胞嘧啶/鳥嘌呤鹼基之間的氫鍵對。在本發明中，用於擴增靶核酸之引子可與靶核酸分子在其整個長度上為完全互補或為〝半互補〞二者，其中引子含有最低能夠或不能夠與靶核酸雜交之額外的非互補序列。
術語〝雜交〞通常係指在與彼等之核苷酸序列一致的不同核酸分子之間的鹼基配對。術語〝雜交〞及〝黏合(anneal)〞可互換使用。
術語〝寡核苷酸〞通常係指典型地經設計為單鏈 DNA且長度小於75個核苷酸的核酸序列。
術語〝引子〞通常係指能夠與核酸序列黏合或雜交且容許在充份的條件下(緩衝液、dNTP、聚合酶、單和二價鹽、溫度等等)延伸核酸至互補的引子之寡核苷酸。
術語〝模板核酸〞、〝模板分子〞、〝靶核酸〞及〝靶分子〞可交換使用且係指核酸分子，其為可隨意地以定序反應辨識以得出其序列信息之擴增反應的對象。模板核酸可為以克隆擴增方法所產生的核酸且其可以固定在固體表面上，亦即固定在珠粒或陣列上。
術語〝核苷〞係指由連結至糖(例如核糖或去氧核糖)的C-1'碳之鹼基所組成的化合物。核苷之鹼基部分通常為雜環鹼，例如嘌呤或嘧啶。
術語〝核苷酸〞係指作為單體單元或在聚核苷酸內的核苷之磷酸酯。〝核苷5'-三磷酸〞係指具有附著至糖5'-碳位置的三磷酸酯基團之核苷酸且有時以〝NTP〞、〝dNTP〞(2'-去氧核苷三磷酸或去氧核苷三磷酸)及〝ddNTP〞(2',3'-二去氧核苷三磷酸或二去氧核苷三磷酸)表示。〝核苷5'-四磷酸〞係指具有附著至糖5'-碳位置的四磷酸酯基團之替代的活化核苷酸。PA-核苷酸係指炔丙基類似物。
如說明書及/或申請專利範圍中所使用的術語〝保護基〞係在習知的化學意義上用作為可逆地使官能基在所欲反應的特定條件下不反應的基團，且經瞭解其不為H。在所欲反應之後，可移除保護基而使經保護之官能團去保 護。在較佳的實施態樣中，所有的保護基應在不使欲合成分子以相當比例降解的條件下可移除(且因此為不穩定的)。保護基亦可稱為〝封端基團〞或〝阻斷基團〞或〝可裂解的保護基〞。應註明為了方便起見而以保護基保護的官能度亦可顯示或稱為保護基的一部分。在本文所述之核苷酸衍生物的上下文中，保護基係用在於3'位置上。不意欲使本發明受限於定序中所使用的可逆式終止核苷酸上的此保護基之本性或化學。出於此目的而設想各種保護基，包括但不限於：3'-O-疊氮甲基核苷酸、3'-O-胺氧基核苷酸、3'-O-烯丙基核苷酸；及二硫化物核苷酸、3'-O-疊氮烷基、3'-O-二硫甲基烷基、3'-O-二硫甲基芳基、3'-O-乙醯基、3'-O-肼甲酸酯(carbazate)、3'-O-烷基醚、3'-O-烷基酯、3'-O-醛肟(-O-N=CH-R)、3'-O-酮肟(-O-N=C(R,R'))。
本發明之一個實施態樣設想經由保護基的官能化作用而使標記物直接附著至核苷酸的3'-OH官能上。
術語〝標識物〞或〝可檢測標識物〞以其廣義而言係指可檢測或容許與其相關聯的檢測之任何部分或性質。例如，包含標識物的核苷酸、寡或聚核苷酸是可檢測的。經標識之寡或聚核苷酸理想地准許檢測雜交複合物，特別在經標識之核苷酸以酶方式併入引子與模板核酸的該雜交複合物之後。標識物可共價地或非共價地附著至核苷酸、寡或聚核苷酸。在各種態樣中，標識物可另外或組合地：(i)提供可檢測信號；(ii)與第二標識物交互作用以修飾由 第二標識物所提供的可檢測信號，例如FRET；(iii)穩定雜交，例如雙顯體形成；(iv)賦予補獲功能，例如疏水親和性、抗體/抗原、離子複合；或(v)改變物理性質，諸如電泳移動性、疏水性、溶解性或層析行為。標識物在彼等的結構上及彼等的作用機制上有廣泛的變化。標識物的實例包括但不限於螢光標識物、非螢光標識物、比色標識物、化學發光標識物、生物發光標識物、放射活性標識物、質量修飾基團、抗體、抗原、生物素、半抗原、酶(包括例如過氧化酶、磷酸酶等等)及類似者。為了進一步例證，螢光標識物可包括螢光素家族的染料、玫瑰紅家族的染料、花青家族的染料或薰草素、噁(oxazine)、硼二氮雜苯並二茚(boradiazaindacene)或彼等的任何衍生物。螢光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。玫瑰紅家族的染料包括例如德克薩斯紅(Texas Red)、ROX、R110、R6G和TAMRA。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G和TAMRA在市場上取自例如Perkin-Elmer,Inc.(Wellesley,Mass.,USA)，德克薩斯紅在市場上取自例如Life技術(Molecular Probes,Inc.)(Grand Island,N.Y.)。花青家族的染料包括例如CY2、CY3、CY5、CY5.5和CY7且在市場上取自例如GE Healthcare Life Sciences(Piscataway,N.J.,USA)。
如本文所使用的術語〝經不同標識之〞係指具有不同的標識物之可檢測標識物，而不是在經標識之核苷核鹼基 上的不同位置所發現之標識物。
術語〝A、G、C和T或U之類似物〞係指經修飾之去氧核苷三磷酸化合物，其中去氧核苷之核鹼基非常類似於對應之核苷去氧腺苷、去氧鳥苷、去氧胞苷和去氧胸苷或去氧尿苷。在可檢測的經標識之去氧核苷三磷酸化合物的例子中，A或去氧腺苷之類似物可以代表。在可檢測的經標識之去氧核苷三磷酸化合物的例子 中，G或去氧鳥苷之類似物可以代表。 在可檢測的經標識之去氧核苷三磷酸化合物的例子中，C或去氧胞苷之類似物可以代表。在可檢測的經標識之去氧核苷三磷酸化合物的例子中，T或U或 去氧胸苷或去氧尿苷之類似物可以代表。額外的核鹼基可包括：選自由下列所組成之群組的非天然核鹼基：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基,7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。在類似物的例子中，可檢測標識物亦可包括在核鹼基與該可檢測標識物之間的連結子分段。
術語〝TCEP〞或〝三(2-羧乙基)膦〞係指經常用於生化及分子生物應用之還原劑。其時常經製備成具有286.65克/莫耳之分子量的鹽酸鹽(TCEP-HCl)且以該鹽酸鹽使用。其可溶於水中且在中性pH下以穩定的溶液取得，且固定在瓊脂糖載體上以加速還原劑移除。不意欲使本發明受限於一種型式的還原劑。可使用能夠還原二硫化物鍵之任何適合的還原劑實施本發明。在一個實施態樣中，還原劑為膦[12]，例如三苯基膦、三丁基膦、三羥甲基膦、三羥丙基膦、三乙氧羰基膦(TCEP)[13，14]。不意欲使本發明受限於使用TCEP。在一個實施態樣中，該可檢測標識物及3'-OCH2-SS-R基團係藉由暴露於攜有硫醇基團之化合物而自該核鹼基移除，以進行以二硫為底質之連結子及終止(保護)基團的裂解，此等含硫氫基化合物包括(但不限於)半胱胺酸、半胱胺、二硫琥珀酸、二硫蘇糖醇、2,3-二巰基-1-丙烷磺酸鈉鹽、二硫丁胺、內消旋-2,5-二巰基-N,N,N',N'-四甲基己二醯胺、2-巰基-乙烷磺酸酯和N,N'-二甲基,N,N'-雙(巰基乙醯基)-肼[17]。反應可以內含的硒醇進一步催化[18]。另外，亦可出於此目的而使用硼氫化物，諸如硼氫化鈉[19](以及抗壞血酸[20])。另外，亦已知用於二硫化物鍵裂解之酶方法，諸如二硫化物和硫還原酶，且可由本發明化合物使用[21]。
併入且構成說明書一部分的所附圖形例證本發明之許 多實施態樣且與發明內容一起用於解釋本發明之原理。圖形僅以例證本發明較佳的實施態樣為目的且不應被解釋成限制本發明。
圖1顯示具有以包含二硫甲烷之基團封端的3'-O之核苷三磷酸的實例，其中R代表烷基，諸如甲基、乙基、異丙基、三級丁基、正丁基或彼等之類似物，具有含有雜原子(諸如O、N、S等等)之取代基。
圖2顯示具有3'-O之含二硫甲烷保護基之核苷三磷酸的經標識之類似物，其中標識物係經由可裂解的二硫甲醛連結子(-OCH2-SS-)附著至核鹼基。類似物為(自左上端順時針方向)去氧腺苷、去氧胸苷或去氧尿苷、去氧胞苷和去氧鳥苷。
圖3顯示3'-O保護基以還原劑(諸如TCEP)去保護之逐步機制。
圖4顯示裂解反應產物，傳統的經硫化物及經二硫甲醛連結的經標識之核苷酸。
圖5顯示經標識之核苷酸的實例，其中可裂解的連結子之間隔子包括炔丙醚連結子。類似物為(自左上端順時針方向)去氧腺苷、去氧胸苷或去氧尿苷、去氧胞苷和去氧鳥苷。
圖6顯示經標識之核苷酸的實例，其中可裂解的連結子之間隔子包括炔丙胺連結子。類似物為(自左上端順時針方向)去氧腺苷、去氧胸苷或去氧尿苷、去氧胞苷和去氧鳥苷。
圖7顯示經標識之核苷酸的實例，其中可裂解的連結子之間隔子包括在嘧啶之5-位置上及在嘌呤之7-去氮雜碳上直接附著至核鹼基的亞甲基(-(CH2)n-。此連結子可為亞甲基(n=1)或聚亞甲基(n>1)，其中在裂解之後，連結子在核鹼基之附著點上產生-(CH2)nOH基團，及其中L1和L2代表間隔子，且取代基R1、R2、R3和R4為提供可裂解的連結子穩定性之原子基團，如先前所述。類似物為(自左上端順時針方向)去氧腺苷、去氧胸苷或去氧尿苷、去氧胞苷和去氧鳥苷。
圖8顯示未經標識之dT類似物(化合物5)之合成。
圖9顯示3'-O-(乙基二硫甲基)-dCTP(10)之合成。
圖10顯示對經標識之dT中間物具有特異性的經標識之核苷酸的合成途徑。
圖11顯示自1,4-丁二醇開始的可裂解的連結子合成。
圖12顯示可裂解的連結子之另一變型，其中穩定之偕二甲基係附著至可裂解的連結子之α-碳。
圖13顯示可裂解的連結子之合成，其中二硫化物係以偕二甲基側面相接且附著至可撓性乙二醇連結子(PEG)。連結子係經由胺甲酸酯基團(-NH-C(=O)O-)附著至PA-核苷酸。所得核苷酸類似物在此例子中可如化合物35(dUTP類似物)。
圖14顯示用於dATP類似物之可裂解的連結子之合成，其中可裂解的二硫化物係以偕二甲基側面相接且連結 子係經由尿素基團(-NH(C=O)NH-)附著至PA-核苷酸。其他的核苷酸類似物(例如dCTP、dGTP、dUTP之類似物)可藉由在反應順序的最後步驟以適當的PA類似物代替42而以類似方式合成。
圖15顯示可裂解的連結子化合物45之合成，其中連結子係經由尿素官能度繫於PA-核苷酸且二硫化物係由兩個碳連結子連接至染料。所得核苷酸類似物在此例子中可如化合物49(dGTP類似物)。其他的核苷酸類似物(例如dATP、dUTP、dCTP之類似物)可藉由在反應順序的第三步驟以適當的PA類似物代替核苷酸46而以類似方式合成。
圖16顯示當經標識之核苷酸50在65℃下暴露於10當量TCEP時，其產生許多副產物(包括化合物52)與預期的產物51。
圖17顯示在292nm(底端)與524nm(頂端)提取及在5分鐘暴露後分析之化合物50的經TCEP暴露之產物的LC-MS軌跡，其中在11.08分鐘之峰對應於化合物51，在10.88分鐘之峰對應於化合物52及其他的峰對應於副產物。
圖18顯示在292nm(底端)與524nm(頂端)提取及在15分鐘暴露後分析之化合物50的經TCEP暴露之產物的LC-MS軌跡；其中在11.32分鐘之峰對應於化合物51及其他的峰對應於副產物。
圖19顯示經二硫甲醛連結之核苷酸35在相同的裂解 條件下完全地產生所欲裂解產物化合物53和54。連結子之亞甲硫醇片段(-CH2SH)在二硫化物基團裂解時完全自核苷酸消除。
圖20顯示在292nm(底端)與524nm(頂端)提取及在5分鐘暴露後分析之化合物35的經TCEP暴露之產物的LC-MS軌跡，其中在11.24分鐘之峰對應於化合物53及在34.70分鐘之峰對應於化合物54。
圖21顯示在292nm(底端)與524nm(頂端)提取及在15分鐘暴露後分析之化合物35的經TCEP暴露之產物的LC-MS軌跡，其中在11.25分鐘之峰對應於化合物53及在34.70分鐘之峰對應於化合物54。
圖22顯示在適當的步驟以甲硫醇或硫甲醇鈉代替巰基乙醇(EtSH)的3'-OCH2-SS-Me類似物之合成，其不同於3'-OCH2-SS-Et之合成(圖10)。
圖23顯示PA-核苷酸(例如57)與適當的可裂解的-OCH2-SS-連結子偶合及最後使用活化連結子32與螢光團染料偶合。
圖24顯示以不同的連結子達成的核苷酸類似物化合物60和61。
圖25顯示經不同的螢光團報導基團標識之4-核苷酸類似物的結構，其中R=Me-或Et-。
圖26顯示經不同的螢光團報導基團標識之4-核苷酸類似物的結構，其中R=Me-或Et-基團。
圖27顯示經不同的螢光團報導基團標識之4-核苷酸 類似物的結構，其中R=Me-或Et-基團。
圖28顯示包含本發明之新穎可裂解的連結子之一般通用的建造區塊結構。PG=保護基，L1，L2-連結子(脂族、芳族、混合型極性直鏈或支鏈)。RG=反應性基團。在本發明之一個實施態樣中，此等建造區塊攜有在連結子之一端的Fmoc保護基及在另一端的反應性NHS碳酸酯或胺甲酸酯。這較佳的組合在包含新穎可裂解的連結子的經修飾之核苷酸合成中特別有用。保護基應在與核酸/核苷酸化學可相容的條件下可移除且反應性基團應具有選擇性。在連結子上的活性NHS基團與胺終止之核苷酸反應之後，Fmoc基團可使用鹼(諸如哌啶或氨)輕易地移除，因此暴露在用於附著可裂解的標記物之連結子的終端上之胺基。包含各種標記物之化合物庫可非常快速地以此方式建構。
圖29顯示攜有經由本發明之新穎連結子附著之可裂解的標記物之核苷酸的通用結構。S=糖(亦即核糖、去氧核糖)，B=核鹼基，R=H或可逆式終止基團(保護基)。較佳的可逆式終止基團包括但不限於：疊氮甲基(-CH2N3)、二硫烷基(-CH2-SS-R)、胺氧基(-ONH2)。
圖30顯示攜有經由本發明之可裂解的連結子附著之可裂解的標記物之核苷酸的另一通用結構，其中D係選自包含下列之群組：疊氮化物、二硫化烷基和經二硫化物取代之烷基，B為核鹼基，A為附著基團，C為可裂解的部位核心，L1和L2為連接基團，及Label為標識物(在具有 標識物之化合物中)。
圖31顯示在圖32A-C中所測試之化合物的化學結構(L系列(96)、B系列(97)、A系列(98)和G系列(99)家族)。
圖32A顯示併入具有以各種二硫化物為底質之可裂解的連結子：L系列(96)、B系列(97)、A系列(98)和G系列(99)家族的標識於3'-O-疊氮甲基Alexa488之核苷酸類似物的時間過程。
圖32B顯示併入以各種二硫化物為底質之可裂解的連結子：L系列(96)、B系列(97)、A系列(98)和G系列(99)家族的標識於3'-O-疊氮甲基Alexa488之核苷酸類似物的反應速率。
圖32C顯示併入以各種二硫化物為底質之可裂解的連結子：L系列(96)、B系列(97)、A系列(98)和G系列(99)家族的標識於3'-O-疊氮甲基Alexa488之核苷酸類似物的反應速率對核苷酸濃度。
圖33顯示dA 3'-可逆式終止核苷酸：-CH2-N3、-CH2-SS-Et、-CH2-SS-Me之併入動力學(incorporation kinetics)。
圖34顯示具有3'-O-CH2-SS-Et終止基團之dC 3'-可逆式終止核苷酸與3種不同的DNA聚合酶：T9、J5和J8之併入動力學。
圖35顯示在GR序列器上的延伸A反應所使用的核苷酸之最優化濃度[nM]。
圖36顯示如以原始誤差率所測量的A系列(98)核苷 酸之定序性能。
圖37顯示如以完美(無誤差)讀數百分比所測量的A系列(98)核苷酸之定序性能。
圖38顯示如以各種定序度量所測量的A系列(98)核苷酸之定序性能。
圖39顯示如以原始誤差率所測量的G系列(99)核苷酸之定序性能。
圖40顯示定如以完美(無誤差)讀數百分比所測量的G系列(99)核苷酸之定序性能。
圖41顯示在ExtB中及在ExtB和A二者中來自含有3'-O-CH2-SS-Et核苷酸之定序操作的多重條形碼之鑑定。
圖42顯示在具有各種可裂解的連結子：B=B系列(97)、G=G系列(99)、A=A系列(98)和SS=L系列(96)的經標識之可逆式終止dC的延伸A緩衝液中於升溫下的穩定性比較。
圖43顯示例證自化合物62合成化合物63-67之合成圖。此合成說明於實施例33、實施例34和實施例35中。
圖44顯示例證自化合物68合成化合物69-73之合成圖。此合成說明於實施例36、實施例37和實施例38中。
圖45顯示從頂端至底端之對應於dCTP、dTTP、dATP和dGTP的四種經標識之核苷酸的完全化學結構(A系列，98)。
圖46顯示GR儀器上定序所使用的核苷酸(經標識之化合物72、74、76、78)及未經標識之(化合物120、126、132、138)的樣品濃度，所有皆在彼等的3'上攜有-CH2-SS-Me作為可逆式終止基團。
圖47顯示使用全部皆攜有-CH2-SS-Me之新穎核苷酸(如圖46所說明的經標識及未經標識)在GR上定序操作所產生的強度之實例。
圖48顯示具有以包含二硫甲烷甲基之基團封端的3'-O之核苷三磷酸的一系列無連結子之實例。
圖49顯示具有以包含二硫甲烷甲基之基團封端的3'-O之經四種不同的螢光團報導基團標識之4-核苷酸類似物的結構。
圖50為顯示合成常見的連結子之NHS活化形式的一個實施態樣之示意圖。
圖51為顯示合成MeSSdATP的一個實施態樣之示意圖。
圖52為顯示合成MeSSdCTP的一個實施態樣之示意圖。
圖53為顯示合成MeSSdGTP的一個實施態樣之示意圖。
圖54為顯示合成MeSSdTTP的一個實施態樣之示意圖。
圖55為顯示合成MeSSdATP-PA的一個實施態樣之示意圖。
圖56為顯示合成147的一個實施態樣之示意圖。
圖57為顯示合成MeSSdCTP-PA的一個實施態樣之示意圖。
圖58為顯示合成156的一個實施態樣之示意圖。
圖59為顯示合成MeSSdGTP-PA的一個實施態樣之示意圖。
圖60為顯示合成MeSSdGTP-ARA-Cy5的一個實施態樣之示意圖。
圖61為顯示合成MeSSdUTP-PA的一個實施態樣之示意圖。
圖62為顯示合成175的一個實施態樣之示意圖。
圖63為顯示3'-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP的結構之示意圖。
圖64為顯示自3'-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP合成3'-(OCH2SSMe)-dNTP的一個實施態樣之示意圖。
圖65顯示用於合成3'-(OCH2SSMe)-dNTP-PA之關鍵中間物。
圖66為顯示自3'-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP-PA合成3'-(OCH2SSMe)-dNTP-PA的一個實施態樣之示意圖。
圖67為顯示連結子設置及螢光染料共軛之示意圖。
圖68顯示可用於附著本發明之連結子及終止基團的羥甲基衍生物核鹼基衍生物的結構。R=可逆式終止基 團，CL=本發明之可裂解的連結子。
圖69顯示在進行裂解後之羥甲基衍生物核鹼基衍生物的結構。
圖70顯示攜有硫醇之化合物的實例，該官能可用於進行本發明以二硫為底質之連結子及終止基團的裂解：A)-半胱胺，B)-二硫琥珀酸，C)-半胱胺，D)-二硫蘇糖醇，E)-2,3-二巰基-1-丙烷磺酸鈉鹽，F)-而硫丁胺，G)-內消旋-2,5-二巰基-N,N,N',N'-四甲基己二醯胺，H)2-巰基乙烷磺酸酯，I)-N,N'-二甲基,N,N'-雙(巰基乙醯基)-肼。
圖71顯示連結子及3'-保護基之選擇性及逐步裂解的實例-化學結構及反應流程。
圖72顯示連結子之選擇性及逐步裂解的實例-與裂解的各步驟相關之層析圖。
圖73顯示連結子之選擇性及逐步裂解的實例-自對應於選擇性裂解反應的所有步驟之峰提取之吸收光譜。
圖74顯示在3'上攜有二硫保護基及攜有以二硫為底質之連結子的核苷酸之裂解反應流程。
圖75A顯示以RP-HPLC分析之起始材料及在以裂解試劑：二硫琥珀酸、L-半胱胺酸、DTT和半胱胺培育10分鐘後的反應混合物之層析圖。
圖75B顯示如以RP-HPLC分析之反應混合物的組成物。
本發明的說明
本發明提供利用去氧核苷三磷酸之方法、組成物、混合物及套組，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置及可逆式連接至該去氧核苷之核鹼基的可檢測標識物。此等化合物提供未來定序技術之新的可能性，包括但不限於以合成定序。本發明設想在說明書及圖形主體中所示之各種結構作為主題之組成。該等組成可用於反應中，包括但不限於引子延伸反應。該等組成可在混合物中。例如，經標識之核苷酸中之一或多者(例如那些在圖25中所示)可在與一或多種未經標識之核苷酸(例如那些在圖48中所示)之混合物中。彼等可在與其他試劑(例如緩衝液、聚合酶、引子等等)的套組中。
在一個實施態樣中，本發明的經標識之核苷酸需要許多合成步驟且包含連結各種染料至不同的鹼。希望能夠以模式化方式而不以逐步法進行連結子及染料附著。模式化方法包含預建造在一端具有保護基的連結子部分及在另一端的活化基團。接著可使用此等預建造之連結子與炔丙胺核苷酸偶合；接著可使遮蔽之胺基去保護及接著偶合活化基團。這與逐步合成法相比而具有更少的步驟及更高的產率之優點。
在一個實施態樣中，本發明的經標識之核苷酸係用於DNA定序中。DNA定序為生物學中的基礎工具。其為基礎研究、生物醫學、診斷和法醫應用中及在許多其他的基 礎與應用研究領域中廣泛地使用的方法。新一代的DNA定序技術正在改變按慣例進行的生物學研究方式。在未來幾年內在精確的醫藥、伴隨的診斷等等領域中準備扮演關鍵角色。
以合成定序(SBS)為革命性新一代定序(NGS)技術，其中數百萬的DNA分子、單一分子或其成簇分子可同時定序。此技術的基礎為使用已知為可裂解的核苷酸終止子的經修飾之核苷酸，其容許在固體表面上的DNA分子之僅單一鹼基延伸及檢測，容許在DNA定序中的巨量並行運算(massive parallelism)(綜合性評論：Cheng-Yao,Chen之Frontiers in Microbiology,2014,5,1[22]；Fei Chen等人之Genomics Proteomics Bioinformatics,2013,11,34-40[5]；C.W.Fuller等人之Nature Biotechnology,2009,27,1013[2]；M.L.Metzker之Nature Reviews,2010,11,31[1])-將全部特此併入本文以供參考。
具有以併入DNA引子及後續的檢測後可以化學反應移除之可裂解的保護基阻斷之3'-OH位置的經修飾之核苷酸為SBS化學成功的關鍵(Ju等人之US 7,883,869,2011[23]；Ju等人之US 8,088,575,2012[24]；Ju等人之US 8,796,432,2014[25]；Balasubramanian之US 6,833,246,2004[26]；Balasubramanian等人之US 7785796B2,2010[27]；Milton等人之US 7,414,116 B2,2008[28]；Metzker,M.L.等人之核酸s Res,1994,22：4259-4267[29]；Ju等人之Proc.Nat.Acad,Sci.USA,103(52), 19635,2006[30]；Ruparel等人之Proc.Nat.Acad,Sci.USA,102(17),5932,2005[31]；Bergmann等人之US 2015/0140561 A1[32]；Kwiatkowski之US 2002/0015961 A1[33])-將全部特此併入本文以供參考。
亦曾嘗試開發已知為實質的終止子之核苷酸類似物，其中3'-OH未經保護，但鹼基係以修飾基團防止在單一鹼基併入DNA模板後進一步延伸，強迫發生鏈終止事件的此一方式修飾(Andrew F.Gardner等人之NucleicAcidsRes 40(15),7404-7415 2012[34]，Litosh等人之Nuc.Acids,Res.,2011,vol 39,No.6,e39[35]，Bowers等人之Nat.方法，2009,6,593[36])-將全部特此併入本文以供參考。
亦揭示核糖核苷酸類似物，其中2'-OH係以可移除的基團保護，其防止相鄰的3'-OH基團參與鏈延伸反應，從而在單一鹼基延伸後停止(Zhao等人之US 8,399,188 B2,2013[37])，併入本文以供參考。
另一方面，Zon提出使用二核苷酸終止子，其含有以可移除的基團阻斷之3'-OH的核苷酸之一(Gerald Zon之US 8,017,338 B2,2011[38])，併入本文以供參考。
先前已使用可裂解的二硫化物連結子(-SS-)附著螢光染料於經標識之核苷酸中，用於GeneReader定序。咸信-SH痕跡在裂解步驟後留在生長的DNA菌株上，引起許多限制達成更長的讀取長度的副反應。
已知-SH殘留物可在裂解步驟中所使用的TCEP存在 下經歷游離基反應，產生非所欲官能基且有可能傷害DNA分子(MS,Zhouxi Wang等人之Desulfurization of Cysteine-Containing Peptides Resulting from Sample Preparation for Protein Characterization,Rapid Commun Mass Spectrom,2010,24(3),267-275[39])。
-SH痕跡亦可與進入的核苷酸在流動細胞內交互作用，使3' OH保護基過早裂解，引起進一步的鏈延長且由此可引起信號移相。
不利的-SH副反應之最終結果為在定序操作中降低讀取長度及增加誤差率。
本發明之詳細說明
本發明提供利用去氧核苷三磷酸之方法、組成物、混合物及套組，該去氧核苷三磷酸包含以包含二硫甲烷作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O位置及可逆式連接至該去氧核苷之核鹼基的可檢測標識物。此等化合物提供未來定序技術之新的可能性，包括但不限於以合成定序。
在一個實施態樣中，本發明包含在DNA定序(例如以合成定序)中的經標識之核苷三磷酸之合成及用途，該經標識之核苷三磷酸包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子，具有包含具有式-CH2-SS-R之二硫甲烷作為保護基的3'-O基團，其中R代表烷基，諸如甲基、乙基、異丙基、三級丁基、正丁基或彼等之類似物，具有含有雜原子(諸如O、N、S等等)之取代基(參見圖1)。在一 個實施態樣中，R基團可含有可調節3'-O封端基團之穩定性及可裂解性且為DNA聚合酶可接受之官能基。
在另一態樣中，本發明關於經標識之核苷三磷酸，其包含在標識物與核鹼基之間可裂解的二硫甲醛連結子，具有以包含二硫甲烷之基團封端的3'-O位置，其中核鹼基可為天然或非天然鹼基，其可藉由氫鍵與DNA模板之天然核鹼基的交互作用而形成DNA雙顯體，且其可為dG和dA及2-胺基-dA之7-去氮雜類似物。dA和dG之7-去氮雜類似物可由於缺少7-N原子而降低DNA三級結構的形成。在一個實施態樣中，展望此等核苷有可能藉由提高DNA模板與聚合酶交互作用來改進DNA定序讀取長度。亦有可能可使2-胺基-dA增加DNA雙顯體穩定性，由於與其互補鹼形成更穩定的3個氫鍵(而非天然狀態的2個氫鍵)，因此可降低在定序操作期間損失DNA引子的風險(A Jung等人之Mol.Pathol.,2002,55(1),55-57[40]；2-amino-dATP：Igor V.Kutyavin,Biochemistry,2008,47(51),13666-73[41])。
在另一實施態樣中，該核苷酸可具有經由可裂解的連結子-OCH2SS-連結至核鹼基之可檢測的報導子分子(諸如螢光染料)。其中-OCH2-SS-基團直接附著至核鹼基且使用其作為可裂解的連結子的經標識之核苷酸不為先前技術所知。與傳統的廣泛地使用之二硫化物連結子(-SS-)相反，此類別之可裂解的連結子(-OCH2-SS-)在還原裂解後未在DNA分子上留下硫痕跡，藉由所得中間物-OCH2-SH的快 速水解而完全地轉化成-OH基團。因為此原因，所以此等連結子可為比傳統的二硫化物連結子更好的替代物。在傳統的以二硫化物為底質之連結子(-SS-)中，所得硫醇基團(-SH)在以還原試劑(諸如TCEP)裂解時可經歷副反應，如下列圖4中所呈示(參考：MS,Zhouxi Wang等人之Desulfurization of Cysteine-Containing Peptides Resulting from Sample Preparation for Protein Characterization,Rapid Commun Mass Spectrom,2010,24(3),267-275[39])。
在另一實施態樣中，報導子基團可附著至5-C位置上的嘧啶鹼基(dT，dC)及天然鹼基之7-N或去氮雜類似物之7-C上的嘌呤鹼基(dA，dG)。
在另一實施態樣中，經標識之核苷酸的結構可如圖5中所示，其中可裂解的連結子之間隔子包括炔丙醚連結子。具有炔丙醚之核鹼基可依照化學合成的先前技術來合成。L1和L2代表化學間隔子，且取代基R1、R2、R3和R4為調節可裂解的連結子穩定性及可裂解性之原子基團。彼等可為氫原子、偕二甲基或任何烷基、苯基或經取代之烷基，諸如甲基、乙基、正丁基、苯基等等。彼等亦可含有具有-O、=O、NH、-N=N、酸、醯胺、聚乙二醇鏈(PEG)等等的烴鏈。在核苷酸上的標識物可為螢光染料、能量轉移染料、放射活性標識物、化學發光探針、庚烷和容許以化學或物理方法檢測之其他形式的標識物。
在另一實施態樣中，經標識之核苷酸的結構可如圖6 所示。可裂解的連結子之間隔子包括炔丙胺連結子。再者，L1和L2代表間隔子，且取代基R1、R2、R3和R4為提供連結子穩定性及調節連結子可裂解性之原子基團，如先前所述。彼等可為氫原子、烷基(諸如甲基、乙基)和其他經取代之基團或彼等之鹽。不意欲受到任何理論的束縛，咸信在可裂解的二硫化物連結子之α-碳上的偕二烷基(例如根據下列結構的偕二甲基類似物：)提供連結子更好的穩地性，容許經標識之核苷酸的模式化合成。經推測其防止在以二硫化物為底質之有機化合物之間普遍不成比例的反應。亦增加對連結子更大的疏水性，有助於經標識之核苷酸類似物的合成及純化[42-44]。咸信在連結子中存在的偕二甲基官能度不僅適合在電子上穩定二硫化物鍵，且亦防止分子間及分子內二者發生二硫化物交換，有可能經由立體效應。已證實在終止子上的二硫化物官能度係在胱胺的存在下參與二硫化物交換，而配備有偕二甲基的連結子不然。在圖42中的連結子研究比較具有及不具有偕二甲基的連結子。可從此研究觀察出不具有偕二甲基的連結子G和L與胱胺快速交換，導致產物降解。如預期，既未以吾等選擇之連結子A，亦未以類似的連結子B觀察到此現像。另外，因為經標識之核苷酸含有兩個二硫化物，一個在分子的終止子上及一個在分子的連結子部分上，咸信此穩定效應防止在染料與終止子之間發生亂序。此穩定性對吾等的核苷酸之定序性能具有重要性。
在另一實施態樣中，經標識之核苷酸的結構可如圖7所示。可裂解的連結子之間隔子包括在嘧啶之5-位置上及在嘌呤之7-去氮雜碳上直接附著至核鹼基的亞甲基(-(CH2)n-。此連結子可為亞甲基(n=1)或聚亞甲基(n>1)，其中在裂解之後，連結子產生在核鹼基之附著點上的-(CH2)nOH基團，及其中L1和L2代表間隔子，且取代基R1、R2、R3和R4為提供可裂解的連結子穩定性之原子基團，如先前所述。
在另一實施態樣中，本發明關於所主張之核苷酸的合成方法。封端基團及連結子可以例如修改所述之先前技術而合成，未經標識之dT類似物(化合物5)可如圖8中所示合成。
在一個實施態樣中，本發明包含：(a)具有以包含二硫甲烷(例如式-CH2-SS-R)作為可裂解的保護基之基團封端的3'-O之核苷三磷酸(參見圖1)；及(b)彼等經標識之類似物(參見圖2)，其中標識物係經由可裂解的二硫甲醛連結子(-OCH2-SS-)附著至核鹼基。此等核苷酸可用於以合成定序(SBS)核酸之技術中。亦說明用於所主張之核苷酸的合成方法。
在一個實施態樣中，如圖1中所示，未經標識之核苷酸的通用結構具有以包含具有常見結構-CH2-SS-R的二硫甲烷之基團保護的3'-O基團，其中R可為正規烷基或經取代之烷基，諸如-Me、-Et、-nBu、-tBu、-CH2CH2NH2、-CH2CH2NMe等等，及B可為天然或非天然核鹼基。非天 然核鹼基的一些特定實例為7-去氮雜dG和dA、2-胺基-dA等等。
在圖2中，經標識之類似物的通用結構顯示具有如圖1以包含二硫甲烷之基團保護的3'-O，除此以外，可檢測的報導子(標識物)(諸如螢光團)係經由具有通用結構-L1-OCH2-SS-L2-之可裂解的連結子附著至核鹼基。分別以L1代表分開核鹼基與可裂解的連結子之分子間隔子，而L2代表在可裂解的連結子與標識物之間的分子間隔子。L1和L2二者可具有適合於連接各個化學實體的官能基，諸如-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N、-N=N-等等。標識物可為螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素、半抗原等等。在不同的核苷酸上用於同時檢測多重鹼基之標識物可能不同，或用於逐步檢測在固體表面上經空間分開的寡核苷酸或彼等擴增之克隆的標識物可能相同。
在一個實施態樣中，本發明關於新類別的核苷酸，其具有以-CH2-SS-R基團封端的3'-O及通過具有通用結構-O-CH2-SS-之可裂解的連結子附著至核鹼基之標識物。此等封端基團及連結子可藉由以TCEP或相關的化學品之單一處理而同時完全地裂解，未在DNA分子上留下硫軌跡。
此類別的核苷酸可具有足以賦予以熱活性聚合酶催化之核苷酸併入DNA模板上所需之相對高溫(~65℃)的穩定性，卻又具有在DNA可相容的條件下足以裂解(諸如以 TCEP等等還原)的不穩定性。在一些實施態樣中，裂解可藉由暴露於二硫蘇糖醇來實現。
當暴露於還原劑(諸如TCEP)時，則核苷酸係經由圖3中所示之逐步機制進行3'-O保護基之去封端，因此恢復3'-OH基團的天然狀態。已知TCEP及其類似物對SBS應用中不可或缺的生物分子是有利的。
在一個實施態樣中，本發明關於如圖28中所示之包含新穎可裂解的連結子之一般通用的建造區塊結構。PG=保護基，L1，L2-連結子(脂族、芳族、混合型極性直鏈或支鏈)。RG=反應性基團。在本發明之一個實施態樣中，此等建造區塊攜有在連結子之一端的Fmoc保護基及在另一端的反應性NHS碳酸酯或胺甲酸酯。這較佳的組合在包含新穎可裂解的連結子的經修飾之核苷酸合成中特別有用。保護基應在與核酸/核苷酸化學可相容的條件下可移除且反應性基團應具有選擇性。在連結子上的活性NHS基團與胺終止之核苷酸反應之後，Fmoc基團可使用鹼(諸如哌啶或氨)輕易地移除，因此暴露在用於附著可裂解的標記物之連結子的終端上之胺基。包含各種標記物之化合物庫可非常快速地以此方式建構。
在一個實施態樣中，本發明關於攜有經由新穎連結子附著之可裂解的標記物之核苷酸的通用結構，如圖29所示。S=糖(亦即核糖、去氧核糖)，B=核鹼基，R=H或可逆式終止基團(保護基)。較佳的可逆式終止基團包括但不限於：疊氮甲基(-CH2N3)、二硫烷基(-CH2-SS-R)、胺 氧基(-ONH2)。
實施例
提供下列的實施例以證明及進一步例證本發明某些較佳的實施態樣及態樣，且不應被解釋為限制其範圍。
實施例1
3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧胸苷(2)之合成
將5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧胸苷(1)(2.0克，5.6毫莫耳)在250毫升圓底燒瓶中溶解於由DMSO(10.5毫升)、乙酸(4.8毫升)及乙酸酐(15.4毫升)所組成的混合物中且在室溫下攪拌48小時。接著將混合物以加入K2CO3飽和溶液淬滅，直到停止放出氣態CO2為止。接著混合物使用分液漏斗以EtOAc(3X100毫升)萃取。接著將合併的萃取物在分溶漏斗中以NaHCO3飽和溶液(2X150毫升)清洗且將有機層經Na2SO4乾燥。將有機部分以旋轉蒸發濃縮。最後將反應混合物以矽膠管柱層析術純化(Hex：EtOAc/7：3至1：1)，參見圖8。獲得成為白色粉末的3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧胸苷(2)，75%產率(1.75克，Rf=0.6，hex：EtOAc/1：1)。1H-NMR(CDCl3)：δH 8.16(s,1H),7.48(s,1H),6.28(m,1H),4.62(m,2H),4.46(m,1H),4.10(m,1H),3.78-3.90(m,2H),2.39(m,1H),2.14,2.14(s,3H),1.97(m,1H),1.92 (s,3H),0.93(s,9H)及0.13(s,3H)ppm。
實施例2
3'-O-(乙基二硫甲基)-2'-去氧胸苷(4)之合成
將在高真空下經隔夜乾燥之化合物2(1.75克，4.08毫莫耳)溶解在20毫升無水CH2Cl2中，加入Et3N(0.54毫升，3.87毫莫耳)及5.0克分子篩-3A，且在Ar氛圍下攪拌30分鐘。接著將反應燒瓶放在冰浴上，使溫度到達零度以下，且緩慢地加入1.8當量於CH2Cl2中的1M SO2Cl2(1.8毫升)且在相同的溫度下攪拌1.0小時。接著移除冰浴使溫度到達室溫，加入在4毫升無水DMF中的硫代甲苯磺酸鉀(1.5克)之溶液且在室溫下攪拌0.5小時。
接著加入2當量EtSH(0.6毫升)且再攪拌40分鐘。接著將混合物以50毫升CH2Cl2稀釋且在漏斗中通過矽藻土-S過濾。將樣品以適量的CH2Cl2清洗，以確保產物濾出。接著將CH2Cl2萃取物濃縮且以層析術在矽膠管柱上純化(Hex：EtOAc/1：1至1：3，在Hex：EtOAc/1：1中的Rf=0.3)。接著所得粗製產物以在20毫升MeOH中的2.2克NH4F處理。在36小時之後，將反應以20毫升飽和NaHCO3淬滅且以CH2Cl2經分溶萃取。將CH2Cl2部分經Na2SO4乾燥且以層析術純化(Hex：EtOAc/1：1至1：2)，參見圖8。獲得成為白色粉末的純化產物(4)，18%產率，0.268克，Rf=0.3,Hex：EtOAc/1：2)。
在CDCl3中的1H NMR：δH 11.25(1H,S),7.65 (1H,S),6.1(1H,m),5.17(1H,m),4.80(2H,S),4.48(1H,m),3.96(1H,m),3.60(2H,m),3.26(3H,s),2.80(2H,m),2.20(2H,m)及1.14(3H,m)ppm。
實施例3
3'-O-(乙基二硫甲基)-2'-去氧胸苷三磷酸(5)之合成
在配備有橡膠隔膜的25毫升燒瓶中，將質子海綿(210毫克)加入化合物4(0.268克，0.769毫莫耳)中。將樣品在高真空下經隔夜乾燥。接著將材料在氬氛圍下溶解在2.6毫升(MeO)3PO中。接著將配備有Ar氣供應的燒瓶放在冰浴上，以攪拌使溫度到達零度以下。接著立即以注射器加入1.5當量POCl3且在相同的溫度下及在氬氛圍下攪拌2小時。接著移除冰浴，且製備由焦磷酸三丁基銨(1.6g)及Bu3N(1.45毫升)於無水DMF(6毫升)中所組成的混合物。立即加入整個混合物且攪拌10分鐘。接著反應混合物以TEAB緩衝液(30毫升，100mM)稀釋且在室溫下再攪拌3小時。將粗製產物以旋轉蒸發濃縮且以C18 Prep HPLC純化(方法：0至5分鐘100%A，接著以至多50%B之梯度經72分鐘，A=50mM TEAB及B=乙腈)。在目標份冷凍乾燥之後，將半純度產物以使用PL-SAXPrep管柱的離子交換HPLC進一步純化(方法：0至5分鐘100%A，接著以至多70%B之梯度經70分鐘，其中A=在水中的15%乙腈，B=在15%乙腈中的0.85M TEAB緩衝液)。最後以如上文所述之C18 Prep HPLC進行 純化，得到~25%產率之化合物5，參見圖8。
實施例4
N4-苯甲醯基-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-3'-O-(甲基硫甲基)-2'去氧胞苷(7)之合成
3'-O-(乙基二硫甲基)-dCTP(10)之合成係根據圖9達成。將N4-苯甲醯基-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧胞苷(6)(50.0克，112.2毫莫耳)在2公升圓底燒瓶中溶解於DMSO(210毫升)中。接著加入乙酸(210毫升)及乙酸酐(96毫升)且在室溫下攪拌48小時。在這段時間內，以TLC觀察到完全轉化成產物(Rf=0.6，以EtOAc：hex/10：1用於產物)。
將混合物分成兩個相等份，將每一份轉移至2000毫升燒杯中且以緩慢地加入K2CO3飽和溶液中止，直到停止放出CO2氣體為止(pH 8)。接著將混合物在分液漏斗中以EtOAc萃取。接著將有機部分以NaHCO3飽和溶液(2X1公升)清洗，接著以蒸餾水(2X1公升)清洗，接著將有機部分經Na2SO4乾燥。
接著將有機部分以旋轉蒸發濃縮。接著將產物以使用puriflash管柱之矽膠快速管柱層析術純化(Hex：EtOAc/1：4至1：9，在15um，HC 300克puriflash管柱上3次管柱操作)，獲得成為灰色粉末的N4-苯甲醯基-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-3'-O-(甲基硫甲基)-2'-去氧胞苷(7)，60%產率(34.0克，Rf=0.6，EtOAc：hex/9：1)，參見圖9。
化合物7之1H-NMR(CDCl3)：δH 8.40(d,J=7.1Hz,1H),7.93(m,2H),7.64(m,1H),7.54(m,3H),6.30(m,1H),4.62 & 4.70(2Xd,J=11.59Hz,2H),4.50(m,1H),4.19(m,1H),3.84 & 3.99(2Xdd,J=11.59 & 2.79Hz,2H),2.72(m,1H),2.21(m,1H),2.18(s,3H),0.99(s,9H)及0.16(s,6H)ppm。
實施例5
N4-苯甲醯基-3'-O-(乙基二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧胞苷(8)
將溶解在無水CH2Cl2(35毫升)中的N4-苯甲醯基-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-3'-O-(甲基硫甲基)-2'-去氧胞苷(7)(2.526克，5.0毫莫耳)加入分子篩-3A(10克)。將混合物攪拌30分鐘。接著加入Et3N(5.5毫莫耳)且在冰鹽水浴上攪拌20分鐘。接著使用注射器緩慢地加入在CH2Cl2中的1M SO2Cl2(7.5毫升，7.5毫莫耳)且在相同的溫度下及在N2氛圍下攪拌2小時。接著加入在8毫升無水DMF中的苯硫代磺酸鈉鹽(1.6克，8.0毫莫耳)且在室溫下攪拌30分鐘。最後加入EtSH(0.74毫升)且在室溫下再攪拌50分鐘。將反應混合物通過矽藻土-S過濾，且以CH2Cl2洗出產物。在濃縮所得CH2CH2部分之後，將其以使用矽膠管柱之快速層析術純化(1：1至3：7/Hex：EtOAc)，獲得化合物8，54.4%產率(1.5克)，參見圖9。化合物8之1H-NMR(CDCl3)：δH 8.40(m,1H),7.95(m,2H),7.64(m, 1H),7.54(m,3H),6.25(m,1H),4.69 & 4.85(2Xd,J=11.60Hz,2H),4.50(m,1H),4.21(m,1H),3.84 & 3.99(2Xdd,J=11.59 & 2.79Hz,2H),2.75(m,3H),2.28(m,1H),1.26(m,3H),0.95(s,9H)及0.16(s,6H)ppm。
實施例6
N4-苯甲醯基-3'-O-(乙基二硫甲基)-2'-去氧胞苷(9)
將N4-苯甲醯基-3'-O-(乙基二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧胞苷(8，1.50克，2.72毫莫耳)溶解在50毫升THF中。接著在冰冷卻溫度下及在氮氛圍下加入在THF中的1M TBAF(3.3毫升)。將混合物在室溫下攪拌1小時。接著將反應以加入1毫升MeOH淬滅且以旋轉蒸發10分鐘後移除溶劑。將產物以使用梯度1：1至1：9/Hex：EtOAc之矽膠快速層析術純化，得到化合物9(0.78克，65%產率，在1：9/Hex：EtOAc中的Rf=0.6)，參見圖9。化合物9之1H-NMR(CDCl3)：δH 8.41(m,1H),8.0(m,2H),7.64(m,2H),7.50(m,2H),6.15(m,1H),4.80 & 4.90(2Xd,J=11.60Hz,2H),4.50(m,1H),4.21(m,1H),4.00 & 3.85(2Xdd,J=11.59 & 2.79Hz,2H),2.80(m,2H),2.65(m,1H),2.40(m,1H)及1.3(s,3H)ppm。
最後，化合物10之合成係依照合成化合物5(參見圖8)所述之標準合成方案而自化合物9達成。
實施例7
經標識之核苷酸的合成可依照圖10和圖11中所示之 合成途徑達成。圖10特別用於合成經標識之dT中間物，且可同樣地合成其他的類似物。
5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-5-(N-三氟乙醯基-胺基炔丙基)-2'-去氧尿苷(12)之合成
將5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-5-碘-2'-去氧尿苷(11，25.0克，53.4毫莫耳)在2頸圓底燒瓶中溶解於無水DMF(200毫升)中。將反應燒瓶以Ar氣填充之氣球吹洗。接著加入新鮮開口式真空乾燥之肆(三苯基膦)苯(0)(6.16克，5.27毫莫耳)及CuI(2.316克，12.16毫莫耳)且在室溫下及在氬氛圍下攪拌10分鐘。接下來依序加入N-三氟乙醯基炔丙胺(23.99克，157.8毫莫耳，2.9當量)及Et3N(14.7毫升，105.5毫莫耳)。將混合物在室溫下攪拌3.0小時且以TLC確認完全反應(在用於產物之EtOAc：Hex/3：2中的Rf=0.5)。
接著以旋轉蒸發移除溶劑。將所得粗製產物溶解在500毫升EtOAc中且轉移至分液漏斗中。接著將有機部分分別以飽和NaHCO3(2X400毫升)及飽和NaCl(2X400毫升)溶液清洗。接著將EtOAc部分經無水Na2SO4乾燥。在濾除Na2SO4鹽之後，將過濾物使用旋轉蒸發器濃縮。在與3X40克矽膠結合後，接著以矽膠快速層析術純化(1：1之Hex：EtOAc至2：3之Hex：EtOAc，200克，15um HP puriflash管柱，3次管柱操作)，得到21.994克12(83.88%產率)，參見圖10。
在化合物12中的1H-NMR(DMF-d7)：δH 11.65(brs, 1H),10.15(brs,1H),8.15(brs,1H,H6),6.37(t,J=5.99Hz,1H,H1'),5.42(m,1H),4.41(m,1H),4.37(brs,2H，炔丙胺基之NH-CH2),4.00(m,1H),3.84-3.97(m,2H),2.30(m,1H,H2'),2.20(m,1H,H2'),0.97(s,9H,3X-CH3,TBDMS)及0.19(s,6H,2X CH3,TBDMS)ppm。
實施例8
5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-3'-O-(甲基硫甲基)-5-(N-三氟乙醯基-胺基炔丙基)-2'-去氧尿苷(13)之合成
將化合物12(21.99克，44.77毫莫耳)在1000毫升圓底燒瓶溶解於DMSO(90毫升)中。接著依序加入AcOH(40毫升)及乙酸酐(132毫升)且在室溫下攪拌48小時。以TLC確認完全反應(Rf=0.5；用於產物之Hex：EtOAc/1：1)。
接著將反應混合物轉移至2,000毫升燒杯中且以飽和K2CO3中和，直到停止放出CO2氣體為止(~pH 8.0)。接著將混合物轉移至分液漏斗中且萃取(2X500毫升CH2Cl2)。將合併的有機部分以飽和NaHCO3(1X500毫升)清洗且經Na2SO4乾燥。在濾除Na2SO4之後，將有機部分以旋轉蒸發濃縮且以矽膠快速層析術純化(Hex：EtOAc/7：3至1：1)，得到12.38克化合物13(~50%產率)，參見圖10。TLC：Rf=0.5；Hex：EtOAc/1：1，化合物13之1H-NMR(DMSO-d6)：δH 11.69(s,1H),10.01(s,1H),7.93(s,1H,H6),6.07(m,1H,H1'),4.69(m,2H),4.38(m,1H),4.19 (m,2H),4.03(m,1H),3.75(m,2H),2.34(m,1H),2.14(m,1H),2.07(s,3H),0.86(s,9H)及0.08(s,6H)ppm。
化合物14、15和16之合成可依照用於化合物5和10所述之相關步驟的合成方案達成。其他的N-三氟乙醯基胺基炔丙基核鹼基之合成係如美國專利8,017,338中所述[38]，併入本文以供參考。移除N-三氟乙醯基以產生胺基炔丙基核鹼基可藉由在溫和條件下的溶劑分解而得到[45]。
另一方面，可裂解的連結子合成可如圖11中所示而達成，該合成係自1,4-丁二醇開始且說明於實施例9中。
實施例9
4-O-(三級丁基二苯基矽基)-丁烷-1-O-(甲基硫甲基)，18之合成
將在1公升燒瓶中溶解於100毫升無水吡啶中的18.3克1,4-丁二醇，17(18.3克，203.13毫莫耳)在氮氛圍下於冰浴上到達零下溫度。以注射器緩慢地加入三級丁基二苯基矽基氯(TBDPSCl，19.34克，70.4毫莫耳)。容許反應燒瓶以移除冰浴而溫熱至室溫且持續在室溫下攪拌隔夜。接著以旋轉蒸發移除溶劑且以快速層析術使用矽膠管柱純化(7：3至1：1/Hex：EtOAc)，得到4-O-(三級丁基二苯基矽基)-丁烷-1-醇(13.7克，59.5%產率，以1：1/Hex：EtOAc之Rf=0.7，1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(4H,m),7.40(4H,m),3.75(2H,m),3.65(m,2H),3.70(4H,m)及1.09(9H, m)ppm。將6.07克(18.5毫莫耳)所得產物溶解在90毫升無水DMSO，參見圖11。接著加入乙酸(15毫升)及乙酸酐(50毫升)。將混合物在室溫下攪拌20小時。接著轉移至分液漏斗且以300毫升蒸餾水清洗，以相同體積的EtOAc分溶。接著將EtOAc部分轉移至1,000毫升燒杯中且以K2CO3飽和溶液中和。將水性部分以分溶移除，且接著將EtOAc部分以蒸餾水(3X300毫升)進一步清洗且經MgSO4乾燥。接著將EtOAc部分濃縮且以快速層析術在矽膠管柱上純化(Hex：EtOAc/97：3至90：10)，獲得4-O-(三級丁基二苯基矽基)-1-O-(甲基硫甲基)-丁烷，18(5.15克，71.7%產率，在9：1/Hex：EtOAc中之Rf=0.8)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(4H,m),7.40(6H,m),4.62(2H,s),3.70(2H,m),3.50(2H,m),2.15(2H,s),1.70(4H,m)及1.08(9H,m)ppm。
實施例10
化合物19之合成
將化合物18(2.0克，5.15毫莫耳)溶解在40毫升無水CH2Cl2中且加入10克分子篩-3A及0.78毫升Et3N(5.66毫莫耳)。將混合物在N2氣下及在室溫下攪拌30分鐘。接著將燒瓶放在冰浴上，使溫度到達零度以下。接著緩慢地加入7.7毫升1M SO2Cl2/CH2Cl2溶液(7.7毫莫耳)且在N2下攪拌1小時。接著移除冰浴，加入在8毫升DMF中的苯硫代磺酸Na鹽(1.6克，8.24毫莫耳)且在室 溫下攪拌30分鐘。接著加入在7毫升無水DMF中的4-巰基苯基乙酸(1.73克，10.3毫莫耳，2.0當量)且攪拌2小時。接著將整個粗製樣品通過矽藻土-S過濾且以EtOAc洗出產物。接著將EtOAc萃取物以旋轉蒸發濃縮且在矽膠管柱上純化(1：1至3：7/Hex：EtOAc)，獲得1.19克化合物19，43%產率，參見圖11，Rf=0.5，Hex：EtOAc/3：7。1H NMR(CDCl3)：7.65(4H,m),7.55(2H,m),7.45(6H,m),7.20(2H,s),4.80(2H,m),3.65(4H,m),3.50(2H,m),1.60(4H,m)及1.09(9H,s)ppm。
實施例11
化合物20之合成
將溶解在20毫升無水DMF中的化合物19(0.6克，1.11毫莫耳)在室溫下以DSC(0.426克，1.5當量)及Et3N(0.23毫升)處理且在氮氛圍下攪拌1.5小時。接著製備由在5毫升DMF中的11-疊氮基-3,6,9-三氧雜癸-1-胺(2.0當量)及Et3N(2.0當量)所組成的混合物。將整個溶液立即加入反應混合物中且攪拌1小時。接著在真空下移除溶劑且以矽膠快速層析術使用梯度0至10%之CH2Cl2：MeOH純化，獲得化合物20，36%產率(0.297克，Rf=0.8，10%MeOH：CH2Cl2)，參見圖11。1H NMR(MeOH-d4)：δH 7.70(4H,m),7.55(2H,m),7.40(6H,m),7.45(2H,m),4.85(2H,s),3.65-3.30(22H,m),1.65(4H,m)及1.09(9H,m)ppm。
接著將產物20(0.297克)在燒瓶中溶解於7毫升無水THF中且放在冰浴上，在氮氛圍下到達零下溫度。接著在冰冷卻溫度下逐滴加入0.6毫升在THF中的1M TBAF且攪拌3小時。將混合物以1毫升MeOH淬滅，以旋轉蒸發移除揮發物且以快速層析術純化，獲得165毫克產物21，參見圖11，1H NMR(MeOH-d4)：δH 7.55(2H,m),7.25(2H,m),4.85(2H,s),3.75-3.30(22H,m)及1.50(4H,m)ppm。此產物可使用點擊化學與經炔取代之染料偶合及使用CDI作為活化劑與核苷酸偶合，得到化合物22。
可裂解的連結子之另一變型可依照圖12達成，其中穩定之偕二甲基係附著至可裂解的連結子之α-碳。
實施例12
在另一態樣中，可裂解的連結子可為化合物30，其中二硫化物係以偕二甲基側面相接且附著至可撓性乙二醇連結子(PEG)。連結子係經由胺甲酸酯基團(-NH-C(=O)O-)附著至PA-核苷酸(例如化合物33)。所得核苷酸類似物在此例子中可如化合物35(dUTP類似物)，其可根據圖13合成。其他的核苷酸類似物(例如dATP、dGTP、dCTP之類似物)可藉由在反應順序的最後步驟以適當的PA-核苷酸類似物代替PA-核苷酸33而以類似方式合成。
實施例13
化合物28之合成
將用於合成化合物18)的化合物18(15.53克，40毫莫耳)(參見實施例9)在圓底燒瓶中溶解於450毫升無水二氯甲烷中。加入分子篩(3Å，80克)及三乙胺(5.6毫升)且將反應混合物在0C下及在氮氛圍下攪拌0.5小時。接下來以注射器緩慢地加入SO2Cl2(在DCM中的1M溶液，64毫升)且在0℃溫度下攪拌1.0小時。接著移除冰水，立即加入在20毫升無水DMF中的硫代甲苯磺酸鉀(10.9克，48.1毫莫耳)之溶液且在室溫下攪拌20分鐘。接著將反應混合物倒入在2公升圓底燒瓶中溶解於20毫升DMF中的3-巰基-3-甲基丁-1-醇(4.4毫升，36毫莫耳)中。將所得混合物在室溫下攪拌0.5小時且通過矽藻土過濾。將產物以乙酸乙酯萃取。將合併的有機萃取物在分液漏斗中以蒸餾水清洗，接著將粗製產物以旋轉蒸發濃縮。以快速層析術在矽膠上使用EtOAc：己烷作為移動相純化之後獲得產物(28)，26%產率(5.6克)，參見圖13。1H NMR(CDCl3)：δH 7.67-7.70(m,4H),7.37-7.47(m,6H),4.81(s,2H),3.81(t,J=6.73Hz,2H),3.70(t,J=6.21Hz,2H),3.59(t,J=6.55,2H),1.90(t,J=6.95Hz,2H),1.58-1.77(m,4H),1.34(s,6H)及1.07(s,9H)ppm。
實施例14
化合物29之合成
將化合物28(5.1克，10.36毫莫耳)在500毫升圓底燒瓶中溶解於100毫升無水吡啶中。將1,1'-羰基二咪唑 (CDI)(3.36克，20.7毫莫耳)以一份加入此溶液中且將反應在室溫下及在氮氛圍下攪拌1.0小時。接著將反應混合物倒入由2,2'-(伸乙二氧基)雙(乙胺)(7.6毫升，51.8毫莫耳)及無水吡啶(50毫升)所組成的溶液中。將混合物在室溫下攪拌1.0小時且以旋轉蒸發移除揮發物。將所得粗製產物以快速層析術在矽膠上使用MeOH：CH2Cl2/9.5：0.5純化，以供給純化合物29(4.4克，65%產率)，參見圖13。1H NMR(CDCl3)：δH 7.63-7.68(m,4H),7.34-7.44(m,6H),4.76(s,2H),4.17(t,J=7.07Hz,2H),3.65(t,J=6.16Hz,2H),3.60(s,4H),3.49-3.51(m,6H),3.31-3.39(m,2H),2.88(m,2H),1.9(t,J=7.06Hz,2H),1.57-1.73(m,4H),1.31(s,6H)及1.03(s,9H)ppm。
實施例15
化合物31之合成
將化合物29(0.94克，1.42毫莫耳)溶解在40毫升無水THF中且在0℃及在氮氛圍下以在THF中的1M TBAF(1.6毫升，1.6毫莫耳)處理。將反應混合物在0℃下攪拌2.0小時，在這段時間內，以LC-MS確認完全移除TBDPS保護基。在以旋轉蒸發移除溶劑之後，將產物以快速層析術在C18 Flash管柱上純化(梯度：0至100%B經50分鐘，其中A=50mM TEAB及B=乙腈)。將目標份合併且冷凍乾燥，得到純化合物30(0.284克，47%產率)，MS(ES+)經計算為(M+H)429.21，經觀測為m/z 429.18。接下來將化合物30(0.217克，0.51毫莫耳)在氮氛圍下溶解在13毫升無水乙腈中。將DIPEA(97.7微升，0.56毫莫耳)及Fmoc-NHS酯(273.6毫克，0.81毫莫耳)在0℃溫度下加入此溶液中且在相同的溫度下攪拌2.0小時。接著將產物以快速層析術在矽膠上1：1至1：9/Hex：EtOAc梯度純化，得到半純度產物，將其使用2-5%/MeOH-CH2Cl2梯度進一步純化，獲得化合物31(0.245克，74%產率)，參見圖13。1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(2H,d,J=7.3Hz),7.59(2H,d,J=7.6Hz),7.32(2H,m),7.24(2H,m),4.69(2H,s),4.35(2H,m),4.16(1H,m),4.09(2H,m),3.60-3.45(12H,m),3.36-3.26(4H,m),1.82(2H,m),1.60(4H,m)及1.22(6H,s)ppm。
實施例16
化合物32之合成
將化合物31(93毫克，0.143毫莫耳)在配備有磁棒及氮氣來源之圓底燒瓶中溶解於無水乙腈(12.0毫升)中。將DSC(56毫克，0.21毫莫耳)及DIPEA(37.4微升，0.21毫莫耳)依序加入此溶液中，且將所得混合物在室溫下攪拌5.0小時。加入額外的DSC(48毫克，0.18毫莫耳)及DIPEA(37.4微升，0.21毫莫耳)且在室溫下持續攪拌15.0小時，在這段時間內，TLC顯示完全轉化成活化NHS酯。在以矽膠快速層析術使用己烷-乙酸乙酯(3：7至1：9)梯度純化之後獲得成為濃油的產物32(59毫克，53%產 率)且用於下一步驟中，參見圖13。1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(2H,d,J=7.53Hz),7.53(2H,d,J=7.3Hz),7.33(2H,m),7.24(2H,m),4.69(2H,s),4.34(2H,m),4.28(2H,m),4.16(1H,m),4.09(2H,m),3.57-3.46(10H,m),3.35-3.26(4H,m),2.75(4H,s),1.74(4H,m),1.62(2H,m)及1.23(6H,s)ppm。
實施例17
化合物34之合成
將等分化合物33(10微莫耳)(根據參考US 2013/0137091 A1所合成)在15毫升離心管中冷凍至乾燥。接著再懸浮於具有60微莫耳DIPEA的1.0毫升無水DMF中。在單獨的試管中，將化合物32(30微莫耳，3當量)溶解在3.33毫升無水DMF中且立即全部加入。將反應以手劇烈搖動而徹底混合且在室溫下放在搖動器上12小時。接下來加入哌啶(0.33毫升)且在室溫下持續搖動30分鐘。接著將產物以使用C18管柱之HPLC純化(梯度：0-70%B經40分鐘，其中A=50mM TEAB及B=乙腈)。在目標份凍乾之後獲得產物34，73.3%產率(7.33微莫耳)，參見圖13。
實施例18
化合物35之合成
將等分化合物34(4.9微莫耳)在15毫升離心管中溶 解在1.0毫升蒸餾水及0.5M Na2HPO4(0.49毫升)中。在單獨的試管中，將10毫克5-CR6G-NHS酯(17.9微莫耳)溶解在0.9毫升無水DMF中。接著將此溶液全部立即加入反應混合物中且在室溫下攪拌6.0小時。接著將反應混合物以50mM TEAB(25毫升)稀釋。將產物以HPLC C18純化(梯度：0-60%B經70分鐘)。在目標份凍乾之後獲得化合物35(2.15微莫耳，44%產率，以HPLC具有~98%純度)，且以MS(ES+)確認結構：經計算為(M-H)C58H76N10O25P3S2 -，1469.36，經實測為m/z 1469.67，參見圖13。
dATP、dCTP和dGTP的類似物同樣地依照以化合物35所述之類似程序合成且以HPLC及LC-MS特徵化，得到整組A系列(98，圖45)。就dATP類似物經計算為(M-H)C66H83N12O23P3S2，1,568.4348，經實測為m/z 1,568.4400；就dCTP類似物經計算為(M-H)C52H65N11O30P3S4，1,545.2070，經實測為m/z 1,545.2080，且就dGTP類似物經計算為(M-H)C66H93N12O27P3S4，1,706.4369，經實測為m/z 1,706.4400。在另一態樣中，本發明包含具有可裂解的連結子之核苷酸，如dATP類似物的化合物43，其中可裂解的二硫化物係以偕二甲基側面相接且連結子係經由尿素基團(-NH(C=O)NH-)附著至PA-核苷酸。化合物可根據圖14合成(dATP類似物)。其他的核苷酸類似物(例如dCTP、dGTP、dUTP之類似物)可藉由在反應順序的最後步驟以適當的PA類似物代替42而以類似方式合成。
實施19
化合物37之合成
在配備有攪拌棒的1公升圓底燒瓶中，將5-(fmoc-胺基)-1-戊醇(36，20克，62毫莫耳)在室溫下溶解於DMSO(256毫升)中。將AcOH(43毫升)及Ac2O(145毫升)依序加入溶液中。將燒瓶以橡膠隔膜密閉，放在N2下且在室溫下攪拌20小時。以TLC確認完全反應。接著將反應混合物轉移至3公升燒杯中且將燒瓶以水清洗。將燒杯在冰浴中冷卻且將反應混合物以50%飽和K2CO3(400毫升)經30分鐘中和。將混合物轉移至分液漏斗中且以EtOAc(2x700毫升)萃取。接著將有機相以50%飽和K2CO3(2x400毫升)清洗，經Na2SO4乾燥，過濾且在真空中濃縮。將粗製油以矽膠層析術純化(0至20%B經20分鐘，A=Hex，B=EtOAc)。收集且濃縮份得到成為白色固體的化合物37(17.77克，75%)，參見圖14。1H NMR(CDCl3)：δH 7.79(d,J=7.33,2H),7.63(d,J=7.83,2H),7.441(t,J=7.33,2H),7.357(t,J=7.58,2H),4.803(bs,1H),4.643(s,2H),4.43(d,J=6.82,2H),4.24(t,J=6.82,1H),3.54(t,J=6.32,2H),3.251(m,1H),2.167(s,3H),1.657-1.550(m,4H)及1.446-1.441(m,2H)ppm。
實施例20
化合物38之合成
將化合物37(2.77克，7.2毫莫耳)在配備有攪拌棒及隔板的250毫升圓底燒瓶中於N2下溶解在DCM(60毫升) 中。將三乙胺(3.0毫升，21.6毫升，3當量)及4Å分子篩(28克)加入燒瓶中。將懸浮液在室溫下攪拌10分鐘，接著在冰浴中攪拌30分鐘。將SO2Cl2(在DCM中的1M溶液，14.4毫升，14.4毫莫耳，2當量)加入燒瓶中且將反應混合物在冰浴中攪拌1小時。反應進度係經由TLC(1：1之Hex：EtOAc)以起始材料的消失來監控。一旦完成SO2Cl2活化，則快速加入在DMF(60毫升)中的硫代甲苯磺酸鉀(2.45克，10.8毫莫耳，1.5當量)之溶液。容許反應混合物經1小時緩慢地溫熱至室溫。接著將3-巰基-3-甲基丁醇(1.8毫升，14.4毫莫耳，2當量)裝入燒瓶中且在室溫下攪拌1小時。將反應混合物過濾且在40℃之真空中濃縮。以FCC純化(0至50%B經30分鐘，A=Hex，B=EtOAc)，以供給成為黃色油的38(482毫克，14%)，參見圖14。1H NMR(CDCl3)：δH 7.76(d,J=7.81,2H),7.59(d,J=7.32,2H),7.40(t,J=7.32,2H),7.31(t,J=7.32,2H),4.87(bs,1H),4.79(s,2H),4.40(d,J=6.84,2H),4.21(t,J=6.841H),3.78(t,J=6.84,2H),3.57(t,J=6.35,2H),3.20(m,2H),1.88(t,J=6.84,2H),1.64-1.50(m,4H),1.42-1.39(m,2H)及1.32(s,6H)ppm。
實施例21
化合物39之合成
將化合物38(135毫克，0.275毫莫耳)在50毫升圓底燒瓶中於真空下經2小時乾燥。除去真空且將燒瓶放在 N2下。將化合物38溶解在DMF(3.1毫升)中且將DIPEA(96微升，0.55毫莫耳，2當量)裝入燒瓶中。將溶液攪拌10分鐘且接著添加一份量的DSC固體(120毫克，0.468毫莫耳，1.7當量)。容許反應混合物攪拌2小時且經由TLC(1：1 Hex：EtOAc)證明完全反應。接著將反應在真空中及在35℃下濃縮且接著在高真空下經1小時進一步乾燥。將粗製油裝載於矽膠上且以FCC純化(0至50%B經14分鐘，A=hex，B=EtOAc)。將份以TLC檢查且濃縮，以供給成為油的化合物39(133毫克，76%)，其隨時間而結晶，參見圖14。1H NMR(CDCl3)：δH 7.78(d,J=7.58,2H),7.61(d,J=7.58,2H),7.42(t,J=7.58,2H),7.33(t,J=7.58,2H),4.87(bs,1H),4.80(s,2H),4.48(t,J=7.07,2H),4.44(d,J=6.82,2H),4.24(t,J=7.07,1H),3.58(t,J=6.32,2H),3.22(m,2H),2.83(s,4H),2.08(m,2H),1.649-1.562(m,4H),1.443-1.390(m,2H)及1.366(s,6H)ppm。
實施例22
化合物40之合成
將2,2'-(伸乙二氧基)雙(乙胺)(92微升，635微莫耳，10當量)及三乙胺(176微升，1270微莫耳，20當量)溶解在DMF(10毫升)中。亦製備在DMF(2.7毫升)中的6-ROX,NHS酯(40毫克，64微莫耳，1當量)之單獨溶液。將6-ROX,NHS酯溶液逐滴加入快速攪拌的含二胺之 溶液中。將反應攪拌2小時且以C18 HPLC-MS監控進度(0至100%B經10分鐘，A=50mM TEAB，B=MeCN)。一旦完成時，將反應經由製備性C18-HPLC純化(10至100%B經50分鐘，A=50mM TEAB，B=MeCN)。將份合併且凍乾，得到成為紫紅色固體的化合物40(20毫克，48%)，參見圖14。MS(ES-)經計算為(M-H)C39H45N4O6 664.33，經實測為m/z 664.56。
實施例23
化合物41之合成
將化合物40(10毫克，15微莫耳)溶解在DMF(1毫升)中且裝入DIPEA(8微升，45微莫耳，3當量)。將化合物39(28毫克，45微莫耳，3當量)單獨溶解在DMF(0.21毫升)中。將化合物39之溶液快速加入具有化合物40之溶液中。將反應放在搖動盤上1.5小時，在此時以分析用C18-HPLC(0至100%B經10分鐘，A=50mM乙酸鹽緩衝液pH 5.2，B=MeCN)顯示剩餘化合物40。加入額外的化合物39(13毫克，21微莫耳，1.4當量)且將反應放在搖動盤上再1小時。不再進行分析，加入哌啶(300微升)且容許反應10分鐘。接著將反應混合物直接注射在製備性C18-HPLC上(10至100%B經50分鐘，A=50mM TEAB，B=MeCN)。收集且凍乾份，得到成為紫紅色固體的化合物41(4.7毫克，34%)，參見圖14。MS(ES+)經計算為(M+H)C51H68N5O9S2 + 959.45，經實測為m/z 959.76。
實施例24
化合物43之合成
將胺41(2毫克，2微莫耳)、DSC(0.8毫克，3微莫耳，1.5當量)、DIPEA(0.7微升，4微莫耳，2當量)及N,N-二甲基甲醯胺(1.7毫升)裝入5毫升樣品小瓶中。將反應混合物放在搖動器上1小時。以C18-HPLC監控反應進度(0至100%B經10分鐘，A=50mM乙酸鹽緩衝液pH 5.2，B=MeCN)。接下來加入在0.1 Na2HPO4(3.3毫升)中的核苷酸42(6微莫耳，3當量，參考US 2013/0137091 A1)且將反應混合物放在搖動器上隔夜。接下來將反應以水稀釋且以製備性C18-HPLC純化(0至60%B經70分鐘，A=50mM TEAB，B=MeCN)，得到標題化合物43(0.5微莫耳，25%)，參見圖14。MS(ES-)經計算為(M-H)C67H87N13O22P3S2 1581.47，經實測為m/z 1581.65。
實施例25
在另一態樣中，可裂解的連結子可為化合物45，其中連結子係經由尿素官能度繫於PA-核苷酸且二硫化物係由兩個碳連結子連接至染料。所得核苷酸類似物在此例子中可如化合物49(dGTP類似物)，其可根據圖15合成。其他的核苷酸類似物(例如dATP、dUTP、dCTP之類似物)可藉由在反應順序的第三步驟以適當的PA核苷酸類似物代 替核苷酸46而以類似方式合成。
實施例26
化合物44之合成
將CH2Cl2中的37(1.00克，2.59毫莫耳)、分子篩及三乙胺(0.72毫升，5.18毫莫耳)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘且冷卻至0℃。緩慢地加入磺醯氯(4.40毫升，4.40毫莫耳)且將所得混合物在0℃下攪拌1小時。使用在己烷中的20%乙酸乙酯之TLC分析表明起始材料消失，在0℃下加入一份在N',N'-二甲基甲醯胺(5毫升)中的苯硫羰基磺酸鈉鹽(648毫克，3.89毫莫耳)之溶液且將反應混合物在室溫下攪拌20分鐘。接下來加入一份N-(三氟乙醯胺基)乙硫醇(896毫克，5.18毫莫耳)且將所得混合物在室溫下攪拌30分鐘。濾除分子篩，在減壓下移除溶劑且將殘留物經由管柱層析術在矽膠上使用0-20%乙酸乙酯-己烷梯度純化，得到成為黃色油的標題化合物44(529毫克，39%)。1H NMR(CDCl3)，參見圖15：δH 7.76(d,J=7.52Hz,2H),7.57(d,J=7.50Hz,2H),7.40-7.38(m,2H),7.30-7.25(m,2H),4.82(s,2H),4.42(d,2H),4.21-4.20(m,1H),3.70-3.67(m,2H),3.59-3.55(m,2H),3.17-3.16(m,2H)及1.64-1.40(m,6H)ppm。
實施例27
化合物45之合成
將胺甲酸酯44(100毫克，0.184毫莫耳)及1毫升在N,N-二甲基甲醯胺中的20%哌啶溶液在室溫下裝入配備有磁攪拌棒的25毫升圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌10分鐘，接著以乙腈(5毫升)稀釋且經由反相製備性HPLC使用0-30%乙腈-TEAB緩衝液梯度純化，得到成為透明油的標題化合物45(11毫克，20%)，參見圖15。1H NMR(400MHz,CD3OD)δH 4.90(s,2H),3.64-3.60(m,2H),3.32(s,2H),2.98-2.93(m,2H),2.86-2.82(m,2H),1.66-1.60(m,2H),1.50-1.48(m,2H)及1.33-1.30(m,2H)ppm。
實施例28
化合物47之合成
將胺45(0.960毫克，3.0微莫耳)、DSC(1.15毫克，4.5微莫耳)及三乙胺(60微升，6.0微莫耳)裝入5毫升樣品小瓶中且在室溫下搖動2小時。接著加入由在200微升N,N-二甲基甲醯胺中的3當量核苷酸46所組成的溶液(參考US 2013/0137091 A1)。將反應混合物放在搖動器上12小時。接下來將反應以TEAB緩衝液稀釋且以製備性反相HPLC使用0-30%乙腈：50mM TEAB緩衝液梯度純化，得到標題化合物47(14%產率)，參見圖15。MS(ES-)：經計算為(M-H)C26H37F3N10O16P3S2 -，959.10，經實測為m/z 959.24。
實施例29
化合物48之合成
將核苷酸47(1微莫耳)溶解在TEAB緩衝液(200微升50Mm水溶液)中且在室溫下以200微升氫氧化銨(30%水溶液)處理50分鐘。接著將反應以TEAB緩衝液(1毫升1M溶液)及蒸餾水(5毫升)稀釋。將所得混合物經由C18-HPLC，0-30%乙腈：50mM TEAB緩衝液梯度純化，以供給標題化合物48(0.40微莫耳，90%)，參見圖15。MS(ES-)：經計算為(M-H)C24H38N10O15P3S2 -，863.12，經實測為m/z 863.45。
實施例30
化合物49之合成
將等分化合物48(0.04微莫耳)在3毫升離心管(eppendorf tube)中溶解於0.1毫升蒸餾水及0.5M Na2HPO4(20微升)中。在單獨的試管中，將1毫克ROX-NHS酯(0.168微莫耳)溶解在48微升無水DMF中。接著將此溶液全部立即加入反應混合物中且在室溫下攪拌6.0小時。接著將反應混合物以50mM TEAB(5毫升)稀釋。將產物以C18-HPLC純化(使用0-60%B梯度，A=50mM TEAB，B=乙腈)。在目標份凍乾之後獲得化合物49(0.03微莫耳，30%產率)，參見圖15。MS(ES-)：經計算為(M-H)C57H67N12O19P3S2 -，1380.33，經實測為1380.25。
與正規的經二硫化物連結之核苷酸的裂解比較
將本文所揭示之此新類別的含有可裂解的二硫甲醛(-OCH2-SS-)連結子之核苷酸與正規的經二硫化物(-SS-)連結之核苷酸(例如在美國專利申請案2013/0137091[46]中所揭示之核苷酸50)在建基於還原膦的裂解條件下比較。觀察到該兩種類別的核苷酸有很大的差別。當經標識之核苷酸50在65℃下暴露於10當量TCEP時，其產生許多副產物，包括以LC-MS鑑定之化合物52與預期產物51(圖16和圖17，5分鐘暴露)。不想要的副產物比例隨時間增加(圖18，15分鐘暴露)。在相同的裂解條件下，經二硫甲醛連結之核苷酸35完全地產生所欲裂解產物化合物53和54。連結子之亞甲硫醇片段(-CH2SH)在二硫化物基團裂解時完全自核苷酸消除(圖20和圖21，5分鐘暴露)。另外，延長暴露於TCEP不產生更多副產物，如以LC-MS所示(圖22，15分鐘暴露)。因此，此新類別的核苷酸可藉由消除在硫醇基團存在的固有副反應而在使用以合成定序(SBS)DNA中提供顯著的優點，如圖4中所示。
實施例31
化合物57之合成
在另一實施態樣中，核苷酸之3'-OH基團可以-CH2-SS-Et或-CH2-SS-Me封端，且螢光團染料係經由先前所述之可裂解的-OCH2-SS-連結子之一附著至核鹼基(例如在化合物35、43和49中)。
具有3'-OCH2-SS-Et及-OCH2-SS-Me之PA核苷酸的 合成可分別根據圖10和圖22達成。3'-OCH2-SS-Me類似物與3'-OCH2-SS-Et的合成差別(圖10)為在適當的步驟以甲硫醇或硫甲醇鈉代替巰基乙醇(EtSH)，如圖22中所示。-OCH2-SS-Me基團為所有可能的3'-O-CH2-SS-R類似物之中最小的結構。因此，具有3'-OCH2-SS-Me封端基團之核苷酸類似物在酶併入率及以還原劑(諸如TCEP)的可裂解性方面應該比其他的類似物表現更好。
接下來可將所得PA-核苷酸(例如57)使用活化連結子32與適當的可裂解的-OCH2-SS-連結子偶合及最後與螢光團染料偶合，如圖23中所示。而且具有不同染料的其他核苷酸可使用適當的PA-核苷酸(例如dATP、dGTP、dCTP的PA類似物)及NHS活化染料(Alexa488-NHS、ROX-NHS、Cy5-NHS酯等等)以類似方式合成，達成經不同的螢光團報導基團標識之核苷酸類似物。
實施例32
具有不同連結子的核苷酸類似物可依照所述方案達成，如在合成化合物60和61中所示(圖24)。
具有可裂解的連結子-OCH2-SS-，但是鏈長度及在α-碳上的取代不同的多樣組別之3'-OCH2-SS-Et及3'-OCH2-SS-Me核苷酸可以類似的方式合成。所得類別的核苷酸顯示於圖25、圖26和圖27中。在圖25中所示之核苷酸中，可裂解的連結子係由附著至可撓性乙二醇連結子的穩定之偕二甲基側面相接且經由胺甲酸酯官能基(-NH- C(C=O)-O-)附著至PA-核鹼基，而在圖26中，將胺甲酸酯基團以尿素基團(-NH-C(C=O)-NH-)代替。另一方面，在圖27中所示之核苷酸中，二硫化物基團係附著至一級碳鏈且經由尿素官能基繫於PA-核鹼基。
實施例33
化合物64之合成：
將化合物62(3.0克，4.58毫莫耳)、25毫升無水CH2Cl2、3-Å分子篩(5.0克)及環己烯(0.55毫升，5.4毫莫耳)裝入250毫升圓底燒瓶中。將所得混合物在室溫下及在氮氛圍下攪拌10分鐘。接著將反應燒瓶放在冰浴上，經由注射器緩慢地加入SO2Cl2(6.8毫升，在CH2Cl2中的1M溶液，1.5當量)且在0℃下攪拌1小時。接下來加入額外的0.5當量SO2Cl2，以確保完全轉化成化合物63。在真空下移除揮發物且保持溫度接近10℃。將所得固體再懸浮於20毫升無水DMF中且保持在氮氛圍下。
在單獨的燒瓶中，將(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(2.45克，11.44毫莫耳)在氮氛圍下溶解在無水DMF(30毫升)中且以NaH(274.5毫克，在油中的60%)處理，產生灰色漿液。將化合物63立即加入其中且在室溫下及在氮氛圍下攪拌3小時。接著將反應混合物在漏斗中通過矽藻土®-S(20克)過濾，以EtOAc(100毫升)溶析出產物。接著將EtOAc溶液以蒸餾水(2X100毫升)清洗。將EtOAc萃取物經Na2SO4乾燥，以旋轉蒸發濃縮且以快速層析術純 化(管柱：120克RediSepRfGold，梯度：80% Hex至50% Hex：EtOAc)。參見圖43。獲得成為白色固體的目標化合物(64)(1.2克，32%產率，Rf：0.4，Hex：EtOAc/3：2)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.13(m,3H),7.43(m,1H),7.32(m,2H),6.12(m,1H),6.00(s,2H),4.62(m,2H),4.31(m,3H),4.00(m,1H),3.82-3.60(m,13H),2.39(m,1H),1.84(m,1H),0.78(m,9H)及0.01(m,6H)ppm。
實施例34
化合物65之合成：
將化合物64(1.2克，1.46毫莫耳)在高真空下以P2O5在乾燥器中經隔夜乾燥且在配備有磁攪拌器的100毫升燒瓶中溶解於30毫升無水CH2Cl2中。將二甲基二硫(0.657毫升，7.3毫莫耳)加入其中且將反應燒瓶放在冰浴上。接著加入四氟硼酸二甲基(甲硫基)鋶(DMTSF，316毫克，1.1當量)且在0℃下攪拌1.5小時。將反應混合物轉移至250毫升分液漏斗，以50毫升0.1M NaHCO3水溶液中和且以CH2Cl2(2X50毫升)萃取。參見圖43。將有機部分經Na2SO4乾燥且以旋轉蒸發濃縮。將粗製產物在矽膠管柱上(80克RediSepRf gold)使用梯度80-50% Hex-EtOAc純化，得到0.82克化合物65(82%產率，RF=0.5，Hex：EtOAc/3：2)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.15(m,3H),7.42(m,1H),7.35(m,2H),6.11(m,1H),4.80-4.65(m,2H),4.34(m,1H),4.28(m,2H),4.10(m,1H),3.83-3.67(m,2H), 2.49(m,1H),2.34(s,3H),1.90(m,1H),0.78(m,9H)及0.10(m,6H)ppm。
實施例35
化合物66之合成：
將化合物65(0.309克，0.45毫莫耳)及10.0毫升無水CH2Cl2(10.0毫升)裝入配備有磁攪拌器的圓底燒瓶中且在氮氛圍下放在冰浴上。經由注射器緩慢地加入TBAF(0.72毫升，0.72毫莫耳，1M溶液)。將反應混合物在0℃下攪拌3小時。接著將反應混合物轉移至分液漏斗且以0.5M NaHCO3溶液(50毫升)萃滅。將所得混合物以EtOAc(2 X100毫升)萃取且經Na2SO4乾燥。以矽膠管柱層析術在40克RediSepRf管柱上使用梯度7：3至2：3 Hex：EtOAc純化之後獲得成為白色粉末的產物66，76%產率(196毫克，Rf=0.3，Hex：EtOAc/1：1)。參見圖43。1H NMR(CDCl3)：δH 8.40(s,1H),8.25(m,2H),7.60(m,1H),7.52(m,2H),6.21(m,1H),4.90-80(m,2H),4.65(m,1H),4.40(m,2H),4.25(m,1H),4.05-3.85(m,2H),2.62(m,1H),2.50(s,3H)及2.31(m,1H)ppm。
在化合物66經由標準的三磷酸合成方法進行磷酸化之後，獲得產物67(以LC-MS確認m/z(M-H)611.19為67之C14H23N4O13P3S2)(參見化合物5之合成細節且參見圖8)。其根據圖13、圖14和圖15中所呈示之用於化合物的所述程序進一步轉化成經染料標識之產物。
實施例36
化合物70之合成：
將化合物68(7.3克，13.8毫莫耳)在乾燥器中經隔夜乾燥且在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的500毫升無水圓底燒瓶中在N2氛圍下溶解於無水DCM(70毫升)中。將環己烯(1.54毫升，15.2毫莫耳，1.1當量)及無水3-Å分子篩(16.6克)加入反應混合物中且將所得懸浮液在冰浴中於0℃下攪拌20分鐘。接下來加入SO2Cl2(在DCM中的1M溶液，32.7毫升，2.36當量)且將所得混合物在0℃下攪拌1小時。反應進度係經由TLC(100% EtOAc)以起始材料的消失來監控。一旦完成SO2Cl2活化，則製備在DMF(120毫升)中的(MeO)3BnSH(7.4克，34.5毫莫耳，2.5當量)及NaH(1.32克，33.12毫莫耳，在礦物油中的60%)之混合物且以一份快速加入。容許反應緩慢地溫熱至室溫且攪拌1小時。將反應混合物過濾且在40℃之真空中濃縮。以管柱層析術在矽膠上純化(以0至60%乙酸乙酯：己烷梯度經15分鐘，接著以60%乙酸乙酯：己烷經45分鐘溶析)，以供給成為透明油的所欲化合物70(4.2克，43.7%產率)。參見圖44。1H NMR(CDCl3)：δH 8.72(s,1H),8.31(s,1H),7.94(m,2H),7.52(m,1H),7.44(m,2H),6.41(m,1H),6.03(s,2H),4.67(s,2H),4.50(m,1H),4.10(m,1H),3.73(m,13H),2.52(m,2H),0.81(s,9H)及0.002(d,6H)ppm。
實施例37
化合物71之合成：
將化合物70(2克，2.87毫莫耳)在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的200毫升圓底燒瓶中於N2氛圍中溶解在無水DCM(38毫升)中且在冰水浴上冷卻。將二甲基二硫(1.3毫升，14.36毫莫耳，5當量)加入此混合物中，接著加入一份在DCM(20毫升)中成為溶液的DMTSF(620毫克，3.15毫莫耳，1.1當量)。容許所得混合物緩慢地溫熱至室溫且接著再攪拌4小時。將反應以加入NaHCO3飽和水溶液(100毫升)淬滅，以DCM(150毫升x 2)及EtOAc(200毫升)萃取，經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮。以管柱層析術在矽膠上純化(以0至60%乙酸乙酯：己烷梯度經15分鐘，接著以60%乙酸乙酯：己烷經45分鐘溶析)，以供給成為白色粉末的所欲化合物71(1克，62%產率)。參見圖44。1H NMR(CDCl3)：δH 8.69(s,1H),8.24(s,1H),7.94(m,1H),7.51(m,1H),7.42(m,2H),6.41(m,1H),4.82(m,2H),4.57(m,1H),4.15(m,1H),3.77(m,2H),2.61(m,2H),2.40(s,3H),0.81(s,9H)及0.00(d,6H)ppm。
實施例38
化合物72之合成：
將化合物71(562毫克，1.25毫莫耳)在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的100毫升圓底燒瓶中於N2氛圍中溶解在無水THF(30毫升)且在冰水浴上冷卻。接著逐滴加入TBAF (1.5毫升在THF中的1M溶液，1.5當量)且在0℃下攪拌2小時。反應進度係以TLC監控(100%乙酸乙酯，化合物72之Rf=0.205，化合物71之Rf=0.627)。在反應完成時加入甲醇(5毫升)，將反應以旋轉濃縮且將殘留物經由管柱層析術在矽膠上純化(以0至60%乙酸乙酯：己烷梯度經15分鐘，接著以60%乙酸乙酯：己烷經45分鐘溶析)，以供給成為白色粉末的所欲化合物72(280毫克，62%產率)。參見圖44。1H NMR(CDCl3)：δH 8.69(s,1H),8.02(s,1H),7.95(m,2H),7.53(m,1H),7.44(m,2H),6.25(m,1H),4.83(m,2H),4.70(m,1H),4.29(m,1H),3.93(m,1H),3.74(m,1H),2.99(m,1H),2.43(s,3H)及2.41(m,1H)ppm。
接著將化合物72依照先前所述之標準的三磷酸合成法轉化成三磷酸73(參見圖8中的化合物5之合成)。
實施例39
化合物108之合成：
將在100毫升無水吡啶中的1,4-丁二醇(18.3克，203.13毫莫耳)裝入配備有攪拌棒的1公升圓底燒瓶中且在氮氛圍下冷卻至0℃。接著經由注射器逐滴加入三級丁基二苯基矽基氯(13.8毫升，70毫莫耳)，容許反應逐漸地溫熱至室溫且在室溫下持續攪拌12小時。以旋轉蒸發移除揮發物且將殘留物吸收在80克矽膠上。經由快速管柱層析術在矽膠上使用在己烷中的30至50%乙酸乙酯梯度 純化，得到4-O-(三級丁基二苯基矽基)-丁-1-醇，108(13.7克，59.5%產率，Rf=0.7，以1：1/己烷：乙酸乙酯，1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(m,4H),7.40(m,6H),3.75(m,2H),3.65(2H,m),1.70(m,4H),1.09(m,9H)ppm。合成法於圖50中例證。
實施例40
化合物109之合成：
將化合物108(6.07克，18.5毫莫耳)及90毫升無水DMSO裝入配備有磁攪拌棒的250毫升圓底燒瓶中。依序加入乙酸(15毫升)及乙酸酐(50毫升)且將反應在室溫下攪拌20小時，轉移至分液漏斗且分溶在300毫升蒸餾水與300毫升乙酸乙酯之間。接著將有機層轉移至1公升燒瓶且使用K2CO3飽和水溶液(500毫升)中和。將有機層以蒸餾水(3 x 300毫升)清洗且經MgSO4乾燥。在減壓下移除揮發物且將殘留物經由快速管柱層析術在矽膠上純化(己烷：乙酸乙酯/97：3至90：10)，獲得4-O-(三級丁基二苯基矽基)-1-O-(甲基硫甲基)-丁烷，109(5.15克，71.7%產率，Rf=0.8，以9：1/己烷：乙酸乙酯)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(m,4H,),7.40(m,6H),4.62(s,2H),3.70(m,2H),3.50(m,2H,),2.15(s,2H),1.70(m,4H),1.08(m,9H)ppm。合成法於圖50中例證。
實施例41
化合物110之合成：
將化合物109(15.5克，40毫莫耳)、無水二氯甲烷(450毫升)、3Å分子篩(80克)及三乙胺(5.6毫升)裝入配備有磁攪拌棒的1公升圓底燒瓶中且將反應在0℃下及在氮氛圍下攪拌30分鐘。接下來經由注射器緩慢地加入SO2Cl2(64毫升在二氯甲烷中的1M溶液)且在0℃下攪拌1小時。接著移除冰浴且立即加入在20毫升無水DMF中的硫代甲苯磺酸鉀(10.9克，48.1毫莫耳)之溶液。將所得混合物在室溫下攪拌20分鐘，立即加入含有在DMF(20毫升)中的3-巰基-3-甲基丁-1-醇(4.4毫升，36毫莫耳)之溶液的2公升圓底燒瓶中。將反應在室溫下攪拌30分鐘且接著通過矽藻土-S過濾。將產物分溶在等量的乙酸乙酯與水之間。將有機萃取物在分液漏斗中以蒸餾水清洗，接著以旋轉蒸發濃縮粗製產物。以快速管柱層析術在矽膠上使用乙酸乙酯：己烷梯度純化，得到標題化合物110(5.6克，26%)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.67-7.70(m,4H),7.37-7.47(m,6H),4.81(s,2H),3.81(t,J=6.73Hz,2H),3.70(t,J=6.21Hz,2H),3.59(t,J=6.55,2H),1.90(t,J=6.95Hz,2H),1.58-1.77(m,4H),1.34(s,6H)及1.07(s,9H)ppm。合成法於圖50中例證。
實施例42
化合物111之合成：
將化合物110(5.1克，10.36毫莫耳)、無水吡啶(100 毫升)及1,1'-羰基二咪唑(CDI)(3.36克，20.7毫莫耳)在氮氛圍下裝入配備有磁攪拌棒的500毫升圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌1小時且倒入在無水吡啶(50毫升)中的2,2'-(伸乙二氧基)雙(乙胺)(7.6毫升，51.8毫莫耳)之溶液中。持續攪拌1小時且以旋轉蒸發移除揮發物。將所得粗製物經由快速管柱層析術在矽膠上使用在CH2Cl2中的0-15%甲醇純化，以供給化合物111(4.4克，65%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.63-7.68(m,4H),7.34-7.44(m,6H),4.76(s,2H),4.17(t,J=7.07Hz,2H),3.65(t,J=6.16Hz,2H),3.60(s,4H),3.49-3.51(m,6H),3.31-3.39(m,2H),2.88(m,2H),1.9(t,J=7.06Hz,2H),1.57-1.73(m,4H),1.31(s,6H)及1.03(s,9H)ppm。合成法於圖50中例證。
實施例43
化合物113之合成：
將化合物111(0.94克，1.42毫莫耳)、無水THF(40毫升)及TBAF(1.6毫升在THF中的1M溶液，1.6毫莫耳)在0℃下及在氮氛圍下裝入配備有磁攪拌棒的50毫升圓底燒瓶中。將反應混合物在0℃下攪拌2.0小時，在這段時間內，LC-MS顯示完全移除TBDPS保護基。在以旋轉移除揮發物之後，將產物經由快速層析術在矽膠上純化(在二氯甲烷中的0-5%甲醇梯度)，得到純化合物112(0.284克，47%產率)，MS(ES+)：經計算為(M+H) 429.21，經觀測為m/z 429.18。
接下來將化合物112(0.217克，0.51毫莫耳)在氮氛圍下溶解在無水乙腈(13毫升)中且冷卻至0℃。加入DIPEA(97.7微升，0.56毫莫耳)及Fmoc-NHS酯(273.6毫克，0.81毫莫耳)且將反應在0℃下攪拌2小時。以使用在己烷中的50至90%乙酸乙酯梯度之快速管柱層析術在矽膠上純化，得到半純度產物，經由管柱層析術在矽膠上使用在CH2Cl2中的2-5%甲醇梯度進一步純化，以供給化合物113(0.245克，74%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.70(2H,d,J=7.3Hz),7.59(2H,d,J=7.6Hz),7.32(2H,m),7.24(2H,m),4.69(2H,s),4.35(2H,m),4.16(1H,m),4.09(2H,m),3.60-3.45(12H,m),3.36-3.26(4H,m),1.82(2H,m),1.60(4H,m)及1.22(6H,s)ppm。合成法於圖50中例證。
實施例44
化合物114之合成：
將化合物7(170毫克，0.26毫莫耳)、無水乙腈(15毫升)、DSC(100毫克，0.39毫莫耳)及DPIEA(68微升，0.39毫莫耳)裝入配備有磁攪拌棒的50毫升圓底燒瓶中。將反應混合物在室溫下攪拌3小時且加入額外的DSC(100毫克，0.39毫莫耳)及DIPEA(68微升，0.39毫莫耳)。將所得混合物在室溫下攪拌12小時。以TLC追蹤反應進度(起始材料之Rf=0.4，產物之Rf=0.8，在9：1/乙 酸乙酯：己烷中)。以旋轉蒸發移除揮發物且將剩餘殘留物經由使用己烷-乙酸乙酯梯度之3個連續矽膠管柱純化，得到化合物114(121毫克，59%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.81(m,2H),7.63(m,2H),7.42(m,2H),7.33(m,2H),4.78(s,2H),4.43(m,2H),4.37(t,J=7.65Hz,2H),4.25(m,2H),4.18(m,2H),3.67-3.55(m,10H),3.39(m,4H),2.84(s,4H),1.88(m,4H),1.73(m,4H)及1.32(s,6H)ppm。合成法於圖50中例證。
實施例45
化合物117之合成：
將化合物115(7.3克，13.8毫莫耳，在乾燥器中經隔夜預乾燥)、無水二氯甲烷(70毫升)、環己烯(1.54毫升，15.2毫莫耳)及3-Å分子篩(16.6克)裝入配備有磁攪拌棒的500毫升圓底燒瓶中且將所得懸浮液在0℃下及在氮氛圍下攪拌20分鐘。接下來加入SO2Cl2(在二氯甲烷中的1M溶液，32.7毫升，2.36當量)且將所得混合物在0℃下攪拌1小時。反應進度係經由TLC(100% EtOAc)以起始材料的消失來監控。一旦完成SO2Cl2活化，則製備在DMF(120毫升)中的(MeO)3BnSH(7.4克，34.5毫莫耳，2.5當量)及NaH(1.32克，33.12毫莫耳，在礦物油中的60%)之混合物且以一份快速加入。容許反應緩慢地溫熱至室溫且攪拌1小時。將反應混合物過濾且在40℃之真空中濃縮。以管柱層析術在矽膠上使用在己烷中的0至60% 乙酸乙酯梯度純化，以供給成為透明油的所欲化合物117(4.2克，43.7%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.72(s,1H),8.31(s,1H),7.94(m,2H),7.52(m,1H),7.44(m,2H),6.41(m,1H),6.03(s,2H),4.67(s,2H),4.50(m,1H),4.10(m,1H),3.73(m,13H),2.52(m,2H),0.81(s,9H)及0.002(d,6H)ppm。合成法於圖51中例證。
實施例46
化合物118之合成：
將化合物117(2.0克，2.87毫莫耳)及二氯甲烷(38毫升)在N2氛圍下裝入配備有磁攪拌棒的200毫升圓底燒瓶中且在冰浴上冷卻。將二甲基二硫(1.3毫升，14.36毫莫耳，5當量)加入此混合物中，接著加入在二氯甲烷(20毫升)中成為溶液的DMTSF(620毫克，3.15毫莫耳，1.1當量)。容許所得混合物緩慢地溫熱至室溫且再攪拌4小時。接著將反應以加入NaHCO3飽和水溶液(100毫升)淬滅，以二氯甲烷(150毫升x 2)及乙酸乙酯(200毫升)萃取，經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮。以管柱層析術在矽膠上純化(以在己烷中的0至60%乙酸乙酯梯度溶析)，得到成為白色粉末的所欲化合物118(1.0克，62%)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.69(s,1H),8.24(s,1H),7.94(m,1H),7.51(m,1H),7.42(m,2H),6.41(m,1H),4.82(m,2H),4.57(m,1H),4.15(m,1H),3.77(m,2H),2.61(m,2H),2.40(s,3H),0.81(s,9H)及0.00(d,6H)ppm。合成法於圖 51中例證。
實施例47
化合物119之合成：
將化合物118(562毫克，1.25毫莫耳)在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的圓底燒瓶中在N2氛圍下溶解於無水THF(30毫升)中且在冰浴上冷卻。接著逐滴加入TBAF(1.5毫升在THF中的1M溶液，1.5當量)且在0℃下攪拌2小時。反應進度以TLC監控(100%乙酸乙酯，化合物119之Rf=0.2，化合物118之Rf=0.6)。在反應完成時，加入甲醇(5毫升)，將反應以旋轉濃縮且將殘留物經由管柱層析術在矽膠上純化(以0至60%乙酸乙酯：己烷梯度經15分鐘，接著以在己烷中的60%乙酸乙酯經45分鐘溶析)，以供給成為白色粉末的所欲化合物119(280毫克，62%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.69(s,1H),8.02(s,1H),7.95(m,2H),7.53(m,1H),7.44(m,2H),6.25(m,1H),4.83(m,2H),4.70(m,1H),4.29(m,1H),3.93(m,1H),3.74(m,1H),2.99(m,1H),2.43(s,3H)及2.41(m,1H)ppm。
接著將化合物119參考使用標準的三磷酸合成方法轉化成三磷酸120，除了去保護係藉由在室溫下以10% NH4OH處理5小時來進行以外，使-SSMe裂解最小化。產率25%；HRMS-ES+：經計算為C12H20N5O12P3S2,582.976，經觀測為m/z 582.975。合成法於圖51中例證。
實施例48
化合物123之合成：
將化合物121(2.5克，4.94毫莫耳)在乾燥器中經隔夜乾燥且在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的無水圓底燒瓶中在N2氛圍下溶解於無水二氯甲烷(25毫升)中。將環己烯(0.55毫升，1.1當量)及無水3-Å分子篩(6.0克)加入反應混合物中且將所得懸浮液在室溫下攪拌20分鐘。接著將反應燒瓶放在冰鹽水浴上，使溫度到達零度以下，且以注射器緩慢地加入SO2Cl2(7.4毫升，在二氯甲烷中的1M溶液)。將所得混合物在0℃下攪拌1小時，接著加入0.5當量SO2Cl2，以完成完應。反應進度係經由TLC以起始材料的消失來監控。接下來在單獨的燒瓶中製備在DMF(40毫升)中的(MeO)3BnSH(2.65克，12.35毫莫耳，2.5當量)及NaH(0.472克，11.85毫莫耳，在礦物油中的60%)之懸浮液。將反應混合物合併，緩慢地溫熱至室溫且攪拌1小時。接著將反應混合物通過玻璃燒結之漏斗過濾以移除MS，將過濾物以加入50mM NaH2PO4水溶液(50毫升)淬滅且以二氯甲烷萃取。將合併的有機物經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮。以管柱層析術在矽膠上使用己烷：乙酸乙酯梯度純化，得到所欲化合物123(1.4克，42.2%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.29(m,1H),7.77(m,2H),7.48(m,1H),7.38(m,2H),6.15(m,1H),5.99(m,2H),4.55(m,2H),4.32(m,1H),4.00(m,1H),3.80(m,1H),3.75(m,1H),3.69(m,9H),2.52(m,1H),1.97(m,1H),0.80(m, 9H)及0.01(m,6H)ppm。合成法於圖52中例證。
實施例49
化合物124之合成：
將化合物123(1.4克，2.08毫莫耳)在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的200毫升圓底燒瓶中在N2氛圍下溶解於無水二氯甲烷(42毫升)且在0℃下冷卻。將二甲基二硫(0.93毫升，10.4毫莫耳，5當量)加入此混合物中，接著加入DMTSF(450毫克，2.28毫莫耳，1.1當量)。將所得混合物在0℃下攪拌2小時。將反應以加入50mM NaHCO3(100毫升)淬滅，以二氯甲烷(100毫升x 2)萃取，經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮。將產物以管柱層析術在矽膠上純化(以在二氯甲烷中的0至30%乙酸乙酯梯度溶析)，以供給成為白色粉末的所欲化合物124(0.93克，83.1%)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.48(m,1H),7.93(m,2H),7.56(m,1H),7.47(m,1H),7.37(m,2H)6.00(m,1H),4.73(m,2H),4.34(m,1H),4.07(m,1H),3.84(m,1H),3.73(m,1H),2.44(m,1H),2.33(m,3H),2.25(m,1H),0.76(m,9H)及0.01(m,6H)ppm。合成法於圖52中例證。
實施例50
化合物125之合成：
將化合物124(930毫克，1.73毫莫耳)在配備有攪拌棒及橡膠隔膜的100毫升圓底燒瓶中在N2氛圍下溶解於 無水THF(52毫升)中且在冰水浴上冷卻至0℃。接著逐滴加入TBAF(3.5毫升在THF中的1M溶液，1.5當量)且在0℃下攪拌4小時。在完成反應時，加入甲醇(5毫升)以淬滅反應，在減壓下移除揮發物且將殘留物經由管柱層析術在矽膠上純化(在己烷中的0至75%乙酸乙酯梯度)，以供給成為白色粉末的所欲化合物125(425毫克，58%產率)。1H-NMR(CDCl3)：δH 8.24(m,1H),7.81(m,1H),7.51-7.42(m,2H),7.41(m,2H),6.09(m,1H),4.80(m,2H),4.50(m,1H),4.17(m,1H),3.94(m,1H),3.80(m,1H),2.58(m,1H),2.40(m,3H)及2.41(m,1H)ppm。合成法於圖52中例證。
實施例51
化合物126之合成：
接著將化合物125使用參考的標準三磷酸酯合成方法轉化成三磷酸酯126；最後去保護係藉由在室溫下以10% NH4OH處理2小時來進行，使-SSMe裂解最小化。30%產率，HR MS-ES+：經計算為C11H20N3O13P3S2,558.965；經觀測為m/z 558.964。合成法於圖52中例證。
實施例52
化合物130之合成：
將127(2.0克，2.8毫莫耳)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中且在高真空下以P2O5在乾燥器中經 12小時乾燥。在N2下加入二氯甲烷(40毫升)且將所得溶液在鹽冰浴上經15分鐘冷卻。加入環己烯(0.34毫升，3.4毫莫耳)，接著逐滴加入SO2Cl2(3.4毫升，在二氯甲烷中的1M溶液，3.4毫莫耳)。將所得混合物攪拌30分鐘，且將反應進度以TLC監控(乙酸乙酯：己烷/1：1，127之Rf=0.5，128之Rf=0.15，-CH2Cl分解產物)。逐滴加入額外的SO2Cl2(3.1毫升，在二氯甲烷中的1M溶液，3.1毫莫耳)且將反應混合物再攪拌40分鐘，以確保完全轉化成化合物128。接著將此混合物在0℃之高真空下濃縮。
接著將無水二氯甲烷(40毫升)在N2下加入殘留物中且將混合物在0℃下攪拌，直到所有的固體溶解為止。緩慢地加入在DMF(8毫升)中的對-甲苯硫代磺酸鉀(0.96克，425毫莫耳)之溶液且將所得反應混合物在0℃下攪拌1小時。將混合物在減壓下及先在0℃下及接著在室溫下濃縮。將殘留物以快速管柱層析術在矽膠上使用在己烷中的0至100%乙酸乙酯梯度純化，得到成為奶油色固體的化合物130(1.1克，51%；TLC Rf：0.35，乙酸乙酯：己烷/2：1)。MS(ES)m/z：733[M+1+]。1H NMR(CDCl3,400MHz)：δH 8.02(br.s,1H),7.94(s,1H),7.88(d,J=8.3Hz,2H),7.45(m,4H),7.38(m,6H),7.27(m,2H),6.01(t,J=6.6Hz 1H),5.46 & 5.38(AB,JAB=12.1Hz,2H),4.97(m,1H),3.86(m,1H),3.74(dd,J=12.5,2.8Hz,1H),3.55(dd,J=12.5,2.9Hz,1H),2.87(m,1H),2.65(m,1H),2.43(s, 3H),2.17(m,1H),1.26(d,J=6.8Hz,3H),1.25(d,J=6.9Hz,3H)ppm。合成法於圖53中例證。
實施例53
化合物131之合成：
將二甲基二硫(0.66毫升，7.5毫莫耳)在N2下加入在冰水浴上冷卻的二氯甲烷(無水，40毫升)中的130(1.1克，1.5毫莫耳)之溶液中。將所得混合物攪拌15分鐘且加入一份NaSMe(0.23克，3.3毫莫耳)。將所得反應混合物在0℃下攪拌4小時。將反應進度以TLC監控(乙酸乙酯：己烷/2：1，130之Rf=0.35，131之Rf=0.45)。將混合物通過矽藻土-S過濾且在減壓下濃縮。將殘留物在矽膠管柱上純化，以在己烷中的乙酸乙酯(0~100%)溶析，以供給成為白色固體的化合物131(0.68克，75%；TLC Rf：0.45，乙酸乙酯/己烷/2：1)。MS(ES)m/z：625[M+1+]。1H NMR(CDCl3)：δH 8.02(s,1H),8.00(br。s,1H),7.45(m,4H),7.39(m,4H),7.28(m,2H),6.24(t,J=6.2Hz,1H),5.05(m,1H),4.99 & 4.94(AB,JAB=11.4Hz,2H),4.27(m,1H),3.99(dd,J=12.5,2.3Hz,1H),3.86(dd,J=12.5,2.3Hz,1H),3.12(m,1H),2.74(m,1H),2.52(s,3H),2.50(m,1H),1.30(d,J=6.6Hz,3H)及1.29(m,3H)ppm。合成法於圖53中例證。
實施例54
化合物132之合成：
接著將化合物131經由在標準方法章節中所述之標準的三磷酸合成方法轉化成三磷酸132。25%產率；HRMS-ES+：經計算為C12H20N5O13P3S2,598.971，經觀測為m/z 598.970。合成法於圖53中例證。
實施例55
化合物134之合成：
將化合物133(4.47克，10.7毫莫耳)及(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(TMPM-SH)在高真空下經2小時乾燥且接著放入具有P2O5的乾燥器中12小時。將化合物133溶解在無水CH2Cl2(50.0毫升)中且加入環己烯(10毫升，96.6毫莫耳)。將所得混合物在-10℃下及在氮氛圍下攪拌15分鐘。接下來經由加料漏斗逐滴加入在CH2Cl2中的1M SO2Cl2之新鮮製備溶液(25毫升，26.75毫莫耳)且將所得混合物在-10℃下攪拌1小時。在真空中移除揮發物且保持浴溫在10℃。接著將殘留物溶解在無水DMF(52毫升)中且保持在氮氛圍下。
在單獨的燒瓶中，將(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(4克，18.7毫莫耳)在氮氛圍下溶解在無水DMF(48毫升)中且冷卻至0℃。接著加入NaH(1.1克，26.8毫莫耳，在礦物油中的60%)且將所得灰色漿液在0℃下攪拌15分鐘。將其以一份加入先前溶液中且在室溫下攪拌1小時。接著將反應混合物在分液漏斗中分溶(150：300毫升/食鹽水： 乙酸乙酯)。接著將有機層以食鹽水(2x150毫升)清洗。將水層反萃取(4 x 50毫升乙酸乙酯)。將合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥。移除溶劑且將產物以快速層析術在矽膠管柱上純化(管柱：120克RediSepRfGold-ISCO，梯度在己烷中的0至100%乙酸乙酯)。獲得成為白色固體的目標化合物134，22%產率(1.35克)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.17(s,1H),7.39(d,1H),6.30(m,1H),6.12(s,2H),4.71(dd,2H),4.43(m,1H),4.04(m,1H),3.87(m,1H),3.83(m,9H),3.74(dd,1H),2.74(ddd,1H),2.34(ddd,1H),1.93(m,2H)1.53(s,3H),0.93(m,9H),0.11(m,6H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]經觀測為581,Rf=0.59(4：6/己烷-乙酸乙酯)。而且亦分離出成為副產物的化合物135，22.5%產率(1.13克)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.55(s,1H),7.41(m,1H),6.12(M,3H),4.76(dd,2H),4.47(m,1H),4.01(m,1H),3.90(m,1H),3.82(m,9H),3.75(m,1H),2.29(m,2H),2.04(s,3H)及1.91(m,2H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]經觀測為467。合成法於圖54中例證。
實施例56
化合物136之合成：
將化合物134(3.6克，6.2毫莫耳)在100毫升圓底燒瓶中於高真空下經2小時乾燥且接著與P2O5放入真空乾燥器中12小時。加入無水CH2Cl2(96毫升)及二甲基二硫(2.8毫升，30.9毫莫耳)且將反應冷卻至0℃。接著加入四 氟硼酸二甲基(甲硫基)鋶(DMTSF，1.34克，6.82毫莫耳)且將反應在0℃下攪拌1小時。接下來將反應混合物轉移至250毫升分液漏斗，以90毫升0.1M NaHCO3水溶液中和且以乙酸乙酯(2 x 200毫升)萃取。將合併的有機層經無水硫酸鈉乾燥且以旋轉濃縮。將殘留物以快速層析術在矽膠管柱上使用己烷中的30-50%乙酸乙酯梯度純化。獲得成為白色固體的目標化合物136(2.1克，77%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.99(s,1H),7.47(d,1H),6.29(dd,1H),4.87(dd,2H),4.49(m,1H),4.13(m,1H),3.88(m,2H),3.5(m,1H),2.47(s,3H),2.45(dd,1H),2.04(dd,1H)及1.54(s,2H),0.93(m,9H)及0.13(m,6H)ppm。LCMS(ESI)[M-H+]經觀測為447.0。合成法於圖54中例證。
實施例57
化合物137之合成：
將在100毫升圓底燒瓶中於高真空下經2小時乾燥之化合物136(2.16克，4.8毫莫耳)溶解在無水THF(40毫升)中，接著加入乙酸(1.2毫升)及在THF中的TBAF(6.7毫升1M溶液，6.72毫莫耳)。將反應混合物在0℃下攪拌1小時及接著在室溫下再2小時。在真空中移除揮發物且將殘留物經由快速層析術在40克RediSepRf gold管柱上使用二氯甲烷中的0-8%甲醇梯度純化。獲得成為白色固體的目標化合物137(1.45克，90%產率)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.12(s,1H),7.36(d,1H),6.11(t,1H),4.87 (dd,2H),4.57(m,1H),4.14(q,1H),3.94(dd,1H),3.83(m,1H),2.50(s,3H),2.4(m,2H),1.93(s,3H)ppm；LCMS(ESI)[M-H+]經觀測為333。合成法於圖54中例證。
實施例58
化合物138之合成：
在化合物137參考使用標準的三磷酸合成方法進行磷酸化之後，獲得產物138。40%產率，HR LC-MS：經計算為C12H21N2O14P3S2,573.965；經觀測為m/z 573.964。合成法於圖54中例證。
實施例59
化合物141之合成：
將化合物139(2.23克，3.55毫莫耳)、CH2Cl2(20毫升)、3-Å分子篩(3.5克)及環己烯(0.60毫升)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中。將所得混合物在室溫下及在氮氛圍下攪拌20分鐘。將反應冷卻至0℃且經由注射器緩慢地加入SO2Cl2(5.4毫升，在CH2Cl2中的1M，1.5當量)。將反應在0℃下攪拌1.5小時，加入額外的1.8毫升SO2Cl2(在二氯甲烷中的1M溶液)且在0℃下持續攪拌40分鐘，以確保完全轉化成化合物140。在減壓下移除揮發物且保持浴溫接近10℃。將所得固體再懸浮於20毫升無水DMF且保持在氮氛圍下。
在單獨的燒瓶中，將(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(1.98克，9.25毫莫耳)溶解在無水DMF(15毫升)中且以NaH(247毫克，在礦物油中的60%，6.17mM)處理，產生深灰色漿液。接下來加入一份化合物140溶液且將反應在室溫下攪拌1小時。接著將反應混合物分溶在蒸餾水(150毫升)與乙酸乙酯(150毫升)之間。將有機層進一步以蒸餾水(2 x 150毫升)清洗且經Na2SO4乾燥。在減壓下移除揮發物且將殘留物以快速管柱層析術在矽膠管柱上使用己烷中的80至100%乙酸乙酯梯度純化。獲得成為白色固體的目標化合物141(798毫克，28%)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.33(s,1H),7.57(m,1H),6.53(m,2H),6.00(s,2H),4.62(m,2H),4.44(m,1H),4.32(m,2H),3.97(m,1H),3.80-3.60(m,11H),3.10(m,6H),2.36(m,1H),2.24(m,1H),0.80(m,9H)及0.01(m,6H)ppm。以LC-MS進一步確認：(M-H)經觀測為m/z 795.25。合成法於圖55中例證。
實施例60
化合物142之合成：
將化合物141(0.779克，0.98毫莫耳，以P2O5經12小時真空乾燥)及無水THF(20.0毫升)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中且在氮氛圍下冷卻至0℃。經由注射器緩慢地加入TBAF(1.17毫升，在THF中的1M溶液，1.17毫莫耳)且將反應混合物在0℃下攪拌1.5小時。 接下來加入額外的TBAF(1毫升，在THF中的1M溶液，1毫莫耳)且在0℃下反應3小時。接著將反應混合物轉移至分液漏斗中且以加入甲醇(5毫升)淬滅，加入蒸餾水(100毫升)且將反應以乙酸乙酯(2 x 100毫升)萃取。將有機物經Na2SO4乾燥且在真空中濃縮。殘留物以管柱層析術在矽膠上使用己烷中的80至100%乙酸乙酯梯度得到成為白色粉末的化合物142(525毫克，79%)。1H NMR(甲醇-d4)：δH 8.33(s,1H),7.19(m,1H),6.06(m,2H),6.03(m,1H),4.72(m,2H),4.64(m,1H),4.57(m,1H),4.35(m,2H),4.17(m,1H),3.75(m,9H),3.16(m,6H),2.80(m,1H)及2.28(m,1H)ppm；LC-MS：M-H經觀測為m/z 680.0。合成法於圖55中例證。
實施例61
化合物143之合成：
化合物143係自化合物142經由標準方法章節中所述之標準的三磷酸合成程序而合成。產率65%，LRMS-ES-：經計算為C25H33N5O15P3S-，768.09；經觀測為m/z 768.54(M-H)。合成法於圖55中例證。
實施例62
化合物144之合成：
將化合物143(3.80毫升在HPLC等級水中的5.25mM溶液，20微莫耳)及pH 4.65之乙酸鹽緩衝液(4.75毫 升)裝入50毫升錐形管中，且快速與9.0毫升在pH 4.65之乙酸鹽緩衝液中新鮮製備的DMTSF(80mM)溶液合併。將所得混合物在室溫下搖動2小時且以加入NaHCO3飽和水溶液(2毫升)淬滅。將產物立即以製備性HPLC純化(管柱：30x250mm C18 Sunfire，方法：0至2.0分鐘100%A，接著以50%B經70分鐘，流速：25毫升/分鐘，A=50mM TEAB，B=乙腈)。將適當的份凍乾且在溶解於HPLC等級水中之後合併，以供給23.4微莫耳化合物144(73%產率)。LRMS-ES-：經計算為C16H23N5O12P3S2-，634.00，m/z經觀測為634.42(M-H)。合成法於圖55中例證。
將化合物144根據標準方法章節中所述之程序轉化成經染料標識之產物(147)(圖56)。以兩個步驟獲得75%產率之化合物146，LRMS-ES+：經計算為C34H59N7O19P3S4，1090.20，m/z經觀測為1090.24(M+H)。自146獲得50-70%產率之化合物147，HRMS-ES-：經計算為C67H86N9O23P3S4，1605.393；經觀測為m/z 1605.380(M-H)。
實施例63
化合物150之合成：
將化合物148(3.0克，4.58毫莫耳)、25毫升無水CH2Cl2、3-Å分子篩(5.0克)及環己烯(0.55毫升，5.4毫莫耳)裝入250毫升圓底燒瓶中。將所得混合物在室溫下及 在氮氛圍下攪拌10分鐘。接著將反應燒瓶放在冰浴上，經由注射器緩慢地加入SO2Cl2(6.8毫升，在CH2Cl2中的1M，1.5當量)且將反應在0℃下攪拌1小時。接下來加入額外的0.5當量SO2Cl2，以確保完全轉化成化合物149。在真空下移除揮發物且保持溫度接近於10℃。將所得固體再懸浮於20毫升無水DMF中且保持在氮氛圍下。
在單獨的燒瓶中，將(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(2.45克，11.44毫莫耳)在氮氛圍下溶解在無水DMF(30毫升)中且以NaH(274.5毫克，在矽油中的60%)處理，產生灰色漿液。將化合物149立即加入其中且將反應在室溫下及在氮氛圍下攪拌3小時。接著將反應混合物通過以乙酸乙酯(100毫升)清洗的矽藻土®-S過濾。將乙酸乙酯溶液以蒸餾水(2 x 100毫升)清洗，將有機萃取物經Na2SO4乾燥，在真空中濃縮且經由快速管柱層析術在矽膠管柱上使用己烷中的20至50%乙酸乙酯梯度純化。獲得成為白色固體的目標化合物150(1.2克，32%產率，Rf：0.4，己烷：乙酸乙酯/3：2)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.13(m,3H),7.43(m,1H),7.32(m,2H),6.12(m,1H),6.00(s,2H),4.62(m,2H),4.31(m,3H),4.00(m,1H),3.82-3.60(m,13H),2.39(m,1H),1.84(m,1H),0.78(m,9H)及0.01(m,6H)ppm。合成法於圖57中例證。
實施例64
化合物151之合成：
將化合物150(1.2克，1.46毫莫耳)在高真空下以P2O5在乾燥器中經隔夜乾燥且在配備有磁攪拌棒的100毫升燒瓶中溶解於30毫升無水CH2Cl2中。將二甲基二硫(0.657毫升，7.3毫莫耳)加入其中且將反應燒瓶放在冰浴上。加入二四氟硼酸二甲基(甲硫基)鋶(DMTSF，316毫克，1.1當量)且在0℃下攪拌1.5小時。將反應混合物轉移至250毫升分液漏斗中，以50毫升0.1M NaHCO3水溶液中和且以CH2Cl2萃取(2 x 50毫升)。將有機層經Na2SO4乾燥且以旋轉蒸發濃縮。將粗製產物在矽膠管柱上使用己烷中的80-50%乙酸乙酯梯度純化，得到0.82克化合物151(82%產率，RF=0.5，己烷：乙酸乙酯/3：2)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.15(m,3H),7.42(m,1H),7.35(m,2H),6.11(m,1H),4.80-4.65(m,2H),4.34(m,1H),4.28(m,2H),4.10(m,1H),3.83-3.67(m,2H),2.49(m,1H),2.34(s,3H),1.90(m,1H),0.78(m,9H)及0.10(m,6H)ppm。合成法於圖57中例證。
實施例65
化合物152之合成：
將化合物151(0.309克，0.45毫莫耳)及10.0毫升無水THF(10.0毫升)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中且在氮氛圍下放在冰浴上。經由注射器緩慢地加入TBAF(0.72毫升，在THF中的1M溶液，0.72毫莫耳)。將反應混合物在0℃下攪拌3小時。接著將反應混合物轉 移至分液漏斗中且以0.5M NaHCO3水溶液(50毫升)淬滅。接著將所得混合物以乙酸乙酯(2 x 100毫升)萃取且經Na2SO4乾燥。在矽膠管柱上使用梯度7：3至2：3之己烷：乙酸乙酯進行矽膠管柱層析術之後，獲得成為白色粉末的產物152，76%產率(196毫克，Rf=0.3，己烷：乙酸乙酯/1：1)。1H NMR(CDCl3)：δH 8.40(s,1H),8.25(m,2H),7.60(m,1H),7.52(m,2H),6.21(m,1H),4.90-80(m,2H),4.65(m,1H),4.40(m,2H),4.25(m,1H),4.05-3.85(m,2H),2.62(m,1H),2.50(s,3H)及2.31(m,1H)ppm。合成法於圖57中例證。
實施例66
化合物153之合成：
在化合物152參考使用標準三磷酸合成方法進行磷酸化之後，獲得30%產率之化合物153(LC-MS：經計算為C14H23N4O13P3S2，610.98；經觀測為m/z 611.11(M-H)。其根據在標準方法章節中所述之程序進一步轉化成經染料標識之產物(156)(圖58)。以兩個步驟獲得49%產率之化合物155及60-85%產率之化合物156，HRMS-ES-：經計算為C53H68N8O30P3S6 -，1581.156(M-H)；經實測為m/z 1582.160。
實施例67
化合物159 & 160之合成：
將化合物157(2.04克，2.39毫莫耳)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中且以高真空經12小時乾燥。在以氬氣吹洗反應容器之後，依序加入13毫升無水CH2Cl2及環己烯(0.30毫升，2.86毫莫耳)。接著將反應燒瓶放在冰水鹽浴上且攪拌10分鐘，使混合物到達0℃以下。經由注射器經2分鐘逐滴加入SO2Cl2(4.0毫升，在CH2Cl2中1M，4.0毫莫耳)且將反應混合物在0℃下攪拌1小時。經1分鐘逐滴加入額外0.8當量SO2Cl2(2.0毫升，2.0毫莫耳)且將反應在0℃下再攪拌1/2小時。接下來在真空中移除揮發物且保持浴溫度在~10℃。將所得固體再懸浮於15毫升無水DMF且保持在氬氛圍下。
在單獨的100毫升燒瓶中，將(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(TMPM-SH，1.27克，6.0毫莫耳，經隔夜真空乾燥)在氬氛圍下溶解在無水DMF(16毫升)中且以NaH(195毫克，在油中的60%，4.88毫莫耳)處理，產生灰色漿液TMPMT-SNa鹽。攪拌混合物，直到氣體的形成消退為止(約10分鐘)。將TMPMT-SNa鹽立即加入其中且將混合物在室溫下及在氬氛圍下攪拌，直到TLC(微整理：二氯甲烷/水；溶劑：己烷：乙酸乙酯/1：1)確認完全轉化為止(1小時)。接著將反應混合物在過濾漏斗中通過矽藻土®-S(10克)過濾，以二氯甲烷(100毫升)溶析產物。接著將二氯甲烷溶液以水(3x100毫升)清洗。將水層以3x100毫升二氯甲烷萃取。將合併的二氯甲烷萃取物經Na2SO4乾燥且以旋轉蒸發濃縮。接著將其以快速層析術純化(管柱： 100克，梯度：25%-50%己烷：乙酸乙酯5 CV，接著50% EE 10 CV)。
獲得成為白色泡沫的目標化合物160(1.22克，51%產率)。1H NMR(DMSO-d6)：δH 10.63(s,1H),10.15(s,1H),7.95(s,1H),7.3-7.5(m,8H),7.20-7.3(m,2H),6.40(m,1H),6.15(m,1H),4.69(m,2H),4.50(dd,1H),4.30(m,2H),3.95(m,1H),3.81(m,11H),3.3(m,4H),2.7(m,1H),1.05(m,8H),0.8(m,9H)及0.11(m,6H)ppm。LCMS：1019.371Da。合成法於圖59中例證。
另外，獲得成為副產物的TBDMS去保護之產物159，25%產率(0.48克)。Rf=0.2/己烷：乙酸乙酯/1：1。1H NMR(DMSO-d6)：δH 10.63(s,1H),10.15(s,1H),7.95(s,1H),7.3-7.5(m,8H),7.20-7.3(m,2H),6.40(m,1H),6.15(m,1H),4.69(m,2H),4.50(dd,1H),4.30(m,2H),3.95(m,1H),3.81(m,11H),3.5(m,1H),3.3(m,4H),2.7(m,1H)及1.04(m,8H)ppm。LCMS：905.286Da。
實施例68
化合物161之合成：
將化合物160(0.36克，0.35毫莫耳)裝入配備有磁攪拌棒及橡膠隔膜的100毫升圓底燒瓶中且以高真空經12小時乾燥。在以氬氣吹洗之後，加入7毫升無水二氯甲烷及二甲基二硫(0.16毫升，1.76毫莫耳)。將反應燒瓶放在 冰浴上且攪拌10分鐘，使混合物到達0℃。接著加入四氟硼酸二甲基(甲硫基)鋶(DMTSF，80毫克，0.4毫莫耳)且將反應在0℃下攪拌，直到TLC(微整理：二氯甲烷/水；溶劑：己烷：乙酸乙酯/1：1)確認完全轉化為止。將反應混合物轉移至250毫升分液漏斗中，以50毫升0.1M NaHCO3水溶液中和且以CH2Cl2(3 x 50毫升)萃取。將有機層經Na2SO4乾燥且以旋轉蒸發濃縮。將粗製產物在矽膠管柱上純化(管柱：25克，梯度：10%-50%己烷：乙酸乙酯3 CV，接著50%乙酸乙酯5 CV)。獲得成為黃色泡泡沫的目標化合物161(0.23克，74%產率)。合成法於圖59中例證。
實施例69
化合物162之合成：
將化合物161(0.18克，0.20毫莫耳)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中，溶解在7.0毫升無水THF中且在氬氛圍下放在冰浴上。將混合物攪拌10分鐘，使其到達0℃，且加入0.28毫升乙酸。經由注射器經1分鐘逐滴加入TBAF(在THF中的1M，0.47毫升，0.47毫莫耳)。將反應混合物在0℃下攪拌0.5小時及接著在室溫下攪拌1小時。TLC(己烷：乙酸乙酯/1：1)仍顯示出起始材料。經由注射器經1分鐘逐滴加入額外的TBAF(在THF中的1M，0.47毫升，0.47毫莫耳)且將反應混合物室溫下攪拌1小時。接下來將混合物以2毫升甲醇淬滅且在室溫 下攪拌10分鐘。以旋轉蒸發移除溶劑且將粗製產物以矽膠管柱層析術純化(管柱：10克，己烷：乙酸乙酯/1：1至100%經2 CV，接著100%乙酸乙酯經20 CV)，得到成為白色泡沫的化合物162(96毫克，62%)。合成法於圖59中例證。
實施例70
化合物163之合成：
在化合物162參考使用標準的三磷酸合成方法進行磷酸化之後，獲得化合物163；除了在去保護步驟中使用AMA或甲醇氨代替氫氧化銨以外。其根據下文的標準程序進一步轉化成經染料標識之產物166。自化合物165獲得97%產率之化合物166。HRMS-ES-經計算為C67H96N9O27P3S6(M-H)1743.395，經實測為1743.390。合成法於圖59中例證。
實施例71
化合物169之合成：
將化合物167(3.120克，5.66毫莫耳)、30.0毫升無水CH2Cl2、3-Å分子篩(5.0克)及環己烯(0.70毫升，6.9毫莫耳)裝入100毫升圓底燒瓶中。將所得混合物在室溫下及在氮氛圍下攪拌10分鐘。接著將反應燒瓶放在冰浴上。將SO2Cl2(8.5毫升，在CH2Cl2中的1M，1.5當量)經由注射器緩慢地加入其中且在0℃下攪拌1小時。接下 來加入額外的4.0毫升1M SO2Cl2且攪拌40分鐘，以確保完全轉化成化合物168。在真空下移除揮發物且保持溫度接近於10℃。將所得固體再懸浮於20毫升無水DMF且保持在氮氛圍下。
在單獨的燒瓶中，將(2,4,6-三甲氧基苯基)甲硫醇(3.028克，14.15毫莫耳)在氮氛圍下溶解在無水DMF(40毫升)中且以NaH(566毫克，在油中的60%，14.15mM)處理，產生灰色漿液。將化合物168溶液立即加入其中且在室溫下及在氮氛圍下攪拌2.5小時。接著將反應混合物通過矽藻土®-S(20克)以乙酸乙酯(200毫升)過濾。接著將乙酸乙酯溶液以蒸餾水(3 x 200毫升)清洗且經Na2SO4乾燥，以旋轉蒸發濃縮且以快速層析術在120克RediSepRfGold上純化，梯度：己烷：乙酸乙酯(7：3至3：7)。獲得成為白色固體的目標化合物(169)(1.43克，35.5%產率，Rf：0.5，己烷：乙酸乙酯/1：1)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.98(m,1H),6.09(m,1H),6.00(m,2H),4.67-4.51(m,2H),4.30(m,1H),4.22(m,2H),4.00(m,1H),3.80-3-60(m,11H),2.31(m,1H),1.83(m,1H),0.80(m,9H)及0.01(m,6H)ppm。合成法於圖61中例證。
實施例72
化合物170之合成：
將化合物169(1.43克，1.99毫莫耳)在高真空下以P2O5經12小時乾燥且在配備有磁攪拌棒的燒瓶中及在氮 氣來源下溶解於無水CH2Cl2(25毫升)中。將二甲基二硫(0.89毫升，9.88毫莫耳)加入其中且將反應燒瓶在冰浴上攪拌。接著加入四氟硼酸二甲基(甲硫基)鋶(DMTSF，430毫克，2.19毫莫耳)且在0℃下攪拌1.0小時。將反應混合物轉移至500毫升分液漏斗，以100毫升50mM NaHCO3水溶液淬滅且以CH2Cl2(2X 150毫升)萃取。將有機部分經Na2SO4乾燥且以旋轉蒸發濃縮。將粗製產物在矽膠管柱上使用己烷-乙酸乙酯(8：2至3：7)梯度純化(80克RediSepRf gold)，得到0.622克化合物170(54%產率，RF=0.6，己烷：乙酸乙酯/1：1)。1H NMR(CDCl3)：δH 7.99(brs,1H,NH),7.98(s,1H),6.12(m,1H),4.69(m,2H),4.35(m,1H),4.19(m,2H),4.06(m,1H),3.80(m,1H),3.60(m,2H),2.40(m,1H),2.33(s,3H),1.88(m,1H),0.78(m,9H)及0.10(m,6H)ppm。合成法於圖61中例證。
實施例73
化合物171之合成：
將化合物170(0.623克，1.06毫莫耳，以P2O5經12小時真空乾燥)及無水THF(20.0毫升)裝入配備有磁攪拌棒的100毫升圓底燒瓶中且在氮氛圍下放在冰浴上。經由注射器緩慢地加入TBAF(1.27毫升，在THF中的1M溶液，1.27毫莫耳)。將反應混合物在0℃下攪拌1.5小時，加入額外的0.9毫升在THF中的1M TBAF溶液且在0℃ 下總共攪拌4小時。接著將反應混合物轉移至分液漏斗且以0.5M NaHCO3溶液(50毫升)淬滅。將所得混合物以乙酸乙酯(2 X100毫升)萃取且經Na2SO4乾燥。在80克RediSepRf管柱上使用梯度7：3至3：7之乙烷中的乙酸乙酯進行矽膠管柱層析術之後，獲得成為白色粉末的產物171，63%產率(311毫克)。1H NMR(甲醇-d4)：δH 8.16(s,1H),6.06(m,1H),4.79(m,2H),4.69(m,1H),4.40(m,1H),4.14(m,2H),3.99(m,1H),3.63(m,2H),2.36(m,3H),2.32(m,1H)及2.08(m,1H)ppm，LRMS-ES-：M-H經觀測為m/z 468.0Da。合成法於圖61中例證。
實施例74
化合物172之合成：
在化合物171經由使用標準的三磷酸合成方法進行磷酸化之後，獲得58%產率之產物172。LRMS經計算為C14H21N3O14P3S2 -(M-H)，611.97，經實測為612.15。化合物171係根據參考標準方法章節中所述之程序進一步精製成經染料標識之產物(175)(圖62)。以兩個步驟獲得74%產率之化合物174(HRMS-ES-經計算為C32H55N5O21P3S4 -(M-H)1066.15，經實測為1066.42。獲得62%產率之化合物175(HRMS-ES-經計算為C59H80N7O25P3S4 -(M-H)，1507.330，經實測為1507.325。
實施例75
用於三磷酸合成之標準方法：
將在高真空下經P2O5預乾燥之核苷(160微莫耳)及質子海綿(1.5當量)在25毫升梨形燒瓶中在N2氛圍下溶解於磷酸三甲酯(0.8毫升)中且攪拌20分鐘，直到所有的固體完全溶解為止。接著將燒瓶放在冰水浴上，使反應到達(-5至0℃)。接著經由注射器加入一份POCl3(1.5當量)且將反應攪拌1小時。
在15毫升錐形管中製備焦磷酸正丁基銨(0.36克)、n-Bu3N(0.36毫升)與無水DMF(1.3毫升)的混合物，產生濃漿液。一旦完全溶解時，立即將其快速加入劇烈攪拌的混合物中且在室溫下攪拌15分鐘。
接著將反應混合物倒入在250毫升圓底燒瓶中的100毫升0.1M TEAB緩衝液中且在室溫下攪拌3小時。接著在真空中濃縮至25毫升且在室溫下以25毫升氫氧化銨(28-30% NH3含量)處理8小時。在減壓下移除大部分的揮發物之後，將反應粗製物再懸浮於0.1M TEAB緩衝液(30毫升)中且以C18製備性-HPLC純化(30x250mm，C18 Sunfire管柱，方法：0至2分鐘100%A，接著50%B經70分鐘，流速25毫升/分鐘；A=50mM TEAB，B=ACN)。將目標份凍乾且在溶解於HPLC等級水(20毫升)之後合併。將此半純度產物在PL-SAX Prep管柱上以離子交換HPLC進一步純化(方法：0至5分鐘100%A，接著線性梯度至70%B經70分鐘，其中A=在水中的15%乙腈，B=在15%乙腈中的0.85M TEAB緩衝液)。最後的 純化係如上述以C18 Prep HPLC進行。在凍乾之後，獲得20-65%產率之核苷三磷酸。
實施例76
使用DMTSF轉化3'-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP成為3'-(OCH2SSME)-dNTP之標準方法：
將3'-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP(3.80毫升在HPLC等級水中的5.25mM溶液，20微莫耳)及pH=4.65之乙酸鹽緩衝液(5.20毫升)裝入50毫升錐形管中且與9.0毫升DMTSF(在pH=4.65之乙酸鹽緩衝液中的80mM溶液)快速合併。將所得混合物在室溫下搖動2小時且將反應以2.0毫升NaHCO3飽和溶液淬滅，且立刻以製備性HPLC在30X250mmC18 Sunfire管柱上純化，方法：0至2.0分鐘100% A，接著線性梯度至50%B經70分鐘，流速：25毫升/分鐘，A=50mM TEAB，B=乙腈。將目標份乾燥且在溶解於HPLC等級水之後合併，得到取決於核苷酸的50-75%產率之3'-(OCH2SSMe)-dNTP。3'-OCH2S-(2,4,6-三甲氧基苯基)甲烷-dNTP的結構實例於圖63中例證。
實施例77
用於NHS活化之連結子共軛之標準方法：
將溶解於HPLC等級水(2毫升)中的MeSSdNTP-PA(10微莫耳)以新鮮製備之0.5M Na2HPO4水溶液(1毫升) 稀釋。在錐形試管中，將NHS活化之連結子(NHS-A-Fmoc，114，35毫克，2.5當量)溶解在無水DMF(2.0毫升)中。接著立即加入MeSSdNTP-PA/Na2HPO4溶液中且在室溫下攪拌8小時。
接著將反應以0.1M TEAB緩衝液(2.0毫升)稀釋且以哌啶(0.6毫升)處理。將混合物在室溫下攪拌1小時，再以0.1M TEAB(10毫升)稀釋且以prep HPLC在30X250mm C18 Sunfire管柱上快速純化，方法：0至2.0分鐘100%A，接著以線性梯度至50%B經70分鐘，流速：25毫升/分鐘，A=50mM TEAB，B=乙腈。將目標份凍乾且在溶解於HPLC等級水之後合併，得到45-75%產率之MeSSdNTP-A-NH2。
實施例78
以NHS染料標識之標準方法：
將在2.0毫升HPLC等級水中的MeSSdNTP-A-NH2(4.55微莫耳)在15毫升錐形管中以Na2HPO4(0.8毫升0.5M水溶液)稀釋且與在1.4毫升無水DMF中的NHS活化之染料(2.5當量)合併。將反應混合物在室溫下攪拌8小時，以0.1M TEAB緩衝液(40毫升)稀釋且以prep-HPLC在30X250mm C18 Sunfire管柱上純化，方法：0至5分鐘100%A，接著以線性梯度至50%B經70分鐘，流速：25毫升/分鐘)。將目標份凍乾且在溶解於HPLC等級水之後合併，得到50-80%產率的經標識之產物。
實施例79
可裂解的連結子及標記物附著至核鹼基
用於附著可裂解的連結子之較佳的部分之一為以炔丙基為底質或以烯丙基為底質。亦設想附著可裂解的連結子及染料之其他方式。特別在染料裂解後造成少許或沒有殘留連結子的鹼基部分附著特別佳。在裂解後造成不帶有電荷的殘留連結子的鹼基部分附著亦較佳。這些特性對確保核苷酸在標識物/染料裂解後藉由酶以有效的方式併入生長的核酸鏈中具有重要性。由本發明設想的一個特別的實施態樣包含使用經羥甲基修飾之鹼基部分附著可裂解的染料。此等化合物的實例顯示於圖68中。圖69顯示在染料及3'-O保護基裂解後之羥甲基衍生物的結構。
實施例80
可裂解的連結子及3'-O保護基之裂解
可使用各種裂解劑裂解本發明之連結子及保護基。例如，可使用各種攜有硫醇之化合物，如在("Thiol-Disulfide Interchange",Singh,R.和Whitesides,G.M.,Sulfur-Containing Functional Groups；Supplement S,Patai,S.,Eds.,J.Wiley and Sons,Ltd.,1993.p633-658)中所述[15]。特別可使用具有降低的硫醇基團pKa之化合物以達成脂肪及有效的裂解產量，例如二硫丁胺、DTBA(Lukesh等人之J.Am.Chem.Soc.,2012,134(9),pp 4057-4059[16])。可用於進行本發明之裂解的攜有硫醇之 化合物的實例顯示於圖70中。
適合於裂解本發明之二硫終止基團及連結子的另一類別的化合物為膦(Harpp等人之J.Am.Chem.Soc.1968 90(15)4181-4182[12]，Burns等人之J.Org.Chem.1991,56,2648-2650[13]，Getz等人之Analytical Biochemistry 273,73-80(1999)[14])。有用於裂解本發明的以二硫為底質之保護基及連結子之膦的實例包括：三苯基膦、三丁基膦、三羥甲基膦(THMP)、三羥丙基膦(THPP)、三乙氧羰基膦(TCEP)。在特定的例子中，可能希望能夠選擇性地裂解連結子或3'-保護基。這可藉由設計保護基及連結子以及選擇裂解試劑來達成。例如，可出於此目的而使用攜有3'-疊氮甲醚保護基及二硫化物連結子之核苷酸的組合。在此例子中，二硫化物橋的選擇性裂解可藉由使用以硫醇為底質之裂解試劑來實現及3'-疊氮甲醚保護基的移除可藉由使用膦(諸如TCEP)來達成。此等程序的實例於圖71、圖72和圖73中例證。圖71顯示發生化學反應的流程及所形成的化合物結構；圖72顯示在各階段收集的HPLC層析圖；及圖73顯示自各峰提取之吸收光譜。步驟A)經標識之3'-O-經保護之核苷酸顯示一個峰(1)及在核苷酸(280nm；應注意炔丙基化合物的最大峰向280-290nm移動)及染料(575nm)二者的吸收。步驟B)以DTT處理產生具有染料吸收峰(575nm)與遷移較慢(更疏水性)的峰2及具有(278nm)吸收與由於更親水性特徵而遷移更快的峰3。步驟C)以TCEP的額外處理產生在278具有最大吸收 及在甚至更短的滯留時間上沒有染料的峰4，與3'-OH保護基的失去一致。經裂解之染料分裂成額外的峰(5、6)，但是兩個峰具有相同的吸收。
裂解的另一實例顯示於圖74和圖75中。圖74顯示使用在3'端攜有以二硫為底質之保護基及攜有以二硫為底質之連結子的核苷酸之裂解反應流程。如此圖顯示裂解反應可以一個步驟或2步驟方法進行。圖75顯示使用下列的各種裂解劑進行之裂解實驗的結果：二硫琥珀酸、L-半胱胺酸、DTT和半胱胺。圖75(A)顯示以起始材料及在以裂解劑二硫琥珀酸、L-半胱胺酸、DTT和半胱胺培育後的反應混合物所產生的RP-HPLC層析圖。圖75(B)顯示反應混合物的經鑑定之組成物，表明在L-半胱胺酸、DTT和半胱胺的例子中使連結子及3'-保護基二者完全裂解，及在二硫琥珀酸的例子中選擇性裂解3'-O-保護基。這表明選擇性可藉由選擇連結子、保護基的結構及裂解劑的本性而達成(亦即以SH基團不同的pKa及立體阻礙程度)。除了該等以外，可使用各種適合的裂解劑，諸如雙(2-巰乙基)碸(BMS)和N,N'-二甲基-N,N'-雙(巰乙醯基)肼(DMH)(Singh等人之Bioorg.Chem.,22,109-115(1994)[17]。反應可以內含的硒醇進一步催化(Singh等人之Anal Biochem.1995 Nov 20；232(1)：86-91[18])。亦可出於此目的而使用硼氫化物(諸如硼氫化鈉)(Stahl等人之Anal.Chem.,1957,29(1),pp 154-155[19])以及抗壞血酸(Nardai等人之J.Biol.Chem.276,8825-8828(2001) [20])。另外，亦熟知用於裂解二硫化物鍵之酶方法，諸如二硫化物和硫還原酶，且可由本發明化合物使用(Holmgren等人之Methods in Enzymology,Volume 252,1995,Pages 199-208[21])。
實施例81
清除劑
根據所使用的裂解劑，熟習本技術領域者必須選擇在完成裂解反應後移除過量裂解劑之清除劑。例如，可使用能夠與游離SH基團反應的清除劑用於攜有硫醇之裂解劑。例如，可使用烷基化劑，諸如碘乙醯胺或順丁烯二醯亞胺衍生物(美國專利第8,623,598號[47]，併入本文以供參考)。熟習本技術領域者可使用攜有酮之化合物用於硼氫化物，例如戊酮酸或類似的化合物。最後，亦可以使用氧化試劑，使過量裂解劑氧化成無反應性種類，例如過碘酸鹽(Molecules 2007,12(3),694-702[48])。
實施例82
模式化合成
本發明的經標識之核苷酸需要許多合成步驟且包含連結各種染料至不同的鹼。希望能夠以模式化方式而不以逐步法進行連結子及染料附著。模式化方法包含預建造在一端具有保護基的連結子部分及在另一端的活化基團。接著可使用此等預建造之連結子與炔丙胺核苷酸偶合、使遮蔽 之胺基去保護及接著偶合活化基團。這與逐步合成法相比而具有更少的步驟及更高的產率之優點。例如，在圖13中的化合物32為包含具有活化之反應性基團(二琥珀醯亞胺基碳酸酯)及經遮蔽/保護之胺(Fmoc)的可裂解的官能度之預活化連結子的實例。在與炔丙胺核苷酸上的游離胺偶合之後，保護基可藉由例如以鹼處理(水性氨、哌啶)而合宜地移除且可與活化之(NHS)染料分子偶合。
實施例83
測試本發明之連結子以測量彼等的疏水性。化合物之logP值為在正辛醇與水之間的化合物分配係數之對數log(c辛醇/c水)，該值為化合物親水性(或欠缺親水性)之完整確立的量度[49]。低的親水性及因此高的logP值引起差的吸收或穿透。在此例子中，logP值係使用預測軟體計算，下表顯示結果，表明連結子(諸如在圖25中的連結子)為疏水性連結子，而一些在市場上使用的連結子為親水性。
雖然本發明已參考該等較佳的實施態樣予以說明，但是其他的實施態樣可達成相同的結果。本發明之變化及修改為那些熟習本技術領域者所明白且意欲使所有此等修改物及同等物涵蓋於所附之申請專利範圍內。將上文引述之 所有申請案、專利與公告及對應之申請案的完整揭示內容特此併入本文以供參考。
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Claims (61)

  1. 一種根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中D係選自由下列所組成之群組：疊氮化物、二硫化烷基、經二硫化物取代之烷基；B為核鹼基；A為選自由下列所組成之群組的附著基團：炔丙基、羥甲基、環外胺、炔丙胺和炔丙基羥基；C為選自由下列所組成之群組的可裂解的部位核心：、和，其中R1和R2係獨立地選自烷基；L1和L2為連接基團，其中L1係選自由下列所組成之群組：-CONH(CH2)x-、-CO-O(CH2)x-、-CONH-(OCH2CH2O)x-、-CO-O(CH2CH2O)x-和-CO(CH2)x-，其中x為0-10，且其中L2係選自由下列所組成之群組：-NH-、-(CH2)x-NH-、-C(Me)2(CH2)xNH-、-CH(Me)(CH2)xNH-、-C(Me)2(CH2)xCO-、-CH(Me)(CH2)xCO-、-(CH2)xOCONH(CH2)yO(CH2)zNH-、-(CH2)xCONH(CH2CH2O)y(CH2)zNH-和-CONH(CH2)x-、-CO(CH2)x-、其中x、y和z各自獨立地選自0-10；及Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤(mass-tag)、生物素和半抗原。
  2. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該核鹼基為選自由下列所組成之群組的非天然核鹼基類似物：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基，7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。
  3. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：其中該標識物為染料。
  4. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  5. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  6. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  7. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  8. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  9. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  10. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  11. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  12. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  13. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  14. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  15. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  16. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  17. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  18. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  19. 根據申請專利範圍第1項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該化合物具有下列結構：
  20. 一種根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中D係選自由下列所組成之群組：疊氮化物、二硫化烷基、經二硫化物取代之烷基、二硫化烯丙基和經二硫化物取代之烯丙基；B為核鹼基；連結子包含可裂解的含二硫甲醛(oxymethylenedisulfide)部位核心，其中該可裂解的部位核心係選自由下列所組成之群組：、、和，其中R1和R2係獨立地選自烷基；及Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。
  21. 根據申請專利範圍第20項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該連結子具有大於0之logP值。
  22. 根據申請專利範圍第20項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該連結子具有大於0.1之logP值。
  23. 根據申請專利範圍第20項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該連結子具有大於1.0之logP值。
  24. 一種包含核鹼基與糖之去氧核苷三磷酸，該核鹼基包含經由可裂解的二硫甲醛連結子附著之可檢測標識物，該糖包含以包含二硫甲烷(methylene disulfide)之可裂解的保護基封端之3'-O，該去氧核苷三磷酸具有下列結構：，其中D係選自由下列所組成之群組：二硫化烷基、經二硫化物取代之烷基、二硫化烯丙基和經二硫化物取代之烯丙基；B為核鹼基；連結子包含可裂解的含二硫甲醛部位核心，其中該可裂解的部位核心係選自由下列所組成之群組：、、和，其中R1和R2係獨立地選自烷基；及Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。
  25. 根據申請專利範圍第24項之去氧核苷三磷酸，其中該核苷係在具有聚合酶之混合物中。
  26. 根據申請專利範圍第24項之去氧核苷三磷酸，其中該核苷之核鹼基為非天然的。
  27. 根據申請專利範圍第26項之去氧核苷三磷酸，其中該核苷之該非天然核鹼基係選自包含下列之群組：7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜腺嘌呤、2-胺基，7-去氮雜腺嘌呤和2-胺基腺嘌呤。
  28. 根據申請專利範圍第24項之去氧核苷三磷酸，其中該可裂解的保護基具有式-CH2-SS-R，其中R係選自由下列所組成之群組：烷基和經取代之烷基。
  29. 根據申請專利範圍第25項之去氧核苷三磷酸，其中該混合物另外包含引子。
  30. 根據申請專利範圍第29項之去氧核苷三磷酸，其中該引子係與核酸模板(template)雜交。
  31. 根據申請專利範圍第24項之去氧核苷三磷酸，其中該可檢測標識物為螢光標識物。
  32. 根據申請專利範圍第30項之去氧核苷三磷酸，其中將該核酸模板固定。
  33. 一種根據下列結構的經標識之去氧核苷三磷酸：其中B為核鹼基，R係選自由下列所組成之群組：烷基和經取代之烷基，及L1和L2為連接基團，其中L1和L2係獨立地選自由下列所組成之群組：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N和-N=N-、烷基、芳基、支鏈烷基、支鏈芳基及彼等之組合，且其中Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。
  34. 根據申請專利範圍第33項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中該標識物為可檢測標識物。
  35. 根據申請專利範圍第33項的經標識之去氧核苷三磷酸，其中L2不為-S-。
  36. 一種套組，其包含DNA聚合酶及至少一種包含核鹼基與糖之去氧核苷三磷酸，該糖包含在3'-O上之可裂解的保護基，其中該可裂解的保護基包含二硫甲烷，且其中該核苷另外包含經由可裂解的二硫甲醛連結子附著至該核苷之核鹼基的可檢測標識物，其中該去氧核苷三磷酸具有下列結構：其中B為核鹼基，R係選自由下列所組成之群組：烷基和經取代之烷基，及L1和L2為連接基團，其中L1和L2係獨立地選自由下列所組成之群組：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N和-N=N-、烷基、芳基、支鏈烷基、支鏈芳基及彼等之組合，且其中Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。
  37. 一種反應混合物，其包含核酸模板連同與該模板雜交之引子、DNA聚合酶及至少一種包含核鹼基與糖之去氧核苷三磷酸，該糖包含在3'-O上之可裂解的保護基，其中該可裂解的保護基包含二硫甲烷，其中該核苷另外包含經由可裂解的二硫甲醛連結子附著至該核苷之核鹼基的可檢測標識物，其中該去氧核苷三磷酸具有下列結構：其中B為核鹼基，R係選自由下列所組成之群組：烷基和經取代之烷基，及L1和L2為連接基團，其中L1和L2係獨立地選自由下列所組成之群組：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N和-N=N-、烷基、芳基、支鏈烷基、支鏈芳基及彼等之組合，且其中Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原。
  38. 一種進行DNA合成反應之方法，其包含步驟a)提供核酸模板連同與該模板雜交之引子、DNA聚合酶、至少一種包含核鹼基與糖之去氧核苷三磷酸，該糖包含在3'-O上之可裂解的保護基，其中該可裂解的保護基包含二硫甲烷，其中該核苷另外包含經由可裂解的二硫甲醛連結子附著至該核苷之核鹼基的可檢測標識物，其中該去氧核苷三磷酸具有下列結構：其中B為核鹼基，R係選自由下列所組成之群組：烷基和經取代之烷基，及L1和L2為連接基團，其中L1和L2係獨立地選自由下列所組成之群組：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N和-N=N-、烷基、芳基、支鏈烷基、支鏈芳基及彼等之組合，且其中Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原，及b)使該反應混合物接受能使DNA聚合酶催化引子延伸反應的條件。
  39. 根據申請專利範圍第38項之方法，其中該DNA聚合酶催化之引子延伸反應為定序反應的一部分。
  40. 一種分析DNA序列之方法，其包含步驟：a)提供核酸模板連同與該模板雜交之引子，以形成引子/模板雜交複合物，b)添加DNA聚合酶及包含核鹼基與糖之第一去氧核苷三磷酸，該糖包含在3'-O上之可裂解的保護基，其中該可裂解的保護基包含二硫甲烷，其中該核苷另外包含經由可裂解的含二硫甲醛連結子附著至該核苷之核鹼基的第一可檢測標識物，其中該去氧核苷三磷酸具有下列結構：其中B為核鹼基，R係選自由下列所組成之群組：烷基和經取代之烷基，及L1和L2為連接基團，其中L1和L2係獨立地選自由下列所組成之群組：-CO-、-CONH-、-NHCONH-、-O-、-S-、-C=N和-N=N-、烷基、芳基、支鏈烷基、支鏈芳基及彼等之組合，且其中Label為選自由下列所組成之群組的標識物：螢光團染料、能量轉移染料、質量標籤、生物素和半抗原，c)使該反應混合物接受能使DNA聚合酶催化引子延伸反應的條件，以產生經改質之引子/模板雜交複合物，及d)檢測在該經改質之引子/模板雜交複合物中的該去氧核苷三磷酸之該第一可檢測標識物。
  41. 根據申請專利範圍第40項之方法，其另外包含步驟：e)自該經改質之引子/模板雜交複合物移除該可裂解的保護基及隨意地移除該可檢測標識物，及f)重複步驟b)至e)至少一次。
  42. 根據申請專利範圍第41項之方法，其中該方法另外包含在重複步驟b)期間添加第二去氧核苷三磷酸，其中該第二去氧核苷三磷酸包含經由可裂解的二硫甲醛連結子附著的第二可檢測標識物，其中該第二可檢測標識物不同於該第一可檢測標識物。
  43. 根據申請專利範圍第42項之方法，其中該可裂解的含二硫甲醛連結子具有大於0之logP值。
  44. 根據申請專利範圍第42項之方法，其中該可裂解的含二硫甲醛連結子具有大於0.1之logP值。
  45. 根據申請專利範圍第42項之方法，其中該可裂解的含二硫甲醛連結子具有大於1.0之logP值。
  46. 根據申請專利範圍第42項之方法，其中該第二去氧核苷三磷酸的該核鹼基不同於該第一去氧核苷三磷酸的該核鹼基。
  47. 根據申請專利範圍第41項之方法，其中在步驟b)中使用至少4個經不同標識於3'-O之經二硫甲烷封端之去氧核苷三磷酸化合物的混合物，該去氧核苷三磷酸化合物代表A、G、C和T或U之類似物。
  48. 根據申請專利範圍第41項之方法，其中在步驟b)中使用至少4個經不同標識於3'-O之經二硫甲烷封端之去氧核苷三磷酸化合物的混合物，該化合物具有下列結構：
  49. 根據申請專利範圍第48項之方法，其中在步驟b)中亦使用具有下列結構的未經標識於3'-O之經二硫甲烷封端之去氧核苷三磷酸化合物：
  50. 根據申請專利範圍第41項之方法，其中步驟e)係藉由將該經改質之引子/模板雜交複合物暴露於還原劑來進行。
  51. 根據申請專利範圍第50項之方法，其中該還原劑為TCEP。
  52. 一種製備3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷之方法，其包含：a)提供i)3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷，及ii)R-SH，其中R包含烷基或經取代之烷基；及b)在產生3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷的條件下處理該3'-O-(甲基硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷。
  53. 根據申請專利範圍第52項之方法，其中該R-SH為乙硫醇。
  54. 根據申請專利範圍第52項之方法，其中該條件包含鹼性條件。
  55. 一種製備3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷之方法，其包含：a)提供3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷；及b)在產生3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷的條件下處理該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5'-O-(三級丁基二甲基矽基)-2'-去氧核苷。
  56. 根據申請專利範圍第55項之方法，其中該條件包含將該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷暴露於NH4F。
  57. 一種製備3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷之三磷酸的方法，其包含：a)提供3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷；及b)在產生3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷之三磷酸的條件下處理該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷。
  58. 根據申請專利範圍第57項之方法，其中該條件包含將該3'-O-(經R取代-二硫甲基)-2'-去氧核苷暴露於(MeO)3PO與POCl3及Bu3N。
  59. 根據申請專利範圍第57項之方法，其中該方法另外包含步驟c)移除該核鹼基保護基。
  60. 根據申請專利範圍第59項之方法，其中該保護基包含N-三氟乙醯基-胺基炔丙基保護基。
  61. 根據申請專利範圍第60項之方法，其中該N-三氟乙醯基-胺基炔丙基保護基係藉由溶劑分解而移除，以產生5'-O-(三磷酸)-3'-O-(經R取代-二硫甲基)-5-(胺基炔丙基)-2'-去氧核苷。
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