TWI636132B - 耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株及含彼之藻類生物反應器 - Google Patents
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Abstract
本發明有關於一種耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，其利用化學突變劑處理小球藻(Chlorella vulgaris)的野生株後，篩選耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，可應用於藻類生物反應器。
Description
本發明是有關於一種藻類突變株及其應用，特別是有關於一種耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株及含彼之藻類生物反應器。
藻類吸收二氧化碳及光經轉換後，可釋放出氧氣。藻類每年可生產約520億噸的有機碳，相當於地球每年碳排放量之一半。在海洋中，藻類扮演食物鏈中最初級的供應者。全球現已知約有30萬種藻類品種，但僅有數十種被現今商業化開發與生產。
十八世紀起，藻類的應用逐漸多元，從褐藻中可萃取出碘和碳酸鈉，也開始定點種植這些藻類；1860年代，Alfred Nobel利用矽藻土(Diatomaceous earth)發明黃色炸藥(dynamite)，其中矽藻土是由矽藻細胞壁的二氧化矽沉積而形成，可吸收液狀硝化甘油，將其轉為固體，提
升硝化甘油之穩定性。隨著對藻類的研究發展，十九世紀含有多醣的褐藻膠(hydrocolloids)開始用於工業；1940年代發現微藻是海洋生物的食物來源；1948年後，從德國到美國、以色列、日本和義大利等國開始利用藻類作為生物質(biomass)，生產蛋白質和脂肪等營養物質。
以藻類生技為主的產業，每年約產出千萬噸的藻類作為各種商業化應用，包括食品、飼料、添加劑、化妝品與色素等，且目前仍以傳統培養技術的生產為主，新興基因改造技術的運用則多處於研發階段。
另外，人類活動排放大量二氧化碳等溫室氣體所產生的增溫效應，使全球正面臨暖化的威脅。微藻養殖過程中會進行固碳反應，1公斤的微藻可以固定2公斤的二氧化碳，因此微藻養殖有助於減碳。臺灣近年在再生能源和減碳發展策略上，也持續致力於發展藻類生質能科技。
燃煤發電廠、煉鋼廠等排放大量含有二氧化碳的煙道氣，可利用含有藻類的生物反應器吸收，目前雖有初步實驗成功案例，但因煙道氣的溫度較高，且含有濃度較高的二氧化碳、硫氧化物(SOx)、氮氧化物(NOx)等，現有藻類難以在此嚴苛的條件下存活，因而限制藻類的應用面。
有鑑於此，亟需提供一種新的藻類突變株，具有耐高溫、耐較高濃度的二氧化碳、硫氧化物(SOx)、氮氧化物(NOx)等特性，以拓展藻類的應用。
因此，本發明之一態樣是在提供一種耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株。
本發明之另一態樣係在提供一種藻類生物反應器(algal biological reactor；ABR)，包含反應器及設於反應器內的小球藻突變株。
根據本發明之上述態樣，提出一種耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株。在一實施例中，上述小球藻突變株係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 980047，寄存日期為2017年12月7日。
根據本發明之另一態樣，提出一種藻類生物反應器(algal biological reactor；ABR)。在一實施例中，ABR包含反應器及上述小球藻突變株。
應用本發明之耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，其利用化學誘變處理小球藻(Chlorella vulgaris)野生株後，篩選耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株ESP-31(283)，可應用於藻類生物反應器。
100‧‧‧方法
101/101a/101b‧‧‧藻液
103‧‧‧NTG溶液
105/135‧‧‧箭頭
111‧‧‧固態培養盤
113‧‧‧培養箱
115‧‧‧人工光源
117‧‧‧加溫器
121‧‧‧培養盤
131‧‧‧厭氧袋
133‧‧‧氣體源
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下：〔圖1〕係繪示根據本發明一實施例的小球藻之化學誘變處理的部分製程示意圖。
〔圖2A〕及〔圖2B〕係繪示根據本發明一實施例之
小球藻突變株與野生株於5% CO2(圖2A)或25% CO2(圖2B)培養後的生質量直條圖。
〔圖3〕係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於25% CO2及高溫(40℃)培養後的生質量直條圖。
〔圖4〕係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於模擬煙道氣中進行大量培養後的生質量曲線圖。
〔圖5〕係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於模擬煙道氣中進行大量培養後的葡萄糖含量及脂質含量的直條圖。
承前所述，本發明提供一種耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，其利用化學誘變處理處理小球藻(Chlorella vulgaris)後，篩選耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，可應用於藻類生物反應器。
本發明此處所稱的小球藻突變株係指寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存編號為BCRC 980047、寄存日期為2017年12月7日的小球藻突變株ESP-31(283)。
在一實施例中，上述化學誘變處理可利用各種習知的化學突變劑，例如N-甲基-N'-硝基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine；NTG)，於光照環境下進行化學誘變處理後，移至黑暗環境下修復，再於
高溫、高二氧化碳濃度之光照環境下，篩選出耐高溫及耐高二氧化碳濃度之小球藻突變株。惟前述利用化學突變劑對藻類進行化學誘變處理的方式，實乃本發明所屬領域中具有通常知識者所熟知，故不另贅述。
本發明此處所稱的高溫係指溫度大於適合藻類培養的溫度，一般為28℃。在一例示中，高溫環境可指溫度超過37℃的環境，例如約40℃的環境。
本發明此處所稱的高二氧化碳濃度係指二氧化碳濃度至少15%的環境。在一實施例中，高二氧化碳濃度可例如二氧化碳濃度25%的環境。在一例示中，上述所得之小球藻突變株ESP-31(283)於二氧化碳濃度25%之環境培養4天後，其生長量高於野生株，例如小球藻突變株ESP-31(283)的生長量為野生株的生長量約1.25倍。
上述小球藻突變株ESP-31(283)可應用於藻類生物反應器。本發明此處所稱的生物反應器係指藻類光合生物反應器(algae bioreactor；ABR)或光合生物反應器(photobioreactor；PBR)。在一實施例中，ABR可包含但不限於反應器及設於反應器內的小球藻突變株，其中反應器的型式不拘，可以是任何適用於藻類培養的反應器。，含有小球藻突變株之ABR可應用於處理較高溫且含有較高濃度的二氧化碳、硫氧化物(SOx)、氮氧化物(NOx)等煙道氣。
本發明此處所稱的煙道氣係指通過煙道，例如熔爐、鍋爐等輸送的管道，排出到大氣中的燃燒廢氣。一般而言，煙道氣的主要成分含有二氧化碳、硫氧化物(SOx)、
氮氧化物(NOx)、水蒸氣、其他化學物質甚至固體懸浮物等。在一實施例中，煙道氣主要含有二氧化碳濃度至少25%、硫氧化物(SOx)濃度至少90ppm及氮氧化物(NOx)濃度至少90ppm。在一例示中，上述所得之小球藻突變株ESP-31(283)可以在含有二氧化碳濃度至少25%、硫氧化物(SOx)濃度至少90ppm以及氮氧化物(NOx)濃度至少90ppm之環境培養。在上述例示中，小球藻突變株ESP-31(283)於模擬煙道氣中經培養後，其生長量、葡萄糖含量及脂質含量分別高出野生株約5.57倍、約1.35倍及約4.81倍，確實具有優異的固碳及生產脂質的能力，可應用於固碳、處理煙道氣甚至生物精煉等平台。
以下利用數個實施例以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。
以下實施例係使用國立成功大學張嘉修教授於台南養蝦場採集的小球藻進行以下實驗。
上述小球藻的18s rDNA的序列經定序後，其序列如序列辨識編號1(SEQ ID NO：1)所示，經與GenBank現有的序列比對後，確認為小球藻(Chlorella vulgaris)，以下稱為小球藻野生株ESP-31。
小球藻野生株ESP-31每個月以固態培養盤進行固態培養，以利於繼代保種。簡言之，將小球藻野生株ESP-31塗佈於含有表1之BG-11培養基的固態培養盤上，於28℃及30μmol/m2s之光強度下進行固態培養，培養期間維持12小時的光照/黑暗循環。
上述BG-11培養基是參考Stanier RY等人在1971年發表於Bacteriol.Rev.第35期第171-205頁、標題為「Purification and properties of unicellular bluegreen algae(Order Chroococcales)」一文，此處一併列為參考文獻。
上述BG-11培養基經高溫高壓滅菌並冷卻後，調整至pH7.4。
小球藻在進行液態培養時，可在無菌環境下，利用接種環由上述BG-11固態培養盤中刮取小球藻野生株ESP-31單一群落的細胞，接種至30mL之BG-11培養液中，於28℃並以30μmol/m2s之光強度進行液態培養，培養期間維持12小時的光照/黑暗循環。經三週培養到OD680吸光值為0.5至1.0的直線生長範圍時，進行後續化學誘變處理、篩選突變株及各項評估。
此實施例係參考Golden S.S.在1988年發表於Methods Enzymol.第167卷第714-727頁、標題為「Mutagenesis of cyanobacteria by classical and gene-transfer-based methods」一文揭示的方法，對小球藻ESP-31進行化學誘變處理，此處一併列為參考文獻。
請參閱圖1，其係繪示根據本發明一實施例的小球藻之化學誘變處理的部分製程示意圖。首先，小球藻野生株ESP-31以BG-11培養液(pH 7.4)培養到OD680吸光值0.4至0.5時，取30mL藻液101離心(3,500rpm，10分鐘)後，以無菌10mM檸檬酸緩衝溶液(pH6.0)重複清洗並離心(3,500rpm，10分鐘)細胞沉澱物(pellet)二次。
上述所得的小球藻ESP-31細胞沉澱物加入950μL 10mM檸檬酸緩衝溶液，使小球藻ESP-31細胞分
散成藻液101，以進行小球藻突變株的製造方法100。在此方法100中，首先，在藻液101加入最終濃度500μg/mL之NTG溶液103(作為化學突變劑)，如圖1箭頭105所示，於28℃並以50μmol/m2s之光強度，對含有小球藻ESP-31的藻液101進行化學誘變處理30分鐘。接著，藻液101經離心(3,500rpm，10分鐘)後，收集小球藻ESP-31細胞，以BG-11培養液(pH 7.4)重複清洗並離心(3,500rpm，10分鐘)細胞沉澱物三次。然後，加入2mL BG-11培養液(pH 7.4)使小球藻ESP-31細胞分散，於黑暗環境下培養並修復1天。之後，將小球藻ESP-31細胞的藻液101a塗佈於含有BG-11培養基的固態培養盤111上，置於培養箱113中，以人工光源115照光並以加溫器117維持於40℃，培養7天至10天。
接下來，挑選在40℃生長快速之小球藻ESP-31單一群落，接種於96孔培養盤121，將含有藻液101b之培養盤121置於密封之厭氧袋131中，由氣體源133提供厭氧袋131達15%的CO2，如圖1箭頭135所示，再置於培養箱113中，以光源115提供50μmol/m2s之光強度並以加溫器117維持於40℃，培養4天至7天。之後，以市售儀器(例如BioTek Synergy HT Microplate Reader)檢測96孔培養盤121之每孔的OD680吸光值，篩選出耐高溫且耐高二氧化碳濃度之小球藻突變株，命名為小球藻突變株ESP-31(283)，並進行後續評估。
上述小球藻突變株ESP-31(283)與小球藻野生株ESP-31分別培養於50mL之BG-11培養液中，以150μmol/m2s之光強度及含有5% CO2(圖2A)或25% CO2(圖2B)的環境中培養4天，其結果分別如圖2A及圖2B所示。
請參閱圖2A及圖2B，其係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於5% CO2(圖2A)或25% CO2(圖2B)培養後的生質量直條圖，其中縱軸為藻液的生質量(g/L)，橫軸為培養時間(日)，WT代表小球藻野生株ESP-31，283則代表小球藻突變株ESP-31(283)。
由圖2A及圖2B結果顯示，小球藻突變株ESP-31(283)培養於BG-11培養液中，以150μmol/m2s之光強度並通入25% CO2培養4天，其生質量(由0.06g/L生長至1.61g/L)高於小球藻野生株ESP-31的生質量(0.06g/L生長至1.28g/L)。經計算後，小球藻突變株ESP-31(283)在25% CO2培養的生質量為野生株ESP-31生質量的1.25倍。
小球藻突變株ESP-31(283)與小球藻野生株ESP-31分別培養於50mL之BG-11培養液中，於40℃並以150μmol/m2s之光強度及含有25% CO2的環境中培養4天，其結果如圖3所示。
請參閱圖3，其係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於25% CO2及高溫(40℃)培養後的生質量直條圖，其中縱軸為藻液的生質量(g/L)，橫軸為培養時間(日)，WT代表小球藻野生株ESP-31，283則代表小球藻突變株ESP-31(283)。
由圖3結果顯示，小球藻突變株ESP-31(283)之生質量(0.06g/L生長至1.08g/L)高於小球藻野生株ESP-31之生質量(0.06g/L生長至0.20g/L)。經計算後，小球藻突變株ESP-31(283)在25% CO2及40℃的生質量為野生株ESP-31生質量的5.4倍。
小球藻突變株ESP-31(283)與小球藻野生株ESP-31分別培養於1L之BG-11培養液中，於40℃並以150μmol/m2s之光強度及模擬煙道氣(含25% CO2、90~100ppm SO2及90~100ppm NO)中進行大量培養9天，再移至空氣培養19天，其結果如圖4及圖5所示。
請參閱圖4，其係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於模擬煙道氣中進行大量培養後的生質量曲線圖，其中縱軸為藻液的生質量(g/L)，橫軸為培養時間(日)，WT代表小球藻野生株ESP-31，283則代表小球藻突變株ESP-31(283)。
由圖4結果顯示，小球藻突變株ESP-31(283)在模擬煙道氣中經大量培養9天，再移至空氣培養19天，其
生質量(0.06g/L生長至0.78g/L)高於小球藻野生株ESP-31之生質量(0.06g/L生長至0.14g/L)。經計算後，小球藻突變株ESP-31(283)的生質量為野生株ESP-31生質量的5.57倍。
請參閱圖5，其係繪示根據本發明一實施例之小球藻突變株與野生株於模擬煙道氣中進行大量培養後的葡萄糖含量及脂質含量的直條圖，其中縱軸分別為藻液在模擬煙道氣中經大量培養9天，再移至空氣培養19天的葡萄糖含量(%)(左縱軸)及脂質含量(%)(右縱軸)，WT代表小球藻野生株ESP-31，283則代表小球藻突變株ESP-31(283)。脂質含量係利用氯仿及甲醇溶液萃取藻體的粗脂肪後，測量粗脂肪的重量。此乃本發明所屬領域中具有通常知識者所熟知，故不另贅述。
由圖5結果顯示，小球藻突變株ESP-31(283)在模擬煙道氣中經大量培養9天，再移至空氣培養19天，其葡萄糖含量(24.2%)及脂質含量(17.8%)高於小球藻野生株ESP-31之葡萄糖含量(17.9%)及脂質含量(3.7%)。經計算後，小球藻突變株ESP-31(283)的葡萄糖含量及脂質含量分別為野生株ESP-31的1.35倍及4.81倍。
由上述結果顯示，小球藻突變株ESP-31(283)的耐高溫、耐高濃度二氧化碳、耐煙道氣的能力，皆優於小球藻野生株ESP-31，確實有潛力應用於固碳、處理煙道氣甚至生物精煉等平台。
綜言之，本發明雖以特定種類的小球藻、特定的化學誘變處理、特定篩選方式或特定的評估方式作為例示，說明本發明之耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株及含彼之藻類生物反應器，惟本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者可知，本發明並不限於此，在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明之耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株亦可使用其他種類的綠藻、其他化學誘變處理、其他篩選方式或其他的評估方式進行。舉例而言，本發明之耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株可應用到其他類型的藻類生物反應器，以更有效固碳、處理煙道氣甚至生物精煉等。
由上述實施例可知，本發明之耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，其優點在於利用化學誘變處理小球藻野生株後，篩選耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株，可應用於藻類生物反應器。
雖然本發明已以數個實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
小球藻突變株寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存日期為2017年12月7日，寄存編號為BCRC 980047。
<110> 國立成功大學
<120> 耐高溫及耐煙道氣之小球藻突變株及含彼之藻類生物反應器
<130> 無
<160> 1
<210> 1
<211> 700
<212> DNA
<213> 小球藻(Chlorella vulgaris)
<400> 1
Claims (2)
- 一種耐高溫及耐煙道氣之小球藻(Chlorella vulgaris)突變株，其係寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 980047，寄存日期為2017年12月7日。
- 一種藻類生物反應器(algal biological reactor；ABR)，包含：一反應器；以及小球藻突變株，設於該反應器內，其中該小球藻突變株係設於該反應器內，且寄存於中華民國財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 980047，寄存日期為2017年12月7日。
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Citations (1)
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2017
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Patent Citations (1)
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| 月，Fatty acid profile of Chlorella biomass obtained by fed batch heterotrophic cultivation，International Food Research Journal 24(1): 284-291 2015年， * |
Also Published As
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