TWI627957B - 以ｐｄｉａ４蛋白作為糖尿病之診斷、監測及治療之標的 - Google Patents

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Abstract

本發明係揭示一種Pdia4抑制劑，用於預防、緩解、及/或治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症，其中Pdia4抑制劑不含聚多炔糖苷(cytopiloyene)。本發明亦揭示Pdia4抑制劑及一其他抗糖尿病藥劑，用於組合療法，以預防、緩解、治療有需求之個體之糖尿病及糖尿病相關併發症，及/或逆轉糖尿病，其中用於組合療法之Pdia4抑制劑可包含聚多炔糖苷。本發明亦揭示診斷、治療、及監測糖尿病之方法，以及篩選Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑之方法。

Description

以PDIA4蛋白作為糖尿病之診斷、監測及治療之標的
本發明係有關以Pdia4作為糖尿病治療標的之角色及用途。
現今的抗糖尿病藥劑，包括胰島素敏化劑、胰島素釋放劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑、腸促胰泌素(incretin)系藥物(GLP-1類似物及二肽基胜肽酶第4型抑制劑)、SGLT2抑制劑等，已發展成可經由不同機制控制葡萄糖恆定。然而，上述治療藥劑僅可改進第二型糖尿病(T2D)症狀，但無法回復病症。人體及動物研究證據顯示，T2D之特徵為功能性β細胞量減少，其無法適應胰島素分泌以補償逐漸升高的胰島素抗性，致使發展成T2D(圖1)。前臨床及臨床試驗數據顯示，β細胞功能及量持續下降，導致發展成T2D。已有累積之數據顯示，此減少情況可經穩定化、延緩、及甚而逆轉，尤其是在糖尿病早期階段，這提高了一種可能性，即保留功能性β細胞量為預防及治療T2D所不可或缺。然而，縱使TZDs及GLP-1類似物經報告於臨床前動物研究中能預防β細胞萎縮，但目前尚無抗糖尿病藥物於臨床上經證實能有效保留β細胞量及功能。
蛋白質雙硫鍵異構酶(protein disulfide isomerases；PDIs)家族於哺乳類動物之發育及疾病扮演重要角色。人體中有九個PDI成員，其含有 1至3個CGHC活性位點。於九個人類PDIs中，Pdia-4為唯一具3個CGHC模體(motif)之PDI成員。Pdia-4基因功能於胰臟β細胞之細胞生長及存活能力目前未知，遑論其於糖尿病之角色。
本發明係有關於一種發現，即Pdia4於β細胞之表現可因反應於代謝壓迫(metabolic stress)而向上調節。糖尿病動物血中Pdia4增加。此外，Pdia4負向調控β細胞功能。反之，減少Pdia4可保護β細胞。Pdia4於小鼠模式中使糖尿病發展加劇。令人意外地，藉由Pdia4抑制/消除而保留β細胞連同藉由胰島素敏化劑二甲雙胍(metformin，甲福明)及二甲雙胍/羅格列酮(rosiglitazone)而減少胰島素抗性之組合，於前臨床試驗中可逆轉糖尿病及減少糖尿病併發症。
於一方面，本發明係有關一種治療有效量之Pdia4抑制劑之用途，以製造用於預防、緩解、及/或治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症之藥劑，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表現，且其中Pdia4抑制劑之用途不含使用式(I)化合物： 其中，R為H或COCH2COOH；m=3或4；n=0或1； o=2；以及p=1或2。
於本發明之一具體實施例，Pdia4抑制劑係選自於由 、及組成之群組。
於另一方面，本發明係有關一種治療有效量之Pdia4抑制劑及治療有效量之其他抗糖尿病藥劑之用途，用於製造組合療法之藥劑，以預防、緩解、治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症，及/或逆轉糖尿病，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表 現。於本文提及之本發明具體實施例，Pdia4抑制劑之用途可包含式(I)化合物之使用： 其中，R為H或COCH2COOH；m=3或4；n=0或1；o=2；以及p=1或2。
於本發明之另一具體實施例，Pdia4抑制劑係選自於由 、、及所組成群組之化合物。
於本發明之另一具體實施例，Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白表現，且係選自於由反義分子、三螺旋分子、核糖核酸酵素、及shRNA組成之群組。
於本發明之另一具體實施例，Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性，且係選自於由抗Pdia4抗體、類萜、及多炔組成之群組。
於本發明之另一具體實施例，多炔係式(II)化合物：
其中R1為H、C1-C10烷基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、C3-C20環烷基、C3-C20環烯基、C1-C20雜環烷基、C1-C20雜環烯基、芳基、或雜芳基；R2為H或單糖殘基；R3為H或C1-C10烷基；m為2、3、或4；n為0、1、2、 或3；o為0、1、2、3、或4；以及p為1、2、3、或4。
於本發明之另一具體實施例，多炔係式(I)化合物： 其中，R為H或COCH2COOH；m=3或4；n=0或1；o=2；以及p=1或2。
於本發明之另一具體實施例，式(I)化合物係選自於由 、及 組成之群組。
於本發明之另一具體實施例，化合物為聚多炔糖苷。
類萜可為二類萜，其係選自於由12-O-乙醯基-8,14-二羥基-17-甲基-3-乙醯甲胺磷甲苯磺醯基乙酸(12-O-acetyl-8,14-dihydroxy-17-methyl-3-orthenthosyletienic acid)、8,14-二羥基-12-O-(4,5-二甲基己醯基)-17-甲基-3-乙醯甲胺磷甲苯磺醯基孕甾烯醇酮(8,14-dihydroxy-12-O-(4,5-dimethylhexanoyl)-17-methyl-3-orthenthosylpregne nolone)、及12-O-桂皮醯基-8,14-二羥基-17-甲基-3-乙醯甲胺磷甲苯磺醯基乙酸(12-O-cinnamoyl-8,14-dihydroxy-17-methyl-3-orthenthosyletienic acid)組成之群組。
於本發明之另一具體實施例，個體患有第二型糖尿病。
於本發明之另一具體實施例，其他抗糖尿病藥劑係胰島素敏化劑。
於本發明之另一具體實施例，shRNA包含核苷酸序列，其係選自於由SEQ ID NOs：1-4組成之群組。
抗糖尿病藥劑可選自於由胰島素敏化劑(雙胍、PPARγ促效劑)、類升糖素胜肽第一型(GLP-1)類似物、DPPV抑制劑、鈉/葡萄糖共運輸蛋白第二型(SGLT2)抑制劑、β-葡萄糖苷酶抑制劑、胰淀素(amylin)類似物、 膽酸螫合劑、及多巴胺促效劑組成之群組。
糖尿病相關併發症包括眼部疾病、心血管疾病、腎臟疾病、及足部潰瘍。
或者，本發明係有關一種治療有效量之Pdia4抑制劑，用於預防、緩解、及/或治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表現，且其中Pdia4抑制劑不含式(I)化合物： 其中，R為H或COCH2COOH；m=3或4；n=0或1；o=2；以及p=1或2。
或者，本發明係有關一種預防、緩解、及/或治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症之方法，其包含：投予個體治療有效量之Pdia4抑制劑，以緩解及/或治療個體之糖尿病，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表現，且其中Pdia4抑制劑不含式(I)化合物： 其中，R為H或COCH2COOH；m=3或4；n=0或1；o=2；以及p=1或2。
或者，本發明係有關治療有效量之Pdia4抑制劑及其他抗糖尿病藥劑，用於組合療法，以預防、緩解、及治療有需求之個體之糖尿病及糖尿病相關併發症，及/或逆轉糖尿病，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表現。
或者，本發明係有關一種方法，用於預防、緩解、及治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症，及/或逆轉糖尿病，其包含：以組合療法投予個體治療有效量之Pdia4抑制劑及其他抗糖尿病藥劑，以緩解、治療個體之糖尿病及糖尿病相關併發症，及/或逆轉糖尿病，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表現。
於另一方面，本發明係有關一種診斷、治療、及監測糖尿病之方法，其包含：(a)量化個體血中Pdia4蛋白濃度；(b)當個體血中Pdia4蛋白濃度高於正常對照組個體時，將該個體鑑定 為糖尿病患者；(c)給予該鑑定為糖尿病患者之個體抗糖尿病藥劑；(d)於投予該鑑定為糖尿病患者之個體抗糖尿病藥劑後，進一步量化血中Pdia4蛋白濃度；以及(e)相較於投予抗糖尿病藥劑前之情況，當血中Pdia4蛋白濃度減少時，確定該個體於投予抗糖尿病藥劑後顯示糖尿病之改進。
於本發明之一具體實施例，抗糖尿病藥劑包含Pdia4抑制劑。
此外，於另一方面，本發明係有關一種篩選Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑之方法，其包含：(a)於投予糖尿病動物測試化合物前或後，量化糖尿病動物之血中Pdia4蛋白濃度；以及(b)當糖尿病動物於投予測試化合物後血中Pdia4蛋白濃度減少時，鑑定該測試化合物為Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑；或者(i)於存在及不存在測試化合物下，測定Pdia4蛋白活性；以及(ii)當於測試化合物存在下Pdia4蛋白活性減少時，鑑定該測試化合物為Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑，其中Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性或抑制Pdia4蛋白表現。
此外，於另一方面，本發明係有關一種篩選Pdia4抑制劑之方法，其包含：(i)於測試化合物之存在及不存在下，其係於緩衝溶液中經鑑定，將減少之BPTI培養於GST-Pdia4；(ii)於測試化合物之存在及不存在下，其係於步驟(c)之緩衝溶液中經 鑑定，測定減少之BPTI之量；以及(iii)鑑定測試化合物為Pida4抑制劑。
又，於另一方面，本發明係有關一種治療個體糖尿病前期或糖尿病之方法，其包含：(a)投予個體治療有效量之Pdia4抑制劑；(b)於投予至個體後，藉監測血中葡萄糖或胰島素濃度，及/或胰臟β細胞功能及量一段時間而鑑定個體之糖尿病前期或糖尿病為Pdia4抑制反應性，其中血中葡萄糖或胰島素濃度之改進，及/或胰臟β細胞功能及/或量之維持，則該個體之糖尿病前期或糖尿病被鑑定為Pdia4抑制反應性；以及(c)進一步投予Pdia4抑制劑或不同之Pdia4抑制劑至個體。
本發明之彼等及其他方面將因下列較佳具體實施例並結合附圖之說明而顯見，雖然可能進行變化及改良，但不背離本發明新穎概念之精神及範疇。
附圖係說明本發明之一或多個具體實施例，連同書面說明，一併闡述本發明之原理。儘可能，貫穿附圖使用相同元件符號，以指稱具體實施例之相同或類似元件。
圖1A-1C係顯示Pdia4蛋白於β細胞、血液、及其他組織中之濃度。(A)小鼠胰島係以指示濃度之葡萄糖處理48小時。以總溶解產物進行SDS-PAGE，並以指示抗體進行西方墨點法。(B)非糖尿病(WT)及糖尿病db/db小鼠之血清Pdia4蛋白濃度，其係分別以ELISA套組及抗Pdia4抗體量化。(C)收集不同小鼠組織，並分析Pdia4蛋白濃度。西方墨點法之結果列於圖1B。結果以平均值±SEM表示，其係取自3次獨立實驗。*P<0.05； **P<0.01；***P<0.001。
圖2A-2D係顯示β細胞之Pdia4蛋白濃度響應代謝壓迫而向上調節。(A-C)Min-6細胞，一種β細胞株，係以指示濃度之葡萄糖(A)、棕櫚酸鹽(B)、及STZ(C)處理48小時。以總溶解產物進行SDS-PAGE，並以抗Pdia4或肌動蛋白抗體進行西方墨點法。(D)將無糖尿病野生型(WT)及糖尿病lepr db/db小鼠之胰臟胰島分離及溶解，接著以抗Pdia4及抗肌動蛋白抗體進行西方墨點法。結果以平均值±SEM表示，其係取自3次獨立實驗。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
圖3A-3C係顯示Pdia4缺乏可增加β細胞功能及胰島保護。(A)野生型(WT)及pdia4 -/-小鼠胰島係以指示劑量之葡萄糖(3.3mM與16.7mM)刺激30分鐘。測定上清液之胰島素濃度。(B)野生型(WT)及pdia4 -/-小鼠接受80mg/kg體重(BW)之STZ單一腹腔(i.p.)注射。於犧牲後，以相對二羥基乙錠螢光及胰島尺寸測定小鼠胰島之活性氧系(ROS)濃度。(C)野生型(WT)及pdia4 -/-小鼠接受80mg/kg體重(BW)之三劑STZ。移除小鼠胰腺，並以抗胰島素抗體及蘇木精與曙紅(H&E)染色。確定胰島面積，係依據胰島型態，係藉組織化學染色顯示。數據以平均值±SEM表示。*P<0.05；**P<0.01。
圖4A-4F係顯示於化學誘發性及自發性糖尿病模式中，Pdia4缺乏可抑制糖尿病發展。(A-B)與圖3C相同之小鼠之空腹血糖(FBG，A部分)及進食後血糖(PPBG，B部分)，其係於指示年齡以血糖計測定。(C-D)以標準飲食餵食野生型(WT)、pdia4 -/-、lepr db/db 、及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠。測定小鼠空腹血糖(FBG，C部分)及進食後血糖(PPBG，D部分)，其係於指示年齡以血糖計測定。(E-F)根據公式HOMA-β=20×胰島素(μU/mL)/〔葡萄糖(mmol/L)- 3.5〕取得圖4C小鼠之HOMA-β(E)。(F)以TUNEL試驗量化與圖4C相同之小鼠之死亡細胞數。小鼠數目(n)係表示於括號內。WT係*P<0.05；lepr db/db 係#P<0.05。
圖5A-5C係顯示Pdia4缺乏/抑制及胰島素敏化劑之組合可逆轉糖尿病。(A)lepr db/db 及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠每日接受PBS載劑(Veh)、二甲雙胍(MET，60mg/kg BW)、及二甲雙胍(MET，60mg/kg BW)/羅格列酮(ROS，20mg/kg BW)之劑量。以血糖計測定其進食後血糖。(B)藉聚多炔糖苷(cytopiloyne)抑制GST-Pdia4之雙硫鍵異構酶活性。減少之BPTI係於載劑、GST-Pdia4、或GST-Pdia4存在下培養於氧化還原緩衝液，其中含不同劑量之CP。GST-Pdia4之酵素活性係以減少之BPTI的減少百分比呈現。(C)lepr db/db 小鼠每日接受PBS載劑(Veh)、聚多炔糖苷(CP，2.5mg/kg)、聚多炔糖苷(CP，2.5mg/kg)/二甲雙胍(MET，60mg/kg BW)、及聚多炔糖苷(CP，2.5mg/kg)/二甲雙胍(MET，60mg/kg BW)/羅格列酮(Ros，20mg/kg BW)之劑量。以血糖計測定其進食後血糖。
圖6A-6E係顯示於糖尿病小鼠模式，Pdia4缺乏可減少糖尿病相關併發症。(A)六週大野生型(WT)及pdia4 -/-小鼠連續3天接受腹腔注射PBS或STZ(80mg/kg BW/天)。四週後，小鼠接受全身X光分析。其中顯示小鼠骨密度，且箭頭代表股骨及膝關節。(B-C)六週大野生型(WT)及pdia4 -/-小鼠係分別以皮膚穿孔器及氫氧化鈉於皮膚(B)及角膜(C)產生傷口。其中顯示指定時間點之傷口影像。(D)收集及測定lepr db/db 及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠於30週齡之尿液樣本。其中顯示肌酸酐清除率(creatinine clearance ratio；CCR)。(E)收集及測定lepr db/db 及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠於46週齡之血液樣本。其中顯示三酸甘油酯 及高密度脂蛋白(HDL)之濃度。
圖7A-7E係顯示以Pdia4抑制劑之虛擬篩選及化學結構篩選及鑑定Pdia4抑制劑。Pdia4活性結構域係用於篩選Pdia4抑制劑。(A)Pdia4活性結構域與CP結合之結構。(B-D)Pdia4活性結構域與化合物00322271(B)、00547011(C)、及00244418(D)結合之結構。Pdia4活性結構域及化合物係分別以綠色及棕色表示。(E)與Pdia4活性結構域最適化之萜炔類結構。
圖8A-8C係分別說明一些經鑑定之Pdia4抑制劑之化學結構(A)、其生物活性(B)、及相對抑制作用(%)(C)。Pdia4(縮寫成A4)係於存在及不存在Pdia4抑制劑(109291、156588、156590、302308、及CP)下培養於其受質胰島素。
定義
本說明書所使用之術語一般而言具有其於本領域、本發明全文中、及使用各術語之特定上下文中之普通涵義。用於說明本發明之特定術語係討論如下或本說明書之他處，以提供執行人額外之指導關於本發明之說明。為方便起見，可使用如斜體及/或引號凸顯特定術語。使用凸顯方式不會影響術語之範疇及意義；無論是否經凸顯，相同上下文之術語之範疇及意義係相同。應理解到，可以一種以上之方式描述相同事物。因此，本文所論及之術語之任一者或多者可使用另一語言及同義詞，且其非以任何特殊意義替代，不論本文所闡述或論及之術語為何。本文提供特定術語之同義詞。一或多個同義詞之聲明並未排除使用其他同義詞。本說明書中隨處使用之實例係僅用於闡述，該實例包括本文所論及之任何術語之實例，且不以任何方式侷限本發明或任何示例性術語之範疇及意義。同樣地， 本發明未侷限於本說明書給定之各具體實施例。
除非另有定義，本文使用之所有技術性及科學性術語具本發明所屬領域之技術人員能普遍理解之相同意義。於衝突情況下，將以本文件，包括定義為基準。
本文所使用之「約略」、「約」、或「大約」等詞一般應指介於一給定數值或範圍之20百分比內，較佳為介於10百分比內，且更佳為介於5百分比內。本文給定之數字量皆為近似值，係指若無明文規定時，可以「約略」、「約」、或「大約」等詞推斷。
「治療」或「處理」等詞是指投予一有效量之治療劑至有需求之個體，其目的在於治癒、緩解、舒緩、治療、改善、或預防該疾病、其症狀、或其傾向。該個體可由健康照護專業人員界定，其係基於任何適用診斷方法之結果。
「有效量」是指需賦予治療效果予待處理個體所需之活性藥劑量。有效劑量將可變，如本領域技術人員之理解，其取決於投予途徑、賦形劑使用、及與其他治療共同使用之可能性。
Pdia4意指蛋白質雙硫鍵異構酶A家族第4成員。人類Pdia4蛋白序列如SEQ ID NO：5所示。shRNAs序列之實例如SEQ ID NOs：1-4所示。
由美國保健與服務部食品藥物管理局出版之「Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」揭示「人體等效劑量」可取自下列公式之計算：HED=動物劑量(mg/kg)×(動物體重(kg)/人類體重(kg))0.33。
目前關於Pdia4於糖尿病之角色仍不明。本發明係有關發現Pdia4表現以反應代謝壓迫。本發明亦有關發現Pdia4於β細胞功能及量之角色。本發明係進一步有關發現Pdia4缺乏/抑制與胰島素敏化劑之組合對T2D發展之影響。本發明亦有關發現Pdia4於T2D併發症之角色。Pdia4之表現係因反應於代謝壓迫而向上調節，該代謝壓迫如高劑量之葡萄糖、脂質、及化學物質。相對於無糖尿病小鼠，糖尿病小鼠血中Pdia4增加。如此，使得Pdia4可作為糖尿病診斷的良好指標。同時，Pdia4消除減少糖尿病併發症，如骨質疏鬆、皮膚潰瘍、眼部疾病、腎臟疾病、及心血管疾病。此外，Pdia4可用於篩選及鑑定Pdia4抑制劑為抗糖尿病藥劑。
相較於現有技術，本發明之獨特特徵及優勢如下：(1)無報告指出糖尿病與Pdia4之間有關聯；(2)現已發現，糖尿病小鼠β細胞及血液之Pdia4表現量向上調節；(2)現亦發現，Pdia4係位於細胞核、細胞質、及細胞膜部位。本發明之商業上應用包括但不侷限於，以Pdia4作為糖尿病診斷標記、以Pdia4作為抗糖尿病治療標的；以及以標的Pdia4單獨地及結合其他抗糖尿病藥物以預防及治療糖尿病。
實施例
未意圖侷限本發明之範疇，本發明具體實施例之示例性儀器、裝置、方法、及其相關結果描述如下。應注意到，標題或子標題可用於實例以方便讀者，其不應以任何方式侷限本發明之範疇。此外，本文提出及揭示特定理論；然而，不論對錯，其不應以任何方式侷限本發明之範疇，只要該發明根據本發明實施，且不考慮任何特定理論或作用機制。
研究設計及方法
試劑、細胞、及動物
鏈佐黴素(Streptozotocin；STZ)、葡萄糖、棕櫚酸鹽、二羥基乙錠(DHE)、二甲雙胍、及羅格列酮係購自Sigma-Aldrich。蘇木精係購自Biocare Medical Inc.。曙紅係購自Muto Pure Chem Inc.。MIN6細胞，一種小鼠β細胞株，係培養於RPMI-1640(Invitrogen)，內含20% FBS及5%青黴素/鏈黴素。細胞係培養於37℃之5% CO2潮濕環境。C57BL/6及lepr db/m 小鼠係購自Jackson laboratory。欲產生pdia4 -/- C57BL/6小鼠，首先以細菌人工染色體(BAC)重組策略構築Pdia4基因標的載體。簡言之，一230-kb BAC殖株(Geneservice，USA)含有所指小鼠pdia4基因之完整對偶基因。Neo基因匣，其由二同源臂、二loxP位點、及Neo基因組成，係經由同源重組插入BAC之pdia4基因之內含子6。於首個Neo基因匣藉Cre彈出後，第二個Neo基因匣，內含二同源臂、二frt位點、一loxP位點、及Neo基因，係經由同源重組插入BAC之pdia4基因之內含子2。於線性化後，此BAC構築體係經電穿孔進入C57BL/6 ES細胞。於重組篩選後，選取經標的之ES系以進行胚囊注射，且反過來，產生嵌合體小鼠。欲產生pdia4 -/-小鼠，嵌合體小鼠係首先以C57BL/6小鼠配種，以取得pdia4 floxed/+小鼠，接著同型育種。隨後，pdia4 floxed/floxed 小鼠係與EIIa/Cre清除子小鼠交配，以取得pdia4 +/-小鼠，其外顯子3至6係清除。pdia4 +/-小鼠同型交配產生野生型(pdia4 +/+)、pdia4 +/-、及pdia4 -/-小鼠，接著以PCR及西方墨點法進行基因型分析。此外，pdia4 -/-小鼠係以lepr db/m 小鼠育種，以取得pdia4 -/- lepr db/db 小鼠。所有動物皆自由取得飲食及水，且於21-23℃之動物機構設施維持12小時明亮-12小時黑暗的週期。所有的小鼠作業皆根據中央研究院機構動物照護及使用委員會之準則處理。
藥物投予及代謝參數測定
欲清除小鼠胰臟β細胞，6週大WT及pdia4 -/- C57BL/6小鼠係以80mg/kg STZ連續腹腔注射3天。此外，部份WT及pdia4 -/- 小鼠係接受食鹽水以作為載劑對照組。欲測定空腹血糖濃度，於STZ之最終投予後，小鼠禁食整夜。隔天，小鼠自由取用飲食2小時，接著移去飲食。於0.5小時後，測定進食後血糖及胰島素之濃度。於STZ之最終注射後，於第0、3、5、7、9、11、及13天監測血糖濃度。糖尿病性高血糖症係定義為於二或多個連續測試中，空腹血糖濃度≧200mg/dl。欲處理lepr db/db 小鼠，於指定時間餵食PBS或結合聚多炔糖苷(2.5mg/kg/天)、二甲雙胍(60mg/kg/天)、及二甲雙胍(60mg/kg/天)加上羅格列酮(20mg/kg/天)。測定進食後血糖。欲處理pdia4 -/- lepr db/db 小鼠，於指定時間餵食PBS、二甲雙胍(60mg/kg/天)、及二甲雙胍(60mg/kg/天)加上羅格列酮(20mg/kg/天)。測定進食後血糖。
細胞凋亡試驗
進行末端去氧核苷酸基轉移酶dUTP鏈裂端標籤化(TUNEL)試驗，其係使用ApopTag原位細胞凋亡檢測套組(Millipore)。TUNEL陽性細胞係以Axio Vision顯微鏡(Carl Zeiss)拍照，並由影像手動計數。利用Axio Vision程式(Carl Zeiss)測量胰島面積。
測定葡萄糖及胰島素
於空腹整夜後，小鼠自由取用飲食2小時。以Elite血糖計(Bayer)測定小鼠空腹或進食後血糖濃度。以ELISA試驗(Mercodia)測定血液樣本或小鼠胰島上清液之胰島素濃度。
測定ROS產生
二羥基乙錠(DHE)係反應於超氧陰離子，形成紅色螢光產物乙錠，其係插入DNA。胰臟冷凍切片或小鼠胰島係於37℃下培養於10μM DHE中10分鐘。於ddH2O清洗三次後，以Axio Vision螢光顯微鏡(Carl Zeiss)觀察乙錠染色情形。以Axio Vision程式(Carl Zeiss)量化胰臟胰島細胞之螢光強度。
分離胰臟胰島及測定胰島素分泌
將十八週大之小鼠禁食整夜。以膠原蛋白酶P(Roche)分解作用分解其胰腺，並以histopaque-1077(Sigma)梯度離心法收取。胰臟胰島(5胰島/孔)係於基礎葡萄糖(3.3mM)或高葡萄糖(16.7mM)存在下培養於克雷布斯-林格碳酸氫鹽(Krebs-Ringer bicarbonate；KRB)緩衝液中30分鐘。收集上清液，進行胰島素ELISA試驗。
西方墨點法分析
MIN6細胞或小鼠胰島係於RPMI無葡萄糖培養基中飢餓1小時。隨後，細胞或胰島係以指定之葡萄糖濃度處理48小時。於高脂處理方面，細胞或胰島係隨後以載劑或0.4mM棕櫚酸鹽(含有5.6mM葡萄糖及0.92% BSA)處理48小時。於STZ處理方面，細胞或胰島係隨後於指定時間以載劑或10mM STZ處理。於充分清洗後，以裂解緩衝液(10mM Tris-HCl pH 7.4、10mM KCl、1.5mM MgCl2、250mM蔗糖、1mM EDTA、1mM EGTA、1% NP-40、及1X蛋白酶抑制劑)裂解細胞或小鼠胰島。於離心後，將總溶解產物進行SDS-PAGE，並將蛋白轉移至PVDF薄膜。於阻斷後，以指定之抗體探測薄膜。
基於牛胰臟胰蛋白酶抑制劑(BPTI)之試驗
由大腸桿菌純化穀胱甘肽瓊脂糖珠結合之GST-Pdia4(0.15μg)。欲測試CP對GST-Pdia4之雙硫鍵異構酶活性之影響，減少之BPTI(0.39μg)係於載劑、5.64μg GST-Pdia4、或5.64μg GST-Pdia4加上不同劑量之CP(0、0.33μg、3.3μg、及33μg)之存在下培養於氧化還原緩衝液。GST-Pdia4之酵素活性係以所述減少之BPTI百分比(%)表示。
評估糖尿病併發症
欲評估骨密度，野生型小鼠及pdia4 -/-小鼠，其係以PBS或STZ處理，接受全身X光分析。骨密度及股骨與膝關節髓腔如所指。欲評估皮膚潰瘍，野生型小鼠及pdia4 -/-小鼠，其係以PBS或STZ處理，以打孔器產生傷口。以測徑器測量傷口。於眼部傷害方面，野生型小鼠及pdia4 -/-小鼠，其係以PBS或STZ處理，以氫氧化鈉產生傷害。當小鼠曝露於紫外線時，拍攝眼部之損傷。欲評估糖尿病小鼠之腎功能，於18週時收集lepr db/db 及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之尿液樣本，並以肌酸酐試驗套組(ab65340)分析肌酸酐。以7600 Clinical Aanazyler(Hitachi)測定血液樣本之生化參數。
Pdia4試驗
於25℃之氧化還原緩衝液，於指定劑量之載劑或CP存在下，將胰島素(200μM)與重組型Pdia4(1.65μg)培養30分鐘。經由公式100%×(載劑之OD595-CP之OD595)/(載劑之OD595)，取得Pdia4酵素活性之抑制作用結果。
虛擬篩選
欲製備化學數據庫，將內部(in-house)化學物質庫(261個化合物)轉換成3D座標，其係藉Discovery Studio/Prepare Ligand Module，使用力 場CHARMm以最小化化合物。欲製備蛋白質結構，使用源自PDB之Pdia4活性結構域晶體結構。殘基之質子化狀態係調整至pH 7.5之主離子形式。以GOLD 5.1版(CCDC Software Limited，Cambridge，U.K.)進行分子嵌合(molecular docking)。以GOLD將內部化學物質庫嵌合至Pdia4蛋白活性結構域，其中開啟彈性嵌合選項。於下列嵌合程序期間，Cys260與Cys269胺基酸殘基之側鏈結構維持彈性，並以內建GOLD套裝軟體旋轉異構體庫建構模型。進行初始100個獨立基因演算週期之計算，其中配位體扭轉角(torsion angles)係於-180與180度間變化。搜尋效率設定為100%，以確保最徹底搜尋嵌合構形空間。於有效使用計算資源方面，嵌合計算係限定在以活性位點為中心之15Å半徑球體內，其於應用約束(constraints)下涵蓋所有可能的化合物。所有原始參數係用於GOLD基因演算。所得之配位體-蛋白質複合體結構係以GOLDSCORE評分功能進行排名，以決定最高命中(top hits)(8,14-二羥基-12-O-(4,5-二甲基己醯基)-17-甲基-3-乙醯甲胺磷甲苯磺醯基孕甾烯醇酮、12-O-乙醯基-8,14-二羥基-17-甲基-3-乙醯甲胺磷甲苯磺醯基乙酸、及12-O-桂皮醯基-8,14-二羥基-17-甲基-3-乙醯甲胺磷甲苯磺醯基乙酸)。CP及其衍生物亦採取相同策略。
結果
Pdia4蛋白係向上調節以反應糖尿病小鼠β細胞及血液之代謝壓迫。
欲探索Pdia4於β細胞及糖尿病之角色，發明人首先評估Pdia4於小鼠胰島之表現。發明人發現，Pdia4主要表現於胰腺及胰臟胰島(圖1A-圖1C)。更重要地，胰臟胰島之Pdia4蛋白濃度，而非PDI及 ERP57，係經向上調節以響應高葡萄糖(圖1A)。發明人亦確認，Pdia4於β細胞之濃度係向上調節以響應代謝壓迫(圖2A-圖2C)。同樣地，糖尿病lepr db/db 小鼠β細胞之Pdia4蛋白濃度增加(圖2D)。
欲測試Pdia4蛋白濃度與糖尿病間之關聯性，發明人以Elisa套組測定無糖尿病C57BL/6及糖尿病lepr db/db 小鼠血中Pdia4之蛋白濃度。發明人之結果顯示，於6或18週齡之無糖尿病C57BL/6小鼠及6週齡之lepr db/db 小鼠，血中Pdia4蛋白濃度不斷變低(圖1B)。然而，18週大糖尿病小鼠血中Pdia4濃度明顯向上調節(圖1B)。數據顯示，血中Pdia4為糖尿病診斷標記。
Pdia4缺乏可增加胰島素分泌及胰島保留但減少β細胞之ROS。
接著，發明人調查Pdia4於β細胞功能及保留之基因功能。發明人比較野生型及pdia4 -/-小鼠胰島之胰島素分泌。於3.3mM葡萄糖存在下，pdia4 -/-胰島釋放之胰島素高於野生型胰島2倍以上(圖3A)。於16.7mM葡萄糖存在下，pdia4 -/-胰島釋放之胰島素比野生型胰島高出更多(圖3A)。數據顯示，Pdia4缺乏可增進β細胞功能。發明人亦測定以一劑PBS或STZ處理之野生型及pdia4 -/-小鼠胰島之ROS濃度。發明人發現，STZ明顯增強野生型小鼠胰島之ROS濃度(圖3B)。相反地，pdia4 -/-胰島產生之ROS濃度比野生型胰島的低(圖3B)。數據顯示，Pdia4缺乏可減少ROS累積。此外，發明人評估以3劑PBS或STZ處理之野生型及pdia4 -/-小鼠之胰島架構。發明人發現，pdia4 -/-胰島對STZ介導之細胞凋亡抗性比野生型胰島的高，係如胰島面積所示(圖3C)。
Pdia4缺乏可經由增進β細胞功能及減少胰島細胞死亡而降 低糖尿病小鼠模式之血糖。
欲評估Pdia4於糖尿病發展之基因功能，發明人首先以化學物質STZ於野生型及pdia4 -/-小鼠誘發糖尿病。發明人發現，野生型小鼠之空腹血糖及進食後血糖類似於pdia4 -/-小鼠(圖4A-圖4B)。相反地，STZ處理之野生型小鼠之空腹血糖及進食後血糖比STZ處理之pdia4 -/-小鼠的高(圖4A-圖4B)。與取自圖3C之數據一致的是，取自圖4A-圖4B之數據顯示，Pdia4缺乏可賦予保護小鼠胰島對抗β細胞及糖尿病。發明人亦比較lepr db/db 及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之糖尿病發展。lepr db/db 小鼠自8週齡自發地發展糖尿病，係如空腹血糖(圖4C)及進食後血糖(圖4D)所示。相反地，pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之空腹血糖(圖4C)及進食後血糖(圖4D)比lepr db/db 小鼠的低。數據顯示，Pdia4缺乏可賦予保護小鼠胰島β細胞及糖尿病(圖4C-圖4D)。
恆定模式評估(HOMA)係用於評估β細胞功能。野生型小鼠之HOMA-β值比pdia4 -/-小鼠的稍低(圖4E)。相反地，pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之HOMA-β值比lepr db/db 小鼠的明顯更高(圖4E)。數據顯示，Pdia4缺乏可改進β細胞功能。
接著，發明人研究Pdia4對野生型C57BL/6、pdia4 -/- C57BL/6、lepr db/db 、及pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之β細胞死亡之影響。發明人發現，pdia4 -/-小鼠之胰臟胰島細胞死亡比野生型小鼠的稍低。據此，pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之胰臟胰島細胞死亡比lepr db/db 小鼠的更低(圖4F)。
整體而言，數據顯示，Pdia4缺乏可經由改進β細胞功能及存活率而減少糖尿病。
結合Pdia4缺乏/抑制與降低胰島素抗性可逆轉糖尿病。
保留β細胞為治療糖尿病之關鍵。發明人之數據顯示，Pdia4缺乏可改進及保留β細胞功能，但無法逆轉糖尿病。接著，發明人調查Pdia4消除/抑制與胰島素敏化劑二甲雙胍(60mg/kg BW)、羅格列酮(20mg/kg BW)、或兩者對pdia4 -/- lepr db/db 及lepr db/db 小鼠糖尿病之組合效應。發明人指出，lepr db/db 小鼠具較高之進食後血糖(圖5A)。相反地，pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之進食後血糖200mg/dL(圖5A)。以二甲雙胍(60mg/kg BW)、羅格列酮(20mg/kg BW)、或兩者處理，能正常化pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之高血糖症(圖5A)。數據顯示，Pdia4缺乏及胰島素敏化劑可治療糖尿病。
聚多炔糖苷顯示可抑制Pdia4酵素活性(圖5B)。發明人亦檢查結合聚多炔糖苷與胰島素敏化劑(二甲雙胍、羅格列酮、或兩者)對lepr db/db 小鼠糖尿病之影響。lepr db/db 小鼠具較高之進食後血糖(圖5C)。相反地，聚多炔糖苷可降低lepr db/db 小鼠之進食後血糖(圖5C)。此外，結合聚多炔糖苷與二甲雙胍或二甲雙胍加上羅格列酮可完全正常化lepr db/db 小鼠之進食後血糖(圖5C)。數據顯示，Pdia4抑制及胰島素敏化劑可治療糖尿病。
整體而言，數據顯示，Pdia4基因剔除/抑制並伴隨敏化劑可逆轉糖尿病。
Pdia4對糖尿病相關併發症之影響
發明人亦調查Pdia4於糖尿病相關併發症之基因功能，該併發症如腎病、骨質疏鬆、皮膚潰瘍、及眼部損傷。發明人比較糖尿病性野生型C57BL/6及pdia4 -/- C57BL/6小鼠於STZ處理後股骨及膝關節之骨質疏鬆。全身X光分析之數據顯示，野生型及pdia4 -/- 小鼠之骨密度於STZ處理後4週降低(圖6A)。有趣的是，pdia4 -/- 小鼠之髓腔比野生型小鼠的大(圖6A)。然 而，於STZ處理後4週，pdia4 -/-小鼠之股骨頭(femur head)比野生型小鼠的更密集(圖6A)。數據顯示，Pdia4缺乏可減少骨質疏鬆。
接著，發明人評估Pdia4對野生型及pdia4 -/-小鼠傷口癒合之影響。發明人發現，pdia4 -/-小鼠之傷口癒合比野生型小鼠的更好(圖6B)。同樣地，pdia4 -/-小鼠之角膜損傷恢復優於野生型小鼠(圖6C)。此外，發明人亦發現，pdia4 -/- lepr db/db 小鼠之肌酸酐清除率比lepr db/db 小鼠的高(圖6D)，顯示Pdia4缺乏可減少腎病。最後，發明人檢查Pdia4於心血管疾病(CVD)之影響。發明人發現，Pdia4缺乏可減少血清三酸甘油酯且增加高密度脂蛋白(HDL)(圖6E)，顯示Pdia4缺乏可拯救CVD。
整體數據顯示，Pdia4負向調節糖尿病相關併發症。總之，Pdia4可作為糖尿病及其併發症之診斷標記及治療標的。
Pdia4可用於篩選糖尿病之Pdia4抑制劑
利用虛擬篩選策略，評估含261個化合物之內部資料庫，發明人發現，聚多炔糖苷、聚多炔糖苷衍生物、及3個其他類萜最適於Pdia4活性位點(圖7)。發明人亦確認，聚多炔糖苷確實抑制Pdia4活性(圖5B)。
前述之本發明示例性具體實施例之呈現目的係僅於說明及闡述，且未旨在窮盡或侷限本發明於所揭示之精確形式。鑑於上述實施，可能有許多改良及變更。所選用及描述之具體實施例及實例係旨在闡述本發明之原理及其實際應用，以使本領域之技術人員能利用本發明及各具體實施例，以及進行各種修飾，以適合預期之特定用途。其他具體實施例為本領域技術人員所顯見，而不背離本發明之精神及範疇。據此，本發明之範疇係由所附申請專利範圍定義，而非本文前面之描述及示例性具體實施 例。
本說明書引用及討論之所有參考資料係在此全部併入本案以作為參考資料，且某種程度上如同各參考資料皆單獨地併入本案以作為參考資料。
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<223> CCGGCCAAGAAGTACAAGGGCCAAACTCGAGTTTGGCCCTTGTACTTCTTGGTTTTTG
<400> 2
<210> 3
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRNA
<400> 3
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> shRNA
<400> 4
<210> 5
<211> 645
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5

Claims (7)

  1. 一種Pdia4抑制劑之用途，以製造用於預防、緩解、及/或治療有需求之個體之糖尿病及/或糖尿病相關併發症之藥劑，其中該Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性及/或抑制Pdia4蛋白表現，且其中該Pdia4抑制劑係化合物，選自於以下所組成之群組：
    Figure TWI627957B_C0001
    或其中該Pdia4抑制劑係shRNA，包含核苷酸序列，其係選自於由SEQ ID NOs：1-4組成之群組。
  2. 如請求項1之用途，其中該Pdia4抑制劑係與其他抗糖尿病藥劑結合使用。
  3. 如請求項2之用途，其中該其他抗糖尿病藥劑係胰島素敏化劑。
  4. 一種用於診斷糖尿病之方法，其包含：(a)於活體外量化個體血中Pdia4蛋白濃度；以及(b)當該個體血中Pdia4蛋白濃度高於正常對照組個體時，將該個體鑑定為糖尿病患者。
  5. 一種用於監測糖尿病之方法，其包含：(a)於活體外分別量化糖尿病患者於給予抗糖尿病藥劑之前及之後，其血中Pdia4蛋白濃度；以及(b)相較於該糖尿病患者給予該抗糖尿病藥劑之前之情況，當於該糖尿病患者給予該抗糖尿病藥劑之後，其血中Pdia4蛋白濃度減少時，確定該個體於給予該抗糖尿病藥劑後顯示糖尿病之改進。
  6. 如請求項4或5之方法，其中該抗糖尿病藥劑包含Pdia4抑制劑。
  7. 一種篩選Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑之方法，其包含：(a)於活體外量化糖尿病動物於給予測試化合物之前或之後，其血中Pdia4蛋白濃度；以及(b)當該糖尿病動物於投予該測試化合物後，其血中Pdia4蛋白濃度減少時，鑑定該測試化合物為Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑；或者(i)於存在及不存在該測試化合物下，測定Pdia4蛋白活性；以及(ii)當於該測試化合物存在下，該Pdia4蛋白活性減少時，鑑定該測試化合物為Pdia4抑制劑及/或抗糖尿病藥劑，其中該Pdia4抑制劑係抑制Pdia4蛋白活性或抑制Pdia4蛋白表現。
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