TWI627280B - 用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的方法 - Google Patents

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Abstract

一種用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的方法包括：令一口腔黏膜組織進行一使用膠原酶的酵素分解處理，俾以獲得包括口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的細胞團；將該細胞團與一羊膜在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之含有血小板溶胞產物的培養基中，而使得該細胞團被附著至該羊膜上；以及接著將該被附著至羊膜上的細胞團在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之促進-增生的培養基中。

Description

用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的方法
本件申請案主張於2016年3月11日提申的美國臨時申請案序號62/306,936的優先權。
本揭露內容是有關於一種用於在活體外培養黏膜上皮細胞以及黏膜上皮祖細胞的方法，更特別地是關於一種用於在一無血清且無餵養細胞的條件下在活體外培養黏膜上皮細胞以及黏膜上皮祖細胞的方法。
角膜(cornea)[其能容許光線穿透至視網膜(retina)]對於正常的視力而言是重要的。特別地，角膜上皮(corneal epithelium)藉由維持角膜的無血管性(avascularity)與通透性(transparency)而在保有正常視力上扮演一必要的角色，因此，重要的是：角膜上皮的正常運作被維持。角膜上皮的更新(renewal)以及修復(repair)是由主要位在角膜緣(limbus)[介於角膜與眼球結膜(bulbar conjunctiva)間的狹窄區域]中的角膜上皮幹細胞(corneal epithelial stem cells)所調節。角膜上皮幹細胞的傷害或是耗竭[被知曉為角膜緣幹細胞缺乏(limbal stem cell deficiency, LSCD)]會引起結膜侵入(conjunctival invasion)，其會導致角膜的血管生成(vascularization)以及相關之大幅度的視力喪失。LSCD的發生可能是起因於外部的因素以及疾病[例如，熱或化學性損傷、微生物感染、涉及角膜緣的手術、史蒂芬斯-強森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、眼瘢痕性類天疱瘡(ocular cicatrical pemphigoid)、無虹膜(aniridia)等]。
細胞移植(cell transplantation)已被認為是用於重建帶有LSCD之病患的角膜上皮的一個有希望的途徑。例如，為了治療LSCD，研究人員已嘗試過使用口腔黏膜上皮細胞(oral mucosal epithelial cells, OMECs)、胚胎幹細胞(embryonic stem cells)、結膜上皮細胞(conjunctival epithelial cells)、表皮幹細胞(epidermal stem cells)、牙髓幹細胞(dental pulp stem cells)、骨髓-衍生的間葉幹細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells)、毛囊隆突部-衍生的幹細胞(hair follicle bulge -derived stem cells)、臍帶襯幹細胞(umbilical cord lining stem cells)，以及眼眶脂肪-衍生的幹細胞(orbital fat-derived stem cells)。在上述治療用非-角膜緣(non-limbal)細胞種類中，只有結膜上皮細胞與OMECs是在人類中已被探究過之實驗室所培養的細胞來源。
角膜以及口腔黏膜上皮這兩者皆是層狀的(stratified)，具有位在基底上層(suprabasal layer)中的緊密連結蛋白(tight junction proteins)[諸如連結蛋白43 (connexin 43)]以及位在基底層(basal layer)中的半胞橋體蛋白(hemidesmosome proteins)[諸如整合蛋白(integrins)]。此外，角蛋白3/76 (keratin 3/76)被表現於角膜和口腔黏膜上皮這兩者中。由於口腔黏膜上皮與角膜上皮的相似性，以及口腔黏膜上皮的容易可獲得性(亦即不須以侵入性手術來收取口腔黏膜上皮)，經培養的口腔黏膜上皮的移植(cultivated oral mucosal epithelial transplantation, COMET)已經被廣泛地使用來修復受損的角膜表面，以及作為對於急性或慢性角膜灼傷(acute or chronic corneal burns)之一個重要的過渡性治療(bridge therapy)。最近，COMET程序亦已被應用於在內視鏡黏膜切除術程序(endoscopic mucosal resection procedure)的期間修復口內黏膜缺損(intraoral mucosal defects)與食道黏膜(esophageal mucosa)，這暗示：該程序具有用於廣泛類型的臨床用途的潛力。
Nakamura等人以及Nishida等人在2004年報導過關於在活體外(ex vivo )培養用於COMET之OMECs的原始操作程序(參見Nakamuraet al . (2004),Br. J. Ophthalmol ., 88:1280-1284；以及Nishidaet al . (2004),N. Engl. J. Med. , 351:1187-1196)。特別地，該原始操作程序使用分散酶II/胰蛋白酶-EDTA (dispase II/trypsin-EDTA)來將OMECs自組織中分離出以及分散該上皮。為了在活體外培養經分離的OMECs，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及3T3小鼠纖維母細胞(mouse fibroblasts)[作用為餵養細胞(feeder cells)]在原始操作程序中被視為是必需的，因為它們能促進細胞附著(cell adhesion)與增生(proliferation)，其接而導致匯聚的(confluent)上皮細胞層片(epithelial cell sheet)的形成。再者，研究人員已驗證了COMET對於在嚴重的眼球表面灼傷中促進傷口癒合的潛能，並證明OMECs在被移植的角膜中長期持續存在。
然而，FBS和小鼠-衍生的3T3餵養細胞是異生物質材料(xenobiotic materials)，其可能會導致人畜共通感染(zoonotic infections)或未知致病原的傳播。特別地當涉及用於臨床應用之在活體外的細胞增殖(ex vivo cell expansion)，異生物質材料(諸如動物-衍生的血清以及餵養細胞)的使用可能會增加疾病[例如牛海綿狀腦炎(bovine spongiform encephalitis)]傳播的風險。因此，對於下一代的COMET而言，一無動物-衍生之組份(animal-derived component-free, ADCF)的培養程序(特別是一無血清且無餵養細胞的培養程序)是有需求的。
發明概要
因此，本揭露內容的一個目的是提供一種可以解決先前技術的至少一個缺點之用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞(oral mucosal epithelial progenitor cells)以及口腔黏膜上皮細胞(oral mucosal epithelial cells)的方法。
依據該揭露內容，該用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的方法包括： 令一口腔黏膜組織進行一使用膠原酶(collagenase)的酵素分解處理(enzymatic digestion treatment)，俾以獲得包括口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的細胞團(cell aggregates)； 將該細胞團與一羊膜(amniotic membrane)在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之含有血小板溶胞產物(platelet lysate)的培養基中，而使得該細胞團被附著至該羊膜上；以及 將該被附著至羊膜上的細胞團在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之促進增生的(proliferation facilitating)培養基中，而使得在該細胞團內的口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞增生。
發明的詳細說明
應被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了避免被用於傳統的COMET程序中的動物-衍生之組份(諸如FBS和3T3纖維母細胞)引起的異種感染(xenogenic infection)，申請人發展出一種用於生成含有口腔黏膜上皮祖細胞和口腔黏膜上皮細胞(OMECs)的黏膜上皮層片(mucosal epithelial sheets)之新穎的無動物-衍生之組份(animal-derived component-free, ADCF)的培養程序，其中為了分解口腔黏膜組織，伴隨使用高速渦動(high-speed vortexing)的膠原酶是被用來取代傳統上所使用的分散酶II/胰蛋白酶-EDTA，為了避免來自動物-衍生之組份的異種感染，人類血小板-衍生的產物(諸如PLTMax® )是被用來取代傳統上所使用之在補充有激素之上皮培養基(supplemented hormonal epithelial medium, SHEM)中的胎牛血清，以及一無血清之促進增生的培養基(諸如EpiLife® 培養基)繼而被使用來排除由黏膜下間葉細胞(submucosal mesenchymal cells)所造成的汙染。
透過上述的程序，申請人發現：以此方式所培養的OMECs在生成具有經提升的增生潛能(proliferative potential)之人類口腔黏膜上皮層片上是優於依據先前技術的程序所培養的OMECs。
於是，本揭露內容提供一種用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的方法，其包括： 令一口腔黏膜組織進行一使用膠原酶的酵素分解處理，俾以獲得包括口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的細胞團； 將該細胞團與一羊膜在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之含有血小板溶胞產物的培養基中，而使得該細胞團被附著至該羊膜上；以及 將該被附著至羊膜上的細胞團在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之促進增生的培養基中，而使得在該細胞團內的口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞增生。
如此處所使用的，術語“在活體外(ex vivo )”意指在宿主(host)外部的人工環境(artificial environment)中在活組織(living tissue)之中或之上所進行之伴隨著最少的自然條件改變的試驗(experimentation)或測量(measurement)。
如此處所使用的術語“培養(cultivate)”以及“培養(cultivating)”，意指在組織或人體的外部[例如在一無菌的細胞培養皿(cell culture dish)或培養瓶(flask)內]之細胞的維持(sustaining)、繁殖(propagating)、生長(growing)和/或分化(differentiating)。此外，如此處所使用的術語“培養(cultivation)”，意指利用一培養基(culture medium)作為營養、激素和/或其他有助於繁殖和/或維持細胞之因子的來源。
如此處所使用的，“口腔黏膜上皮細胞”意指口腔黏膜的上皮細胞。該口腔黏膜可以是任何在口腔(oral cavity)中所發現的黏膜表面或口腔黏膜組織，其包括但不限於：舌表面(lingual surfaces)，亦即舌頭的表面膜；舌下表面(sublingual surfaces)，亦即內襯(lining)於口的底部內的黏膜；頰面(buccal surfaces)，亦即內襯於臉頰內的黏膜；顎面(palatal surfaces)，亦即內襯於口的頂部內的膜；咽面(pharyngeal surfaces)，亦即內襯於咽喉內的黏膜；牙齦表面(gingival surfaces)，亦即牙齦的黏膜；以及牙齦溝(gingival sulcus)，亦即形成於牙齒與牙齦間的腔室。
此外，如此處所使用的術語“口腔黏膜上皮祖細胞”，是被理解為意指一種由口腔黏膜的組織生成之能夠在被控制和/或被限制的條件下增生與分化的細胞。
如此處所使用的術語“無血清的”，是被理解為意指完全沒有人類或動物的血清。
如此處所使用的術語“餵養細胞”，意指任何一種類型的細胞，其可與另一種類型的細胞被共-培養(co-cultured)，以提供第二種類型的細胞可生長於其中的環境。為了將細胞[例如多潛能幹細胞(pluripotent stem cells)、祖細胞(progenitor cells)，以及類似之物]維持在未分化狀態(undifferentiated state)而未失去多潛能性(pluripotency)，這些餵養細胞(例如，纖維母細胞)可作用為一用於提供所分泌的因子、胞外基質(extracellular matrix)，以及細胞接觸(cellular contact)的基底層。
如此處所使用的，術語“增生(proliferate)”或“增生(proliferation)”意指在一細胞培養物中的細胞數量上的增加。
依據本揭露內容，該酵素分解處理可以在以一範圍落在800 rpm至1,600 rpm內的速度進行振盪下而被執行。如此處所使用的術語“振盪(shaking)”，意指一可能表現為一振盪動作或一概略地迴轉動作(orbital motion)的重複性動作，它可藉由使用一振盪器(shaker)[例如迴轉式振盪器(orbital shaker)、渦動振盪器(vortex shaker)，或平台振盪器(platform shaker)]來攪動(agitate)或混合(mix)一樣品。在某些具體例中，該最佳的酵素分解處理是在以1,200 rpm進行振盪下被執行。
依據本揭露內容，該酵素分解處理可以在餵養細胞的不存在下於一無血清之補充有激素的上皮培養基中被執行。
依據本揭露內容，該羊膜是一經剝露的羊膜(denuded amniotic membrane)。如此處所使用的，術語“經剝露的羊膜”和“去上皮化的羊膜(de-epithelialized amniotic membrane)”可以被交換地使用，且意指其中該上皮層(epithelial layer)已被去除的羊膜的樣品。
術語“含有血小板溶胞產物的培養基”意指一含有透過血小板的溶解(lysing)而被釋放出之血小板產物的培養基。在某些具體例中，該無血清之含有血小板溶胞產物的培養基包括PLTMax® 血小板溶胞產物。在一示範性的具體例中，以無餵養細胞之無血清之含有血小板溶胞產物的培養基的總重為基礎，該PLTMax® 血小板溶胞產物可以一為5 wt%的含量而存在。
在某些具體例中，該無血清之含有血小板溶胞產物的培養基可進一步包括一上皮細胞生長培養基(epithelial cell growth medium)。
如此處所使用的，術語“上皮細胞生長培養基”意指一被用來使上皮細胞生長的培養基。在某些具體例中，該上皮細胞生長培養基可以是一補充有激素的上皮培養基(SHEM)。
依據本揭露內容，該補充有激素的上皮培養基可包括一基礎培養基(basal medium)、一生長因子(growth factor)，以及胰島素。
術語“基礎培養基”意指任何提供用於在培養中的細胞之生長的鹽類、營養、胺基酸(amino acids)以及維生素(vitamins)之溶液的培養基。基礎培養基的範例包括，但不限於，杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)、最低基本培養基(Minimal Essential Medium)、基礎依格培養基(Basal Medium Eagle)、DMEM/F-12 [營養混合物F-12 (Nutrient Mixture F-12)]、DMEM/F-10 [營養混合物F-10 (Nutrient Mixture F-10)]、α-最低基本培養基、格拉斯哥最低基本培養基(Glasgow’s Minimal Essential Medium)、KnockOut DMEM，以及它們的組合。在某些具體例中，該基礎培養基是DMEM/F-12培養基。
術語“生長因子”意指任何可刺激細胞生長的物質。生長因子的範例包括，但不限於，重組型人類表皮生長因子(recombinant epidermal growth factor)、角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor)，以及它們的組合。在某些具體例中，該生長因子是重組型人類表皮生長因子。
在某些具體例中，該補充有激素的上皮培養基可進一步包括一抗菌劑(anti-bacterial agent)和/或一抗真菌劑(anti-fungal agent)。
抗菌劑的範例包括，但不限於，盤尼西林(penicillin)、鏈黴素(streptomycin)，以及健他黴素(gentamycin)。在某些具體例中，該抗菌劑是健他黴素。
抗真菌劑的範例包括，但不限於，雙性黴素B (amphotericin B)以及氟康唑(fluconazole)。在某些具體例中，該抗真菌劑是雙性黴素B。
如此處所使用的，術語“促進增生的培養基”意指任何可促進上皮細胞團的增生與增殖的培養基。
應被注意的是：單獨使用如上所述的上皮細胞生長培養基可能無法促進被附著至該羊膜上的細胞團的增生，由於存在於該細胞團中的間葉細胞與纖維母細胞(當令口腔黏膜組織進行一使用膠原酶的酵素分解處理時所獲得的)可能會增殖並過度生長，藉此抑制上皮細胞團的增生。因此，該被附著至羊膜上的細胞團要在餵養細胞的不存在下被培養於該無血清之促進增生的培養基，俾以促進該上皮細胞團的增生，同時抑制該間葉細胞與纖維母細胞的增生。例如，單獨的SHEM、DMEM，以及限定的角質細胞之無血清培養基(Defined Keratinocyte Serum-Free Medium)皆不適宜供用於作為促進增生的培養基。在某些具體例中，無餵養細胞之無血清之促進增生之培養基可取代無餵養細胞之無血清之含有血小板溶胞產物的培養基。
依據本揭露內容，該無血清之促進增生的培養基可包括EpiLife® 培養基、角質細胞-無血清培養基[Keratinocyte-serum free medium (SFM)]、Stemline® 角質細胞培養基II (Keratinocyte Medium II)、DermaLife® K無血清角質細胞培養基(Serum-Free Keratinocyte Culture Medium)，以及它們的組合。在某些具體例中，該無血清之促進增生的培養基是EpiLife® 培養基。
在某些具體例中，該無血清之促進增生的培養基可進一步包括一補充劑。該補充劑的範例包括，但不限於，補充劑S7 (Supplement S7)、無BPE的角質細胞培養基補充劑(BPE-free Keratinocyte Medium Supplement)，以及它們的一組合。在某些具體例中，該補充劑是補充劑S7。
本揭露內容將就在下列的實施例中被進一步說明。然而，應被瞭解的是：下列的實施例僅是意欲用於例示說明的目的，而不應被解釋為本揭露內容於實施上的限制。實施例 一般實驗材料： 1. 人類口腔黏膜組織以及羊膜(AM)是依據有關涉及人類受測者之研究的赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)的原則以及得自於台灣桃園長庚紀念醫院(Chang Gung Memorial Hospital in Taoyuan, Taiwan)的人體試驗倫理委員會(Institutional Review Board, IRB)的核可(IRB核可編號：101-0108B以及102-5895B)而被獲得。 (a) 口腔黏膜組織是在口腔手術的期間自30位病患中被獲得(男性：女性=26：4，平均年齡=53.8±13.8歲；範圍：21至85歲)。為了研究而使用該組織的告知同意書(informed consent)是得自於每一位捐贈者。病理學報告顯示：這些皆為正常組織。 (b) AM是在選擇性剖腹產(elective cesarean section)後被獲得，並且針對B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus)，及梅毒(syphilis)而被檢測為陰性。所獲得的AM是在-80℃下被保存於1：1的DMEM/甘油中，並且當實驗時，AM被解凍，以磷酸緩衝的鹽水溶液(phosphate-buffered saline, PBS)予以清洗三次並且在37℃下被浸泡於0.25% EDTA (2.5g EDTA配於1000mL PBS中)中歷時1小時，繼而以細胞刮刀(cell scraper)(Corning)輕輕地去除上皮層，俾以獲得去上皮化的AM。 2. 下列材料是購自於Invitrogen (卡爾斯巴德，CA)：杜貝可氏改良的依格氏培養基[Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)(Cat. No. 11995065)]、Gibco® 杜貝可氏改良的依格氏培養基：營養混合物F-12 (Nutrient Mixture F-12, DMEM/F-12)(1：1)培養基(Cat. No. 11330)、EpiLife® 培養基(Cat. No. MEPI500CA)、補充劑S7 (Cat. No. S0175)、pH 7.4 PBS (Cat. No. 10010)以及Alexa-Fluor-綴合的山羊抗-小鼠IgG (Alexa-Fluor-conjugated goat anti-mouse IgG)(Cat. No. A11001)。 3. 健他黴素(Gentamycin)是購自於生達化學製藥股份有限公司(Standard Chem & Pharm Co.)(台南，台灣)。 4. 雙性黴素B (Amphotericin B)是購自於Bristol-Myers Squibb (紐約，NY)。 5. 下列材料是購自於Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)：二甲亞碸[dimethyl sulfoxide (DMSO)](Cat. No. D2650)、甲醇(Cat. No. 34860)、Triton® X-100 (Cat. No. 93443)、氟化納(sodium fluoride)(Cat. No. S7920)、正釩酸鈉(sodium orthovanadate)(Cat. No. S5680)、蛋白酶抑制劑雞尾酒(protease inhibitor cocktail)(Cat. No. P8340)、EDTA (Cat. No. E-6758)，以及PBS (Cat. No. P3813-10PAK)。 6. PLTMax® (Cat. No. PLTM100GMP)是購自於Mill Creek Life Sciences (洛契斯特，MN)。 7. 膠原酶A (Collagenase A)(Cat. No. 10103578001)是購自於Roche Applied Science (印第安納波利斯，IN)。 8. T-PER® 組織蛋白萃取試劑(T-PER® Tissue Protein Extraction Reagent)(Cat. No. 78510)是購自於Pierce (洛克福，IL)。 9. 重組型人類表皮生長因子[recombinant human epidermal growth factor (EGF)](Cat. No. 1416-050)是購自於CellGenix Inc.(德國)。 10. 下列材料以及抗體是購自於Santa Cruz Biotechnology (聖塔克魯茲，CA)：Hoechst 33342染劑(Cat. No. SC-391054)、碘化丙錠(propidium iodide)、AKT (H-136)、GSK-3β (H-76)、GAPDH (FL-335)、P27KIP1 (C-19)兔子多株和P75NTR (C20)山羊多株抗體，以及細胞角質蛋白8 (cytokeratin 8)(選殖株C51)小鼠單株抗體。 11. 下列的抗體是購自於Cell Singling Technologies (比佛利，MA)：對抗ILK、組織蛋白H3 (Histone H3)、磷酸-β-連接素(phospho-β-catenin)(S33/37)、磷酸-AKT (S473，選殖株193H12)，以及磷酸-GSK-3β (S9，選殖株5B3)的兔子多株抗體。 12. 下列的抗體是購自於Abcam (拉荷雅，CA)：細胞角質蛋白13 (選殖株1C7)、β-連接素(選殖株15B8)與細胞週期蛋白D1 (cyclin D1)(選殖株CD1.1)的小鼠單株抗體，以及TCF4 (選殖株EP2033Y)的兔子單株抗體。 13. BrdU小鼠抗體(RPN20Ab)是購自於Amersham, GE Healthcare (查芳特聖吉爾斯，UK)。 14. 下列的抗體是購自於Chemicon, Millipore (Billerica, MA)：連結蛋白43 (connexin 43)(選殖株4E6.2)、p63 (選殖株4A4)以及細胞角質蛋白3/76 (選殖株AE5)的小鼠單株抗體。 15. 磷酸-ILK (T173)的兔子多株抗體是購自於Abgent (聖地牙哥，CA)。 16. ΔNp63兔子多株抗體是購自於BioLegend (聖地牙哥，CA)。 17. 所有的塑膠細胞培養器皿皆是得自於Corning Incorporated, Life Sciences (康寧市，NY)。實施例 1. 在活體外培養口腔黏膜上皮細胞以及口腔黏膜上皮祖細胞
口腔黏膜組織在3mL的漱口水(Day and Night Mouthwash)中被滅菌歷時3分鐘，再以PBS予以清洗三次，接著被切成小碎片。被切碎的口腔黏膜組織接著被添加至一含有配於如表1中所示之無血清之補充有激素的上皮培養基[serum-free supplementary hormonal epithelial medium (SHEM)]中的2 mg的膠原酶A之1.5 mL的Eppendorf試管內，繼而在1,200 rpm以及37℃下於一迴轉式振盪器中進行振盪歷時16小時。接著，由此所形成的產物在3,500 rpm以及4℃下被離心歷時5分鐘。在去除該上清液(supernatant)之後，所得到之含有口腔黏膜上皮祖細胞及口腔黏膜上皮細胞的細胞團是以1.5 mL的無血清之補充有5% PLTMax® 的SHEM而被培養於去上皮化的AM上(1.5 cm×1.5 cm)，其被放置在一個25-mm的培養小杯(culture insert)上並且被風乾隔夜。培養是在37℃以及5%的CO2 下被執行，俾以輔助該細胞團貼附至該去上皮化的AM上。
在細胞附著之後的兩天後，該培養基被更換為無血清之EpiLife®培養基(含有1%補充劑S7以及60μM的鈣)，該無血清之EpiLife®培養基是被用以促進細胞團的增殖以及上皮細胞與上皮祖細胞的增生。該培養基每三天被更換。 表1
為了與如上所述之本揭露內容的方法作比較，一用於在活體外培養口腔黏膜上皮細胞及口腔黏膜上皮祖細胞之先前技術的方法是依據Ma, D. H. et al. (2009), Eye, 23:1442-1450而被進行。簡言之，該口腔黏膜組織被清洗並且在37℃下以100 μL之配於PBS中的1.2 IU分散酶II (dispase II)予以處理歷時1小時，接著被轉移至另一個35-mm培養皿中，並且為了細胞懸浮在37℃下以75 μL的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液(trypsin-EDTA solution)予以處理。該細胞在950×g下被離心，接著被再散浮(resuspended)於1.5 mL之含有補充有5% FBS、0.5% DMSO、2 ng/mL重組型人類EGF、1 mg/mL重組型胰島素、40 μg/mL健他黴素，以及2.5 μg/mL雙性黴素B之DMEM/F-12培養基(1：1，20mM HEPES緩衝液)的SHEM中。最後，培養是在覆蓋有一層去上皮化的AM之25-mm的穿井小杯(transwell inserts)上被執行。該穿井小杯是在37℃以及5%的CO2 下於一6-井培養盤內與作為餵養細胞(feeder cells)之絲裂酶素C-預處理的NIH/3T3纖維母細胞(mitomycin C-pretreated NIH/3T3 fibroblast)(ATCC CRL-1658™)進行共-培養。該培養基每3天被更換。
由本揭露內容的方法所形成的細胞(下稱實驗組)以及由先前技術的該方法所形成的那些者(下稱對照組)被收集，俾以進行下列實驗。
依據初步的觀察，被發現到的是：實驗組的細胞在14天的培養後在去上皮化的AM上達到匯聚(confluency)，且它們的形態比對照組所具者更為緊密(數據未顯示)，對照組的細胞通常要耗時3週來達到匯聚。
先前已被顯示：細胞角質蛋白3/76 (K3/76)是被表現在非-角質化(non-keratinized)之角膜、結膜，以及口腔黏膜上皮中，然而，細胞角質蛋白8 (K8)是被表現在角膜和結膜上皮中，但沒有在口腔黏膜的上皮中(Chen, H.C.et al. (2009),Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , 50:4660-4668)。申請人透過免疫共軛焦顯微鏡(immunoconfocol microscopy)發現：類似於對照組，實驗組的細胞在於去上皮化的AM上培養歷時14天後亦呈K3/76陽性及K8陰性。此外，在由本揭露內容的方法所獲得的培養物中連結蛋白43 (Cx43)以及細胞角質蛋白13 (K13)的表現是類似於正常口腔黏膜上皮中所具者(Cx43+與K13+)(數據未顯示)，顯示：本揭露內容的方法可有效地在活體外培養口腔黏膜上皮細胞及口腔黏膜上皮祖細胞。實施例 2. 比較藉由使用本揭露內容的方法與先前技術的方法所獲得的口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞的增生潛能
依據本揭露內容的方法以及先前技術的方法在活體外培養的口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞的增生潛能在下列分析中被評估。 實驗程序： A、 細胞菌落形成分析 (Cell colony formation assay) ：
NIH/T3T細胞在37℃下被處理以4 μg/mL的絲裂黴素C (mitomycin C)歷時2小時，並以2×104 細胞/cm2 而被接種(seeded)於35-mm培養皿上。接著，得自於實施例1之各組口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞在去上皮化的羊膜上培養歷時兩週之後在37℃下被處理以1.5 U的分散酶II歷時15分鐘，藉由胰蛋白酶而被分離，接著以一為5×102 細胞/cm2 之密度而被接種於經平盤培養(plated)以有絲裂黴素C-處理的3T3餵養細胞的培養皿上。該培養基每三天被更換。在第12天，要被評估的細胞在配於在PBS中的4%三聚甲醛(paraformaldehyde)中被固定歷時10分鐘。該細胞接著被染色以2% (wt/vol)的玫瑰紅-B水溶液(aqueous solution of rhodamine-B)(Pancreac，屈爾內，比利時)歷時30分鐘並在Zeiss螢光顯微鏡(上科亨，德國)下被觀察。菌落形成是藉由使用Image J 1.29軟體(NIH，貝賽斯達，MD)所定量之每一培養皿所形成的菌落數量而被測定。B、 溴去氧尿 苷標記分析 [Bromodeoxyuridine (BrdU) labeling assay] ：
為了檢測細胞增生，BrdU標記分析是在依據在Chen, H.C.et al . (2009),Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. , 50:4660-4668中所述的方法而被進行。簡言之，得自於實施例1之各組口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞在去上皮化的羊膜上培養歷時一週之後，被供給以含有1:500所稀釋的BrdU標記試劑之補充有5% FBS的DMEM歷時一週，並接著在無-BrdU之DMEM中被追蹤歷時兩週。所得到之BrdU-標記的培養物檢體被冷凍保存，接著以100%之預冷卻的甲醇予以固定歷時10分鐘。非特異性結合(nonspecific binding)是以配在PBS中的5%正常驢血清(normal donkey serum, NDS)予以阻斷(blocked)歷時30分鐘。之後，經復水的(reconstituted)核酸酶(nuclease)/抗-BrdU小鼠抗體被添加至該檢體中，其接著在室溫下被培育歷時1小時。接著，該檢體被培育以Alexa-Fluor-綴合的山羊抗-小鼠IgG歷時另一個30分鐘，接著被對比染色(counterstained)以碘化丙錠(propidium iodide, PI)。BrdU-陽性細胞之百分比是藉由在五個隨機化視野(randomized fields)中BrdU陽性細胞核之總數除以PI-陽性細胞核之總數而被計算。 C、免疫螢光染色 (Immunofluorescence staining) ：
在兩週的培養之後，各組中在去上皮化的羊膜上的細胞在室溫下在4%的甲醛(formaldehyde)中被固定歷時15分鐘，以PBS予以清洗，以0.2%的Triton X-100予以通透化歷時15分鐘，以及以PBS予以清洗。在培育以2%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin)歷時30分鐘以阻斷非特異性染色之後，該細胞在4℃下被培育以p75NTR 以及p63一級抗體(各個呈1:100的稀釋率)歷時24小時。在以PBS予以清洗之後，該細胞在室溫下被培育以對應的Alexa-Fluor (488或594)-綴合的山羊抗-小鼠IgG抗體培育歷時60分鐘。細胞核被對比染色以Hoechst 33342或PI。切片以Gel Mount (Biomeda，福斯特城，CA)予以封固並使用Zeiss螢光顯微鏡(上柯亨，德國)或共軛焦顯微鏡(Leica，迪爾菲爾德，IL)而被檢視。每一染色被重複五次。D、 統計：
所有數據是以針對各組所計算的平均值(mean)±標準偏差(standard deviation, S.D.)而被呈現，並且至少三次獨立的實驗被執行。該數據是藉由使用針對成對樣本的威爾卡森等級和檢定(Wilcoxon Rank-sum test)而被比較。為了統計學分析，SPSS 12.0軟體(SPSS Inc., 芝加哥，IL，USA)被使用。檢定結果是以雙尾p值(two-tailed p values)而被報導，其中p＜0.05*被認為是統計學顯著的。 結果： A、 細胞菌落形成分析：
細胞菌落形成分析的結果被顯示於圖1-2，其中可見的是：當與對照組相較之下，更多的菌落形成自實驗組的細胞，這暗示：得自於本揭露內容之方法的口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞具有較佳的增生潛能。此外，如圖2所示，較大的菌落是使用本揭露內容之方法而被生成，這表示：祖細胞是使用本揭露內容之方法而被較佳地保存。B、 BrdU 標記分析：
圖3顯示關於在實驗組以及對照組中所獲得的人類細胞之BrdU-陽性細胞的百分比。從圖3可見的是：在實驗組中BrdU-陽性細胞之百分比大於對照組所具者。C、 免疫螢光染色：
得自於免疫螢光染色的結果顯示：關於在實驗組中人類細胞之p75NTR -陽性細胞與p63-陽性細胞的百分比是大於對照組所具者(圖4與5)。
從上述的該菌落形成分析、BrdU標記分析，以及p63與p75NTR 免疫染色之結果，明顯的是：當與先前技術所具者相較之下，藉由本揭露內容的方法，較高的增生潛能與較多的祖細胞被保存。明顯的是：本揭露內容的方法在生成具有經提升的增生潛能之人類口腔黏膜上皮層片上是優於先前技術所具者。實施例 3. 依據本揭露內容的方法以及先前技術在活體外所培養的口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞中的 ILK/β- 連接素途徑活性之比較
已被知曉的是：在上皮細胞中，β-連接素途徑能透過增加的細胞週期蛋白D1表現直接地促進細胞的增生，或是間接地，經由透過p63途徑的活化抑制CDK抑制劑(CDK inhibitor) p27KIP1 。因此，為了測定在自本揭露內容之方法以及先前技術所分離出的細胞中的ILK/β-連接素途徑活化是否不同，申請人執行了免疫墨點法(immunoblotting)來分析訊息途徑-相關之分子(signal pathway-related molecules)的磷酸化(phosphorylation)以及β-連接素的核轉位(nuclear translocation)。 實驗程序： A、 蛋白質萃取與西方墨點法 (Protein extraction and Western blotting) ：
將各組位於去上皮化之羊膜上的細胞以冰冷的PBS予以清洗一次，而上皮層是在37℃下藉由使用1.5 U的分散酶II的處理歷時15分鐘而被分離。經分離的口腔黏膜上皮細胞與口腔黏膜上皮祖細胞被散浮在0.5 mL之經補充有10 mM氟化納、10 mM正釩酸鈉，以及1×蛋白酶抑制劑雞尾酒的T-PER® 組織蛋白萃取試劑(T-PER® Tissue Protein Extraction Reagent)中。該懸浮液被轉移至一冰上的Eppendorf試管內，被音波處理以打破細胞，並在4℃下於一微量離心機(Labnet，愛迪生，NJ)內以全速予以離心歷時15分鐘。上清液被合併並被稱為全蛋白萃取物(total protein extract)。
細胞核蛋白是依據製造商的操作指南使用一細胞核萃取套組(Nuclear Extraction kit)(Affymetrix，聖塔克拉拉，CA)而被萃取。簡言之，各組的培養物以冷的PBS予以清洗兩次，繼而添加10×體積的緩衝液A (Buffer A)[補充有1 mM DTT、1倍的蛋白酶，以及磷酸酶抑制劑(phosphatase inhibitor)]並在冰上培育歷時10分鐘。細胞是藉由使用一無菌的細胞刮刀而被釋出，繼而反覆吸沖(pipetting)以分散細胞團塊。細胞接著被轉移至一離心管內並在4℃下以14,000×g予以離心歷時3分鐘。沉澱物(pellets)被再散浮於150 μL的緩衝液B (Buffer B)(補充有1 mM DTT、1×蛋白酶以及磷酸酶抑制劑)中並以全速予以渦動(vortexed)歷時10秒鐘。所得到之樣品在冰上被培育歷時2小時，每20分鐘予以震盪，並在4℃下以14,000×g予以離心歷時5分鐘。上清液被收集並被稱為細胞核蛋白萃取物(nuclear protein extract)。
在各組中的全蛋白萃取物與細胞核蛋白萃取物之濃度是利用一Bio-Rad蛋白質分析套組(Bio-Rad protein assay kit)(Bio-Rad，海克力斯，CA)而被測定，接著等量的蛋白質於丙烯醯胺梯度凝膠(acrylamide gradient gel)上被解析並被轉移至聚偏二氟乙烯膜[polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes](Millipore)。將該膜以配於TBST (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20)中的5% (w/v)脫脂牛奶予以阻斷並在4℃下以呈如表2中所示之稀釋率的一級抗體予以偵測隔夜。在以TBST溶液予以清洗三次之後，適當的辣根過氧化酶-綴合的二級抗體(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies)隨後被添加。針對各個蛋白質的免疫反應帶(immunoreactive bands)是以增強化學發光偵測系統(enhanced chemiluminescence detection system)(GE Healthcare)在X-射線底片上被視覺化(visualized)並利用Image J 1.29軟體(NIH，貝賽斯達，MD)予以光密度定量(densitometrically quantified)。各個蛋白質的免疫反應帶密度是藉由內部對照組(internal controls)(GAPDH或組織蛋白H3)予以標準化，接著相對訊號強度(relative signal intensity)是以對照組除以實驗組而被呈現。各個實驗是以三次獨立的試驗而被完成。 表2 B、 統計：
所有數據是以針對各組所計算的平均值±S.D.而被呈現。數據是使用針對成對樣本的威爾卡森等級和檢定而被比較。為了統計學分析，SPSS 12.0軟體(SPSS Inc.，芝加哥，IL，美國)被使用。檢定結果是以雙尾p值被報導，其中p ＜0.05*被認為是統計學顯著的。 結果：
介於實驗組與對照組細胞之間的β-連接素訊息途徑-相關之分子的相對表現被顯示在表3中。如表3中所示，關於實驗組，磷酸-ILK (T173)、磷酸-AKT (S473)、磷酸-GSK 3β (S9)以及β-連接素的表現被顯著地正向調節(up-regulated)，而磷酸-β-連接素(S33/37)的表現被負向調節(down-regulated)。此外，在TCF4、Np63以及細胞週期蛋白D1的表現上有增加，然而p27KIP1 的表現被降低。這些實驗數據顯示出在由本揭露內容的方法所獲得的口腔黏膜上皮細胞中經提升的ILK/β-連接素途徑活性以及經正向調節的細胞週期調控子(cell cycle modulators)之表現。 表3
綜上所述，本揭露內容之用於在活體外培養口腔黏膜上皮細胞以及口腔黏膜上皮祖細胞的該方法[其中(i)為了分解口腔黏膜組織，伴隨使用高速渦動的膠原酶是被用來取代傳統上所使用的分散酶II/胰蛋白酶-EDTA，(ii)為了避免來自動物-衍生之產物的異種感染，人類血小板-衍生之PLTMax® 是被用來取代SHEM中的胎牛血清，以及(iii)無血清之EpiLife® 培養基是被使用來有效地排除由黏膜下間葉細胞所造成的汙染]在生成具有經提升的增生潛能之人類口腔黏膜上皮層片上優於先前技術的方法。此優勢極有可能是由於在膠原酶處理(而非分散酶II/胰蛋白酶-EDTA處理)後被增強的ILK/β-連接素途徑活性。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參照被認為是示範性的具體例而被描述，應被瞭解的是：本揭露內容不限於所揭示的具體例，而意欲涵蓋被包括在最廣泛的解釋之精神與範疇中之各種不同的配置，俾以包含所有這類的修改以及等效的配置。
本揭露內容之其他的特徵以及優點將在下列參照隨文檢附的圖式之具體例的詳細說明中變得明顯，其中： 圖1針對實驗組與對照組的人類口腔黏膜上皮細胞以及口腔黏膜上皮祖細胞以一個每一培養皿的菌落數目的長條圖來例示說明菌落形成分析的結果； 圖2針對實驗組與對照組的細胞以一個所形成的菌落的圖片來例示說明該菌落形成分析的結果； 圖3針對得自於實驗組與對照組的細胞以一個BrdU-陽性細胞百分比的長條圖來例示說明BrdU標記分析的結果； 圖4針對得自於實驗組與對照組的細胞以一個p75NTR -陽性細胞百分比的長條圖來例示說明免疫染色的結果；以及 圖5針對得自於實驗組與對照組的細胞以一個p63-陽性細胞百分比的長條圖來例示說明免疫染色的結果。

Claims (15)

  1. 一種用於在活體外培養口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的方法，其包含有： 令一口腔黏膜組織進行一使用膠原酶的酵素分解處理，俾以獲得包括口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞的細胞團； 將該細胞團與一羊膜在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之含有血小板溶胞產物的培養基中，而使得該細胞團被附著至該羊膜上；以及 將該被附著至羊膜上的細胞團在餵養細胞的不存在下培養於一無血清之促進增生的培養基中，而使得在該細胞團內的口腔黏膜上皮祖細胞以及口腔黏膜上皮細胞增生。
  2. 如請求項1的方法，其中，該酵素分解處理是在以一範圍落在800 rpm至1,600 rpm內的速度進行振盪下而被執行。
  3. 如請求項1的方法，其中，該酵素分解處理是在以1,200 rpm進行振盪下而被執行。
  4. 如請求項1的方法，其中，該酵素分解處理是在餵養細胞的不存在下於一無血清之補充有激素的上皮培養基中被執行。
  5. 如請求項1的方法，其中，該羊膜是一經剝露的羊膜。
  6. 如請求項1的方法，其中，該無血清之含有血小板溶胞產物的培養基包含有PLTMax®血小板溶胞產物。
  7. 如請求項6的方法，其中，該無血清之含有血小板溶胞產物的培養基進一步包含有一上皮細胞生長培養基。
  8. 如請求項7的方法，其中，該上皮細胞生長培養基是一補充有激素的上皮培養基。
  9. 如請求項8的方法，其中，該補充有激素的上皮培養基包含有一基礎培養基、一生長因子，以及胰島素。
  10. 如請求項9的方法，其中，該基礎培養基是選自於下列所構成的群組：杜貝可氏改良的依格氏培養基(DMEM)、最低基本培養基、基礎依格培養基、DMEM/F-12 (營養混合物F-12)、DMEM/F-10 (營養混合物F-10)、α-最低基本培養基、格拉斯哥最低基本培養基、KnockOut DMEM，以及它們的組合。
  11. 如請求項9的方法，其中，該生長因子是選自於下列所構成的群組：一重組型人類表皮生長因子、角質細胞生長因子、肝細胞生長因子，以及它們的組合。
  12. 如請求項1的方法，其中，該無血清之促進增生的培養基是選自於下列所構成的群組：EpiLife®培養基、角質細胞-無血清培養基(SFM)、Stemline®角質細胞培養基II、DermaLife®K無血清角質細胞培養基，以及它們的組合。
  13. 如請求項12的方法，其中，該無血清之促進增生的培養基是EpiLife®培養基。
  14. 如請求項13的方法，其中，該無血清之促進增生的培養基進一步包含有一補充劑。
  15. 如請求項14的方法，其中，該補充劑是選自於下列所構成的群組：補充劑S7、無BPE的角質細胞培養基補充劑，以及它們的組合。
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