TWI625525B

TWI625525B - 檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑及使用其之檢測方法

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Publication number: TWI625525B
Application number: TW105138068A
Authority: TW
Inventors: 林冠成; 謝博全; 陳力騏; 鄭宗記; 侯詠德
Original assignee: 國立臺灣大學
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2016-11-21
Publication date: 2018-06-01
Also published as: TW201819908A

Abstract

本發明為一種檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑及使用其之檢測方法，該試劑包含銅離子及一與該銅離子鍵結之染料，其中該染料與該銅離子之鍵結能力低於嘉磷塞與該銅離子之鍵結能力，該染料與該銅離子分離時之顏色係與該銅離子鍵結時之顏色相異，而藉由量測染料顏色變化程度之吸光值，即可定量樣品中嘉磷塞之含量。

Description

檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑及使用其之檢測方法

本發明係關於一種檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑，其主要係利用嘉磷塞與銅離子之鍵結能力高於染料與銅離子之鍵結能力，若樣品中存有嘉磷塞，其與銅離子鍵結後，使染料變色，以檢測樣品中嘉磷塞殘留。

嘉磷塞為一種非常有效的廣效型除草劑，可有效清除雜草，在台灣被稱為年年春、好過春或好伯春等農藥。為達到可有效清除雜草及種植經濟作物的方便性，美國孟山都公司製造出可抵抗嘉磷塞的基改作物，例如黃豆、棉花、油菜、苜蓿等，此類基因改造作物都被植入有抵抗嘉磷塞的基因，此類作物稱為「抗農達」(Roundup Ready)，能抵抗嘉磷塞的毒性，不會因嘉磷塞的噴灑而死亡，使農民在除草劑的使用上更加肆無忌憚，因此嘉磷塞殘留量過高的問題常見於基改作物上。台灣目前雖然沒有大規模栽種抗農達的基改作物，但由於大部分的黃豆都係經由美洲(北美洲、南美洲)或中國大陸所進口，而這些地區的黃豆皆為基改黃豆。換言之，台灣所進口的黃豆存有嘉磷塞殘留之慮。

至今，已有相關研究陸續指出嘉磷塞對動物、植物及人體的負面影響。舉凡造成囓齒動物有肝臟及腎臟功能缺陷的問題，並增加罹癌的機會；阻斷植物中的莽草酸路徑(Shikimate pathway)，使植物無法合成苯丙胺酸、酪胺酸和色胺酸等必需胺基酸；造成植物體內過量的氨殘留，阻礙植物生長；抑制哺乳類動物體中細胞色素P450酵素的活性(細胞色素P450具有解毒能力，可以分解外來有毒物質)，使得人類接觸或吃到各種毒素後，因細胞色素P450受到抑制而無法自體解毒，提高人體患病機率；甚者，更有研究指出嘉磷塞可能會導致不孕。因此，在農作物中嘉磷塞殘留的問題已不可被小覷。

由於嘉磷塞的分子量低、電化學活性極低、沒有明顯的吸光行為及缺乏利於檢測用的官能基，因此檢測上相當困難。至今，檢測嘉磷塞的技術多為使用管柱前衍生或管柱後衍生之方法，其中，又以管柱前使用螢光物質芴醯氯(Fluorenylmethyloxycarbonyl chloride,FMOC)前處理搭配液相層析儀串聯質譜儀之方法最為常見。然而，此方法需要衍生前處理及大量清洗等程序(如潤洗管柱)，致使分析過程非常耗時；此外，由於嘉磷塞在液相層析儀裡之滯留時間太短，因而降低液相層析儀分離的效果。

歐盟曾欲開發快速且直接的檢測方法，以檢測蔬菜和水果中的嘉磷塞殘留。該方法主要係藉離子交換樹脂串聯質譜儀，在電噴灑游離法狀態下進行偵測，以減去衍生前處理繁雜的作業，使樣品能直接上機檢測分析。然而，該方法卻因離子交換樹脂和質譜儀兩者之移動相的緩衝溶液發生不相容，致使降低檢測效果。因此，歐盟最終也並沒有順利推動且落實使用此方法檢測嘉磷塞。

此外，更有相關研究係利用嘉磷塞之高極性，使用親水作用液相色譜(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography,HILC)以進行嘉磷塞的直接檢測分析。然而，此方法仍需要串接質譜儀才可完成檢測分析，操作程序上亦是繁複而不便於檢測。

呈上所述，本發明者鑒於嘉磷塞對人體及環境的負面影響，以及現今繁複不便的嘉磷塞檢測方法，欲開發一種可快速有效檢測嘉磷塞之方法。

本發明者發現，由於嘉磷塞或其代謝物與銅離子有高度的鍵結能力，當將含有嘉磷塞殘留之樣品置入於已與銅離子鍵結之染料溶液時，嘉磷塞會與染料競爭搶奪銅離子。而由於嘉磷塞與銅離子之鍵結能力高於染料與銅離子之鍵結能力，因此染料會釋放出銅離子而開始變化顏色，且染料的顏色變化會與嘉磷塞殘留之濃度呈正比，藉由量測染料之顏色的吸光值，便可有效定量出樣品中嘉磷塞之濃度。

是以，本發明者所發明之試劑，其含有染料與銅離子可檢測嘉磷塞或其代謝物，提供了一種有效檢測嘉磷塞或其代謝物之方法，能快速地檢測出樣品中的嘉磷塞之濃度，有別於以往需要複雜的前處理及搭配昂貴的質譜儀的檢測分析方法，並解決了以往檢測效果不佳的問題。

即，本發明之目的為提供一種檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑，其包含銅離子及一與該銅離子鍵結之染料，其中該染料與該銅離子之鍵結能力低於嘉磷塞與該銅離子之鍵結能力，該染料與該銅離子分離時之顏色係與該銅離子鍵結時之顏色相異。

本發明之另一目的為提供一種檢測樣品中嘉磷塞或其代謝物之檢測方法，包含：(a)提供一試劑，其包含銅離子及一與該銅離子鍵結之染料；(b)將該樣品加入該試劑中，使該樣品中之嘉磷塞或其代謝物與該試劑中之銅離子鍵結，且該染料因與該銅離子分離而變色；(c)依據該試劑中染料變色之程度，換算樣品中嘉磷塞或其代謝物之含量。

於較佳實施例中，該染料及該銅離子之濃度比4：1~1：100。

於較佳實施例中，該染料為偶氮類染劑或二苯并吡喃類染劑。

於較佳實施例中，該染料為胭脂紅(Ponceau 4R，C.I.16255)、麗春紅2R(Ponceau 2R，C.I.16150)、麗春紅6R(Ponceau 6R，C.I.16250)、麗春紅S(Ponceau S,C.I.27195)、對位紅(Para red，C.I.12070)、磺胺米柯定(Prontosil)、酸性橙5(Acid orange 5，C.I.13080)、酸性橙7(Acid orange 7，C.I.15510)、酸性紅88(Acid red 88，C.I.15620)、誘惑紅(Allura red AC，C.I.16035)、酸性紅27(Amaranth，C.I.16185)、偶氮紫(Azo violet，C.I.24105)、比西列希猩紅(Biebrich scarlet，C.I.26905)、酸性橙6(Chrysoine resocinol，C.I.14270)、橘紅2號(Citrus red 2，C.I.12156)、剛果紅(Congo red，C.I.22120)、酸性紅33(D&C red 33，C.I.17200)、分散橘(Disperse orange 1，C.I.11080)、立索玉紅(Lithol Rubine BK，C.I.15850)、甲基橙(Methyl orange，C.I.13025)、甲基紅(Methyl red，C.I.13020)、酸性媒介紅、(Mordant red 19，C.I.18735)、油紅(Oil red O，C.I.26125)、酸性橙B(Orange B，C.I.19235)、酸性橙G(Orange G，C.I.16230)、酸性橙GGN(Orange GGN，C.I.159802)、紅色2G(Red 2G，C.I.18050)、猩紅GN(Scarlet GN，C.I.148152)、溶劑紅26(Solvent red 26，C.I.26120)、蘇丹紅I(Sudan I，C.I.12055)、蘇丹紅II(Sudan II，C.I.12140)、蘇丹紅III(Sudan III，C.I.26100)、蘇丹紅IV(Sudan IV，C.I. 26105)、蘇丹紅7B(Sudan 7B，C.I.26050)、蘇丹紅G(Sudan red G，C.I.12150)、台昐藍(Trypan blue，C.I.23850)、伊紅B(Eosin B，C.I.45400)，伊红Y(Eosin Y，C.I.45380)、羅丹明B(Rhodamine B，C.I.45170)、羅丹明6G(Rhodamine 6G，C.I.45160)、磺醯羅丹明B(Sulforhodamine B，C.I.45100)、酸性紅51(Erythrosin B，C.I.45430)、酸性紅92(Phloxine B，C.I 45410)、食用色素紅色105號(Rose Bengal，C.I.45440)、媒染紫25(Gallein，C.I.45445)、鄰苯二酚紅(Pyrogallol Red)、螢光素鈉(Uranine，C.I.45350)或螢光素(Fluorescein，C.I.45350)。

於較佳實施例中，該試劑之pH為4~7。

於較佳實施例中，該試劑包含緩衝溶液，其係選自為醋酸、硼酸、或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽或其等之組合之溶液。

於較佳實施例中，該試劑中染料變色之程度，係以吸光值判定。

圖1為本發明之試劑之金屬干擾物測試結果，圖1(a)分別為本發明之試劑中分別為無金屬離子、含有1mM鋅離子、含有1mM鈣離子、含有1mM錳離子及含有1mM鎂離子之檢量線；圖1(b)為分別為本發明之試劑中無金屬離子及同時含有1mM鋅離子、1mM鈣離子、1mM錳離子與含有1mM鎂離子之檢量線。

圖2為本發明之製備例4之製備嘉磷塞樣品流程圖。

本發明之檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑，其包含銅離子及一與該銅離子鍵結之染料，其中該染料與該銅離子之鍵結能力低於嘉磷塞與該銅離子之鍵結能力，該染料與該銅離子分離時之顏色係與該銅離子鍵結時之顏色相異。

上述之試劑中，該染料及該銅離子之濃度比為4：1~1：100，例如4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.5：1、1：1、0.5：1、1：0.5、1：1、1：2、1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50、1：55、1：60、1：65、1：70、1：75、1：80、1：85、1：90、1：95或1：100。

上述之試劑之pH為4~7，例如4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5或7.0；其中，該試劑之pH取決於該染料，而多數該染料之pH範圍為4~7。

上述之試劑包含緩衝溶液，其係選自為醋酸、硼酸、或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽或其等之組合之溶液；緩衝溶液之選擇取決於染料所需的pH範圍。當染料之pH範圍須設定為pH4.0~6.0時，得使用磷酸或其鹽類作為緩衝溶液；當染料之pH範圍須設定為pH7.0時，得使用三羥甲基氨基甲烷作為緩衝溶液；當染料之pH範圍須設定為pH8.0~10.0時，得使用硼酸或其鹽類作為緩衝溶液。緩衝溶液之pH範圍調整可使用氫氧化鈉或鹽酸等通用之酸鹼溶液進行調整之，且不侷限於此等。

上述之試劑中，該染料為偶氮類染劑或二苯并吡喃類染劑。該染料能與銅離子鍵結而變色，且其與銅離子之鍵結能力小於嘉磷塞或其代謝物之鍵結能力。

上述之偶氮類染劑可為胭脂紅(Ponceau 4R，C.I.16255)、麗春紅2R(Ponceau 2R，C.I.16150)、麗春紅6R(Ponceau 6R，C.I.16250)、麗春紅S(Ponceau S,C.I.27195)、對位紅(Para red，C.I.12070)、磺胺米柯定 (Prontosil)、酸性橙5(Acid orange 5，C.I.13080)、酸性橙7(Acid orange 7，C.I.15510)、酸性紅88(Acid red 88，C.I.15620)、誘惑紅(Allura red AC，C.I.16035)、酸性紅27(Amaranth，C.I.16185)、偶氮紫(Azo violet，C.I.24105)、比西列希猩紅(Biebrich scarlet，C.I.26905)、酸性橙6(Chrysoine resocinol，C.I.14270)、橘紅2號(Citrus red 2，C.I.12156)、剛果紅(Congo red，C.I.22120)、酸性紅33(D&C red 33，C.I.17200)、分散橘1(Disperse orange 1，C.I.11080)、立索玉紅(Lithol Rubine BK，C.I.15850)、甲基橙(Methyl orange，C.I.13025)、甲基紅(Methyl red，C.I.13020)、酸性媒介紅(Mordant red 19，C.I.18735)、油紅(Oil red O，C.I.26125)、橙黃B(Orange B，C.I.19235)、橙黃G(Orange G，C.I.16230)、橙黃GGN(Orange GGN，C.I.159802)、紅色2G(Red 2G，C.I.18050)、猩紅GN(Scarlet GN，C.I.148152)、溶劑紅26(Solvent red 26，C.I.26120)、蘇丹紅I(Sudan I，C.I.12055)、蘇丹紅II(Sudan II，C.I.12140)、蘇丹紅III(Sudan III，C.I.26100)、蘇丹紅IV(Sudan IV，C.I.26105)、蘇丹紅7B(Sudan 7B，C.I.26050)、蘇丹紅G(Sudan red G，C.I.12150)、台昐藍(Trypan blue，C.I.23850)或日落黃(Sunset yellow，C.I.15985)，分別如式(1)至(37)所示。

式(1)至(37)：

上述之二苯并吡喃類染劑可為伊紅B(Eosin B，C.I.45400)、伊红Y(Eosin Y，C.I.45380)、羅丹明B(Rhodamine B，C.I.45170)、羅丹明6G(Rhodamine 6G，C.I.45160)、磺醯羅丹明B(Sulforhodamine B，C.I.45100)、酸性紅51(Erythrosin B，C.I.45430)、酸性紅92(Phloxine B，C.I.45410)、食用色素紅色105號(Rose Bengal，C.I.45440)、媒染紫25(Gallein，C.I.45445)、鄰苯二酚紅(Pyrogallol Red)、螢光素鈉(Uranine，C.I.45350)或螢光素(Fluorescein，C.I.45350)，分別如式(38)至(49)所示。

式(38)至(49)：

上述之方法中，該試劑即為上述之本發明之檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑。

上述之方法中，步驟(b)中的樣品係由樣本(例如黃豆)萃取所獲得之樣品。萃取方法會因樣本不同而有所差異，可因不同樣本需求而選擇使用通用之萃取方法，例如溶劑萃取法、管柱萃取法、超臨界流體萃取法或微波萃取法等。

上述之方法中，步驟(c)中的染料變色之程度係以吸光值判定。其中，該吸光值的吸收波長係由所使用之染料而異，依不同染料之吸收破常設定調整之，例如胭脂紅(Ponceau 4R，C.I.16255)的吸收波長為506nm；麗春紅S(Ponceau S,C.I.27195)為352nm；酸性橙5(Acid orange 5，C.I.13080)為445nm等。吸光值之測定係使用任何通用之紫外線/可見光分光光譜儀所完成。

上述之方法中，該步驟(c)中的換算樣品中嘉磷塞或其代謝物之含量，係將所量測樣品之吸光值代入檢測嘉磷塞或其代謝物之檢量線中，以換算出樣品中嘉磷塞含量。該檢量線係利用本發明之試劑加入不同已知濃度之嘉磷塞或其代謝物的標準品(由低濃度至高濃度)，量測吸光值後，藉迴歸線以換算出該檢量線。

[具體實施例]

在下文中，將利用具體實施例特別描寫本發明所揭示之內容。然而，本發明所揭示之內容不限制於下列範例。

胭脂紅染料

以下實驗係以胭脂紅作為本發明之試劑的染料，然而本發明之染料並不限於胭脂紅。由於胭脂紅與銅離子之錯合物在pH為5時，加入嘉磷塞之褪色效果最為明顯，因此以下試劑之pH反應環境設定為5。此外，已經測試胭脂紅與不同濃度之銅離子在不同波長下之吸光值，其中500至550nm之間波長範圍可因不同濃度之銅離子而異，因此選擇506nm作為以下實驗中，量測胭脂紅之吸光值波長。

此外，濃度40μM的純胭脂紅，其吸光值為0.97676，在吸光法可定量的吸光值線性範圍內(一般定吸光值上限為1)，無庸置疑地，40μM的胭脂紅可以說是可檢測的吸光值上限；我們固定胭脂紅的最終濃度為40μM，並接著在可定量的線性範圍內混摻不同的銅離子濃度造成吸光值下降，最後再觀察加入嘉磷塞後的吸光值上升響應如何，以決定最終的試劑配方。

製備例1. 配製磷酸緩衝溶液

取2g的氫氧化鈉固體，溶於100mL的去離子水中以配製0.5N的氫氧化鈉水溶液，並稀釋35%的鹽酸至10%，之後將兩者置於室溫下保存作為調整緩衝溶液至準確的pH值使用。

pH 5.0醋酸緩衝溶液：混合0.1157g的醋酸鈉與0.0338mL的99.7%醋酸，再加水至體積為100mL；使用上述之0.5N的氫氧化鈉溶液或10%鹽酸調整至精確的pH值為5.0。

製備例2. 配製嘉磷塞標準品

將0.4228嘉磷塞(購自SIGMA-ALDRICH，美國密蘇里州聖路易斯)溶於50mL的去離子水中，得到50mM嘉磷塞水溶液，再使用去離子水稀釋成1mM的嘉磷塞水溶液。

實施例1. 配製本發明之試劑1及使用其檢測嘉磷塞用之檢量線(染料：銅離子為4：1)

1.將0.3022g的胭脂紅(Ponceau 4R；購自SIGMA-ALDRICH，美國密蘇里州聖路易斯)溶解於50mL的去離子水中，得到10mM的胭脂紅水溶液後，再使用去離子水稀釋得到1mM的胭脂紅水溶液。

2.將0.6242g的五水合硫酸銅(購自NACALAI TESQUE，日本京都)溶解於50mL的去離子水中，得到50mM的硫酸銅水溶液後，再使用去離子水稀釋成1mM的硫酸銅水溶液。

3.在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液和10μL的1mM硫酸銅水溶液，即完成本發明之試劑(染料：銅離子為4：1)。隨後，重複配置4管相同的試劑，並分別於各管試劑中添加5μL、10μL、15μL及20μL的製備例2之1mM嘉磷塞水溶液後，使用製備例1之磷酸緩衝溶液定量使最終各管溶液總體積1mL，即該各管試劑分別為含有5μM、10μM、15μM及20μM嘉磷塞水溶液。

4.將分別含有5μM、10μM、15μM及20μM嘉磷塞水溶液之試劑，使用紫外光/可見光分光光譜儀(JASCO V-530系列，日本東京)於506nm下量測吸光值，並建立檢量線，檢量線之斜率(靈敏度)及截距(偏差)，如表1所示。

實施例2. 配製本發明之試劑2及使用其檢測嘉磷塞用之檢 量線(染料：銅離子為2：1)

同實施例1之配置步驟，差異在步驟3係在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液和20μL的1mM硫酸銅水溶液，以完成本發明之試劑(染料：銅離子為2：1)，本實施例2之檢量線斜率(靈敏度)及截距(偏差)如表1所示。

實施例3. 配製本發明之試劑3及使用其檢測嘉磷塞用之檢量線(染料：銅離子為1：1)

同實施例1之配置步驟，差異在步驟3係在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液和40μL的1mM硫酸銅水溶液，以完成本發明之試劑(染料：銅離子為1：1)，本實施例3之檢量線斜率(靈敏度)及截距(偏差)，如表1所示。

實施例4. 配製本發明之試劑4及使用其檢測嘉磷塞用之檢量線(染料：銅離子為1：100)

同實施例1之配置步驟，差異在步驟3係在500μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液和400μL的1mM硫酸銅水溶液，以完成本發明之試劑(染料：銅離子為1：100)，本實施例4之檢量線斜率(靈敏度)及截距(偏差)如表1所示。

由上表可知，，本發明之試劑在胭脂紅與銅離子之濃度比為4：1至100：1之範圍時，皆可製備出檢量線；另發現隨著試劑中銅離子濃度的下降，檢量線的截距也隨之上升；考慮靈敏度的話，以20μM銅離子-40μM胭脂紅作為試劑配方時，具有最高的靈敏度。因此較佳可選擇以20μM銅離子-40μM胭脂紅作為試劑配方。

製備例3-配製金屬離子干擾物

將0.0273g的氯化鋅、0.0222g的氯化鈣、0.0252g的氯化錳及0.0190g氯化鎂，分別溶於20mL的去離子水中，以配製均為10mM的金屬離子水溶液，並再將該等金屬離子水溶液稀釋至1mM，以作為測試本發明之試劑之干擾物。

[金屬離子干擾物對本發明之試劑測試]

測試例1-鋅離子干擾物對本發明之試劑影響

2.將0.6242g的五水合硫酸銅(購自NACALAI TESQUE，日本京都)溶解於50mL的去離子水中，得到50mM的硫酸銅水溶液後，再將該50mM的硫酸銅水溶液稀釋至1mM硫酸銅水溶液。

3.在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液、20μL的1mM硫酸銅水溶液、及0.1μL的製備例3之10mM鋅離子水溶液，得到鋅離子干擾物測試例之試劑；隨後，重複配製4管相同此試劑，並分別於各管試劑添加5μL、10μL、15μL及20μL的製備例2之50mM嘉磷塞水溶液後，再使用製備例1之緩衝溶液定量，使最終各管溶液總體積1mL即該各管試劑分別為含有5μM、10μM、15μM及20μM之含有鋅離子的嘉磷塞水溶液。

4.將分別含有5μM、10μM、15μM及20μM之含有鋅離子的嘉磷塞水溶液之試劑，使用紫外光/可見光分光光譜儀(JASCO V-530系列，日本東京)量測於506nm下量測吸光值，並建立檢量線，如圖1(a)所示。

測試例2-鈣離子干擾物對本發明之試劑測試影響

同測試例1之配置步驟，差異在步驟3係在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液、20μL的1mM硫酸銅水溶液、及0.1μL的製備例3之10mM鈣離子水溶液，本測試例3之檢量線如圖1(a)所示。

測試例3-鎂離子干擾物對本發明之試劑影響

同測試例1之配置步驟，差異在步驟3係在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液、20μL的1mM硫酸銅水溶液、及0.1μL的製備例3之10mM鎂離子水溶液，本測試例3之檢量線如圖1(a)所示。

測試例4-錳離子干擾物對本發明之試劑影響

同測試例1之配置步驟，差異在步驟3係在900μL的製備例1 之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液、20μL的1mM硫酸銅水溶液、及0.1μL的製備例3之10mM錳離子水溶液，本測試例4之檢量線如圖1(a)所示。

測試例5-有鋅、鈣、鎂及錳離子干擾物對本發明之試劑影響

同測試例1之配置步驟，差異在步驟3係在900μL的製備例1之20mM的醋酸緩衝溶液中，加入40μL的1mM胭脂紅水溶液、20μL的1mM硫酸銅水溶液、0.1μL的製備例3之10mM鋅離子水溶液、0.1μL的製備例3之10mM鈣離子水溶液、0.1μL的製備例3之10mM鎂離子水溶液、及0.1μL的製備例3之10mM錳離子水溶液，使4種離子的最終濃度皆為1mM，以研究4種離子同時存在時對檢測嘉磷塞的可能干擾，本測試例5之檢量線如圖1(b)所示。

由測試例1至5及圖1(a)及(b)所示，本發明之試劑縱使在有金屬離子之存在下，其吸光值及嘉磷塞的濃度之變化仍維持良好的線性關係。本發明者測試時所採用的金屬離子濃度為1mM，而試劑中僅為20μM銅離子，然而，本發明之試劑仍可以準確地檢測並定量μM等級的嘉磷塞濃度。即，本發明之試劑並不受到金屬離子等干擾物之影響，係一種能有效檢測嘉磷塞之試劑。

[嘉磷塞樣品檢測]

製備例4-從黃豆及豆漿中萃取樣品

1.將台灣市面上流通的10款黃豆及3款豆漿作為樣本。

2.黃豆樣本：將黃豆經過粉碎機(台灣彰化祐麟機械公司， DN6系列)粉碎成粉末狀後，如圖2所示，取2g黃豆粉末加入20mL的去離子水和5mL的二氯甲烷(購自SIGMA-ALDRICH，美國密蘇里州聖路易斯)；接著進行30分鐘的超音波震盪(功率180瓦，震盪頻率140赫茲，水量1公升)；超音波震盪結束後，進行4600rpm的離心10分鐘；使用SPE固相萃取管柱(WATERS公司，WAT094226系列，粒徑30μm，美國馬薩諸塞州米爾福德)禁行萃取，先後用2mL甲醇和2mL去離子水潤洗後，通入2mL離心後的上層液進行萃取，接著取萃取後的上層液1mL，與1mL的乙腈混合後，將混合液靜置於-18℃的冰箱中2小時，使黃豆中尚未被分離的豐富蛋白質沉澱。最後取上層液進行12000rpm的離心程序，過程10分鐘，即可得到含有嘉磷塞的透明澄清上清液，作為檢測用樣品；使用此萃取方法所得的嘉磷塞標準品(10μM嘉磷塞水溶液)，回收率為99.11%。

3.樣本為豆漿：量取20mL豆漿與5mL的二氯甲烷混合進行超音波震盪，後續步驟則同前述萃取樣本為黃豆之步驟。

實施例5至17. 檢測樣品中嘉磷塞

將製備例4所得之嘉磷塞樣品，各別加於已配製於試管中之實施例2之試劑(染料：銅離子為2：1)中，依序標示為實施例5至17，使用製備例1之磷酸緩衝溶液定量至最終各管溶液總體積1mL，並使用紫外光/可見光分光光譜儀(JASCO V-530系列，日本東京)於506nm下量測吸光值，套入配有5μM、10μM、15μM、20μM嘉磷塞標準品之檢量線中，以換算各樣品中嘉磷塞及其代謝物殘留之含量，如表2所示。

表2

由實施例5至17所示，本發明之試劑可有效檢測嘉磷塞濃度範圍廣的樣本。且，由檢測結果可知，目前台灣市售的10款黃豆及3款豆漿並不符合台灣、美國與歐盟中的嘉磷塞容許規範，分別為10ppm及20pmm。

是以，本發明之試劑及其檢測方法，受金屬離子干擾物之影響小。而除了在製備上簡單，更重要的是藉由染料之顏色變化搭配紫外/可見光光譜儀，相較於傳統方法必須進行衍生前處理及LC-MS/MS等操作都來的快速許多，為一種具新穎性及進步性之嘉磷塞檢測方法。

Claims

一種檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑，其係由銅離子及一與該銅離子鍵結之染料所組成，其中該染料與該銅離子之鍵結能力低於嘉磷塞與該銅離子之鍵結能力，該染料與該銅離子分離時之顏色係與該銅離子鍵結時之顏色相異；其中，該染料為胭脂紅(Ponceau 4R，C.I.16255)、酸性紅27(Amaranth，C.I.16185)或日落黃(Sunset yellow，C.I.15985)。
如請求項1之檢測嘉磷塞或其代謝物之試劑，其中該染料及該銅離子之濃度比4：1~1：100。
一種檢測樣品中嘉磷塞或其代謝物之檢測方法，包含：(a)提供一試劑，其包含銅離子及一與該銅離子鍵結之染料；(b)將該樣品加入該試劑中，使該樣品中之嘉磷塞或其代謝物與該試劑中之銅離子鍵結，且該染料因與該銅離子分離而變色；(c)依據該試劑中染料變色之程度，換算樣品中嘉磷塞或其代謝物之含量；其中，該染料為胭脂紅(Ponceau 4R，C.I.16255)、酸性紅27(Amaranth，C.I.16185)或日落黃(Sunset yellow，C.I.15985)。
如請求項3之檢測方法，其中該染料及該銅離子之濃度比4：1~1：100。
如請求項4之檢測方法，其中該試劑之pH為4~7。
如請求項3至5任一項之檢測方法，其中該試劑包含緩衝溶液，其係選自為醋酸、硼酸、或三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽或其等之組合之溶液。
如請求項3至5任一項之檢測方法，其中該試劑中染料變色之程度，係以吸光值判定。