TWI602572B - 抗菌胜肽tp4治療癌症之用途 - Google Patents

Description

抗菌胜肽TP4治療癌症之用途

本發明係關於一種抗菌胜肽TP4在治療癌症、具體而言是三陰性乳癌(TNBC)的用途。

乳癌(BC)是導致婦女死亡最常見的惡性腫瘤。整體基因表現圖譜研究已將乳癌歸類成不同的亞型，其中缺乏雌激素受體(ER)、孕酮受體(PR)、及人類表皮生長因子受體2(HER2)表現的亞型被群集為三陰性乳癌(TNBC：ER^-/PR^-/HER2^-)。荷爾蒙或標靶療法對抗TNBC通常沒有效，但全身性治療，例如蒽環類或紫杉烷類傳統化療展現強的治療功效(Rouzicr等人，乳癌分子亞型對術前化療反應不同，Clinical cancer research：an officialjournal of the American Association for Cancer Research 11,5678-5685,2005；Carey等人，三陰性悖論：乳癌亞型之原發腫瘤化療敏感性，Clinical cancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research 13,2329-2334,2007)。然而，TNBC患者常表現出遠處轉移和預後不良。化療劑失敗的主要原因是在標準化療方案之下發展出多重抗藥性(MDR)癌細胞；此外，這種方案會損傷健康細胞、引起不良的副作用。使用非交叉抗藥性藥物或生物試劑與化療藥物組合是轉移的TNBC患者可能的選擇。然而，即使這種選擇可提高療效，但轉移性TNBC患者的 預後仍然不良。

一些研究表示，相對於通常是兩性離子的健康細胞，一些對治療反應不佳的轉移性癌細胞在外膜上具有帶負電荷的磷脂醯絲胺酸(PS)或陰離子結構。這個特性允許一些選擇性細胞毒性劑(例如陽離子抗菌胜肽(CAPs))通過靜電相互作用攻擊惡性腫瘤(Hallock等人，膜成分決定pardaxin的脂質雙層破壞機制，Biophysical journal 83,1004-1013,2002；Gottler & Ramamoorthy，pexiganan的結構、膜方向、機制、及功能--一種從magainin設計的高效抗菌胜肽，Biochimica et biophysica acta 1788,1680-1686,2009；以及Ramamoorthy等人，膽固醇降低pardaxin的動力-藉由固態核磁共振研究膜破壞的桶狀式穿鑿機制，Biochimica et biophysica acta 1798,223-227,2010)。陽離子抗菌胜肽(CAPs)是先天免疫系統進化時保存的成分，對於對抗範圍廣泛的病原體的活性是不可或缺的(Zasloff，多細胞生物體的抗菌胜肽，Nature 415,389-395,2002；及Zanetti，Cathelicidins，先天免疫力的多功能性胜肽，Journal of leukocyte biology 75,39-48,2004)。CAPs的防禦能力是從它們的結構產生的，這允許CAPs滲透陰離子細菌膜(Powers JP,Hancock RE.，胜肽結構與抗菌活性之間的關係，Peptides 24,1681-1691,2003)。除了抗菌活性之外，某些CAPs對某些癌症類型是有細胞毒性的，但對正常細胞的毒性較少(Papo等人，由DL-胺基酸組成的新穎裂解胜肽選擇性地滅殺培養菌和小鼠身上的癌細胞，The Journal of biological chemistry 278,21018-21023,2003；Hoskin & Ramamoorthy，抗菌胜肽的抗癌活性研究，Biochimica et biophysica acta 1778,357-375,2008；以及Ting等人，自然陽離子抗菌胜肽pardaxin鎖定內質網和誘導c-FOS之機制， Biomaterials 35,3627-3640,2014)。使用大量CAPs治療癌細胞導致瞬間的膜裂解(Hilchie等人，Pleurocidin家族陽離子抗菌胜肽可溶解乳癌細胞並防止腫瘤異種移植物生長，Breast cancer research：BCR 13,R102,2011；Papo等人，由溶細胞的D-、L-胺基酸胜肽在小鼠身上抑制人類前列腺腫瘤生長：膜溶解、增加的壞死、及抑制前列腺特異性抗原分泌，Cancer research 64,5779-5786,2004；Rodrigues等人，由抗菌胜肽gomesin有效局部治療皮下鼠B16F10-Nex2黑色素瘤，Neoplasia 10,61-68,2008；Chen等人，魚抗菌胜肽吳郭魚鐵調節素(hepcidin)TH2-3顯示對抗人類纖維肉瘤細胞的有效抗腫瘤活性，Peptides 30,1636-1642,2009；Lin等人，Epinecidin-1，一種來自魚(點帶石斑魚)的抗菌胜肽，具有類似在人類纖維肉瘤細胞中的裂解胜肽的抗腫瘤效果，Peptides 30,283-290,2009；Gaspar等人，抗癌胜肽SVS-1：膜中和之前的效用，Biochemistry 51,6263-6265,2012；Wang等人，來自中國棕蛙(中國林蛙)的皮膚分泌物的抗菌胜肽temporin-1CEa之抗腫瘤效果和細胞選擇性，Biochimie 94,434-441,2012)。然而，低濃度的CAPs會引發細胞凋亡(Kawamoto等人，一種鎖定新穎運鐵蛋白受體的雜合胜肽分解癌細胞膜而誘導癌細胞的快速滅殺，BMC cancer 11,359,2011；以及Huang & Chen，蛋白質組學分析顯示pardaxin引發人類子宮頸癌HeLa細胞的凋亡傳訊路徑：UPR、c-Jun及ROS之間的串擾，Carcinogenesis 34,1833-1842,(2013)、及/或癌細胞壞死(Papo等人；Leuschner等人，膜破壞裂解胜肽偶聯物在體外和體內破壞荷爾蒙依賴性和非依賴性乳癌細胞，Breast cancer research and treatment 78,17-27,2003；Leuschner & Hansel，通過荷爾蒙受體鎖定乳癌和前列腺癌，Biology of reproduction 73,860-865,2005；van Zoggel H等 人，抗菌胜肽dermaseptin B2之抗腫瘤和血管生成抑制活性，PloS one 7,e44351,2012)。CAPs已被報告可誘導幾種細胞內事件，包括改變鈣體內恆定、粒線體功能障礙、及誘導活化物蛋白-1(AP-1)(Hilchie等人；Ting等人；Huang & Chen；及Wang等人，抗菌胜肽tempoprin-1CEa在乳癌細胞中通過膜破壞和細胞內鈣機制的快速細胞毒性，PloS one 8,e60462.2013)。鈣傳訊的活化似乎為CAPs在癌細胞內所誘發的早期事件，並介導下游活化物蛋白-1(AP-1)的傳訊(Ting等人)。AP-1成員是幾個途徑的關鍵介質；這些蛋白質與JUN原癌基因(c-JUN)家族的蛋白(c-JUN、JUNB、JUND)或FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FOS)家族的蛋白(c-FOS、FOSB、FRA1/2)形成二聚體。AP-1的二聚體組合物響應細胞刺激或在不同的細胞環境中調節下游基因的表現以及控制細胞命運決定(Eferl & Wagner，AP-1：在腫瘤發生中的雙刃劍，Nature reviews Cancer 3,859-868,2003)。FRA1通過在不良分化的TNBC細胞中抑制CDH1來調節腫瘤細胞的生長和轉移(Milde-Langosch等人，AP-1轉錄因子c-Fos、FosB、Fra-1及Fra-2在乳房腫瘤的入侵過程中的作用，Breast cancer research and treatment 86,139-152,2004；及Zhao等人，AP-1調控轉錄的全基因組分析提供深入了解三陰性乳癌的侵襲性，Cancer research 74,3983-3994,2014)，其缺乏FOSB表現(Bamberger等人，AP-1家族在乳癌的表現模式：fosB表現與分化良好、受體陽性腫瘤表型的關聯，International journal of cancer Journal international du cancer 84,533-538,1999；及Milde-Langosch等人，FosB在正常乳腺上皮細胞中有高度表現，但下調不良分化的乳房惡性腫瘤，Breast cancer research and treatment 77,265-275,2003)。然而，有關FOSB在TNBC 的作用所知甚少。

意外地發現，從尼羅河吳郭魚(Oreochromis niloticus)衍生的特定CAP吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)具有治療三陰性乳癌(TNBC)的潛力。

在一方面，本發明提供一種在有需要的個體身上用於TNBC的方法，該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4連同醫藥上可接受載體。

在本發明的一個特定實例中，該方法可通過誘導FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B(FOSB)有效地治療TNBC。

在另一方面，本發明提供一種在有需要的個體身上用於惡性癌症的方法，該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4連同醫藥上可接受載體。

在進一步方面，本發明提供一種在有需要的個體身上治療多重抗藥性(MDR)癌症的方法，該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4連同醫藥上可接受載體。

在又一方面，本發明提供一種在有需要的個體身上治療轉移性癌症的方法，該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4連同醫藥上可接受載體。

在又進一步方面，本發明提供一種治療患有癌症的個體的方法，其中癌細胞在外膜上具有帶負電荷的磷脂醯絲胺酸(PS)或陰離子結構，該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4連同醫藥上可接受載體。

在本發明的一個具體實施例中，提供一種治療患有惡性MDR癌症、復發性癌症或轉移性癌症的個體的方法。該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4連同醫藥上可接受載體。

在再一方面，本發明提供一種治療患有惡性MDR癌症、復發性癌症或轉移性癌症的個體的方法，該方法包含施予該個體一組合物，該組合物包含TP4與一比例的一種或更多種抗癌藥物的組合，以在治療惡性或復發性癌症時提供增效作用。

另一方面，本發明提供TP4用於製造治療癌症、具體而言是TNBC的藥物的用途。

具體而言，該癌症為惡性癌症、MDR癌症、復發性癌症或轉移性癌症。該個體可以是患有癌症的個體，其中癌細胞在其外膜上具有帶負電荷的磷脂醯絲胺酸(PS)或陰離子結構。

在一個又進一步方面，本發明提供一種治療惡性、多重抗藥性(MDR)、復發性或轉移性癌症的醫藥組合物，該醫藥組合物包含TP4與一比例的一種或更多種抗癌藥物的組合，以在治療癌症時提供增效作用。

當結合附圖一起閱讀時將更好地理解前面的概述、以及以下本發明的詳細描述。為了說明本發明的目的，在圖式中圖示出目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明並不限於此具體實施例。

在圖式中：圖1圖示TP4通過誘導壞死選擇性地殺死乳癌細胞。

圖1(a)-圖1(e)圖示使用不同劑量的TP4(2.5-20μg mL^-1) 治療之後在指示的時間點(3-24h)由MTS試驗測定的細胞存活率，包括：(a)MB231(圖1(a))、(b)MB453(圖1(b))、(c)MCF7(圖1c)、(d)M10(圖1(d))、及(e)HDF(圖1(e))。為每個試驗進行一式六份孔的分析。結果表示平均±SD(n=3，將統計分析圖示於表1)。

圖1(f)圖示藉由2%瓊脂糖凝膠電泳在TP4處理的MB231細胞中檢測DNA片段的結果(P道：正對照(放線菌素D處理的HL60細胞溶解物)；N道：負對照(MB231細胞溶解物)；T道：TP4處理的MB231細胞溶解物；M道：DNA分子量標記。

圖1(g)圖示使用不同劑量的TP4(2.5-20μg mL^-1)處理之後在3小時測定的MB231細胞LDH水平。為每個試驗進行一式六份細胞培養孔的分析。結果表示平均±SEM(n=3，單因子變異數分析：***，P<0.001對比對照組，ns：不顯著)。

圖2圖示TP4沒有引發細胞凋亡。

圖2(A)圖示在使用TP4(14μg mL^-1)處理3或6小時的HDF(左)或MB231(右)細胞中使用TUNEL染色來評估凋亡性細胞死亡。DNase I：DNA片段的正對照。比例尺：50μm。

圖2(B)圖示圖2(A)圖示的TUNEL陽性訊號之定量結果，指出數量非常有限的細胞顯現螢光標記。結果表示平均±SEM(學生的t測試(Student’s t-test)：ns：不顯著)。

圖2(C)圖示藉由西方墨點法使用針對Caspase3、裂解Caspase3、細胞色素C、及β肌動蛋白的抗體分析來自使用(T)或不使用(C)TP4培育的HDF和MB231細胞的總蛋白質溶解物。

圖2(D)圖示圖2(C)圖示的墨點之定量分析結果，並使用β肌動蛋白作為標準化的對照。結果表示來自三個以一式三份進行的獨立實驗的平均±SEM(學生的t測試：*，P<0.05，ns：不顯著)。

圖3提供TP4在乳癌細胞中誘導FOSB的效果。

圖3(a)圖示微陣列研究的基因本體論(GO)分析結果將失調基因分類為九個定義的類別(P<0.01)；其中圖形顯示與未處理的對照組相比在TP4治療之後在MB231細胞中有差異表現的每個類別之基因數量。使用David 6.7軟體決定註解術語。

圖3(b)圖示描繪在TP4治療之後MB231或HDF細胞中受影響的基因之表現變化的熱圖(比例尺表示log₂倍的變化)。以紅色圖示AP-1轉錄因子成員。C1、C2和T1、T2表示分別從兩個獨立的試驗中收集的模擬和TP4處理樣品。

圖3(c)圖示使用FOSB抗體(紅色)和β肌動蛋白(綠色)將TP4(14μg mL^-1)或模擬處理的細胞染色。使用Hochest 33342染料用於核染色(藍色)。比例尺：50μm。

圖3(d)圖示來自不使用(-)或使用(+)TP4處理的MB231(左)或HDF(右)細胞的總蛋白質溶解物，藉由西方墨點法使用針對GAPDH和FOS/JUN家族蛋白的抗體分析該總蛋白質溶解物。

圖3(e)和圖3(f)提供圖3(d)圖示的墨點之定量分析結果，並使用GAPDH作為標準化的對照。結果表示平均±SEM(n=3，學生的t測試：*，P<0.05及**，P<0.01對比對照組，ns：不顯著)。

圖3(g)圖示來自對照細胞(道1)、及使用TP4(道2)、阿 黴素(道3)、泛艾黴素(道4)、歐洲紫杉醇(道5)、或太平洋紫杉醇(道6)處理的細胞之總蛋白質溶解物，藉由西方墨點法使用針對GAPDH和FOSB的抗體分析該總蛋白質溶解物。將每一道的FOSB加FOS△B之相對量表示為相對密度單位(RDUs)，其計算係將FOSB加FOS△B訊號除以GAPDH訊號。

圖3(h)圖示用以在使用PD98059和TP4處理的細胞中量測細胞存活率的MTS試驗之結果。為每個試驗分析一式六份的細胞培養孔。結果表示平均±SEM(n=3)。使用學生的t測試進行使用或未使用PD98059處理的組之間的差異之統計比較。ns：不顯著；*，P<0.05；***，P<0.001。

圖4圖示在BC細胞中藉由TP4誘導FOSB。

圖4(A)和圖4(B)圖示使用FOSB抗體(紅色)和β肌動蛋白(綠色)將TP4(14μg mL^-1)或模擬處理的細胞染色。使用Hochest 33342染料用於核染色(藍色)。比例尺：50μm。

圖4(C)圖示藉由西方墨點法使用針對GAPDH和FOSB的抗體分析來自不使用(-)或使用(+)TP處理的MB453和MCF7細胞的總蛋白質溶解物。

圖4(D)圖示圖4(C)圖示的墨點之定量分析結果，並使用GAPDH作為標準化的對照。結果表示來自三個以一式三份進行的獨立實驗的平均±SEM(學生的t測試：*，P<0.05)。

圖5圖示在MB231細胞中MAPK路徑受TP4影響。

圖5(A)圖示藉由西方墨點法使用針對ERK、phospho-ERK、JNK、phospho-JNK、p38、phospho-p38、及β肌動蛋白的抗體分析來自使用(T)或不使用(C)TP4處理的MB231和HDF細胞的總蛋白質溶解物。

圖5(B)和圖5(C)圖示圖5(A)圖示的墨點之定量分析結果，並使用β肌動蛋白作為標準化的對照。結果表示來自三個以一式三份進行的獨立實驗的平均±SEM(學生的t測試：**，P<0.01，ns：不顯著)。

圖6圖示TP4通過FOSB誘導引發TNBC細胞死亡。

圖6(a)圖示使用FOSB(紅色)抗體和Hochest 33342(藍色)將正常相鄰組織(NAT，n=26)和不同等級的TNBC樣品(等級I、II、III的樣品分別為n=6、19、10)染色。比例尺：200μm。下圖，FOSB螢光訊號的定量指出，FOSB水平與TNBC病理等級相關。AU：任意單位。

圖6(b)圖示藉由西方墨點法檢查來自模擬(M)和TP4處理組的總蛋白質溶解物。下圖，總FOSB(FOSB加FOS△B)誘導的定量分析，對GAPDH標準化。

圖6(c)圖示使用FOSB或FOS△B載體轉染的MB231細胞之相位對比及螢光影像。比例尺：50μm。藉由ATP試驗測定細胞存活率。為每種劑量分析至少14個複製孔。

圖6(d)圖示藉由西方墨點法分析來自使用對照或FOSB shRNA慢病毒轉導的、模擬和TP4處理(14μg mL^-1，6小時)的MB231細胞的總蛋白質溶解物。

圖6(e)圖示對GAPDH標準化的FOSB誘導水平。

圖6(f)圖示TP4處理對於藉由MTS試驗測定的指定細胞存活率的影響。為每個試驗分析一式六份的細胞培養孔。

圖6(g)圖示藉由西方墨點法分析來自MB231細胞(模擬(-)或TP4處理(+))的總蛋白質溶解物。

圖6(h)和圖6(i)圖示對GAPDH標準化的FRA1(圖6(h))和CDH1(圖6(i))水平之定量分析結果。

圖6(j)圖示使用指定的抗體從模擬(M-)或TP4處理的(T-)MB231核萃取物(NEs)免疫沉澱的DNA-蛋白複合物。在競爭試驗中使用40皮莫耳結合野生型(WT)或突變(MT)AP-1的寡核苷酸。使用以TPA刺激的K-562細胞NEs作為正對照。

圖6(k)和圖6(l)圖示使用抗c-JUN抗體從模擬(C)或TP4處理的(T)NE免疫沉澱出cJUN。使用來自模擬或TP4處理組的總蛋白質溶解物作為正對照。使用非特異性IgG進行免疫沉澱作為負對照。藉由西方墨點法使用cJUN檢查FRA1(圖6(k))和FOSB(圖6(l))的共免疫沉澱。藉由學生的t測試(a、d、e、h-j)、單因子變異數分析(b)、或雙因子變異數分析(c)，結果表示平均±SEM(n=3)。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，ns：不顯著。

圖7圖示TP4鎖定TNBC細胞膜和胞內胞器。

圖7(a)-圖7(d)圖示生物素標記的TP4在MB231(圖7(a)-圖7(c))和HDF細胞(圖7(d))中的細胞定位。細胞用生物素(綠色)、高爾基標記(giantin；紅色)(圖7(a)、圖7(d))、內質網標記(鈣網伴護蛋白；紅色)(圖7(b))、以及粒線體標記(mitotracker；紅色)(圖7(c))抗體染色。質膜標有結合Alexa Flour--647的WGA(紫色)。將Hoechst 33342用於核染色(藍色)。在合併影像右側的分格中圖示放大的箱型區。黃色和白色箭頭表示生物素標記的TP4分別與質膜和高爾基或粒線體的共定位。比例尺：50μm。

圖7(e)和圖7(f)圖示螢光訊號的定量結果，指出粒線體膜電位在TP4處理的MB231細胞中明顯下降(圖7(e))。使用學生的t測試進行模擬和TP4處理的細胞之間的統計比較。ns：不顯著；*，P<0.05；***，P<0.001。

圖7(g)圖示在載體對照(V)、eGFP轉染的、及FOSB轉染的MB231細胞中的螢光強度之定量結果，指出粒線體螢光強度在FOSB轉染的MB231細胞中降低。使用學生的t測試進行模擬和TP4處理的組之間的統計比較。ns：不顯著；***，P<0.001。

圖7(h)圖示在使用TP4(14μg m^-1L持續0.5-6.0小時)處理的Controlsh-和FOSBsh-MB231細胞中的粒線體螢光訊號之定量結果，指出粒線體強度可以藉由T4處理在FOSB默化的MB231細胞中部分恢復。使用學生的t測試(每組n=50)進行模擬和TP4處理組之間的統計比較。ns：不顯著；*，P=0.0221；**，P<0.01；***，P<0.001。AU：任意單位。

圖8圖示藉由TP4處理通過FOSB誘導所造成的粒線體功能障礙。

圖8(A)和圖8(B)圖示使用TP4(14μg mL^-1)處理MB231和HDF細胞3或6小時，並使用MitoTracker Red CMX-ROS染料染色來檢測粒線體。Hoechst 33342用於細胞核染色(藍色)。

圖8(C)、圖8(D)、圖8(E)圖示藉由MitoTracker Red CMX-ROS染料將MB231細胞染色；其中圖8(D)圖示表現eGFP的MB231細胞，與圖8(C)圖示的那些粒線體染色圖案類似。

圖8(E)圖示表現FOSB-tGFP的MB231細胞具有比未轉染 細胞降低的粒線體強度。MT：MitoTracker。比例尺：50μm。

圖8(F)和圖8(G)圖示使用TP4(14μg mL^-1)處理Contsh-MB231(圖8(F))和FOSBsh-MB231(圖8(G)，由箭頭指示)細胞0.5至6小時。使用MitoTracker Red CMX-ROS染料染色來檢測粒線體(紅色)。Hoechst33342用於細胞核染色(藍色)。在合併圖式右側的分格中圖示放大的箱型區。比例尺：30μm。

圖9圖示TNBC細胞中的FOSB誘導需要鈣傳訊。

圖9(a)圖示使用指定劑量的TP4處理5至30分鐘之後藉由添加螢光Ca²⁺指示劑(Fluo-4)量測的Ca²⁺水平。為每個試驗分析一式8份的細胞培養孔。結果表示平均±SEM(n=3，學生的t測試：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。

圖9(b)圖示每30秒使用指定劑量的TP4處理30分鐘之後使用螢光Ca²⁺指示劑(Rhod-2AM)動態量測的粒線體Ca²⁺水平。結果表示平均±SEM(n=3，單因子變異數分析：***，P<0.001)。

圖9(c)和圖9(f)圖示來自對照(道1)、BAPTA/AM(鈣螯合劑)處理的或AIP2(CaMKII抑製劑)處理的細胞(道2)、TP4處理的細胞(道3)、及組合處理的細胞(道4)的總蛋白質溶解物，其係藉由西方墨點法使用對抗GAPDH和FOSB的抗體分析。

圖9(d)和圖9(g)圖示圖9(c)和圖9(f)圖示的墨點之定量分析結果；對GAPDH標準化FOSB加FOS△B的水平。結果表示平均±SEM(n=3，學生的t測試：*，P<0.05；**，P<0.01)。

圖9(e)和圖9(h)圖示在使用Ca²⁺螯合劑或CaMKII抑制 劑和TP4處理的細胞中量測的細胞存活率。為每個試驗分析一式六份的細胞培養孔。結果表示平均±SEM。使用學生的t測試進行使用或未使用抑制劑處理的組之間的差異之統計比較。***，P<0.001。

圖9(i)圖示所提出的TP4對抗TNBC的作用機制。TP4鎖定細胞膜並選擇性鎖定粒線體，導致Ca2⁺釋放並誘導FOSB表現。FOSB/c-JUN成為在細胞死亡上介導下游作用的主要AP-1複合物。

圖10圖示缺失小鼠良好吸收KY膠。

圖10(A)圖示裸鼠(n=5)每兩天被皮下注射10μL的KY膠加50μL的蒸餾水，總共注射14次。

圖10(B)圖示每兩天計算的注射混合物量。結果表示平均±SEM。

圖11圖示TP4在裸鼠體內抑制TNBC異種移植物生長。

圖11(a)圖示在裸鼠體內的異種移植物生長(n=5)。

圖11(b)圖示在TP4處理開始之後在指定天數的腫瘤大小之定量結果。藉由具有事後分析(Bonferroni檢測)的雙因子變異數分析進行KY和TP4處理組之間的統計比較。ns：不顯著；*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。

圖11(c)圖示異種移植物腫瘤重量(左)和小鼠體重(右)，其係於小鼠犧牲時測得(學生的t測試，**，P<0.01；ns，不顯著)。

圖11(d)圖示異種移植物腫瘤的蘇木素-伊紅染色。白色虛線標示壞死區。

圖11(e)圖示異種移植物腫瘤中的Ki-67陽性細胞的免疫組 織化學染色。比例尺：200μm。

圖12提供概述斑馬魚異種移植物研究設計的示意圖。圖示的是在斑馬魚胚胎中在48小時進行的實驗。

圖13圖示螢光報導細胞株的產生。在G418或嘌呤黴素選擇之下取得螢光穩定殖株(表現eGFP的M10或表現eGFP/mOrang2的MB231細胞)。操作、擴張單殖株、並用於異種移植。

圖14圖示TP4處理延長了TNBC異種移植斑馬魚的生存期。

圖14(a)圖示有或沒有TP4處理的M10和TNBC細胞之存活分析。藉由Log-rank檢測進行統計比較。*，P<0.05；***，P<0.001。

圖14(b)圖示在有或沒有TP4處理(5d為3μg mL^-1)的M10和TNBC異種移植物中eGFP螢光訊號的定量結果。使用學生的t測試(n=11)進行模擬和TP4處理的細胞之間的統計比較。ns：不顯著；***，P<0.001。AU：任意單位。

圖14(c)圖示具有表現mOrange2的TNBC異種移植物(紅色)的轉基因斑馬魚(fli：eGFP)進行模擬或TP4處理(5d為3μg mL^-1)，然後用FOSB抗體染色(白色)。每個方格都是拍攝背部和前部的照片的合併影像。在圖的右下角圖示放大的箱型區。藍色箭頭指示彌散性腫瘤病灶。黃色箭頭指示具有陽性FOSB訊號的TNBC異種移植物。比例尺：200μm。

圖14(d)和圖14(e)圖示在TNBC異種移植斑馬魚體內主要腫瘤區(圖14(d))和彌散性腫瘤病灶(圖14(e))的定量結果。結果表示平均±SEM，並藉由學生的t測試分析(每組n=4)。ns：不顯著；*，P=0.0221；**，P<0.01；***，P<0.001。

圖14(f)圖示在使用TP4(3μg mL^-1)單一處理期間具有表現mOrange2的TNBC異種移植物(紅色)的轉基因斑馬魚(fli：eGFP)之時間推移研究。每隔1小時截取時間序列影像，包括z-堆疊。圖示出48小時內的選擇畫面。在異種移植斑馬魚的箭頭指示TNBC細胞的血管侵入。在圖上方的影像中圖示放大的箱型區。

圖14(g)提供在斑馬魚體內通過共同主靜脈(CCV)的TNBC異種移植物遷移之示意圖。

圖14(h)圖示有或沒有TP4(3μg mL^-1，單次處理)的TNBC異種移植物在72-120hpf的生存分析。藉由Log-rank測試進行組之間存活曲線的統計比較。*，P<0.05。

圖14(i)和圖14(j)圖示在有或沒有TP4處理的斑馬魚體內異種移植腫瘤生長基於標準化腫瘤面積(圖14(i))和螢光強度(圖14(j))的定量分析結果。結果表示平均±SD，並藉由雙因子變異數分析進行分析；***，P<0.001。

圖15圖示TP4在斑馬魚胚胎中的毒性和治療功效評估。

圖15(A)圖示每天在48hpf將一系列13種劑量的TP4加到容納斑馬魚的魚水中。測定生存率(每組n=32)。

圖15(B)和圖15(C)圖示在五天的連續TP4處理(1或2μg mL^-1)期間在螢光顯微鏡下觀察到的TNBC異種移植斑馬魚體內的eGFP螢光訊號。

圖16圖示TP4增強斑馬魚胚胎的免疫活性。圖16(A)-圖16(G)圖示有與沒有TP4處理的對照魚或有與沒有TP4處理的TNBC異種移植 魚之間相對免疫基因表現圖譜的即時PCR分析。藉由單因子變異數分析進行時間點之間的免疫基因表現的統計比較。ns：不顯著；**，P<0.01；***，P<0.001。

除非另有定義，否則本文中使用的所有技術和科學術語皆具有與本發明所屬技術領域中具有通常知識之人士一般理解的相同的含義。

除非內文以其他方式清楚指明，否則本文中使用的單數形「一」及「該」包括複數的指示對象。因此，舉例來說，提及「一樣品」包括複數個這樣的樣品及所屬技術領域中具有通常知識者習知的該樣品之均等物。

本文中使用的「吳郭魚抗菌蛋白4」或「TP4」乙詞是指一種陽離子抗菌胜肽(CAP)或其片段或變體，其係衍生自尼羅河吳郭魚(Oreochromis niloticus)。TP4具有FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR(SEQ ID NO：1)的胺基酸序列，如Peng等人揭示的。(Peng等人，五種來自尼羅河吳郭魚Oreochromis niloticus的不同抗菌蛋白：其表現及生物功能之分析；PLoS One 7(11)：e50263,2012)。

本文中使用的「其功能性片段或變體」乙詞是指保持相同或相似活性、並且表現出相同或相似性質的胜肽之片段或變體。

如本文中使用的，「FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B」(也稱為「FOSB」或「FosB」)是指在人類體內由FOSB基因編碼的蛋白質。FOSB基因屬於FOS基因家族的一員，其編碼可與JUN家族的蛋白(例如c-Jun、JunD)二聚化的白胺酸拉鍊蛋白，從而形成轉錄因子複合物AP-1。因此， FOS蛋白一直被認為是細胞增殖、分化、及轉形的調節劑。

本發明意外地發現，吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)可通過誘導FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B(FOSB)來治療癌症。

在本發明中發現的是，TP4藉由誘導稱為FOSB的AP-1蛋白來作用，FOSB的表現與腫瘤的病理等級成負相關，並且TP4鎖定粒線體，TP4在粒線體破壞鈣的穩態並活化FOSB。FOSB過度表現導致TNBC細胞死亡，而抑制鈣的訊號傳導會消除FOSB的誘導並阻止TP4誘導TNBC細胞死亡。有趣的是，TP4和蒽環類藥物皆強烈誘導FOSB，特別是在TNBC，表示FOSB適合作為藥物響應的生物標記。因此，本發明提供TP4可被用作針對惡性癌症(例如TNBC)的新治療方法，該方法涉及以FOSB介導的「往死亡之路」訊號傳導為目標。

在本發明中，發現TP4對乳癌細胞具有選擇性的毒性。依據乳癌細胞株和異種移植模型顯示的體外和體內數據，建議的是，TP4適合作為用以治療TNBC的新試劑。TP4以鈣相依的方式通過ERK/FOSB/cJUN軸損傷TNBC細胞。在TNBC中活化FOSB需要鈣傳遞訊號，此係藉由TP4選擇性鎖定粒線體來轉導。此外，由TP4誘導CDH1也可有助於TNBC抑制。有趣的是，廣泛使用的蒽環類藥物也在TNBC細胞中誘導FOSB。此一發現連同觀察到FOSB過度表現而引發TNBC細胞死亡一起表示，FOSB可以是一種用於治療TNBC的新治療標靶。

本發明還發現的是，FOSB的水平在從TNBC患者分離出的II/III級腫瘤樣品(中度分化或低分化的腫瘤)中明顯下調(參見圖6(a))。還發現的是，在TNBC中FRA1的水平不受TP4影響(圖6(g)、圖6(h))。 然而，腫瘤抑制蛋白CDH1的表現(圖6(g)、圖6(i))被FRA相關的傳訊抑制，這表示FRA1介導的EMT程序可能已經被TNBC細胞中FOSB誘導的主導AP-1複合物的變化破壞(圖9(i))。有趣的是，FOSB在不同乳癌亞型中表現出不同模式的轉錄後調控。發現TP4或蒽環類藥物在MCF7細胞中誘導更大比例的全長FOSB轉錄；相反地，在MB453細胞中發現較少全長的、但較多的FOS△B轉錄(圖3(g))。由於高濃度FOS△B過度表現對MB231細胞的毒性比FOSB過度表現低(圖6(c))，可能的是，主要是FOSB(而不是FOS△B)有助於乳癌細胞死亡。支持這種可能性的是，在TP4處理後12小時觀察到MB453細胞重新生長，而MCF7和MB231細胞未重新生長(圖1(a)-圖1(c))。表示FOSB可以是乳癌細胞響應蒽環類藥物的適當生物標記。此外，觀察到，FOSB在TNBC細胞中的誘導水平比在MCF7和MB453細胞中要高得多。目前還不知道在不同乳癌亞型中荷爾蒙或HER2受體狀態是否與化療的療效及生物標記的誘導水平相關。闡明傳訊路徑之間的交聯可便於更加了解不同乳癌亞型的抗藥性。

TP4和蒽環類藥物誘導FOSB和介導BC細胞死亡的機制是不同的。雖然據報告一些BC標靶胜肽被定位於細胞核並造成DNA斷裂，但在乳癌細胞中並沒有觀察到TP4有強的細胞核染色圖案(圖7(a)-圖7(d))，這表示在BC細胞中TP4可能不會通過與蒽環類藥物相同的方式來影響基因轉錄組。此外，經顯示阿黴素可在BC細胞中引起粒線體鈣水平提高(Kuznetsov等人，在阿黴素誘導的細胞死亡中粒線體氧化還原狀態、膜電位及鈣的變化先於粒線體功能障礙，Biochimica et biophysica acta 1813,1144-1152,2011)，並引發凋亡性細胞死亡(Wang等人，阿黴素在正常和腫 瘤細胞中經由明顯不同的機制誘導凋亡，H(2)O(2)之中間性-及p53依賴性路徑，The Journal of biological chemistry 279,25535-25543,2004)。然而，TP4導致鈣從粒線體洩漏(圖9(b))，從而導致壞死(圖1(e)、圖1(g))。由鈣螯合劑(BATPA-AM)阻止的鈣訊號傳導消除了FOSB誘導並擾亂TP4介導的TNBC細胞死亡(圖9(c)-圖9(e))，表示FOSB可用於作為響應TP4的特定生物標記；然而，在這裡我們沒有檢查蒽環類藥物誘導的FOSB是否也會被鈣螯合劑的治療阻止、以及消除FOSB活化是否會擾亂蒽環類藥物誘導的BC細胞死亡。基於FOSB過度表現引發TNBC細胞死亡的發現(圖6(c))，可以得出的結論是，FOSB活化可用於作為測試對抗TNBC的細胞毒性試劑的響應標記。

腫瘤內注射TP4在異種移植腫瘤中引起廣泛的TNBC壞死(圖11(d)、圖11(e))而不會影響體重或導致不良副作用(圖11(c))，表示腫瘤內注射TP4可以是用於進一步治療方案的可行使用。另一個關鍵問題在於TP4造成的壞死性細胞死亡可能會在體內引發嚴重的免疫原性並進一步損傷周圍的組織。還觀察到的是，在斑馬魚胚胎和TNBC異種移植胚胎中，先天免疫力皆受到TP4治療的影響(圖16)。在TNBC異種移植胚胎中觀察到免疫反應基因表現達增強，具體而言是在第1-3天(圖16(A)-圖16(G)，右邊)。由於TP4並未表現出在正常胚胎中引起整體的免疫反應誘導，我們認為，可以在斑馬魚胚胎中藉由對抗TNBC異種移植物的自我防禦機制來增強免疫力。在本發明中，斑馬魚胚胎中的非TNBC細胞自主效應存在並有助於消除癌細胞；然而，其活化涉及的主要參與者(例如嗜中性白血球和巨噬細胞)與所需的訊號傳導路徑仍需要被識別。

總之，本發明可以指出的是，(i)TP4作為可適用於乳癌治療的新穎細胞毒性胜肽，以及(ii)FOSB作為響應TP4和蒽環類藥物的生物標記，具體而言是在TNBC。相較於可以通過FRA1介導的「往生存之路」訊號傳導抑制來抑制TNBC的先前報告，本發明發現的是，TNBC細胞生長可以藉由FOSB上調來擾亂。TP4和FOSB訊號傳導是用於TNBC治療的有前景治療候選物。

因此，本發明提供一種使用TP4治療惡性癌症、具體而言是MDR癌症、復發性癌症或轉移性癌症的新方法，其中癌細胞在外膜上具有帶負電荷的磷脂醯絲胺酸(PS)或陰離子結構。

此外，本發明還提供一種用於治療患有惡性、MDR、復發性、轉移性癌症的個體的醫藥組合物，該醫藥組合物包含TP4與一比例的一種或更多種抗癌藥物的組合，以在治療惡性或復發性癌症時提供增效作用。

在本發明中，該醫藥組合物可以使用任何標準技術或所屬技術領域中具有通常知識者習知的常用方法配製。

本文中使用的「治療有效量」乙詞是指與未接收該量的相應個體相比導致疾病、失調、或副作用之治療或預防效果、或疾病或失調之進展速度減緩的藥物或藥劑量。該詞還包括在其範圍內可有效增強正常生理功能的量。

對於治療的用途，治療有效量的胜肽、或該胜肽之功能性變體可被配製成用於施予的醫藥組合物。因此，本發明進一步提供一種包含治療有效量的胜肽或該胜肽之功能性片段或變體、連同一種或更多種醫藥上可接受載體的醫藥組合物。

本文中使用的「醫藥上可接受的載體」乙詞是指在與製劑的其他成分相容、而且對被施予醫藥組合物的個體無害的層面上醫藥上可接受的載體、稀釋劑、或賦形劑。可以在本發明中使用技術領域中普遍知道或使用的任何載體、稀釋劑或賦形劑，取決於對醫藥製劑的要求。

依據本發明，該醫藥組合物可適用於藉由任何適當的途徑施予，該途徑包括但不限於局部的、直腸的、經鼻的、陰道的、口服的或腸胃外的途徑。現在將參照以下實施例更特定地描述本發明，提供該等實施例是為了示範的目的而不是限制。

實施例

1. 材料和方法

1.1試劑

如先前由Peng等人所述由GL生物化學公司(中國上海)合成並純化TP4(FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR)和在N-末端生物素標記的TP4。從EMD Millipore購得Autocamtide-2相關的抑制肽II(AIP II)。BAPTA-AM[1,2-雙(2-胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸肆(乙醯氧基甲基酯)]、太平洋紫杉醇、歐洲紫杉醇、鹽酸表柔比星、及阿黴素鹽酸鹽係購自Sigma。

1.2細胞培養和穩定殖株選擇

這項研究中使用的細胞株是購自生物資源收集和研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)，並且細胞是以BCRC提供的標準細胞培養程序和條件培養的。如先前Ting等人所述培養MB231(BCRC 60425)、MB453(BCRC 60429)、及HDF細胞。將MCF7(BCRC 60429)細胞保持在補充有2mM左旋麩醯胺酸、10%FBS、0.1mM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、及抗生素(100U mL^-1青黴素G和100g mL^-1鏈黴素)的α-MEM培養基(賽默飛世爾科技，ThermoFisher Scientific)中。將M10(BCRC 60197)細胞保持在補充有10%FBS和抗生素的α-MEM培養基(賽默飛世爾科技)中。除了MB231和MB453之外，所有的細胞都在37℃下使用5%的CO₂培養。對細胞存活率和轉染試驗，1×10⁴個細胞[5×10³個M10細胞被接種和培養48小時，以允許細胞有足夠的時間附著]被接種到96孔盤的孔中並培養整夜。對於轉染試驗，將細胞用0.1-0.4μg FOSB/FOS△B表現質體(Origene科技公司)轉染，並在72小時後測定細胞存活率。藉由在耦接到數位相機(Olympus DP80)的倒置顯微鏡(Olympus，IX71)下使用10倍物鏡(LCPlanFI 20×/0.40 Ph1)觀察對照的GFP質體轉染的10個隨機選擇的視野(來自三個獨立的轉染)來測定MB231轉染試驗的轉染效率(表現eGFP的細胞數/所有細胞)。使用CellSens標準軟體(Olympus)進行影像擷取。在藥物治療試驗期間，在TP4之前30分鐘添加抑制劑(PD98059、BAPTA-AM、及AIP II)，並在指示的時間點測定細胞存活率。使用LipofectAMINE^TM3000(賽默飛世爾科技)按照製造商的建議進行轉染。使用預合成的FOSB(或對照的)shRNA慢病毒顆粒(Santa Cruz Biotechnology)轉導MB231細胞、並按照製造商的標準方案選擇抗嘌呤黴素細胞來產生默化細胞。通過peGFP-嘌呤黴素或pmOrange2-C1質體的轉染、接著如上所述進行嘌呤黴素(5μg mL^-1)或G418(500μg mL^-1)選擇來產生穩定表現eGFP或mOrange2的MB231或M10細胞。

1.3 抗體

這項研究中使用的抗體(在補充結果中顯示的結果)如下：β肌動蛋白(1：5000，殖株AC-15)和半胱天冬酶3(1：1000，殖株74T2)來自賽默飛世爾科技；細胞色素C(1：500，殖株EP1326Y)來自EMD Millipore；裂解半胱天冬酶3(1：1000，殖株5A1E)、SAPK/JNK(1：1000)、磷酸化SAPK/JNK(1：1000，殖株81E11)、ERK1/2(1：5000)、及磷酸化ERK1/2(1：5000)來自Cell signaling；P38 MAPK和磷酸了化p38 MAPK來自BD Transduction Laboratories。

1.4 細胞存活率試驗

按照製造商的方案使用CellTiter-Glo®發光細胞存活率試驗套組(ATP試驗)和CellTiter96®含水非放射性細胞增殖試驗套組(MTS試驗)(Promega)定量分析細胞存活率。對於MTS試驗，將1×10⁴個細胞接種到96孔盤的細胞培養孔中並培養整夜[5×10³個M10細胞被接種和培養48小時，以能夠充分附著孔]。細胞隨後使用不同劑量的TP4(2.5-20μg mL^-1)處理，並在指定的時間點(3-24h)收取。將反應混合物(20μL：MTS+PMS，使用20：1的比例)直接加到細胞中，並將盤在37℃下培育3小時。在490nm的吸收率正比於培養液中的活細胞數量，並使用光度計(SpectraMax® i3，Molecular Devices)量測。如先前Ting等人所述進行ATP試驗。按照製造商的方案使用Cytotoxicity Detection Kit^PLUS(LDH)(Roche)定量量測細胞裂解來進行乳酸脫氫酶(LDH)試驗。從Cayman Chemical購得LDH標準品。簡言之，將1×10⁴個細胞接種到96孔盤的細胞培養孔中並培養整夜。培養基放有含1%FBS的新鮮介質，隨後使用不同劑量的TP4(2.5-20μg mL^-1)處理細胞。在3小時收取上清液。以200×g離心5分鐘以去除細胞碎片之後，收 集上清液並從每個孔中取出50μL的等分試樣到新的微孔盤中。然後加入反應混合物並在室溫下培育15分鐘。添加終止溶液到孔中，並使用600nm的參考波長測定在490mm的吸收率。

1.5 DNA斷裂試驗

按照製造商的標準程序使用Suicide-Track^TM DNA斷裂分離套組(EMD Millipore)分析DNA片段。收集來自10cm²的盤的細胞來萃取足夠的、來自TP4治療組的DNA樣品。藉由1.5×瓊脂糖凝膠電泳分析沉澱的DNA樣品。

1.6 轉錄組分析

從使用TP4(14μg mL^-1)處理6小時的MB231和HDF細胞中萃取總RNA樣品。使用低輸入快速放大標記(Low Input Quick-Amp Labeling)套組(美國安捷倫科技)放大總RNA(0.2μg)，並在體外轉錄程序期間使用Cy3(CyDye，美國安捷倫科技)標記cDNA。在60℃下使用片段化緩衝液培育30分鐘以將標記Cy3的cRNA(0.6μg)片段化成平均約50-100個核苷酸的大小。然後在65℃下將對應的片段化標記cRNA匯集並雜合到Agilent SurePrint G3 Human V2 GE 8×60K微陣列(美國安捷倫科技)進行17小時。在洗滌並使用氮氣槍吹掃乾燥之後，使用安捷倫微陣列掃描儀以535nm掃描微陣列，以檢測Cy3。使用Feature extraction 10.5.1.1軟體(美國安捷倫科技)分析掃描的影像；使用影像分析和標準化軟體來定量每個特徵的訊號和背景強度。

1.7 AP-1轉錄因子活化試驗

使用TransAM AP-1套組(Active Motif公司)測定AP-1的活 化，如先前Ting等人所述。

1.8 免疫共沉澱法與西方墨點法

如前所述²³製備核萃取物。按照推薦的方案使用等量的核萃取物(200μg)使用Dynabeads蛋白G(賽默飛世爾科技)進行免疫沉澱法(IP)。使用cJUN抗體(賽默飛世爾科技，殖株C.238.2)進行免疫沉澱法。如前所述²³進行總細胞萃取物製備和西方墨點法。在丙烯醯胺凝膠上分離等量的煮沸溶解物(20μg總細胞蛋白質萃取物)，然後轉移到PVDF膜。將該膜在室溫(RT)下在阻斷液(0.1M PBS、5%脫脂乳、0.2%Tween-20)中培育1小時，然後在相同溶液中使用初級或二級抗體(GE Healthcare Life Science)培育。初級抗體如下：c-FOS(Cell Signaling，9F6，1：1000)、FOSB(Cell Signaling，5G4，1：1000)、FRA1(Cell Signaling，D80B)、ATF3(EMD Millipore，6B8，1：500)、JUNB(Cell Signaling，C37F9，1：1000)、JUND(EMD Millipore，1：1000)、c-JUN(EMD Millipore，6A6.2，1：2000)、波形蛋白(Abcam，EPR3776，1：5000)、CDH1(Cell Signaling，24E10，1：1000)、Integrin α5(Cell Signaling，1：1000)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，EMD Millipore，殖株6C5，1：10,000)、αActin(平滑肌)(αSMA，OriGene Technologies，1：5,000)、SNAI1(ABGENT，N-term D24，1：500)、及ZO1(賽默飛世爾科技，1：1,000)。使用增強的化學發光(Immobilon Western Chemiluminescent HRP基質，Merck Millipore)使膜顯現，並藉由成像系統(UVP，BioSpectrum^TM 500)檢測。使用AlphaImager程式藉由密度分析(AlphaInnotech)檢測訊號強度。將結果表示為相對密度單位(RDU)(FOSB+FOS△B的密度單位除以GAPDH的密度單位)。

1.9 鈣量測

使用製造商推薦的Fluo-4乙醯氧基甲酯(AM)直接Ca²⁺試驗套組(賽默飛世爾科技)和Rhod-2鈣指示劑(賽默飛世爾科技)測定鈣(Ca²⁺)水平。簡言之，將1×10⁴個細胞接種到96孔盤的細胞培養孔中並培養整夜。每個條件重複八次。直接添加2×Fluo-4 Direct^TM試劑(5mM的最終丙磺舒濃度)到每個孔中，然後在37℃下將盤培育30分鐘，並於隨後在室溫下培育30分鐘來量測細胞溶質的鈣。使用TP4(5-20μg mL^-1)處理細胞5、10、20、或30分鐘。隨後使用螢光讀取器(SpectraMax® i3，Molecular Devices)量測螢光，使用適合在494nm激發並在516nm發射的儀器設定。將Ca²⁺水平表示為相對螢光單位(△RFU)，並使用下式決定：F-F_min/F_min，其中F_min表示扣除背景的刺激前螢光水平。在37℃下使用2μM的Rhod-2 AM酯和0.02%的普朗尼克F-127培育細胞30分鐘來量測粒線體Ca²⁺。在D-PBS中洗滌三次之後，在37℃下在培養基中培育細胞30分鐘。使用TP4(5-20μg mL^-1)處理細胞，並且每30秒使用儀器設定適合在552nm激發並在581nm發射的螢光讀取器動態測定螢光進行30分鐘。將粒線體Ca²⁺水平表示為相對螢光單位F/F0，其中F0表示未刺激的螢光水平。

1.10 免疫細胞化學、免疫組織化學、及全固定研究

在細胞固定之前，在37℃下使用結合Alexa Flour 647染料的麥胚凝集素(WGA)(5μg mL^-1)(賽默飛世爾科技)預培育生物素化TP4處理的細胞(14μg mL^-1，3小時)10分鐘或在37℃下使用MitoTracker® Red CMXRos探針(200nM)(賽默飛世爾科技)預培育生物素標記的TP4處理的細胞45分鐘來將質膜和粒線體染色。然後使用4%的PFA(在PBS中)將 細胞固定15分鐘，並在室溫下使用在PBS(PBST)中的0.1%Triton X-100滲透12分鐘。使用在PBST中的5%BSA阻斷之後，在4℃下使用生物素(Santa Cruz Biotechnology，39-15D9，1：500)、鈣網伴護蛋白(1：500)、Giantin(Abcam，1：1000)、或FOSB(1：500)抗體將細胞培育整夜。然後使用TBS-T(20mM Tris-HCl，pH 7.4，137mM NaCl及0.1%Tween-20)將細胞洗滌三次，並在室溫下使用與適當螢光染料結合的第二抗體(1：500；賽默飛世爾科技)培育1小時。使用Hochest33342進行核染色。使用Image J軟體定量測定螢光訊號(正比於官能性粒線體)。從US Biomax,Inc.購得人類乳房鄰近處的正常組織陣列(BRN801a)和TNBC組織陣列(BR487a)。按照中央研究院「人體試驗倫理委員會(Human Subject Research Ethics Committee)」的規定使用市售的人體組織樣品。使用FOSB抗體(1：50)和Hochest 33342將石蠟切片免疫染色。使用耦接到數位相機(OlympusDP80)的倒置顯微鏡(Olympus，IX71)使用4倍(UPlanFI 4×/0.13 PhL)物鏡取得螢光影像。使用CellSens標準軟體(Olympus)取得影像。使用Image J軟體定量測定螢光FOSB訊號。至於全固定染色，在室溫下使用4%的PFA固定異種移植斑馬魚1小時。在PBST(1%的Triton-X-100)中洗滌四次每次5分鐘之後，將魚在阻斷緩衝液(PBS+1%triton-X-100+10%FBS)中培育1小時。然後將魚使用阻斷緩衝液洗滌兩次並在阻斷緩衝液中使用FOSB抗體(1：50)培養2天。在PBST中進一步洗滌三次每次1小時之後，在室溫下將魚使用結合Alexa Flour 647的二級抗體培育2小時。然後在室溫下使用PBST將魚洗滌三次，每次10分鐘。使用螢光固定介質(ProLong Gold Antifade試劑，賽默飛世爾科技)固定(組織或細胞)之後，使用FV1000 雷射掃描共焦顯微鏡(Olympus)、使用10倍(Olympus UPlanSApo 10×，N.A.0.40)或60倍物鏡(Olympus UPlanSApo 60×，N.A.1.35，油)取得影像。使用ASW2.1軟體(Olympus)進行影像採集、彌散性腫瘤病灶定量、以及原發腫瘤區的量測。

1.11 小鼠和病理研究

從樂斯科台灣生物科技股份有限公司取得雌性BALB/c nu/nu小鼠，並將小鼠安置在台灣基隆國立台灣海洋大學動物設施實驗室。依據農委會(台灣COA)的指導方針將小鼠保持在無病原體的無菌隔離區中，並在使用之前將所有的食物、水、籠子、及寢具消毒。動物方案(103034)得到國立台灣海洋大學生命科學學院的實驗動物照護及使用委員會(IACUC)批准。對於TP4治療的試驗，將預生長MB231腫瘤的裸鼠(每組n=5)每兩天皮下注射TP4(500μg溶於50μL蒸餾水加10μL KY膠(嬌生))共14次，注射之前腫瘤尺寸已經達到30-50mm³的平均體積。將無腫瘤異種移植物、年齡匹配的對照裸鼠注射KY膠(10μL加50μL蒸餾水)。每兩天使用下面的公式計算腫瘤尺寸：體積=[(高度×長度×寬度)×3.1416]/6。開始TP4治療之後28天犧牲小鼠，並將腫瘤取出稱重。使用福馬林固定腫瘤樣品並使用石蠟包埋。藉由蘇木紫&曙紅(H&E)將石蠟切片染色，並使用Ki-67抗體(Cell Signaling，殖株D2H10，1：100)進行免疫染色。使用耦接到數位相機(Olympus DP80)的倒置顯微鏡(Olympus，IX71)使用10倍(UPlanFI 10×/0.30 Ph1)和40倍(LUCPlanFI 40×/0.60 Ph2)物鏡取得影像。使用CellSens標準軟體取得影像。使用FV1000雷射掃描共焦顯微鏡使用10倍物鏡(UPlanSApo 10×，N.A.0.40)獲得螢光影像。使用ASW2.1軟體進行影像 取得和分析。

1.12 斑馬魚異種移植模型

由台灣斑馬魚核心設施(Taiwan Zebrafish Core Facility，中研院)提供AB株斑馬魚(Danio rerio)。轉基因株(fli：eGFP)是來自JY LIN貿易有限公司(台灣屏東)所提供。魚的照顧、扶養、及實驗程序是按照「在台灣使用脊椎動物作為實驗動物的倫理準則(The Ethical Guideline for Using Vertebrates as Experimental Animals in Taiwan)」進行，並得到中研院「使用脊椎動物作為實驗動物倫理委員會」批准。腫瘤細胞異種移植方案是按照先前公佈具有修改^44,45的方法進行。簡言之，在28℃下在含有0.2mM PTU(Sigma)的E3胚胎培養基(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM MgSO₄)中培育受精的斑馬魚卵。在24hpf(受精後小時)去除卵殼之後，將卵浸泡在具有三卡因(0.02mg mL^-1，Sigma)的E3培養基中。24小時後(48hpf)，讓胚胎適應1.8%瓊脂糖改質的微注射盤。將腫瘤細胞(2×10⁶個表現eGFP/mOrange2的MB231或M10細胞)懸浮於25μL Matrigel®基質(12.0mg mL^-1)溶液(Corning)中，並將10-15nL的細胞懸浮液微注射到胚胎中(將參數設定在7.0psi和0.5-1.0秒)。將異種移植的胚胎放在具有透明底部的96孔黑色盤(Coring)中，然後使用甲基纖維素(1.25μL)固定；使用配備照相機(Olympus DP80)的倒置顯微鏡(Olympus IX71)使用4倍物鏡(Olympus UPlanFI 4×/0.13phL)獲得影像。在之後的每一天持續5天，使用含有TP4(3μg mL^-1)的新鮮E3培養基置換各孔中的培養基，並取得影像。使用Image J軟體定量測定螢光訊號(正比於表現eGFP的細胞的數量)。對於時間推移的研究，在攝像之前固定異種移植胚胎並接收單一劑量的TP4 或模擬治療，並在28℃下培養48小時。使用ImageXpress Micro HCS Image System(Molecular Devices)獲得影像。在4倍物鏡(Plan Fluor 4×/0.13)下使用透射光和FITC(EX 482/35，EM 536/40)及TRITC(EX 543/22，EM 593/40)濾波器組以1小時的間隔記錄影像(包括z堆疊)。從5個影像沿著z軸橫跨70μm的距離截取每個頻道，並合成最佳聚焦影像。拍攝影像並使用整合的MetaXpress®程式(v.5.3，客製模組編輯器)進行腫瘤分析，以量化斑馬魚體內腫瘤的面積與螢光強度。將標準化數據相對於在0小時的值表示。

1.13 TUNEL染色

使用原位細胞死亡檢測套組POD(羅氏)按照製造商建議的標準程序進行TUNEL(去氧核糖核苷酸轉移酶介導的缺口末端標記法)染色。簡言之，將細胞(MB 231和HDF)接種到腔室載玻片上，並培養整夜。在TP4處理3或6小時之後，細胞被阻斷、固定及滲透。然後將標記溶液和TUNEL反應混合物加到細胞中。在PBS中洗滌三次之後，讓細胞藉由Hoechst33342進行核染色。隨後使用FLoid細胞成像站(賽默飛世爾科技)獲得細胞影像。使用DNase I處理的細胞作為正對照，並且未使用終端轉移酶(酶混合物)處理的細胞作為負對照。

1.15 定量即時PCR

在第1-5天收集斑馬魚(每組n=10，進行3個實驗，總共30隻斑馬魚)並在300μL Qiazol(Qiagen)中均質化。使均質物渦旋15秒、在室溫下靜置5分鐘、然後加到60μL的氯仿中。然後將混合物渦旋15秒、在室溫下靜置另外3分鐘、然後轉移到Phase Lock Gel^TM(5 PRIME)。以 12,000×g離心15分鐘之後收集上清液，並使用RNA萃取套組(WELGENE Biotech)進行處理。對於反轉錄，按照製造商的建議使用1μg的總RNA和ProtoScript®II第一股cDNA合成套組(New England Biolabs)。對於即時PCR，使用1.5μL的cDNA和SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TOYOBO)與StepOnePlus即時PCR系統(應用生物系統，生命技術公司)。PCR條件如下：95℃進行1分鐘(持溫階段)；40個95℃的循環進行15秒、60℃進行15秒、以及72℃進行45秒；95℃進行15秒、60℃進行1分鐘、以及95℃進行15秒(熔化曲線階段)。為了分析基因表現，使用α-微管蛋白(Tub-α1b)作為校準基因進行△△CT法。引子序列如下：Tubα1b：F：TTCCCTCTGGCTACCTATG(SEQ ID NO：2)；R：TCTTGATGGTGGCGATTGCG)(SEQ ID NO：3)；Cxcl8a：F：CTCACTTAGGCAAAATGACCAG(SEQ ID NO：4)；R：TTCCAATGCGTCGGCTTTC(SEQ ID NO：5)；Ifn ：F：GCCGATACAGGATAATAACGACAG(SEQ ID NO：6)；R：AGTGTTTTGGTCCCAGTT(SEQ ID NO：7)；Il1β：F：TTTGTGGGAGACAGACGGT(SEQ ID NO：8)；R：CCAACTGCTTCATTTTGTGC(SEQ ID NO：9)；Il10：F：AGCACTCCACAACCCCAATC(SEQ ID NO：10)；R：GACCCCCTTTTCCTTCATC(SEQ ID NO：11)；Mmp9：F：CATCCGCAACTACAAGAC(SEQ ID NO：12)；R：TCACCTGGAGGATAAGCG(SEQ ID NO：13)；Tnfα：F：TCTTCAAAGTCGGGTGTATG(SEQ ID NO：14)；R：GGTCATCTCTCCAGTCTAAGG(SEQ ID NO：15)；Tnfβ：F：GCCAAACGAAGAAGGTCAG(SEQ ID NO：16)；R：CACCGCCAACCCATTTCA(SEQ ID NO：17)。

1.16 統計分析

對於基於多孔的試驗，至少培養一式六份的盤的細胞。從獨立重複的實驗(n3)收集數據，並藉由Prism 5軟體(GraphPad公司)進行分析。任何差異的統計學意義都是應用雙尾t測試或單因子/雙因子變異數分析(ANOVA)與Bonferroni後測試來決定。差異在P<0.05時視為具有統計學意義。

2. 結果

2.1 TP4誘導選擇性的TNBC細胞壞死

將BC細胞株(MDA-MB231、MDA-MB453、及MCF7)的不同分子亞型進行MTS試驗來研究TP4是否可以選擇性地在體外殺死BC細胞。據觀察，使用15μg mL^-1、5.03μM的TP4處理足以在6小時殺死超過50%的BC細胞，而相同的劑量對於對照的正常人體乳房上皮細胞(M10)或皮膚纖維母細胞(HDFs)的存活率只有很小的影響(圖1(a)-圖1(e)和表1)。在不同的時間點從TP4處理的MDA-MB231細胞(表示為MB231)取出基因體DNA樣品並進行DNA斷裂試驗；在TP4處理之後沒有觀察到明顯的DNA片段化，這表示TP4不會在TNBC細胞中誘導凋亡(圖1(f))。此外，TP4處理的MB231或HDF細胞的TUNEL染色顯示非常有限的DNA片段化(圖2(A)、圖2(B))，而且在TP4處理的TNBC細胞中沒有觀察到明顯的caspase3活化(圖2(C)、圖2(D))。另一方面，壞死的標記-乳酸脫氫酶(LDH)在TP4處理TNBC細胞3小時後明顯增多，並且這種增多取決於劑量(圖1(g))。鑑於上述情況，研究結果表示，TP4在TNBC細胞中誘導壞死性死亡。將來自圖1a-圖1e的統計結果圖示出。為每個實驗分析一式六份的孔(每劑量n=18)。結果表示來自三個獨立實驗的平均±SD。使用雙因子變異數分析 與Bonferroni事後檢測進行模擬對比TP4處理組之間的統計學比較：a，不顯著；b，P<0.05；c，P<0.01；d，P<0.001。

2.2 藉由TP4在TNBC細胞中誘導FOS家族成員

為了特徵化有助於TP4誘導的TNBC死亡的下游事件，我們通過微陣列研究來分析基因表現圖譜。基因本體論(GO)分析顯示，TP4 處理在TNBC細胞的基因表現圖譜中引起急劇變化(圖3(a)和圖3(b))，但在HDF細胞中只有小的變化(圖3(b))。值得注意的是，FOS成員(FOSB、c-FOS)和ATF3在TNBC細胞中被明顯誘導(圖3(b))。免疫細胞化學研究和西方墨點法證實的是，FOS成員(具體而言是FOSB)在測試的BC細胞株中被誘導(圖3(c)-圖3(h)和圖4(A)-圖4(D))。除了JUNB之外，JUN家族蛋白質在TNBC細胞中未被明顯影響(圖3(d)、圖3(e))。FOS和JUN家族成員在對照的HDF細胞中皆未被明顯影響(圖3(d)、圖3(f))。為了探索FOSB的治療作用，我們研究在使用蒽環類或紫杉烷類化療試劑處理的過程中是否能夠在TNBC細胞中觀察到FOSB誘導。有趣的是，蒽環類藥物(阿黴素和泛艾黴素)(圖3(g)，道3和道4)誘導強的FOSB表現，與藉由TP4處理TNBC細胞所誘導的相當(圖3(g)，道2)。然而，紫杉烷類試劑(歐洲紫杉醇和太平洋紫杉醇)在MDA-MB453(表示為MB453)和MCF7細胞中誘導FOSB，但在MB231細胞中則無(圖3(g)，道5和道6)。這些結果表示，TP4和蒽環類藥物在TNBC細胞中通過類似的治療途徑作用。此外，微陣列數據的京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析顯示TP4處理對MAPK訊號傳導的顯著效果(表2)；已知這個訊號傳導途徑可調節AP-1活性(Karin；由促分裂原活化蛋白激酶導致的AP-1活性調節，The Journal of biological chemistry 270,16483-16486,.1995)。

進一步檢查西方墨點法涉及的分子。據觀察，JNK和p38的活性形式在TNBC細胞中都被TP4處理明顯減少，但在對照的HDF細胞中則否(圖5(A)-圖5(C))。ERK蛋白的活化沒有明顯的影響(圖5(A)、圖5(B))，但被PD98059抑制的ERK活性會破壞TP4誘導的TNBC細胞死亡，如MTS試驗所示(圖3(h))；這些發現表示，ERK訊號傳導對於TP4介導的細胞死亡是必要的。

2.3 TP4誘導FOSB以引發TNBC細胞死亡

TP4在TNBC細胞中強力誘導FOSB表示FOSB可能參與TP4介導的TNBC細胞死亡。先前的研究指出，FOSB在正常乳管上皮細胞中有高度表現，但在不良分化的乳管癌⁴⁰中則否。為了解決FOSB表現是否與TNBC進展相關，我們藉由免疫組織化學分析分析了來自TNBC患者的各種等級的腫瘤樣品中的FOSB表現。發現FOSB在乳房正常鄰近組織中的表現(NAT，n=26)比在II級(n=19)和III級(n=10)TNBC樣品中的表現更強(圖3a，P<0.001)。I級樣品(n=6)顯示減少的趨勢，但與NAT並非統計學上不同的(圖6(a))。這些結果表示FOSB表現在TNBC進展期間下 調，並且表示FOSB對於TNBC發展可能是有害的。然後我們評估TP4誘導的FOSB是否與TNBC死亡相關。如西方墨點法所展示的，在使用TP4處理的TNBC細胞中FOSB的增加是時間相依的(圖6(b))，並與TP4誘導的細胞死亡的時機相關聯(圖1(a))。與載體對照組相比，FOSB或FOS△B(0.1-0.4μg)在TNBC細胞中的短暫表現導致大量的細胞死亡，如ATP試驗所測定(圖6(c)，P<0.001)。有趣的是，在高濃度下TNBC細胞耐FOS△B表現更甚於FOSB表現(圖6(c)，P<0.001)。測定FOSB默化是否擾亂TP4介導的TNBC細胞死亡。通過使用含4個特定標靶shRNA構築體(19-25個核苷酸，包括髮夾)的慢病毒顆粒的轉導來產生FOSB默化的MB231細胞。西方墨點法的數據表示，TP4處理在對照細胞中引起明顯的FOSB誘導(P<0.01)，但在FOSB默化細胞則否(圖6(d)、圖6(e))。從MTS試驗獲得的結果顯示，FOSB默化明顯保護MB231細胞免於TP4誘導的死亡(圖6(f))。接下來我們研究了AP-1複合物的分子組合物是否受TNBC細胞中FOSB的強誘導影響。先前顯示的是，FRA1與上皮至間質轉變(EMT)相關聯，上皮至間質轉變作為TNBC進展中涉及的關鍵因子³⁸；然而，FRA1的水平沒有受到TP4處理影響，如免疫墨點法所示(圖6(g)、圖6(h))。出人意料的是，雖然CDH1的水平明顯提高(圖6(g)、圖6(i))，但其他EMT相關蛋白的水平則未受影響(ZO1、Intergrin α5、波形蛋白、αSMA、及SNAI1)(圖6(g))。我們繼續測定每個FOS家族成員的活性。AP-1的活化是藉由培育來自TNBC細胞的核萃取物來定量，該等TNBC細胞使用或不使用TP4與含有四環素反應元件(TRE)的寡核苷酸處理；隨後使用對抗c-FOS、FOSB、FRA1、及c-JUN的抗體分離DNA-蛋白質複合物。在不存在TP4下(模擬對照組)，c-FOS、 FOSB，FRA1、及c-JUN活化的訊號對背景比(以OD₄₅₀表示)分別為1.4：1、1.4：1、3.5：1、及8.8：1(圖6(j))。與模擬對照組相比，使用TP4處理的細胞表現出c-FOS和FOSB的活性分別增加1.4和2.8倍(P=0.0291和P<0.001)(圖6(j))；在FRA1並未觀察到這種增加(P=0.5593，圖6(j))。有趣的是，c-Jun的活性被TP4處理降低(P=0.0272)(圖6(j))。c-JUN的免疫共沉澱證實了c-JUN與FRA1之間的關聯(圖6(k))，並在TP4處理TNBC細胞後鑑定cJUN-FOSB免疫複合物(圖6(1))。這些結果表示，TP4在TNBC細胞中誘導FOSB可能會改變AP-1複合物組合物，從而導致細胞死亡。

TP4導致粒線體功能障礙

為了特徵化TP4的作用機制及FOSB誘導的作用，我們研究了TP4在TNBC細胞中的細胞定位。將以生物素化TP4(14μg mL^-1)處理1小時的細胞使用生物素、特定胞器的抗體/染料(鈣網伴護蛋白用於內質網；Giantin用於高爾基；以及MitoTracker用於粒線體)、及結合螢光染料的WGA(用於質膜)共染色。觀察到TP4鎖定高爾基、粒線體及質膜，如生物素訊號與Giantin(圖7(a)，由白色箭頭指示)、MitoTracker(圖4b，由白色箭頭指示)、及WGA(圖7(a)-圖7(c)，由黃色箭頭指示)、但不與ER(如圖7(c))強共定位所證明的。重要的是，在HDF對照組的細胞核中觀察到只有弱的、針對生物素的背景染色(圖7(d))，表示正常細胞膜不大可能被TP4鎖定。TP4選擇性鎖定粒線體的觀察引領我們研究TP4介導的BC毒性是否與粒線體的功能障礙有關。與對照組(P<0.001)(圖7(e)和圖8(A))相比，通過電位依賴性累積的MitoTracker的免疫細胞化學染色顯示在TP4處理3和6小時後在TNBC細胞中粒線體膜電位明顯損失，而在HDF細胞(圖 7(f)和圖8(B))沒有觀察到顯著差異。我們接著研究FOSB感應是否有助於TNBC細胞中粒線體膜電位的損失。與對照細胞(圖7(g)及圖8(C)和圖8(D))相比，FOSB默化部分防止響應TP4處理的粒線體膜電位損失。有趣的是，與未轉染的對照組或載體轉染的對照組(圖7(h)和圖8(E)-圖8(G))相比，FOSB轉染細胞表現出粒線體膜電位明顯損失。建議的是，TP4在FOSB誘導之前引起粒線體膜電位的損失；隨後的FOSB誘導可以進一步促進粒線體功能障礙。

2.4 由TP4誘導FOSB所引起的粒線體鈣洩漏

Ting證明CAP誘導AP-1通過鈣訊號傳導引發癌細胞死亡(Ting等人)。接下來我們研究Ca²⁺體內恆定是否受TNBC細胞中的TP4處理影響。使用TP4處理TNBC細胞後在5-30分鐘使用fluo-4 AM Ca²⁺指示劑量測細胞內Ca²⁺水平(圖9(a))。觀察到，與模擬對照組(P<0.001)相比，使用5-20μg mL^-1的TP4處理5分鐘的細胞之Ca²⁺水平明顯上升，表示TP4處理改變了TNBC細胞中的Ca²⁺體內恆定。然而，很可能的是TP4未鎖定內質網(細胞內的Ca²⁺貯藏處)(圖7(c))，而是鎖定粒線體(圖7(a)、圖7(b))，此舉開始從ER釋放Ca²⁺，表示細胞內的Ca²⁺增加可能是由於從粒線體洩漏。我們使用粒線體Ca²⁺指示劑Rhod-2 AM來測試這種可能性，以動態監測TP4處理後的Ca²⁺水平。我們觀察到，與模擬對照組(P<0.001)相比，使用5-20μg mL^-1的TP4處理30分鐘的細胞中Ca²⁺水平表現出降低的趨勢，這表示TP4處理擾亂了粒線體中的Ca²⁺動力學(圖9(b))。此外，我們討論TP4誘導的Ca²⁺介導壓力反應是否會導致下游的FOSB誘導。與模擬對照組(圖9(c)-圖9(e))相比，在TP4處理之前使用BAPTA/AM(一種Ca²⁺螯合劑)預處 理TNBC細胞擾亂了FOSB誘導和TP4介導的TNBC細胞死亡。此外，施加AIP2(一種鈣/攜鈣蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)II抑製劑)來阻止Ca²⁺介導的下游訊號傳導導致下降的傾向，但與模擬對照組(圖9(f)、圖9(g))相比並未完全阻止FOSB誘導，並部分防止了TP4誘導的TNBC細胞死亡(圖9(h))。總而言之，這些結果表示，TP4鎖定粒線體、破壞Ca²⁺體內恆定、並於最終誘導下游的FOSB介導TNBC細胞死亡(圖9(i))。

2.5 TP4在裸鼠異種移植模型中抑制腫瘤生長

為了評估TP4處理在體內對腫瘤生長的影響，將移植的TNBC細胞皮下注入裸鼠體內(n=5)，並且每日評估腫瘤生長持續28天。一旦腫瘤達到一定的尺寸，則每兩天使用TP4處理一組異種移植的裸鼠。如圖10所示，KY膠被缺失小鼠充分吸收(圖10(A))，並且每兩天對裸鼠(n=5)皮下注射10μL的KY膠加50μL的蒸餾水，總共注射十四次。每兩天計算注射混合物的大小，並將結果圖示於圖10(B)。結果表示平均±SEM。在對照組(單獨KY膠)與TP4(KY膠加TP4)處理組之間觀察到腫瘤生長有明顯的差異(P<0.001)(圖11(a)、圖11(b))。TP4處理的腫瘤長成比對照組更小的腫瘤塊(P=0.0017)(圖11(c)，左側)，但在各組的小鼠之間未觀察到體重有明顯的差異(圖11(c)，右側)。病理學研究證實，在腫瘤內TP4處理組中大部分的中央區域是壞死的(圖11(d))。在來自TP4處理組的腫瘤組織切片中觀察到對增殖標記Ki-67陽性的細胞急劇減少，與肉眼可見的結果相似(圖11(e))；總而言之，這些結果表示TP4在體內殺死TNBC細胞。

2.6 TP4延長TNBC異種移植斑馬魚的生存

為了進一步研究TP4的治療能力，我們產生TNBC異種移植斑馬魚模型來研究TP4抑制TNBC遷移和侵襲的能力。將指示本研究中使用的治療程序與分析方法的示意圖圖示於圖12。首先使用eGFP或mOrange2表現載體轉染M10或TNBC細胞來得到螢光報導TNBC細胞株，接著選擇抗生素(圖13)。受精後48小時(hpf)的生存分析顯示非致瘤性表現eGFP的M10細胞的注射沒有明顯的毒性作用(每胚胎800-1,200個細胞，斑馬魚存活率>90%，圖14(a))。相反地，注射表現eGFP和mOrange2的TNBC異種移植物顯示在168hpf斑馬魚胚胎死亡率分別意外地增加到約38.3%和44.8%(圖14(a))。評估TP4的治療活性之前，我們檢查斑馬魚內TP4的毒性。將TP4的連續稀釋液(0.125ng mL^-1-20μg mL^-1)加到斑馬魚培養基中；我們觀察到，1和2μg mL^-1的TP4劑量對正常斑馬魚沒有明顯的毒性作用(圖15(A))。然而，進一步的測試顯示這些劑量在表現eGFP的TNBC異種移植斑馬魚體內的不良治療效果(圖15(B)、圖15(C))。因為大多數使用3μg mL^-1(1.01μM)TP4治療的野生型斑馬魚(>75%)在168hpf時仍存活(圖15(A))，所以我們在隨後的實驗中使用此劑量。與模擬治療組相比(分別為P=0.0149和P<0.0001)，TP4(3μg mL^-1，每日施予)治療明顯延長eGFP-和mOrange2-TNBC異種移植斑馬魚的存活率(78.9%和82.5%)(圖14(a))。在第0-5天(48-168hpf)期間藉由定量eGFP螢光訊號來測定TP4在單異種移植斑馬魚體內的療效。在對照的M10異種移植斑馬魚中，eGFP螢光訊號表現出逐漸下降的趨勢；然而，這樣的趨勢在TNBC異種移植斑馬魚中並未觀察到(圖14(b)，左側和中間)。與模擬對照組(P<0.001)相比，TP4治療組的eGFP螢光強度在2-5天期間明顯降低，表示TP4在體內的正面療效 (圖14(b))。為了提出TP4介導的治療活性的潛在機制，我們進行了全固定染色以確定TP4治療是否產生任何TNBC細胞自主的效果。我們報告的是，在TP4治療組的TNBC細胞(但模擬治療組的沒有)呈現陽性的FOSB染色(圖14(c))。此外，異種移植腫瘤面積(與未治療組相比P<0.05)與彌散性腫瘤病灶的數目(在第1天與未治療組相比P<0.01)在TP4治療後降低了(圖14(d)、圖14(e))。總之，這些結果表示，TP4可能有助於通過FOSB誘導自主消除TNBC。我們還研究了由TP4誘導的任何非TNBC細胞自主作用是否有益於體內的癌細胞消除。為此目的，藉由qPCR測定對抗斑馬魚胚胎中的某些病原體感染的先天免疫力中涉及的某些基因之表現圖譜(van der Vaart等人，斑馬魚體內的先天免疫反應之病原體識別與活化，Advances in hematology,159807.2012)。我們觀察施加TP4(3μg mL^-1，每天施予)給野生型斑馬魚通常導致免疫基因表現隨時間明顯減少(圖16(A)-圖16(G)，左側)，除了在一些特定的時間點之外(Il8在第1天增加，並且Il10/Ifn 1第5天增加)；然而，與未治療的對照組相比，TP4治療對Tnfα表現沒有明顯影響(圖16(E)，左側)。在TNBC異種移植斑馬魚胚胎中觀察到，與未治療組相比，TP4治療在約第2天明顯增強免疫反應基因表現(圖16(A)-圖16(G)，右側)。這些結果表示，TP4可以在TNBC異種移植斑馬魚胚胎中增強先天免疫力。此外，TNBC異種移植物提高斑馬魚死亡率的發現引領我們通過高通量成像進一步研究所涉及的機制。隨時間推移的成像顯示，TNBC細胞遷移並侵入成熟的血管、導致大量的腹部水腫、軀幹彎曲、及死亡(圖14(f)、圖14(g))。接受單一TP4治療(3μg mL^-1)的TNBC異種移植斑馬魚與非治療組相比表現出延長的存活期(92.6%對65.6%，P<0.05) (圖14(h))，而且還含有數量減少的TNBC，如逐漸減少的異種移植TNBC腫瘤面積(圖14(i))和螢光強度(圖14(j))所顯示的。這些結果表示，TNBC轉移和侵襲可能是斑馬魚死亡的主因，而TP4治療消除體內的TNBC生長。

鑑於上述情況得出的結論是，TP4是一種用於治療乳癌的潛在藥物。

所提供的描述和申請專利範圍應被理解為示範的目的，而不是以任何方式限制本發明的範圍。

<110> 中央研究院

<120> 抗菌胜？TP4治療癌症之用途

<130> ACA0110TW

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> PRT

<213> 尼羅河吳郭魚Oreochromis niloticus

<400> 1

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tubalb正股引子

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Tubalb反股引子

<400> 3

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Cxcl8a正股引子

<400> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> Cxcl8a反股引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> IFN-(phi)正股引子

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<212> DNA

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<223> IFN-(phi)反股引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> IL-1B正股引子

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-1B反股引子

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-10正股引子

<400> 10

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IL-10反股引子

<400> 11

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mmp9正股引子

<400> 12

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Mmp9反股引子

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF-a正股引子

<400> 14

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF-a反股引子

<400> 15

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF-B正股引子

<400> 16

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TNF-B反股引子

<400> 17

Claims (7)

1. 一種吳郭魚抗菌蛋白4(TP4)用於製造一用於治療三陰性乳癌(TNBC)的藥物之用途。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中TP4具有一胺基酸序列FIHHIIGGLFSAGKAIHRLIRRRRR(SEQ ID NO：1)。
3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中TP4可以是TP4之一功能性片段或變體。
4. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該癌症為惡性、多重抗藥性(MDR)、復發性或轉移性癌症。
5. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該癌症細胞在外膜上具有帶負電荷的磷脂醯絲胺酸(PS)或陰離子結構。
6. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該癌症之治療係通過FBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B(FOSB)的誘導。
7. 一種用於治療三陰性乳癌(TNBC)的醫藥組合物，包含TP4與一種或更多種抗癌藥物的組合，其比例在治療該癌症中提供增效作用。