TWI602571B - 含迷迭香與五倍子組合物及其抗菌用途 - Google Patents

Description

含迷迭香與五倍子組合物及其抗菌用途

本發明係有關於一種含天然草本萃取物之複方組合物，尤其係指一種含迷迭香與五倍子之組合物及其抗菌之用途，其係以特定比例之迷迭香萃取物與五倍子萃取物混合而成，藉此，達到以低濃度且有效殺菌之目的，可作為抗菌劑用途。

現有使用的各種生活產品中，業者為了增加有效成分與內容添加物之保存，提供使用者能長時間使用到穩定品質的產品，必須添加防腐劑(preservative)或抑菌劑(bacteriostatic agent)以降低細菌孳生。

防腐劑或抑菌劑之添加目的係為了能抑制細菌或微生物的生長，使得產品本身可以更為安全以及防止產品本身的腐化分解，並提高保存期限。市售各類產品中，為了成本方面之考量，大多數係選擇使用產量高、取得方便、價格便宜，且用量僅需少許就可達到有效之防腐效果的合成防腐劑，然而合成防腐劑也係常見造成皮膚過敏的元凶之一。如果使用這類容易造成皮膚過敏或皮膚炎、甚至可能危害人體生殖系統或致癌之合成抗菌劑，不僅無法達到預期的產品效果，更會造成使用者健康的傷害。

為解決上述問題，相關領域之業者紛紛改為研發具有抗菌效 果的天然物質，以盡可能降低合成抗菌劑或合成防腐劑之使用。生活中有許多天然物，本身具有抗菌之效果，舉例而言，中華民國專利公告第I544937號「塗覆傳統中藥之抗微生物/抗菌醫療裝置」，即揭示一種用於塗覆醫療裝置的抗微生物組成物，其包含選自魚腥草(Houttuynia cordata)萃取物、魚腥草素鈉和新魚腥草素鈉及其混合物之物質的抗微生物劑；中華民國專利公告第I515001號「具抗菌活性之芒果花粗萃物及其製造方法與應用」，揭示一種具抗菌活性之芒果花粗萃物及其製造方法，其係將疏花後被視為廢棄物棄之愛文芒果(Mangifera indica L.cv.Irwin)的新鮮花苞新鮮花，藉用不含甲醇之極性溶劑以加熱迴流萃取製程而獲得的芒果花粗萃物，具有抗金黃色葡萄球菌之活性，可應用於皮膚外用組成物；以及中國專利公開第CN 103931676 A號「香椿萃取物的用途」亦揭示香椿萃取物具有抑制微生物生長或/和繁殖的功效，因此香椿萃取物具有作為抗菌劑、防腐劑或用於製造醫藥組合物的用途；然而上述天然物雖然具有抑制細菌生長的效果，但其添加量仍需要相當濃度以上才具有顯著的抑菌效果。

根據台灣衛生福利部食品藥物管理署之化粧品相關法規規定，化粧品中防腐劑成分使用及限量規定基準表中，防腐劑限量濃度僅能為約0.1%~1.0%，因此許多以天然萃取物作為防腐劑之研究，仍須不斷測試如何萃取出抑菌能力佳的萃取物或開發最具抗菌效果之比例濃度的複方天然物，以達到作為天然防腐劑使用之目的，減低使用者在使用化粧品或保養品等皮膚外用組成物之疑慮。

今，發明人即是鑑於上述現有添加於皮膚外用組成物之抗菌劑或防腐菌於實際實施使用時仍具有多處缺失，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加 以改善，並據此研創出本發明。

本發明主要目的為提供一種含天然草本萃取物之複方組合物及其抗菌之用途，其係以特定比例之迷迭香萃取物與五倍子萃取物混合而成，藉此，本發明之複方組合物可達到以極低濃度即能有效殺菌之目的。

為了達到上述實施目的，本發明提供一種含迷迭香與五倍子組合物，其係包括重量比例為1：1至2：8的迷迭香萃取物與五倍子萃取物，其中迷迭香萃取物與五倍子萃取物分別係以80%酒精與95%酒精萃取而得。

本發明亦提供一種含迷迭香與五倍子之組合物用於作為抗菌劑之用途，其係用於抑制至少一微生物生長，其中組合物係包括迷迭香萃取物與五倍子萃取物以重量比例為1：1至2：8混合。

於本發明之一實施例中，迷迭香萃取物與五倍子萃取物之濃度可例如皆為1wt%，且迷迭香萃取物與五倍子萃取物較佳可例如以2：8之重量比例混合；且迷迭香萃取物與五倍子萃取物於組合物之終濃度較佳為0.025%~0.07%。

於本發明之一實施例中，微生物係選自於由大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)所構成之群組。

於本發明之一實施例中，含迷迭香與五倍子組合物係可作為防腐劑。

藉此，本案之組合物可應用於各種產品中，達到抗細菌孳生與提升保存期限之效果。

第一圖：不同濃度之迷迭香萃取物或五倍子萃取物之紙錠擴散試驗分析圖。

第二圖：不同混合比例之迷迭香萃取物和五倍子萃取物之紙錠擴散試驗分析圖。

第三圖：不同終濃度之迷迭香萃取物或五倍子萃取物抑制金黃色葡萄球菌之示意圖。

第四圖：不同混合比例之迷迭香萃取物和五倍子萃取物抑制金黃色葡萄球菌之示意圖。

第五圖：不同終濃度之迷迭香萃取物或五倍子萃取物抑制綠膿桿菌之示意圖。

第六圖：不同混合比例之迷迭香萃取物和五倍子萃取物抑制綠膿桿菌之示意圖。

第七圖：不同終濃度之迷迭香萃取物或五倍子萃取物抑制大腸桿菌之示意圖。

第八圖：不同混合比例之迷迭香萃取物和五倍子萃取物抑制大腸桿菌之示意圖。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明為一種含迷迭香與五倍子組合物，其係包括重量比例為1：1至2：8的迷迭香萃取物與五倍子萃取物，其中迷迭香萃取物與五倍子萃取物分別係以80%酒精與95%酒精萃取而得；較佳而言，迷迭香萃取物與五倍子萃取物之濃度皆為1wt%，且係以2：8之重量比例混合。

本發明亦為一種含迷迭香與五倍子之組合物用於作為抗菌劑之用途，其係用於抑制至少一微生物生長，其中組合物係包括迷迭香萃取物與五倍子萃取物以重量比例為1：1至2：8混合；較佳 而言，迷迭香萃取物與五倍子萃取物之濃度皆為1wt%，且係以2：8之重量比例混合，另，迷迭香萃取物與五倍子萃取物於組合物之終濃度較佳為0.025%~0.07%；微生物係選自於由大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)所構成之群組。

另，本發明之含迷迭香與五倍子之組合物亦可作為一種防腐劑，添加於各種產品中，達到抗細菌孳生與提升化粧品或保養品保存期限之功效。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

實施例一：製備含迷迭香與五倍子組合物

將購自中藥行(台南，台灣)的乾燥迷迭香(Rosmarinus officinalis)與五倍子(Galla chinensis)磨碎之後，使用浸漬法與減壓濃縮機萃取，並配製成不同比例濃度之迷迭香萃取物與五倍子萃取物。

(i)迷迭香萃取物

將購買之迷迭香磨碎，先以浸漬法萃取作粗萃取，精秤10g放入血清瓶中，加入100mL之80%酒精蓋過迷迭香粉末並混合均勻，浸漬24小時；再以真空抽氣過濾得粗萃取液，將此粗萃取液以旋轉真空減壓濃縮機濃縮而得其乾燥粉狀之迷迭香萃取物，放置4℃冰箱保存。

(ii)五倍子萃取物

將購買之五倍子磨碎，先以浸漬法萃取作粗萃取，精秤10g放入血清瓶中，加入150mL之95%酒精蓋過五倍子粉末並混合均勻，浸漬24小時；再以真空抽氣過濾得粗萃取液，將此粗萃取液以旋轉真空減壓濃縮機濃縮而得其乾燥結晶狀之五倍子萃取物，放 置4℃冰箱保存；迷迭香萃取物和五倍子萃取物產率如表一所示。

實施例二：紙錠擴散試驗(Disc diffusion method)

(i)製備接種源

根據台灣衛生署公告化粧品中微生物容許量基準，不得檢出大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等，故本實驗主要為挑選此三種細菌進行代表性測試。

於無菌操作檯中操作，先將接種環燒紅後放置一旁冷卻；由繼代之固態培養基中選取一個單一菌落，並用接種環接種至液態培養基中活化，實驗之菌株為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus；ATCC編號6538p；BCRC編號10451)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa；ATCC編號9027；BCRC編號11633)與大腸桿菌(Escherichia coli；ATCC編號8739；BCRC編號11634)，其培養條件如表二；分別培養到期對數生長期，取此培養菌液定量到McFarland No.0.5，菌液濃度約為1.0 x 10⁸CFU/mL。

其中使用胰蛋白酶大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)(pH值為7.3±0.2)和胰蛋白酶大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)(pH值為7.0)作為培養金黃色葡萄球菌與綠膿桿菌之配方；營養液體培養基(nutrient broth，NB)(pH值為7.3±0.2)與營養洋菜培養基(nutrient agar，NA)(pH值為7.3±0.2)作為培養大腸桿菌之配方。

上述細菌經過適當時間培養後，以微量吸管取1mL菌液移植至新的液態培養基中，放置培養箱使其菌種放大生長至對數生長期；再使用紫外線/可見光分光光譜儀測量其是否生長至對數生長期；將菌液倒入離心管中，以落地型低溫離心機離心(4℃，7000rpm，10分鐘)後，倒出上清液僅收集菌體；再以PBS(Phosphate buffered saline)沖洗；重複上述離心步驟三次；再以PBS稀釋定量至McFarland No.0.5，菌液濃度為1.0×10⁸CFU/mL即完成；定量之菌液可保存於4℃並於24小時內使用。

(ii)紙錠擴散試驗係將含特定組合物之紙錠放置培養基中，並藉由量測抑菌圈直徑(diameter of inhibitory zone)大小得知對於微生物造成之抑菌效果。實驗步驟為利用微量吸管分別取不同濃度(1%、5%、10%、20%)、不同比例(迷迭香：五倍子=2：8、1：1、8：2，濃度皆為1%)之萃取物和空白組(80%酒精、90%酒精)各50μL，分別滴在紙錠上，等待一段時間使其酒精揮發至乾；另，正控制組係利用20μL的BAC(benzalkonium chloride，10mg/mL)；以微量吸管吸取100μL菌液(1.0×10⁸CFU/mL)在固態養基上，再將菌液均勻塗佈於固態培養基的表面；用含有不同樣品之紙錠分別放置固態培養基之上；將固態培養基放置培養箱中培養，於24小時之後觀察並測量其抑菌圈大小，測量方式包括紙錠(直徑8mm)在內之抑菌圈直徑，單位為毫米(mm)。

迷迭香萃取物和五倍子萃取物之紙錠擴散試驗結果如第一圖、第二圖與表三所示，單一植物萃取物(迷迭香、五倍子)濃度越高，抗菌效果愈好。然而，迷迭香對於金黃色葡萄球菌相較於其他兩株菌之抗菌效果較為明顯；而五倍子濃度愈高時，對於金黃色葡萄球菌、大腸桿菌會有較明顯之抗菌效果。兩者於同樣濃度下，約略可看出五倍子之抗菌效果較迷迭香佳；不同混合比例之萃取物各自對三菌株抗菌效果相比，混合比例(2：8)對於大腸桿菌和綠膿桿菌，以及混合比例(8：2)對於金黃色葡萄球菌，皆有較明顯抗菌效果。

實施例三：最小抑菌濃度試驗(Minimum Inhibitory Concentration，MIC ₉₀ )

為了更精準計算出其不同混合比例濃度之抑菌效果，進行最小抑菌濃度試驗(Minimum Inhibitory Concentration，MIC₉₀)。取定量完之菌液(1.0×10⁸CFU/mL)，使用PBS(Phosphate buffered saline)為稀釋液，作十倍連續稀釋後，用微量吸管取100μL至固態培養基上，將菌液均勻塗佈，培養平盤放置培養箱培養24小時，再計算其菌落數。另，用不同終濃度之單一植物萃取物(迷迭香、五倍子)或混合比例之萃取物樣品(迷迭香：五倍子=2：8、1：1、8：2)、再加入適合之液態培養基和100μL之定量菌液(1.0×10⁸CFU/mL)，總體積共為1mL；將此混合液放置培養箱中震盪培養24小時之後，使用PBS為稀釋液，作十倍連續稀釋後，用微量吸管取100μL至固態培養基上均勻塗佈，將培養平盤放置培養箱中培養24小時，計算其菌落數；其MIC₉₀值(抑制90%微生物生長之最小樣品濃度)，依下列公式計算：抑菌率=[1-(加入樣品培養後之菌落數/未加入樣品培養之菌落數)]x 100%。

迷迭香萃取物和五倍子萃取物對於金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌與大腸桿菌之最小抑菌濃度試驗結果分別如第三圖~第八圖與表四~表六所示。對於三種細菌之MIC₉₀值分別是金黃色葡萄球菌為0.025~0.03%；綠膿桿菌為0.06%；大腸桿菌為0.07%。其中單一植物萃取物五倍子抗菌效果大於迷迭香，而混合萃取物中以2：8抗菌效果為最佳。

表四結果顯示，金黃色葡萄球菌之抗菌效果中，其迷迭香萃 取物於終濃度0.03%達MIC₉₀值，五倍子萃取物於終濃度0.02%達MIC₉₀值。然而於混合比例中，在MIC₉₀為0.025%時，以混合比例為2：8(迷迭香：五倍子)之抑菌率為99.84%相較於其他比例最具抗菌效果。

表五結果顯示，綠膿桿菌之抗菌效果中，迷迭香萃取物對於此菌株無抗菌之效果，五倍子萃取物於中濃度0.05%達MIC₉₀值，另於混合比例中，混合比例2：8(迷迭香：五倍子)MIC₉₀為0.05%即有明顯的抗菌效果，而混合比例8：2(迷迭香：五倍子)即使 濃度為0.06%抗菌效果仍然不佳。

表六結果顯示，大腸桿菌之抗菌效果中，迷迭香萃取物於濃度0.07%達MIC₉₀值，五倍子萃取物於0.05%達MIC₉₀值，混合比例中，混合比例2：8(迷迭香：五倍子)終濃度於0.04%即達到MIC₉₀效果，由此濃度顯示，此比例具有加乘之抗菌效果。

由上述結果可知，五倍子產率極高且抗菌效果極佳，適合添加於各種產品作為防腐劑，但過去因為其色素影響頗大，仍需克服此點才能避免消費者對於產品外觀之問題；因此發明人提出複方組合物以期解決上述問題，在天然複方防腐劑方面，由混合比例2：8(迷迭香：五倍子)終濃度為0.025%~0.07%即有很好效果，尤其以終濃度為0.04%具有加乘之抗菌效果。

綜上所述，本發明證實含迷迭香與五倍子組合物於特定比例具有相乘的抑制細菌生長效果，故含迷迭香與五倍子組合物可做為抑菌劑或防腐劑應用或添加於各種產品，如材料、食品、醫藥產品等等。舉例而言，可例如為化妝材料組成物，如美白淡斑之化妝材料組成物、保養品等，並且可與一皮膚外用劑合併使用；上述“皮膚外用劑”意指一通常在化粧品或醫藥品中被使用的外用成份，包括，但不限於：其他的美白劑、保濕劑、抗氧化劑、紫外線吸收劑、介面活性劑、增稠劑、色料以及皮膚營養劑等等，可例如為濃縮精華液之成分或添加於面膜中使用，提供使用者以一適當量施予皮膚，進而達到提升上述用品長效保養之目的；另，亦可例如使用於 抗菌敷料、凝膠、泡棉、粉末或塊材等生物醫學材料。然，上述說明僅為眾多可應用方向其中一部分，在此並不引以為限定本發明所運用之範疇；換言之，舉凡需使用抑菌劑以提升保存期限或避免細菌孳生之產品皆可採用本發明。藉此，本發明可減少合成防腐劑之添加，大幅降低合成防腐劑可能造成人體健康危害或其它副作用之疑慮，達到較佳之美容保養功效。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明藉由抗菌植物之研究證實含迷迭香與五倍子組合物兩者之結合，在特定比例下相較於單一成分之作用，具有相乘之抑菌功效，因此可將此源自天然植物(迷迭香、五倍子)之萃取物作為天然複方抑菌劑或防腐劑使用。

2.本發明作為防腐劑使用僅需濃度0.025%~0.07%即有很好效果，不僅符合化粧品相關法規有關防腐劑限量濃度為0.1%~1.0%，更遠低於法規規定之濃度，故於實際實施使用上具有減少成本之優點。

綜上所述，本發明之含迷迭香與五倍子組合物及其抗菌用途，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

Claims (8)

1. 一種含迷迭香與五倍子之組合物，係包括重量比例為1：1至2：8的迷迭香萃取物與五倍子萃取物，其中該迷迭香萃取物與該五倍子萃取物分別係以80%酒精與95%酒精萃取而得。
2. 如申請專利範圍第1項所述之組合物，其中該迷迭香萃取物與該五倍子萃取物之濃度皆為1wt%，且係以2：8之重量比例混合。
3. 如申請專利範圍第2項所述之組合物，其中該迷迭香萃取物與該五倍子萃取物於該組合物之終濃度為0.025%~0.07%。
4. 一種如請求項1之含迷迭香與五倍子之組合物用於製備抗菌劑之用途，其係用於抑制至少一微生物生長，其中該組合物係包括迷迭香萃取物與五倍子萃取物以重量比例為1：1至2：8混合，其中該迷迭香萃取物與該五倍子萃取物分別係以80%酒精與95%酒精萃取而得。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該迷迭香萃取物與該五倍子萃取物之濃度皆為1wt%，且係以2：8之重量比例混合。
6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該迷迭香萃取物與該五倍子萃取物於該組合物之終濃度為0.025%~0.07%。
7. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該微生物係選自於由大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)所構成之群組。
8. 一種防腐劑，係由申請專利範圍第1項或第2項之組合物所構成。