TWI601743B - 作為雞介白素－１β拮抗物的變異型雞介白素－１β蛋白質及其用途 - Google Patents
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Description
本發明提供一種新穎的變異型介白素-1β蛋白質；特別係一種作為介白素-1β拮抗物的變異型介白素-1β蛋白質。
全球的家禽產業持續地擴產展中，因此在家禽產業發達的地區，增加飼養規模大多採用高密度的飼養方式，此造成家禽間緊迫程度提升，必須在生物安全及疾病防治上花費更多心力。近年來，國際間的家禽產業已面臨到疾病難以控制的情況。這種情況的發生，有些與不良的衛生狀況及管理有關，但大部分的因素是來自於更具攻擊性的病毒株所致，如會造成人類感染高病原性家禽流行性感冒病毒(Avian influenza virus)、引發病毒性關節炎的家禽里奧病毒(Avian reovirus)、高致死性的新城雞病(Newcastle disease)以及引起腫瘤的雞馬立克病(Marek's disease)等。
目前，家禽里奧病毒為台灣五種法定家禽傳染病之中必須檢測抗體的一種疾病，雖然已有家禽里奧病毒疫苗販售使用中，但是在養禽場還是見到許多家禽里奧病毒所引發的雞病毒性關節炎、腱鞘炎及消化吸收不良症候群等疾病，在福建沿海的養鴨業者也因為鴨隻感染家禽里奧病毒處處可見罹患關節炎的鴨隻而稱之為鴨僵病，這病毒將嚴重影響家禽的育成率造成農民經濟上的重大損失。因此，目前的法定家禽傳染病之疫苗仍然無法保護所有家禽免受家禽里奧病毒感染，要有效控制該些傳染病的疫情除了利用疫苗之外，尚需要其他有效、快速的防疫措施。
有鑑於此，本發明提供一種變異型雞介白素-1β蛋白質，其係利用單點突變法將野生型雞介白素-1β胺基酸序列進行設計改良，改良過後的變異型雞介白素-1β蛋白質會成為野生型雞介白素-1β的拮抗物，其能抑制家禽發炎反應，並有效抑制雞體內的病毒複製與增殖並提升抗病毒能力。因此，本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質可提升抗發炎之應用之醫療用途，其係為一種新穎治療方法。
本發明提供一種變異型雞介白素-1β蛋白質，其係具有野生型雞介白素1β胺基酸序列的第117個及/或第118個胺基酸位置被另一個胺基酸取代的變異。
本發明又提供雞介白素-1β拮抗物，其係為如申請專利範圍第1項所述之變異型雞介白素-1β蛋白質。
本發明另提供一種變異型雞介白素-1β蛋白質用於製備治療家禽病毒感染疾病的藥物之用途。
本發明再提供一種雞介白素-1β拮抗物用於製備治療家禽病毒感染疾病的藥物之用途。
在本發明之一實施例中，其中該變異係為第117個位置的酥胺酸(Threonine)被丙胺酸(Alanine)取代；及/或第118個位置的谷氨胺酸(Glutamic acid)被離胺酸(Lysine)、精胺酸(Arginine)或丙胺酸(Alanine)取代之變異。
在本發明之一實施例中，其中該家禽病毒係包含里奧病毒(Avian reovirus)、禽流感(Avian Influenza virus)、馬立克病(Marek's disease)或新城雞病(Newcastle disease)。
在本發明之一實施例中，其中該變異型雞介白素-1β蛋白質會抑制家禽病毒增殖以及家禽發炎反應。
在本發明之一實施例中，其中該藥物係經由口服或注射給予。
在本發明之一實施例中，其中該雞介白素-1β拮抗物係具有野生型雞介白素1β胺基酸序列的第117個位置的酥胺酸(Threonine)被丙胺
酸(Alanine)取代；及/或第118個位置的谷氨胺酸(Glutamic acid)被離胺酸(Lysine)、精胺酸(Arginine)或丙胺酸(Alanine)取代之變異。
因此，本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質具有拮抗野生型雞介白素-1β的能力，其能有效抑制家禽發炎反應，並且除能抑制家禽里奧病毒的增殖外，甚至對於高病原性家禽流行性感冒等病毒亦能達到防治的效果。故本發明擺脫傳統從單一病毒的特性去發展對抗單一病毒的藥物，而是從宿主本身的免疫系統因為會被一些重要家禽病毒性疾病如禽流感、里奧病毒、新城雞病、馬立克病等劫持(hijack)免疫細胞造成嚴重傷害，來設計創造免疫分子；因此，本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質可適用於生化醫藥、畜禽、動物抗病毒藥物之產業。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第一圖係為本發明之一較佳實施例之建構變異型雞介白素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)蛋白質的流程圖。
第二圖係為本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質經基因選殖與重組蛋白質的表現與純化後之12%SDS-PAGE電泳圖，ChIL-1β表示野生型雞IL-1β蛋白質；ChIL-1β T117A表示具有T117A突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；ChIL-1β E118K表示具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；ChIL-1β E118R表示具有E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。
第三圖係表示本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的皮質酯酮濃度測試結果；PBS表示磷酸鹽緩衝生理鹽水；ChIL-1β表示野生型雞IL-1β；ChIL-1β T117A表示具有T117A突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；ChIL-1β E118K表示具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；以及ChIL-1β E118R表示具有E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。
第四圖係為本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的二級結構光譜圖；ChIL-1β表示野生型雞IL-1β；ChIL-1β T117A表示具有T117A突
變的變異型雞介白素-1β蛋白質；ChIL-1β E118K表示具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；以及ChIL-1β E118R表示具有E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。
第五圖A至C係表示本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的結合能力分析結果；WT表示野生型雞IL-1β；T117A表示具有T117A突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；以及E118K表示具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。
第六圖A及B表示本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的訊息傳導效應；Control表示雞纖維芽母細胞對照組；IL-1β表示野生型雞IL-1β；T117A表示具有T117A突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；以及E118K表示具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。
第七圖A至D係為本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的3D結構圖；A係為野生型雞IL-1β與變異型雞介白素-1β蛋白質的結構差異；B係為野生型雞IL-1β；C係為具有T117A突變的變異型雞介白素-1β蛋白質；以及E118K表示具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。
第八圖A及B係為雞介白素-1β、雞介白素-1β接受體以及雞介白素-1β接受體協同蛋白的複合體3D模式圖；IL-1β表示野生型雞IL-1β；IL-1R表示IL-1β接受體；IL-1RAcP表示IL-1β接受體協同蛋白；T117、E118、N113、N223以及K202表示胺基酸位置。
第九圖A至C係為無特定病源(specific pathogen free，SPF)雞接種家禽里奧病毒(Avian reovirus，ARV)、或家禽里奧病毒混和具有E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質(ARV+E118R)的關節免疫組織化學染色圖；PBS表示磷酸鹽緩衝生理鹽水。
第十圖A至C係為無特定病源(specific pathogen free，SPF)雞接種家禽里奧病毒(Avian reovirus，ARV)、或家禽里奧病毒混和具有E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質(ARV+E118R)的肝臟免疫組織化學染色圖；PBS表示磷酸鹽緩衝生理鹽水。
第十一圖係為帶有其他突變位點或其他胺基酸取代變異之變異型雞介白素-1β蛋白質經基因選殖與重組蛋白質的表現與純化後之
12%SDS-PAGE電泳圖，M為標準品、野生型人類介白素-1β(第一條帶)、野生型雞介白素-1β(第二條帶)、以及帶有T7A(第三條帶)、R8A(第四條帶)、N18A(第五條帶)、E25A(第六條帶)、H34A(第七條帶)、Q36A(第八條帶)、R52A(第九條帶)、R54A(第十條帶)、Q64A(第十一條帶)、E118A(第十三條帶)以及Q138A(第十六條帶)其他突變位點之變異型雞介白素-1β蛋白質、具有E118A(第十三條帶)其他胺基酸取代之變異型雞介白素-1β蛋白質、具有T117A(第十二條帶)、E118K(第十四條帶)以及E118R(第十五條帶)突變之變異型雞介白素-1β蛋白質。
第十二圖係表示帶有其他突變位點之變異型雞介白素-1β蛋白質的皮質酯酮濃度測試結果；PBS表示磷酸鹽緩衝生理鹽水；HmIL-1B表示野生型人類IL-1β；ChIL-1β表示野生型雞IL-1β；T7A、R8A、N18A、E25A、H34A、Q36A、R52A、R54A、Q64A、T117A、E118A、E118K、E118R以及Q138A分別表示帶有該些突變位點之變異型雞介白素-1β蛋白質。
本發明利用參與先天性免疫反應的重要細胞激素介白素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)作為標的物，因為它的活化增生會引起一連串的炎症反應甚至是作為後天性免疫反應的橋樑，這些免疫細胞會被像是家禽流行性感冒病毒或家禽里奧病毒作為感染增殖的目標。本發明利用IL-1β關鍵胺基酸(第117、118胺基酸位置)並以基因工程技術改造設計成變異型雞介白素-1β蛋白質，並用高效能蛋白質表現與純化平台獲得高產量、高純度的可溶性蛋白，經動物體內的免疫系統反應結果，證實具有抗發炎的效果。此外，該變異型雞介白素-1β蛋白質二級結構與受體結合能力幾乎與野生型IL-1β相同，經由細胞訊息傳遞的競爭性實驗得知變異型雞介白素-1β蛋白質確實為野生型IL-1β拮抗物。
為了證實本發明的IL-1β拮抗物能夠抑制病毒感染，家禽里奧病毒、或家禽里奧病毒混合本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質，被分別接種於無特定病源(specific pathogen free，SPF)雞的體內，再以特異性抗家禽里奧病毒蛋白的單源抗體進行免疫組織化學染色法，驗證出含有本發明
之變異型雞介白素-1β蛋白質的病毒接種組織的病毒複製增殖明顯比只有病毒接種來的少。同時，經由已知文獻可知感染禽流感(Cellular and Molecular Immunology.2008.5(2)：113-120)、馬立克病(Viral Immunology.2008.21(2)：203-214)以及新城雞病(Virology Journal 2016.13：41)病毒後，與發炎及免疫反應有關的介白素-1β的mRNA表現會提升，此與家禽里奧病毒感染後介白素-1β的表現相同；故本發明擺脫傳統從單一病毒的特性去發展對抗單一病毒的藥物，而是從宿主本身的免疫系統因為會被一些重要家禽病毒性疾病劫持(hijack)免疫細胞造成的嚴重傷害，來設計創造免疫分子。
在本文中所指「家禽病毒」係表示感染家禽之病毒株，例如：里奧病毒(Avian reovirus)、禽流感(Avian Influenza virus)、馬立克病(Marek's disease)或新城雞病(Newcastle disease)，但不限於此。
參閱第一圖，為本發明之一較佳實施例之建構變異型雞介白素-1β蛋白質的流程圖。本發明將野生型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：1)進行單點突變設計，利用野生型雞介白素-1β及其受體所形成的3D結構，預測可能會影響其生物活性的胺基酸位置，其分別為T117A、E118K及E118R。因此，本發明分別產生帶有T117A突變位點之變異型雞介白素-1β突變T117A序列(SEQ ID NO：2)、帶有E118K突變位點序列之變異型雞介白素-1β突變E118K序列(SEQ ID NO：3)以及帶有E118R突變位點序列之變異型雞介白素-1β突變E118R序列(SEQ ID NO：4)。
首先，針對該帶有突變位點序列之變異型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3以及SEQ ID NO：4)之突變位點設計包含該突變位點的正向及反向引子，其中突變T117A序列(SEQ ID NO：2)的T117A正向引子及T117A反向引子分別為SEQ ID NO：5以及SEQ ID NO：6；突變E118K序列(SEQ ID NO：3)的E118K正向引子及E118K反向引子分別為SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8；突變E118R序列(SEQ ID NO：4)的E118R正向
引子及E118R反向引子分別為SEQ ID NO：9以及SEQ ID NO：10。
再將野生型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：1)進行針對突變位點進行的聚合酶鏈鎖反應，其中T117A突變位點係以野生型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：1)作為模板，並以野生型雞介白素-1β之正向引子(SEQ ID NO：11)及T117A反向引子(SEQ ID NO：6)進行的聚合酶鏈鎖反應產生突變T117A序列之第一片段(SEQ ID NO：13)，及以T117A正向引子(SEQ ID NO：5)及野生型雞介白素-1β之反向引子(SEQ ID NO：12)進行的聚合酶鏈鎖反應產突變T117A序列之第二片段(SEQ ID NO：14)；E118K突變位點係以野生型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：1)作為模板並以野生型雞介白素-1β之正向引子(SEQ ID NO：11)及E118K反向引子(SEQ ID NO：8)進行的聚合酶鏈鎖反應產突變E118K序列之第一片段(SEQ ID NO：15)，及以E118K正向引子(SEQ ID NO：7)及野生型雞介白素-1β之反向引子(SEQ ID NO：12)進行的聚合酶鏈鎖反應產生突變E118K序列之第二片段(SEQ ID NO：16)；E118R突變位點係以野生型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：1)作為模板並以野生型雞介白素-1β之正向引子(SEQ ID NO：11)及E118R反向引子(SEQ ID NO：10)進行的聚合酶鏈鎖反應產突變E118R序列之第一片段(SEQ ID NO：17)，及以E118R正向引子(SEQ ID NO：9)及野生型雞介白素-1β之反向引子(SEQ ID NO：12)進行的聚合酶鏈鎖反應產生突變E118R序列之第二片段(SEQ ID NO：18)。
接者，將突變T117A序列之第一片段(SEQ ID NO：13)及突變T117A序列之第二片段(SEQ ID NO：14)作為模板及引子對進行的聚合酶鏈鎖反應將兩片段接合延伸，以獲得帶有T117A突變位點序列之雞介白素-1β突變T117A序列(SEQ ID NO：2)；將突變E118K序列之第一片段(SEQ ID NO：15)及突變E118K序列之第二片段(SEQ ID NO：16)作為模板及引子對進行的聚合酶鏈鎖反應將兩片段接合延伸，以獲得帶有E118K突變位點序列之雞介白素-1β突變E118K序列(SEQ ID NO：3)；將突變E118R序列之第一片段(SEQ ID NO：17)及突變E118R序列之第二片段(SEQ ID NO：18)作為模
板及引子對進行的聚合酶鏈鎖反應將兩片段接合延伸，以獲得帶有E118R突變位點序列之雞介白素-1β突變E118R序列(SEQ ID NO：4)。
進一步地，將帶有T117A突變位點序列之雞介白素-1β突變T117A序列(SEQ ID NO：2)作為模板以野生型雞介白素-1β之正向引子(SEQ ID NO：11)及反向引子(SEQ ID NO：12)進行的聚合酶鏈鎖反應擴增該序列；將帶有E118K突變位點序列之雞介白素-1β突變E118K序列(SEQ ID NO：3)作為模板以野生型雞介白素-1β之正向引子(SEQ ID NO：11)及反向引子(SEQ ID NO：12)進行的聚合酶鏈鎖反應擴增該序列；將帶有E118R突變位點序列之雞介白素-1β突變E118R序列(SEQ ID NO：4)作為模板以野生型雞介白素-1β之正向引子(SEQ ID NO：11)及反向引子(SEQ ID NO：12)進行的聚合酶鏈鎖反應擴增該序列。
最後，本發明先將野生型雞介白素-1β序列(SEQ ID NO：1)與雞介白素-1β突變T117A序列(SEQ ID NO：2)、雞介白素-1β突變E118K序列(SEQ ID NO：3)以及雞介白素-1β突變E118R序列(SEQ ID NO：4)進行基因選殖與重組蛋白質的表現與純化，獲得高產量、高純度的可溶性蛋白質，其分子量與野生型雞介白素-1β接近；如第二圖所示，由12% SDS-PAGE電泳圖得到分子量23.6kDa之野生型雞介白素-1β(ChIL-1β)與本發明之具有T117A(ChIL-1β T117A)、E118K(ChIL-1β E118K)以及E118R(ChIL-1β E118R)突變之變異型雞介白素-1β蛋白質。
本發明進行活體內(in vivo)皮質酯酮濃度分析，以判斷本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的活體內生物活性。於活體內直接將具有T117A、E118K以及E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質分別以翼靜脈注射方式注射於無特定病源(specific pathogen free，SPF)雞隻內；如第三圖所示，注射本發明之具有T117A、E118K以及E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質(ChIL-1β T117A、ChIL-1β E118K及ChIL-1β E118R)顯示雞的
血漿中皮質酯酮濃度顯著下降。相對於野生型雞IL-1β刺激產生的皮質酯酮含量，具有T117A、E118K以及E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質分別為16%、4%及10%；其中具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質與只注射磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)無法促進皮質酯酮濃度的提升之結果近乎一致。因此，此結果證實本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質能在雞體內能阻斷炎症前期的免疫反應。
為了釐清本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質生物活性顯著減少的原因是否因為這些蛋白的三級結構瓦解所造成，本發明利用遠紫外圓二色光譜儀(Far-UV CD spectra)進行野生型IL-1β蛋白質以及具有T117A、E118K以及E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質二維結構的測定。
結果如第四圖所示，這四個蛋白質的光譜幾乎一樣，最小值落在206nm，也就是富含β摺疊的結構。這結果說明了本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質生物活性明顯下降並非是由二級結構改變所造成。
為了確定本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質生物活性顯著減少是否是因為與其接受體的結合能力下降的原因，將野生型IL-1β蛋白質以及具有T117A、E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質分別與IL-1β接受體利用表面電漿共振儀(Surface Plasmon Resonance，SPR)進行結合力測定。
結果如第五圖A至C所示，野生型IL-1β蛋白質、具有T117A、E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質的結合常數(Kd)分別為0.12、0.23及0.37nM。此結果證實這些蛋白與接受體的結合能力相似，但又不具生物活性，意味者這些改變可能會影響訊息傳導。
為了要評估本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的訊息傳導之效應，IL-6是IL-1β的下游端所活化的產物，其被用來作為測量野生型IL-1β蛋白質在雞纖維芽母細胞作用後的訊息傳遞。
結果如第六圖A所示，固定濃度的蛋白質對於IL-6的表達量以野生型雞IL-1β最高，具有T117A以及E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質則與細胞對照組一樣低，這表示只有野生型雞IL-1β能進行訊息傳遞，而本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質無訊息傳遞能力。
因此，本發明進一步假設這些變異型雞介白素-1β蛋白質具有拮抗野生型IL-1β的能力，這項假設在細胞訊息傳遞的競爭性實驗獲得驗證；結果如第六圖B所示，因為固定非飽和濃度的野生型雞IL-1β搭配逐漸提高濃度的變異型雞介白素-1β蛋白質，確實能抑制IL-6的表達量成為IL-1β的拮抗物，也就是會競爭接受體而阻斷IL-1β訊息的傳導。
為了證實本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質3D結構是否與野生型IL-1β有差異，本發明利用已建立的x-ray結構生物學平台確認具有T117A以及E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質的3D結構。
結果如第七圖A至D所示，顯示本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的局部二級結構最大差異就是位於改變的胺基酸附近結構，原本野生型雞IL-1β為環狀(loop)(第七圖A黑色)，但變異型雞介白素-1β蛋白質此區域結構已轉為α-螺旋型(第七圖A灰色及淺灰色)，甚至蛋白質表面帶電性也從野生型雞IL-1β的陰性電荷區(第七圖B)轉變成變異型雞介白素-1β蛋白質的陽性電荷區(第七圖C及D箭頭處)。這種顛覆性的改變暗示本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質結構特性會影響接連的訊息傳遞。
將雞介白素-1β訊息傳導至細胞核再引發一連串的免疫反應是需要IL-1β、IL-1β接受體I(interleukin-1β receptor type I，IL-1RI)以及IL-1β接受體協同蛋白(IL-1R accessory protein，IL-1RAcP)共同作用才能完成，然而至今有關雞野生型IL-1β/IL-1RI/IL-1RAcP 3D結構尚未被卻確定，因此本發明經由電腦結構生物模擬平台進行此複合體的模擬。
結果如第八圖A及B所示，觀察到本發明進行基因工程技術
改造設計的T117與E118位置係位於IL-1RI/IL-1RAcP的分界面(第八圖A及B上圖)，此分界面形成一個口袋狀構型讓野生型雞IL-1β的T117與E118位置所形成的環型結構在另兩個蛋白質的分界面以氫鍵或疏水性鍵結相互作用(第八圖A下圖)。這塊小區域的複合體蛋白質表面帶電性顯示野生型雞IL-1β為陰性電荷區(第八圖B下圖)，位於IL-1RI/IL-1RAcP的分界面為陽性電荷區，彼此互相吸引，若改變此位置胺基酸極性例如本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質，該分界面將呈現局部區域不穩定，而無法正確傳送IL-1β訊息至細胞核並引發連鎖免疫反應。
為了證實本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質可作為能夠作為對抗像能引發的IL-1β大量表達的雞介白素-1β拮抗物。以併發病毒性關節炎的里奧病毒(Avian reovirus，ARV)為例，由於已知里奧病毒是藉由消化道或腳掌傷口進入雞隻體內，接著會依序在關節內及肝臟內的免疫細胞進行複製增殖，因此本發明分別將家禽里奧病毒、或家禽里奧病毒混和具有E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質，經由SPF雞的腳掌進行接種，三天後犧牲動物並分別取其關節與肝臟製作成組織切片，再以特異性抗家禽里奧病毒蛋白σNS的單源抗體進行免疫組織化學染色法。
結果如第九圖A至C以及第十圖A至C所示，單獨接種ARV的SPF雞在其腳關節腱鞘滑膜處及皮下見到大量強陽性家禽里奧病毒蛋白σNS訊號(第九圖B)，在其肝臟之肝細胞胞質內見到大面積強陽性家禽里奧病毒蛋白σNS訊號(第十圖B)。反觀家禽里奧病毒混和具有E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質所接種的SPF雞，僅在其腳關節腱鞘滑膜處血管周圍的肉芽腫性結節內見少量的家禽里奧病毒蛋白σNS訊號(第九圖C)，肝臟有少量散佈的家禽里奧病毒蛋白σNS訊號(第十圖C)，兩個組織在只有PBS接種後都無任何特異性訊號(第九圖A及第十圖A)。此動物實驗證實出本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質的ARV病毒接種組織，其ARV病毒複製增殖明顯比只有ARV病毒接種來的少，能夠有效的抑制病毒在動物體內的傳染。
若將上述動物實驗的染色鑑別結果進行量化，可將其分為
0-5級分。0級分為沒有明顯家禽里奧病毒蛋白σNS陽性訊號，1級分為局部且少量，5級分為大面積至瀰漫性多量陽性訊號。如表一所示，單獨接種ARV的SPF雞在其腳關節腱鞘滑膜處其肝臟皆見到大量強陽性家禽里奧病毒蛋白σNS訊號(3級分)。而家禽里奧病毒混和具有E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質所接種的SPF雞在其腳關節腱鞘滑膜及肝臟則只有少量分佈家禽里奧病毒蛋白σNS陽性訊號(1級分)。
綜上所述，本發明經由將野生型雞的IL-1β關鍵第117、118個胺基酸序列位置進行設計改良，以構築出具有T117A、E118K以及E118R突變的變異型雞介白素-1β蛋白質。經由蛋白質表現與純化系統，可獲得高純度、高表現量的可溶性蛋白質。本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質經由無特定病源雞(SPF)的體內(in vivo)生物學試驗，證實其生物活性幾乎喪失，再以遠紫外圓二色光譜儀證實本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質與野生型雞IL-1β彼此的二級結構相似；同時以表面電漿共振儀分析發現本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質與野生型雞IL-1β與其接受體的結合能力與野生型IL-1β相似。因而證實本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質與野生型雞IL-1β主要結構沒有改變、卻喪失免疫訊息傳遞的能力而讓其生物活性下降、但與接受體結合能力與野生型雞IL-1β相近。
本發明經由細胞訊息傳遞的競爭性實驗獲得證實變異型雞介白素-1β蛋白質具有拮抗野生型IL-1β的能力。另外，利用x-ray結構生物學平台獲得具有T117A以及具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質的
3D結構圖，發現變異型雞介白素-1β蛋白質的局部二級結構及帶電性與野生型IL-1β明顯不同，經電腦結構生物模擬平台更觀察到變異型雞介白素-1β蛋白質的第117及118個胺基酸突變位置與其執行訊息傳導相關的連結蛋白如IL-1β接受體及接受體協同蛋白，呈現局部區域不穩定，而無法正確傳送IL-1β訊息至細胞核並引發連鎖免疫反應。
更進一步地，本發明證實可作為雞介白素-1β拮抗物的變異型雞介白素-1β蛋白質具有抑制病毒感染之能力。以家禽里奧病毒為例，本發明分別將家禽里奧病毒、或家禽里奧病毒具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質分別接種於SPF雞，再以特異性抗家禽里奧病毒蛋白的單源抗體進行免疫組織化學染色法，驗證出具有E118K突變的變異型雞介白素-1β蛋白質的病毒接種組織的病毒複製增殖明顯比只有病毒接種來的少。
為證實本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質具有關鍵性的胺基酸突變位點，本發明依據實施例1的方法分別產生帶有T7A、R8A、N18A、E25A、H34A、Q36A、R52A、R54A、Q64A、E118A以及Q138A突變位點之其他變異型雞介白素-1β蛋白質；以及具有E118A其他胺基酸取代之變異型雞介白素-1β蛋白質，並進行基因選殖與重組蛋白質的表現與純化，獲得高產量、高純度的可溶性蛋白質，其分子量與野生型雞介白素-1β接近；如第十一圖所示，由12% SDS-PAGE電泳圖得到分子量23.6kDa之野生型人類介白素-1β(第一條帶)、野生型雞介白素-1β(第二條帶)、以及帶有T7A(第三條帶)、R8A(第四條帶)、N18A(第五條帶)、E25A(第六條帶)、H34A(第七條帶)、Q36A(第八條帶)、R52A(第九條帶)、R54A(第十條帶)、Q64A(第十一條帶)、與具有T117A(第十二條帶)、E118A(第十三條帶)、E118K(第十四條帶)、E118R(第十五條帶)以及Q138A(第十六條帶)之變異型雞介白素-1β蛋白質。
接著，依據實施例2的方法進行進行活體內(in vivo)皮質酯酮濃度分析，以判斷帶有其他突變位點或其他胺基酸取代變異之變異型雞介
白素-1β蛋白質的活體內生物活性。本發明將野生型人類介白素-1β、野生型雞介白素-1β、以及帶有T7A、R8A、N18A、E25A、H34A、Q36A、R52A、R54A、Q64A、E118A以及Q138A其他突變位點之變異型雞介白素-1β蛋白質、具有E118A其他胺基酸取代之變異型雞介白素-1β蛋白質、與具有T117A、E118K以及E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質，分別以翼靜脈注射方式注射於無特定病源(SPF)雞隻內。結果如第十二圖所示，相對於野生型雞IL-1β刺激產生的皮質酯酮含量，注射本發明之具有T117A、E118K以及E118R突變之變異型雞介白素-1β蛋白質在雞的血漿中分別含有16%、4%及10%皮質酯酮濃度，具有顯著下降；具有E118A其他胺基酸取代之變異型雞介白素-1β蛋白質在雞的血漿中含有約40%的皮質酯酮濃度下降；而帶有T7A、R8A、N18A、E25A、H34A、Q36A、R52A、R54A、Q64A以及Q138A其他突變位點之變異型雞介白素-1β蛋白質在雞的血漿中含有約80%至90%的皮質酯酮濃度，具有極些微之下降趨勢。因此，此結果證實並非所有帶有突變位點之其他變異型雞介白素-1β蛋白質，皆具有使生物活性降低之能力。本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質係具有關鍵性的胺基酸(第117、118胺基酸位置)突變位點，使本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質在雞體內能具有阻斷炎症前期的免疫反應之優異效果。
因此，本發明提供一種新穎的雞介白素-1β拮抗物，其有機會補強部分動物疫苗效力不佳的窘境。以變異型雞介白素-1β蛋白質作為雞介白素-1β拮抗物或抗病毒藥的成本每隻雞使用劑量僅需新台幣0.1角至1.0角，若進入產業界大規模生產將遠遠低於此價錢；同時，該變異型雞介白素-1β蛋白質之品質優良且成分穩定，在-20℃保存下，可維持6個月以上具有活性且不沉澱，因此極具有市場競爭性。再者，現今世界各國包括台灣面對日益增加的抗藥病菌以及不斷突變重組的新型病毒，甚至是會靠感染後免疫細胞激素介白素-1β的表達來刺激淋巴細胞增生並在其內進行複製增殖的病毒，例如是禽流感、里奧病毒以及馬立克病。因此，若能以本發明之變異型雞介白素-1β蛋白質作為生物性細胞激素拮抗劑來對抗病毒，將可大大補強疫苗的使用而保護禽畜健康避免受疾病的危害，故本發明是一種
新穎的免疫療法，其可被應用於抗病毒、抗發炎等醫療用途。
<110> 國立清華大學
<120> 作為雞介白素-1β拮抗物的變異型雞介白素-1β蛋白質及其用途
<130> 105B0233-I1
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Claims (7)
- 一種變異型雞介白素-1β蛋白質，其係具有SEQ ID NO：1編碼的野生型雞介白素-1β帶有一胺基酸取代的變異，該胺基酸取代的變異選自於由第117個、第118個以及其組合的胺基酸位置組成的群組，且該變異係為第117個位置的酥胺酸(Threonine)被丙胺酸(Alanine)取代；及第118個位置的谷氨胺酸(Glutamic acid)被離胺酸(Lysine)、精胺酸(Arginine)或丙胺酸(Alanine)取代之變異。
- 一種雞介白素-1β拮抗物，其係為如申請專利範圍第1項所述之變異型雞介白素1β蛋白質。
- 一種如申請專利範圍第1項所述之變異型雞介白素-1β蛋白質用於製備治療家禽病毒感染疾病的藥物之用途。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該家禽病毒係包含里奧病毒(Avian reovirus)、禽流感病毒(Avian Influenza virus)、馬立克病(Marek's disease)病毒或新城雞病(Newcastle disease)病毒。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該變異型雞介白素-1β蛋白質會抑制家禽病毒增殖以及家禽發炎反應。
- 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該藥物係經由口服或注射給予。
- 一種雞介白素-1β拮抗物用於製備治療家禽病毒感染疾病的藥物之用途，其中該雞介白素-1β拮抗物係具有SEQ ID NO：1編碼的野生型雞介白素1β帶有一胺基酸取代的變異，該胺基酸取代的變異選自於由第117個、第118個胺基酸位置以及其組合組成的群組；且該變異係為第117個位置的酥胺酸(Threonine)被丙胺酸(Alanine)取代；及第118個位置的谷氨胺酸(Glutamic acid)被離胺酸(Lysine)、精胺酸(Arginine)或丙胺酸(Alanine)取代之變異。
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| Cheng CS et al,"Comparative analysis of receptor binding by chicken and human interleukin-1β.", J Mol Model. 2011 Jun;17(6):1283-94. * |
| Cheng CS et al,"Structural and functional comparison of cytokine interleukin-1 beta from chicken and human.", Mol Immunol. 2011 Mar;48(6-7):947-55. * |
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