TWI594752B - Ｄｍｇｆ用於製備抑制腫瘤轉移的醫藥組合物之用途 - Google Patents
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Description
本案係關於一種抑制腫瘤轉移的醫藥組合物以及製備該醫藥組合物之物質的用途。
多酚類化合物(Polyphenolic compound)常見於一般日常飲食及草藥的成分之中，例如蔬菜、水果、豆類、紅酒、茶及銀杏等皆含有不同的多酚類化合物。不同的多酚類化合物對於生物體可產生不同的生物活性，例如具有抗發炎、抗癌或抗老化等功效。其中，又以從太平洋紫杉(Taxus brevifolia Nutt.)的樹皮所萃取出來紫杉醇(Paclitaxel，商品名稱為Taxol)，成功地被證實具有治療癌症的潛力，最為醫藥學界所注目。因此，從紫杉所萃取出的其他成分之生理活性十分值得研究，具有開發的價值。
從紫杉的枝葉中所萃取的成分，除紫杉醇之外，更包括其他的雙磺酮類(biflavonoid)化合物。目前對於雙磺酮類化合物的研究，已知其具有廣泛的生物活性，例如抗真菌、抗發炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等活性，然，不同的雙磺酮類化合物便具有不同的生物活性，即便同樣具有抗癌之潛力，其機轉與應用仍有許多未知。
而在雙磺酮類化合物中，更發現有特殊的一類，簡稱為DMGF(即7,7"-Dimethoxyagastisflavone)，但目前對於DMGF的機轉與功效研究相當少，僅發現其具有抑制黃麴黴菌(Aspergillus flavus)分泌黃麴毒素(aflatoxin)之功效，而後續的研究卻未能進一步突破。基於不同的雙磺酮類化合物便具有不同的生物活性，DMGF是否具有其他的生物活性，可產生不同的功效，尤其是如紫杉醇一樣具有抑制癌症之功效，以應用於抗癌之用途，已成為醫藥產業中相當值得研究的課題。
有鑑於先前技術之不足，發明人經研發後得本發明。本發明之目的概略為提供一種包括DMGF醫藥組合物與以DMGF製備醫藥組合物之用途，其實質上係以雙磺酮類化合物DMGF提供抑制腫瘤轉移的效果。
詳細來說，本發明提供一種抑制腫瘤轉移的醫藥組合物，其包括雙磺酮類化合物DMGF(7,7"-Dimethoxyagastisflavone)。且較佳的，其係包括一有效量之雙磺酮類化合物DMGF以及一醫藥上可接受之載體、稀釋劑、賦形劑或其組合。
本發明另提供一種雙磺酮類化合物DMGF用於製備抑制腫瘤轉移的醫藥組合物之用途。
為使之後內容能清楚呈現本發明的技術特徵，以下擬先定義特定名詞，爾後進一步說明本發明內容。在本說明書中所使用之「腫瘤轉移(Tumor Metastasis)」一詞意指腫瘤細胞從原發的部位，轉移到身體其他遠離原發的部位繼續生長的過程，換言之，即腫瘤細胞擴散至其他組織或器官的過程。其過程與細胞遷移(migration)很類似，但在腫瘤轉移的過程中，腫瘤細胞必須通過細胞外基質(extracellular matrix,ECM)或是基底膜(Basement membrane)，完成，以入侵(invasion)至其他組織或器官，其詳細的腫瘤轉移過程詳述於後。一般而言，良性的腫瘤細胞並不會產生轉移的情形，因此，轉移(Metastasis)亦稱為惡性轉移，另外，本說明書所述之腫瘤細胞係指惡性的腫瘤細胞。
腫瘤細胞要擴散至其他部位必須先越過或繞過鄰近細胞，再進入循環系統中。進而言之，腫瘤細胞必須藉由重組細胞骨架(cytoskeleton)，以及附著於其他細胞或細胞外基質，以進行遷移(migration)。
細胞的遷移，或稱為細胞的運動，必須藉由重組細胞骨架改變其位置，細胞骨架包括微絲、微管及中間絲，微絲是由肌動蛋白(Actin)組成的纖維結構，其具有單體型態的肌動蛋白單體(Globular Actin,G-Actin)，其表面上有三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)結合位點，當肌動蛋白單體與三磷酸腺苷結合時，肌動蛋白單體可連成一條多聚體的肌動蛋白鏈，這種多聚體肌動蛋白又被稱為絲狀肌動蛋白(Fibrous Actin,F-Actin)，而兩條絲狀肌動蛋白互相纏繞扭曲而聚合形成一股微絲。微絲可
再與微管、中間絲及其他蛋白質分子結合，以進行細胞的遷移或運動。因此，抑制絲狀肌動蛋白的聚合，便可進而抑制腫瘤轉移。而在本說明書中所使用之「絲狀肌動蛋白的聚合」一詞意指前述之絲狀肌動蛋白互相纏繞扭曲而形成一股微絲。
另外，細胞外基質意指在細胞內合成並分泌到胞外，以分佈在細胞表面或細胞之間的大分子，主要是由多醣和蛋白質、或蛋白聚醣(proteoglycan)所組成，例如彈性蛋白(elastin)或纖維蛋白(fibrin)。而腫瘤細胞藉由附著於細胞質膜(plasma membrane)表面或細胞外基質的蛋白質(protein)後，再藉由重組細胞骨架向前遷移，進而越過鄰近的細胞，直到遇到不能繞過的障礙。該障礙通常是圍繞著組織的基底層(basal lamina)或基底膜。腫瘤細胞可合成並分泌各種蛋白質水解酶(protease)，以降解細胞外基質與基底膜的蛋白質，進而進入循環系統中，例如進入血管之中。一般而言，腫瘤細胞附著於細胞質膜表面或細胞外基質的蛋白質，並分泌各種蛋白質水解酶降解細胞外基質的蛋白質，以穿越細胞外基質的過程，皆可被歸類為「腫瘤轉移」的過程。
而當腫瘤細胞須離開循環系統，亦需藉由降解細胞外基質以穿出血管或淋巴管的管壁。因此，抑制腫瘤細胞之降解細胞外基質的能力，以及抑制腫瘤細胞之蛋白質水解酶的表現皆可進而抑制腫瘤轉移。而在本說明書中所使用之「蛋白質水解酶的表現」一詞包括核醣核酸(RNA)層級或蛋白質層級之合成蛋白質水解酶的能力。
腫瘤細胞轉移的能力受到其降解細胞外基質或基底膜的能力所影響，進而言之，同樣受到腫瘤細胞所合成及分泌各種蛋白質水解酶的能力所影響。而在腫瘤細胞所合成與分泌蛋白質水解酶中，其中，包括基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteases,MMP)。基質金屬蛋白酶最早是在1962年被發現，具有降解膠原蛋白及細胞外基質的能力。目前已經發現有至少28個不同種類的基質金屬蛋白酶，其中，屬於明膠酶(gelatinase)的基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)同樣具有降解細胞外基質的能力，且被認為與腫瘤的轉移及血管生成具有高度相關性，它們透過助長微血管生成與分解組織，幫助腫瘤細胞向外擴散。因此，抑制基質金屬蛋白酶-2的表現，便可抑制腫瘤細胞之降解細胞外基質的能力，進而抑制腫瘤轉移。另外，
在本說明書中所使用之「基質金屬蛋白酶-2的表現」一詞意指核醣核酸(RNA)層級或蛋白質層級可生成基質金屬蛋白酶-2的能力。
除此之外，在本說明書中所使用之「發炎反應」一詞意指人體為對抗外來或內生性刺激，使多種免疫系統或免疫細胞的產生的防禦機制。其中，主要受核轉錄因子(nuclear factor-κB,NF-κB)調節表現的促發炎因子(pro-inflammatory factor)，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)，其與發炎反應高度相關。另外，發炎反應又可分為短期的急性發炎及長期的慢性發炎，雖短期的急性發炎已被證實具有修復、重建受損組織的功效，但過度及長期的慢性發炎卻又有可能導致癌症、糖尿病、心血管疾病等多種慢性疾病。尤其是近年來，許多的分子、細胞或免疫機轉層面的研究已直接地顯示發炎作用也與癌症密切相關，例如促進腫瘤組織周邊的血管新生(angiogenesis)及癌細胞的入侵、轉移等多種病理作用，均與發炎作用高度有相關性。因此，抑制免疫細胞分泌腫瘤壞死因子-α以抑制發炎反應，更可進而抑制腫瘤轉移。
在本說明書中所使用之「雙磺酮類化合物DMGF」，或簡稱為「DMGF」者，除可指雙磺酮類化合物DMGF外，也包括基本雙磺酮類化合物DMGF結構經化學或生物學修飾或取代所產生之衍生物，而且仍保有原基本雙磺酮類化合物DMGF結構的性質或具有與原基本雙磺酮類化合物DMGF結構相似的性質。另外，在本說明書中有提及且與本發明技術特徵實質相關的化合物或物質均可涵蓋所稱之化合物或物質以及其任何醫藥上可接受的形式。其中，醫藥上可接受的形式可例如但不限於含非鏡像異構物(diastereomer)與鏡像異構物(enantiomer)的各式異構物(isomer)、鹽類、游離形式、溶劑、前藥(prodrug)、多形體(polymorph)及消旋混合物(racemic mixture)。
在本說明書中所使用之「有效劑量」意指雙磺酮類化合物DMGF可產生抑制腫瘤轉移之劑量。在本發明中，雙磺酮類化合物DMGF的劑量較佳係介於每日每公斤體重0.8至4毫克之間。另外，腫瘤可例如但不限於黑色素瘤、肺癌腫瘤或大腸癌腫瘤，藉由雙磺酮類化合物DMGF的成分以抑制腫瘤轉移。
綜上所述，依據本發明之醫藥組合物、與製造該醫藥組合
物之用途，其使用雙磺酮類化合物DMGF，對於由多種不同途徑以抑制腫瘤轉移，提供了顯著的功效。
圖1為計算實驗例二中B16F10細胞轉移至透孔培養皿之下層空室所得的數據圖。
圖2為實驗例三中B16F10細胞之基質金屬蛋白酶-2表現量的數據圖。
圖3為實驗例四中SVEC4-10細胞之絲狀肌動蛋白聚合情形的結果圖。
圖4為實驗例五中各小鼠之腫瘤體積的結果圖。
圖5為實驗例六中老鼠胰臟細胞分泌之腫瘤壞死因子-α之的結果圖。
以下將配合圖式說明本發明之實施例與實驗例，惟相關文義說明可參照前述，於此不再贅述。
依據本發明之一種抑制腫瘤轉移的醫藥組合物，在一實施例中，透過將一治療上有效劑量之雙磺酮類化合物DMGF(以下以DMGF稱之)以及一醫藥上可接受之載體，共同製備成一個醫藥組合物，再給予患者來達成抑制腫瘤轉移的效果。其中，DMGF係萃取自曼地亞種的紅豆杉(Taxus media var.Hicksii)之乾燥的針葉，且較佳地，萃取係以高效能液相層析法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)實施，以獲得含有DMGF的萃取物，且使DMGF的純度達到98%以上。使用高效能液相層析法萃取化合物的實施細節係為本發明所屬領域中具有通常知識者所能理解者，於此不再贅述。
另外，本發明的醫藥組合物可以任何口服可接受之劑量形式，經口服而投予患者，其例如但不限於膠囊、藥錠、水性懸浮液或溶液。在以口服使用之藥錠情況中，常使用的載體包括乳糖及玉米澱粉。另外，亦可加入潤滑劑，如硬脂酸鎂。關於膠囊形式之口服投藥，有用的稀釋液包括乳糖及乾燥的玉米澱粉。在以水性懸浮液供口服使用時，則將活性成份之DMGF與乳化及懸浮劑結合。在其他實施例中，也可以加入特定的甜
味劑、香味劑或著色劑，以使患者容易地服用。
或選擇將本發明的醫藥組合物以直腸投藥之栓劑形式，以針對下腸道的局部施藥。本發明的醫藥組合物可以更包括適合且無刺激性之賦形劑混合，以製備成栓劑。上述之賦形劑在室溫下是固體，但是在直腸溫度作用下會成為液體，從而在直腸中溶解，釋出活性成份之DMGF。具體來說，賦形劑包括椰子奶油、蜂蠟及聚乙二醇。另外，醫藥組合物亦可以調配成為軟膏形式，以針對皮膚局部施藥。而可供局部投藥使用之軟膏中的載體可例如但不限於礦物油、液態凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟或水。當然，除上述劑型外，依據本發明之醫藥組合物還可調製成注射用針劑等形式，本發明於此不限。
較佳的，具有腫瘤的患者可接受之DMGF之劑量範圍係介於每日每公斤體重0.8至4毫克之間，即每日0.8mg/kg至4mg/kg之間。當然，在此所稱之患者可接受之劑量範圍即醫藥組合物中含有之DMGF的劑量範圍。醫藥組合物中所含有之DMGF的劑量可以隨投予路徑或有需要之個體及其生理狀況的不同而有所調整。普遍而言，口服形式之醫藥組合物需要較高的劑量，反觀治療初期所使用的劑量則相對較低。另外，以醫藥組合物製成配方來說，每一配方中可含有一個劑量單位的醫藥組合物，換言之，一個配方即含有足可對具有腫瘤的患者於一特定時間內產生抑制腫瘤轉移效果的劑量，以方便直接投予。在實施上，醫藥組合物之配方可以為散劑，且每一包散劑即含有一個劑量單位的醫藥組合物。當然，在其他實施方式中，一個劑量單位亦可由分散於數個次劑量單位或次包裝中的複數個醫藥組合物組成，例如分散於二至三粒錠劑或膠囊內但包裝在同一吸塑包裝(blister pack)中。
進一步說明，依據本發明之醫藥組合物，當醫藥組合物投予具有腫瘤的患者後，其中DMGF可透過抑制基質金屬蛋白酶-2的表現而抑制腫瘤細胞之降解細胞外基質的能力、或藉由抑制腫瘤細胞之蛋白質水解酶的表現、或抑制絲狀肌動蛋白的聚合、或抑制免疫細胞分泌腫瘤壞死因子-α，進而達到抑制腫瘤轉移的功效，且較佳的，係抑制黑色素瘤、肺癌腫瘤或大腸癌腫瘤的轉移。間接的，可進一步達成消除、抑制、改善、緩解、預防癌症及其症狀、或延緩、阻止、反轉腫瘤增生速率、或達到與
上述目的相似的醫療效果。
本發明又提供一種雙磺酮類化合物DMGF用於製備抑制腫瘤轉移的醫藥組合物之用途。然而，該醫藥組合物與前述說明之醫藥組合物大致相同，可參考前述，於此不再贅述。
承上所述，依據本發明之醫藥組合物與用途，其使用雙磺酮類化合物DMGF，對於抑制腫瘤轉移，提供了顯著的功效。
本發明所使用DMGF係由高效能液相層析法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)取得含有DMGF的萃取物，且其DMGF的純度為98%以上。本實驗例係於Waters高效能液相層析系統(Waters 2796 Bio-separation Module)萃取DMGF，其中，本實驗例所使用的管柱即為該系統的管柱，其為粒徑尺寸5mm的C18TM Symmetry管柱(250mm x 4.6mm)，並藉由30%的甲醇水溶液以0.5mL/min的速度流洗該管柱，並取於254nm可測得吸光值有明顯變化的流洗液，即為含有DMGF的萃取物。接著，在室溫下秤取約5毫克前述含有DMGF的萃取物，並以此為一單位劑量。接著，包裝為一散劑或扁囊劑之形式，保存於室溫下。
以組織培養技術，於含有濃度10%之胎牛血清(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)與1%抗生素的細胞培養液DMEM(Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中培養老鼠黑色素瘤(mouse melanoma cells)細胞株B16F10至適當數量，其中，抗生素較佳係為盤尼西林(Penicillin)/鏈黴素(streptomycin)/兩性黴素(amphotericin)。接著，取含有數量3×104之B16F10細胞的懸浮液，並接種於二個透孔(transwell)培養皿的上層空室中，其一，更添加最終濃度為1μg/ml之DMGF；另一，則不添加DMGF，以作為對照組。另外，添加細胞培養液DMEM於透培養皿的上、下層空室，且下層更另外添加胎牛血清(FBS)。接著，再置回37℃的培養箱。於其他實施例中，更可將含有數量為3×104之B16F10細胞的懸浮液接種於四或六個透孔培養皿的上層空室中，以進行二重複或重複的試驗，本發明不以此為限。
其中，上層空室的底部，即上層空室與下層空室之間，具有透孔膜，於本實驗例中，係使用8μm的透孔膜，且透孔膜上塗覆有基質膠，以模仿細胞外基質的環境，用於腫瘤轉移的實驗。藉由下層空室的細胞培養液DMEM添加有胎牛血清(FBS)，使B16F10細胞自上層空室轉移至下層空室。一般而言，培養4小時後，B16F10細胞開始自上層空室轉移至下層空室，再培養6至8小時，便可直接以棉花棒清除上層空室殘留的B16F10細胞。並以甲醇固定轉移至下層空室的B16F10細胞，接著，再以50μg/ml的碘化丙啶(propidium iodide)對B16F10細胞染色。最後，在螢光顯微鏡下計數下層空室的B16F10細胞數量。
圖1為計算實驗例二中B16F10細胞轉移至透孔培養皿之下層空室所得的數據圖。請參考圖1所示，將標示「對照組」的B16F10細胞數量定義為轉移速率為100%，再推算經由DMGF處理之B16F10細胞的遷移速率(標示「雙磺酮類化合物DMGF」者)。由圖1可知，經DMGF處理後的黑色素瘤細胞(B16F10)相較未經DMGF處理的黑色素瘤細胞，其黑色素瘤細胞的轉移速率下降了65%。因此，由實驗例二可知，含有DMGF之醫藥組合物對腫瘤細胞，尤其是黑色素瘤細胞，確實有抑制腫瘤轉移的效果。
除此之外，由於本實驗例所使用透孔培養皿，其透孔膜塗覆有類似細胞外基質的基質膠，故必須先藉由黑色素瘤細胞分泌水解蛋白酶，以降解細胞外基質後，才可轉移至下層空室。故從實驗例二亦可得知，含有雙磺酮類化合物DMGF之醫藥組合物確實可抑制腫瘤細胞降解細胞外基質的能力，進而抑制腫瘤轉移的效果。
以組織培養技術培養B16F10細胞，其培養條件與實驗例二相同。取含有數量1×106之B16F10細胞的懸浮液接種於至少三個的培養皿中，其中選取二個培養皿，添加最終濃度為1μg/ml的雙磺酮類化合物DMGF於B16F10細胞的懸浮液後，置回37℃的培養箱繼續培養，分別培養12及24小時後，將培養皿中的培養液及加入的化合物吸除，另以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗，再利用胰蛋白酵素溶液(trypsin-EDTA)收取B16F10細
胞。而其中一個培養皿不添加DMGF，並依照前述方式收取B16F10細胞。
接著，萃取上述收取之B16F10細胞的核醣核酸(RNA)，於本實施例中，係以TRIzol試劑(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)萃取B16F10細胞的核醣核酸。接著，以該些核醣核酸為模板(template)進行反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse Transcription-PCR)，將該些核醣核酸反轉錄形成互補去氧核醣核酸(cDNA)。最後，再以互補去氧核醣核酸為即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)的模板，並以5’-CAC CTG GTT TCA CCC TTT CTG-3’作為基質金屬蛋白酶-2的前置引子(forward primer)，以及5’-AAC GAG CGA AGG GCA TAC AA-3’作為基質金屬蛋白酶-2的反置引子(reverse primer)，進而定量實驗組與對照組於上述各個時間點的基質金屬蛋白酶-2之核醣核酸表現量。
詳細而言，於本實施例中，反轉錄聚合酶連鎖反應係於SuperScript First-Strand系統(Invitrogen Life Technologies)的環境下進行，另外，即時聚合酶鏈鎖反應係以螢光染劑作為偵測方式的系統(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)。即時聚合酶鏈鎖反應所使用的反應試劑(總體積為25μl)其內含物質如下：上述之互補去氧核醣核酸1μl、基質金屬蛋白酶-2的前置引子0.25μl、基質金屬蛋白酶-2的反置引子0.25μl、二次滅菌水11μl、以及兩倍反應試劑濃縮液(realQ PCR master mix)12.5μl。其中，兩倍反應試劑濃縮液中包含濃度10mM之二氯化鎂(MgCl2)以及去氧核醣核酸螢光染劑(Green DNA dye)。另外，即時聚合酶鏈鎖反應的反應步驟：以95℃處理10分鐘；再以95℃處理15秒，60℃處理1分鐘，並重複40個循環，進而擴增基質金屬蛋白酶-2的去氧核醣核酸片段。
以TRIzol試劑萃取核醣核酸、反轉錄聚合酶連鎖反應以及即時聚合酶鏈鎖反應的實驗方法，均為本發明所屬領域中具有通常知識者所能理解者，於此不再贅述。
圖2為實驗例三中B16F10細胞之基質金屬蛋白酶-2表現量的數據圖。請參考圖2所示，標示「0小時」者為未以DMGF處理之B16F10細胞的基質金屬蛋白酶-2核醣核酸表現量，而標示「12小時」、「24小時」則是分別以DMGF處理12小時、24小時後的B16F10細胞之基質金屬蛋白
酶-2核醣核酸表現量。其中，以標示「0小時」的基質金屬蛋白酶-2表現量定義為1倍，再推算標示為「12小時」及「24小時」的基質金屬蛋白酶-2表現量。由圖2的結果顯示可知，以DMGF處理12小時及24小時的B16F10細胞之基質金屬蛋白酶-2核醣核酸表現量分別為0.5倍、0.3倍。因此，由實驗例三可知，含有DMGF之醫藥組合物對腫瘤細胞，尤其是黑色素瘤細胞確實有抑制基質金屬蛋白酶-2的表現之功效。
進而言之，由於基質金屬蛋白酶-2具有降解細胞外基質的能力，以及基質金屬蛋白酶-2係屬水解蛋白酶的一種，故由實驗例三亦可得知DMGF可透過抑制基質金屬蛋白酶-2的表現而抑制腫瘤細胞之降解細胞外基質的能力，以及DMGF亦可抑制腫瘤細胞之蛋白質水解酶的表現而抑制腫瘤轉移。
以組織培養技術培養老鼠淋巴內皮(mouse vascular endothelial)細胞株SVEC4-10，其培養方式可參照實驗例二關於B16F10細胞的培養方式，於此不加贅述。並取含有數量3×104之SVEC4-10細胞的懸浮液，接種於至少二的培養皿中，再添加具有濃度16ng/ml血管內皮生長因子VEGF(Upstate Inc.,Lake Placid,NY,USA)的培養液於該二96孔培養皿中，且其中之一，更添加有濃度1μg/ml的DMGF作為實驗組。添加完培養液及前述之化合物後，將SVEC4-10細胞置於37℃的培養箱培養3至4小時，再分別以4,6-二氨基-2-苯基吲哚(diamidino-phenyl-indole,DAPI)及鬼筆毒素(Phallotoxin)對於培養後的SVEC4-10細胞染色。其中，4,6-二氨基-2-苯基吲哚可與雙股去氧核醣核酸結合，用以標示細胞核的位置，而鬼筆毒素可與絲狀肌動蛋白結合，故常利用鬼筆毒素作為觀察絲狀肌動蛋白聚合情形的染劑。染色後，再於40倍率的顯微鏡鏡頭下，觀察並拍攝絲狀肌動蛋白聚合的情形。
圖3為實驗例四中SVEC4-10細胞之絲狀肌動蛋白聚合情形的結果圖，其中，顯示為綠色者為絲狀肌動蛋白的結構，而藍色則為細胞核的位置。如圖3所示，未以DMGF處理的SVEC4-10細胞(標示「對照組」者)，其絲狀肌動蛋白的結構明顯呈現「絲狀肌動蛋白互相纏繞扭曲而形成微絲」的情形。而以DMGF處理後的SVEC4-10細胞(標示「DMGF」
者)，其絲狀肌動蛋白呈現複數個點狀，並未有如對照組之絲狀肌動蛋白聚合的情形。其中，絲狀肌動蛋白聚合與細胞遷移相關，且當細胞進行遷移時會有絲狀肌動蛋白聚合的過程，而細胞遷移係為腫瘤轉移的初期步驟，因此，由實驗例四可知，含有DMGF之醫藥組合物確實有抑制絲狀肌動蛋白的聚合之功效，進而可抑制腫瘤轉移。
接種1×106之B16F10細胞於至少三隻8週大的C57BL/6的小鼠(母)，當腫瘤體積為30mm3以上的腫瘤被觀察到時，開始分別注射磷酸鹽緩衝溶液(PBS，作為對照組)、10mg/kg及50mg/kg之DMGF，且每隔三天注射一次，並每隔2~3天量測一次腫瘤大小，所得之結果如圖4所示，圖4為實驗例五中各小鼠之腫瘤體積的結果圖。由圖4可知，經由DMGF處理後之小鼠，其腫瘤體積明顯較未處理DMGF(即注射磷酸鹽緩衝溶液)之小鼠來得小，因此，由實驗例五可知，含有DMGF之醫藥組合物確實可抑制腫瘤細胞的移動，即可抑制腫瘤轉移。
由實驗例五可推知，具有腫瘤的C57BL/6的小鼠可接受之DMGF之劑量範圍大約介於每日每公斤體重10至50毫克之間，即10mg/kg至50mg/kg之間。將小鼠劑量代入人體等效劑量(HED)換算公式「人體等效劑量(mg/kg)=小鼠劑量(mg/kg)×小鼠Km因數÷人體Km因數」，其中，本實驗例之小鼠劑量為10mg/kg至50mg/kg，而小鼠Km因數為3、人體Km因數為37，故可得到人體等效劑量為0.8mg/kg至4mg/kg之間。
取含有數量1×106之老鼠胰臟細胞(mouse splenocyte)的懸浮液，接種於24孔培養皿中，添加濃度1μg/ml之脂多醣(lipopolysaccharide,LPS)，用以誘導老鼠胰臟細胞中的免疫細胞分泌腫瘤壞死因子-α，且分別添加濃度為0、0.3125、0.625、1.25μg/ml的DMGF。添加完前述之化合物後，老鼠胰臟細胞置於37℃的培養箱培養72小時。於此培養的時間中，老鼠胰臟細胞中的免疫細胞受到脂多醣的誘導，進而分泌腫瘤壞死因子-α，且釋出至培養液中。故於培養72小時之後，收取懸浮的培養液，再以檢測腫瘤壞死因子-α的ELISA酵素免疫分析套組，測量培養液中之腫瘤壞
死因子-α的濃度。
圖5為實驗例六中老鼠胰臟細胞分泌之腫瘤壞死因子-α之的結果圖。由圖5可知，未以DMGF處理的老鼠胰臟細胞(標示「0」者)，其腫瘤壞死因子-α的濃度高達200pg/ml，且隨著DMGF使用的劑量提高，腫瘤壞死因子-α的濃度就越低。舉例而言，以濃度1.25μg/ml之DMGF處理的老鼠胰臟細胞，其所分泌的腫瘤壞死因子-α濃度降至60pg/ml。因此，由實驗例六可知，含有DMGF之醫藥組合物確實有抑制免疫細胞分泌腫瘤壞死因子-α以抑制發炎反應。由於發炎作用也與促進腫瘤組織周邊的血管新生及癌細胞的入侵、轉移等多種病理作用密切相關，因此，DMGF之醫藥組合物具有抑制發炎反應之功效，可進而抑制腫瘤轉移。
總和而言，本發明之抑制腫瘤轉移的醫藥組合物，其包含有雙磺酮類化合物DMGF，且DMGF可抑制腫瘤細胞降解透孔培養皿所塗覆之細胞外基質的能力，進而降低腫瘤細胞的轉移速率。另外，從RNA層級來看，DMGF更可有效的抑制基質金屬蛋白酶-2之核醣核酸表現量，而基質金屬蛋白酶-2係為蛋白質水解酶的一種，故抑制基質金屬蛋白酶-2(或蛋白質水解酶)的表現量，進而可抑制腫瘤細胞降解細胞外基質的能力，以達抑制腫瘤轉移之功效。
除此之外，DMGF亦可有效的抑制絲狀肌動蛋白聚合，以抑制腫瘤轉移的移動過程。以及，DMGF可有效的抑制免疫細胞分泌腫瘤壞死因子-α以抑制發炎反應，進而避免腫瘤細胞的入侵及轉移。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
Claims (3)
- 一種雙磺酮類化合物DMGF用於製備抑制腫瘤轉移的醫藥組合物之用途，其中該雙磺酮類化合物DMGF係抑制腫瘤細胞之降解細胞外基質的能力、抑制基質金屬蛋白酶-2的表現、抑制絲狀肌動蛋白的聚合，或抑制腫瘤細胞之蛋白質水解酶的表現，而抑制腫瘤轉移，且該雙磺酮類化合物DMGF的劑量係介於每日每公斤體重0.8至4毫克之間。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該腫瘤包括黑色素瘤、肺癌腫瘤或大腸癌腫瘤。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該雙磺酮類化合物DMGF係抑制免疫細胞分泌腫瘤壞死因子-α以抑制發炎反應進而抑制腫瘤轉移。
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| 黃嘉祥，"源自曼地亞紅豆杉(Taxus x media cv. Hicksii)抗癌化合物之篩選與特性探討"， 國立清華大學博士論文，2011年（國家圖書館上架日：2012年9月28日） * |
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