TWI564390B - 熱穩定角蛋白酶及其用途 - Google Patents

Description

熱穩定角蛋白酶及其用途

本發明涉及一種蛋白酶，且更特定為由台灣嗜熱菌(Meiothermus Taiwanesis)分離之微生物角蛋白酶。

角蛋白，一種纖維結構蛋白之家族，係為皮膚、毛髮、毛料、指甲、鱗片、及羽毛之重要結構組成。角蛋白多胜肽係為不可溶且可抵抗多數蛋白酶。環境中不可溶角蛋白，多以羽毛及毛髮之形式存在，其累積變成一種固態廢棄物管理之議題。

角蛋白酶可有效率地降解角蛋白。因此，角蛋白酶可用於生物廢棄物的處理使用。在清潔劑及皮革工業中，其可做為特殊酵素以分別移除蛋白質類污漬及毛髮等。該等應用亦可延伸至毛料及絲綢清潔及藥物。近來，角蛋白酶已被廣泛用於增加動物飼料中蛋白質之可消化性。

加熱通常於工業應用中用於加快反應使用。此外角蛋白酶粉末的製備中，其噴霧乾燥過程亦需要加熱。因此，一種熱穩定角蛋白酶將對於該工業十分有助益。

在一方面，本發明涉及一種融合基因，包含：(a)編碼一蛋白分泌訊號胜肽之第一DNA序列，其位於該融合基因之N端；(b)編碼一台 灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶抑制域(inhibitory domain)之第二DNA序列，其與第一DNA序列以可轉譯框架(translation frame)連結；及(c)編碼一台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域(catalytic domain)之第三DNA序列，其與第二DNA序列以可轉譯框架連結，其中該融合基因係為一種非自然存在之嵌合型DNA。

該蛋白分泌訊號胜肽可選自由α-澱粉酶(alpha-amylase)訊 號胜肽、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)訊號胜肽、血清白蛋白(serum albumin)訊號胜肽、菊糖酶(inulinase)訊號胜肽、轉化酶(invertase)訊號胜肽、殺手病毒(killer virus)訊號胜肽、溶菌酶(lysozyme)訊號胜肽、交配型因子α-1(mating factor alpha-1)訊號胜肽、及交配型因子α-2(mating factor alpha-2)訊號胜肽所組成之群組。

本發明之一具體實施例中，該第一DNA序列編碼一種酵母 菌之α因子訊號胜肽。

在另一方面，本發明關於一種蛋白表現載體，包含：(a)前 述之融合基因；及(b)一啟動子，與該融合基因以可轉譯框架連結。該啟動子可選自由乙醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)啟動子、轉譯延伸因子1-α(translational elongation factor 1-α)啟動子、Na⁺-耦聯磷酸鹽共同輸送子(Na⁺-coupled phosphate symporter)啟動子及甲醛去氫酶(formaldehyde dehydrogenase)啟動子所組成之群組。

在另一方面，本發明關於一種含有前述表現載體之宿主細 胞。

在另一方面，本發明關於一種細胞培養物，其包含前述之宿 主細胞及一人工培養基，該宿主細胞分泌台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶之催化域至該人工培養基中。

本發明之另一具體實施例中，該第二DNA序列包含一核苷酸序列，其與SEQ ID NO：11具有至少90%或95%之相同性。

在另一方面，本發明關於一種分離之蛋白酶，包含台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶催化域，該蛋白酶缺少台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶抑制域，以及配製為一片劑(tablet)、囊片(caplet)、小丸(pellet)、膠囊(caspule)、顆粒(granule)、丸劑(pill)、粉末(powder)或藥囊(sachet)、或溶液形式，且不含有細胞培養補充物。本發明之一具體實施例中，該蛋白酶包含一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：14具有至少95%之相同性。

在又另一方面，本發明關於一種用於降解蛋白質類物質之方法，包含：將該蛋白質類物質與有效量之前述蛋白酶接觸。於接觸步驟前，該方法可進一步包含製備台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶催化域之步驟。

此外，本發明關於該融合基因用於製備一前述蛋白酶於降解一蛋白質類物質之用途。

本發明進一步關於前述融合基因於製備一前述蛋白酶用於降解蛋白質類物質之用途。此外，本發明關於前述蛋白酶於製備一組合物用於降解蛋白質類物質之用途。該用途可在高於25℃之溫度施行。於使用前，該蛋白酶可以約高於40℃但低於95℃之溫度進行預處理，或以一pH值 界於3至10之溶液進行預處理，且仍維持其活性。該蛋白類物質可選自由動物飼料、食物、牛奶、酪蛋白、彈性蛋白、皮膚、毛髮、毛料、絲、指甲、鱗片、纖維、皮革、羽毛所組成之群組。

在更另一方面，本發明關於一種製備台灣嗜熱菌(M. taiwanensis)WR-220角蛋白酶催化域之方法，包含(ai)培養前述之宿主細胞於一培養基中，其在允許台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶的表現且分泌該催化域其進入培養基之條件下培養；或(aii)培養一轉型具有包含一編碼台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶的抑制域及催化域之DNA插入片段的表現質體之宿主細胞，其在允許台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶的表現且分泌該催化域其進入培養基之條件下培養；及(b)移除該宿主細胞以獲得含有台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶催化域之上清液；及(c)從該上清液中分離出該催化域，或藉由噴霧乾燥法或其他方法來將脂質從上清液中去除，以得到固體形式之催化域。

在又另一方面，本發明關於一種分離之蛋白酶，包含台灣嗜 熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶催化域且缺乏抑制域，該蛋白酶係藉由前述方法製備。

本發明之另一具體實施例中，該抑制域包含一胺基酸序列， 其與SEQ ID NO：13具有至少95%之相同性；以及該催化域包含一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：14具有至少95%之相同性。或者，該抑制域包含一如SEQ ID NO：13之胺基酸序列，以及該催化域包含一如SEQ ID NO：14之胺基酸序列。

該等與其他方面將藉由下述較佳具體實施例，並搭配以下圖 式得以更明晰，雖然其中可存在各種變動及修改，但仍不背離本發明新穎觀念之精神及範疇。

所附之圖式用於闡述本發明之一個或多個具體實施例，且與 所揭露之說明書，用於解釋本發明之原理。有可能的是，用於圖式中之相同代號，可能係指具體實施例中之相同或相似元件。

圖1A-圖1C顯示台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220對於 完整雞隻之羽毛的降解能力。圖1A顯示於第0天時，含有作為碳及氮源之羽毛的培養基係為澄清的。於第2天，該混濁之培養基顯示羽毛的降解及微生物之生長。圖1B顯示殘留於培養基中之羽毛。圖1C顯示分別經台灣嗜熱菌處理或沒有處理之殘留羽毛重量(圖1C左)，或殘留於培養基中不可溶殘留物之重量，及於培養上清液中由降解的羽毛所得可溶游離胺基酸量(圖1C右)。

圖2A-圖2B顯示由台灣嗜熱菌WR-220所分泌之胞外蛋白酶於蛋白電泳之片段以及於酶譜(zymography)檢驗，其角蛋白酶活性區域為染色洋菜膠複製培養(agarose replica)中澄清之區域。(圖2A)4-20%梯度之聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)以SYPRORUBY^TM染色。(圖2B)1%洋菜膠於角蛋白/酪蛋白粉末中。

圖3為蛋白電泳之圖片，顯示該重組角蛋白酶之分子量係小於30KDa。

圖4為一系列圖片，顯示該重組角蛋白酶，對於牛奶、酪蛋白、彈性蛋白、及羽毛的蛋白質具有寬廣範圍之蛋白水解活性。角蛋白酶用量0μg、1μg、2μg、4μg、8μg及16μg分別以a、b、c、d、及e標示。

圖5A-圖5B之圖片顯示角蛋白酶之熱及pH耐受性。圖5A為一澄清區域環繞在碟形濾紙周遭，其顯示蛋白酶之活性。相對之加熱溫度係標示於近濾紙處。圖5B顯示相對之pH值係標示於靠近長形濾紙處。

圖6顯示該蛋白酶活性於紙上杯碟瓊脂擴散測定法(paper disk-agar diffusion assay)的結果。將8個選擇之酵母菌選植株(第5天)之培養上清液係收集以進行蛋白酶活性分析。

圖7顯示該8個選擇之酵母菌選植株(No.2、3、5、7、8、9、10及12)之培養上清液的SDS-PAGE電泳圖。D1、D2、D3及D5，係分別代表第1、2、3及5天。

圖8A顯示該SPR2261基因(SEQ ID NO：3)之核苷酸序列。該選殖部分係以粗體表示。其預測的分泌蛋白之訊號胜肽係以斜體表示。

圖8B顯示SPR2261基因(SEQ ID NO：4)之胺基酸序列。該預測的分泌蛋白之訊號胜肽係以斜體表示，該預測的抑制域係以底線表示，以及角蛋白酶之活性形式(催化域)僅以粗體表示。

圖9A顯示該角蛋白酶(SEQ ID NO：5)之選殖DNA序列。該第一個甲硫胺酸(methionine)(起始密碼子)係以底線標示，該抑制域以非粗體標示，該截斷型之角蛋白酶活性形式(催化域)僅以粗體表示，及一用於純化之融合標記係以斜體標示。

圖9B顯示由台灣嗜熱菌WR-220分離之選殖角蛋白酶(SEQ ID NO：6)之胺基酸序列。第一個甲硫胺酸(起始密碼子)係以底線標示，該抑制域以非粗體標示，該截斷型之角蛋白酶活性形式僅以粗體表示，及一用於蛋白純化之融合標記係以斜體標示。

圖10A-圖10B顯示該pHTPY2_spr2261ic(SEQ ID NO：7)之質體構築體的核苷酸序列，及其對應之角蛋白酶的蛋白質序列(SEQ ID NO：8)。(圖10A)該基因之α因子係以底線標示，LIC選殖位置係以斜體標示，插入的spr2261ic(包含抑制及催化域)係以粗體及斜體標示，及具有一中止密碼子的8xHis標記僅以粗體標示。(圖10B)該對應之表現蛋白序列(SEQ ID NO：8)包含該α因子(SEQ ID NO：15)係以底線標示，該抑制域僅以斜體標示，該催化域係以粗體及斜體標示，及8xHis標記係以粗體標示。

圖11A-圖11B顯示pHTPY2_spr2261c(SEQ ID NO：9)之質體構築體的核苷酸序列，及其對應之角蛋白酶的蛋白質序列(SEQ ID NO：10)。(圖11A)該α因子係以底線標示，LIC選殖位置係以斜體標示，插入的spr2261c(僅含有催化域，而不含有抑制域)係以粗體及斜體標示，及8xHis標記(具有一中止密碼子)係以粗體標示。(圖11B)該對應之表現蛋白序列包含該α因子係以底線標示，該催化域係以粗體及斜體標示，及8xHis標記係僅以粗體標示，但無包含該抑制域。

圖12A-圖12B為圖畫模組，顯示該台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶之結構研究結果。圖12A顯示該兩個角蛋白酶之結構，係以亮灰色及暗灰色分別表示之。該黑色盒框中亮標處為活性區域，以及重要之活性位置殘基，Ser224(係指SEQ ID NO：14)係以桿狀模型表示。由其中一個角蛋白酶來之連結 區域(亮灰色)係位於另一個角蛋白酶(暗灰色)之活性區域中。圖12B為角蛋白酶之活性位置之近觀。該活性位置殘基(Asp39、His72及Ser224)及與受質交互作用之殘基位置係予以標示。

用於本文中之術語，於本發明之內容及特定文段所使用之每 一個術語，一般具有其於該領域中原具有之意義。部分術語係用於描述於下敘明的本發明，或於說明書中任一處，以提供實施者額外指引以了解本發明之說明。為了便於瀏覽，部分術語可能以亮標標示，例如使用斜體及/或引號。使用亮標並不影響該術語之範疇及意義；於相同內容中，該術語之範疇及意義仍為相同，無論其有無被亮標。可被理解的是相同事務可被以多於一種方式述說。同理的，其他語言及同義詞可被用於本文中任一種或多種術語，且無論於本文中有無詳述或討論一術語，皆無特別之影響。 用於部分術語之同義詞係予以提供。一種或多種同義詞之詳述不排除其他同義詞之使用。於說明書任一處所用之實施例，包含任何本文所述之實施例係僅用於闡述之目的，並不用於限制本發明或限制任何示例性術語之範疇及意義。相同地，本發明不局限於說明書中所提供之各種具體實施例。

除非另有定義，所有用於本文之技術及科學性術語具有該領 域具有通常技藝者所熟知之相同意義。如有衝突之情形，以本發明，包含定義將予以控制。

於本文所用之「約」、「約略」或「近乎」一般應代表所給予 之數值或範圍的20%以內，較佳為10%以內。以及更佳為5%以內。本文所給予之數量為近似值，意指該術語「約」、「約略」或「近乎」，若未表明仍 可推斷為近似值。

蛋白分泌訊號胜肽決定蛋白分泌之效率。該等包括，但不限 於α-澱粉酶訊號胜肽(SEQ ID NOs：17、18)、葡萄糖澱粉酶訊號胜肽(SEQ ID NOs：19、20)、血清白蛋白訊號胜肽(SEQ ID NOs：21、22)、菊糖酶訊號胜肽(SEQ ID NOs：23、24)、轉化酶訊號胜肽(SEQ ID NOs：25、26)、殺手病毒訊號胜肽(SEQ ID NOs：27、28)、溶菌酶訊號胜肽(SEQ ID NOs：29、30)、交配型因子α-1訊號胜肽(SEQ ID NOs：31、32)、及交配型因子α-2訊號胜肽(SEQ ID NOs：33、34)。

本文所使用之「台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶抑制域」係指 一胺基酸序列具有與SEQ ID NO：13至少90%相同性。因此，於本文所使用之「台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶抑制域」包含野生型或突變的台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶抑制域，其中該突變抑制域包含一胺基酸序列具有與SEQ ID NO：13至少90%相同性。

本文所使用之「台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域」係指 一蛋白酶其包含一胺基酸序列具有與SEQ ID NO：14至少90%相同性。因此，於本文所使用之「台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域」包含野生型或突變之台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域，其中該突變催化域包含一胺基酸序列具有與SEQ ID NO：14至少90%相同性。

台灣嗜熱菌(Meiothermus taiwanensis)WR-220為一種於台 灣發現之嗜熱菌種，生長於溫度範圍55至65℃。該台灣嗜熱菌所產生之蛋白質必須於超過55℃之溫度下保持穩定，此能力使該蛋白質適合於工業使用。

本發明關於台灣嗜熱菌角蛋白酶之發現，其不僅具有一可對 抗熱、酸及鹼性環境的熱穩定，且亦顯示一寬廣範圍之蛋白水解活性。該熱及酸耐受性係適合於工業應用。

本發明進一步關於一種用於重組台灣嗜熱菌WR-220角蛋白 酶作為分泌蛋白之生產的表現質體，其使用甲基營養型之Pichia pastori表現系統，其可由乙醇氧化酶基因之啟動子所調控。P.pastoris本身不會分泌任何內生型之角蛋白酶至培養基中。此外，P.pastoris係一般認為安全的(generally regarded as safe，GRAS)且用於重組角蛋白酶生產具有額外之優勢。

台灣嗜熱菌WR-220被發現可降解羽毛。該相對應之角蛋白 酶相繼被分離且其DNA及胺基酸序列係被鑑定。該具有一融合標記的角蛋白酶係被選殖入一載體中，使用大腸桿菌表現系統以用於重組蛋白之生產。該重組的且截斷的角蛋白酶顯示具有廣泛之蛋白酶活性，其可水解脫脂牛奶、酪蛋白、彈性蛋白、及羽毛中之蛋白質。再者，該重組角蛋白酶不僅對於熱、酸及鹼環境具有高穩定性，且亦具有廣泛之蛋白水解活性，其可適用於工業應用。

抑制域DNA序列：SEQ ID NO：11；催化域DNA序列：SEQ ID NO：12。抑制域蛋白序列：SEQ ID NO：13；催化域蛋白序列：SEQ ID NO：14.。

實施例

根據本發明所給予之下述具體實施例中的示例性設備、裝置、方法及其相關之結果，其並非用於限制本發明之範疇。需注意的是用 於實施例之標題或副標題係便於讀者閱讀，不應以任何方式用於限制本發明之範疇。再者，於此所提出或揭露之部分理論，然而，也不應以任何方式，無論其對或錯，用於限制本發明之範疇；不須考量任何特定理論或作用方式，只要根據本發明可以實施即可。

材料及方法

細胞培養及羽毛降解試驗。台灣嗜熱菌(M.taiwanensis) WR-220為蔡珊珊教授所贈，係在55℃下培養於改良之Thermus培養基(TM培養基)。該改良之TM培養基含有0.3%之蛋白腖(peptone)、0.1%酵母萃取物、0.1%之麩胺酸(glutamic acid)、及1X Castenholtz鹽類(pH 7.8)。為了進行羽毛降解試驗，將1%之隔夜培養物加至該含有3%(w/v)完整的雞羽毛及1X Castenholtz鹽類之培養基中，於55及65℃作用。殘留於培養基中之羽毛重量的改變係藉由將培養過程中不可溶之殘留物進行秤重來檢視。取得該不可溶之殘留物並於濾紙過濾該培養物後進行秤重。從降解羽毛中釋放之胺基酸量係以茚三酮比色法(ninhydrin colorimetric method)量化之(Rosen,H.A“Modified ninhydrin colorimetric analysis for amino acids”Arch Biochem Biophys(1957)67,10-15)。

從台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220中分離出角蛋白酶。 台灣嗜熱菌係培養於4公升之TM培養基中。將培養後之培養基以6,000 x g離心20分鐘，且該上清液係以0.22μm濾紙過濾以移除微生物及不可溶之殘留物。該收集之上清液係使用LABSCALE^TM TFF系統(Millipore,USA)進行濃縮並將緩衝液換成50mL PBS緩衝液(pH 7.4)。藉由137,24 x g超高速離心以移除色素，且該上清液進一步使用Amicon-Ultra 15離心過濾裝置以濃 縮成2ml。該濃縮後之樣本係裝填至預先以50mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)平衡之1ml資源S管柱中(resource S column，GE Healthcare，USA)。該蛋白係在50mM醋酸鈉緩衝液(pH 5.0)中以NaCl由0至1M之線性梯度予以沖提。收集每一沖提片段並使用酶譜法分析羽毛降解能力。

酶譜法及角蛋白酶之胺基酸序列鑑定。將每一個色譜片段中 之蛋白質進一步以4至20% SDS-PAGE及Laemmli法(Laemmli,U.K.“Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”Nature(1970)227,680-685)進行分離。該SDS-PAGE係以1.5% Triton X-100溶液清洗兩次，其可使得於SDS-PAGE中之標的細胞外蛋白酶得以保留其活性以供進一步之酶譜法試驗。該復性膠體係於PBS緩衝液中放置於含有角蛋白/酪蛋白粉末之1%洋菜膠上。蛋白水解活性之區域即為染色洋菜膠體中澄清區域。該蛋白水解活性之區域中之蛋白質係以標準蛋白體學分析法鑑定，並使用台灣嗜熱菌之基因體序列作為參考(吾人未發表之結果，NCBI生物計畫提交ID：SUB251796及生物計畫ID：PRJNA205607)。該蛋白質體學分析指出該標記SPR2261係最有可能為角蛋白酶。

將角蛋白酶基因進行分子選殖至蛋白表現載體。使用標準苯 酚萃取方法萃取該染色體DNA，並使用phusion快速高保真度之PCR反應混合物(phusion flash high-fidelity PCR master mix，Thermo Scientific,USA))以增幅角蛋白酶基因，其正向引子為5’TTA AGA AGG AGA TAT ACC ATG CTA GCC CCG GTG CTA GGA；SEQ ID NO：1及反向引子為5’GAT TGG AAG TAG AGG TTC TCT GC G TAA TTG CTG TAC AGC AGC AGG TTG； SEQ ID NO：2。用於選殖目的之位置係以底線表示。該PCR產物係藉由電泳予以純化，並於dGTP存在下以T4 DNA聚合酶處理。該修飾後之pET9載體其含有對應之接合獨立選殖位置、TEV蛋白酶位置、及兩個親和性標記(6xHis及Strep)，係以phusion快速高保真度之PCR反應混合物增幅後，並接著以dpnI處理(Thermo Scientific,USA)，並以PCR純化套組(Geneaid,Taiwan)進行純化。該線性化之載體接著於dCTP存在下以T4 DNA聚合酶處理(Thermo Scientific,USA)。該角蛋白酶基因與該載體係進行黏合並轉型入大腸桿菌DH5α中。由成功的轉殖株萃取出編碼角蛋白酶之質體，並進行DNA序列分析，且該轉譯之蛋白質序列係列於圖8B(SEQ ID NO：4)中。

酵素純化及製備。該含有角蛋白酶之質體係轉型至大腸桿菌(DE3)ArticExpress細胞中，並於含有50μg/mL康黴素(kanamycin)及10μg/mL四環黴素(tetracycline)之20mL的TB(terrific broth)培養基中於37℃整夜培養。該培養物係轉移至1L之TB培養基中，其含有抗生素、5%乳糖及0.5%葡萄糖，置於37℃培養4小時，接著冷卻至20℃以進行整夜表現。該細胞係藉由6000 x g離心30分鐘予以收穫並以溶解緩衝液(20mM咪唑(imidazole)、250mM NaCl、及50mM HEPES，pH 8.0)及DNase I(5μg/mL)及溶菌酶(1mg/mL)於冰上重新懸浮30分鐘。該細胞係藉由超音波予以破碎，接著以20000 x g離心30分鐘。該上清液裝填至一2mL之Ni Sepharose(GE healthcare)管柱中，其係先以20mL溶解緩衝液進行平衡。該管柱以25mL清洗緩衝液(50mM咪唑、250mM NaCl、及50mM HEPES、pH 8.0)清洗。該角蛋白酶係以10mL沖提液(250mM咪唑、250mM NaCl、及50mM HEPES、pH 8.0)予以沖提。洗提出之角蛋白酶係以含有10mM CaCl₂、150mM NaCl及50mM HEPES、pH8.0之溶液進行透析，並濃縮至約10mg/mL。該重組角蛋白酶之分子量係以蛋白電泳及MS質譜儀測定。

結晶、數據收集、及結構決定。於19℃，使用坐滴氣相擴 散法(sitting drop vapor diffusion method)使該角蛋白酶結晶於0.2M硫酸鋰(lithium sulfate)、0.1M醋酸鈉及50% PEG400中。於數據收集前，將結晶於液態氮中快速冷卻。X光繞射數據係於國家同步輻射研究中心(National Synchrotron Radiation Resource Center)中之15A光束線以ADSC Q315偵測器於100K予以收集。數據係使用HKL2000程式套組予以處理。該角蛋白酶之結構係使用該Aqualysin I(PDB ID：4DZT)之結晶結構藉由分子替換予以判定。模型係於COOT軟體中反覆重建並於Refmac5套件中改進。

紙上杯碟瓊脂擴散法用於分析角蛋白酶及蛋白酶活性。蛋白 酶或角蛋白酶活性係藉由含有1%脫脂牛奶、1%酪蛋白、1%彈性蛋白、或1%羽毛粉末於150mM NaCl₂、10mM CaCl₂及50mM CHES緩衝液(pH8.6)之1%洋菜膠予以測量。將浸泡有角蛋白酶之杯碟形濾紙輕輕地壓在洋菜膠表面，並置於55℃。環繞在每一碟形周圍之澄清區域即表示蛋白酶或角蛋白酶活性。

熱及pH耐受性試驗。為了進行該熱耐受性試驗，角蛋白酶 溶液(1.6mg/mL於含有10mM CaCl₂、150mM NaCl及50mM HEPES pH8.0之溶液)係於對應溫度加熱2分鐘。為了進行該pH耐受性試驗，角蛋白酶溶液(1.6mg/mL)製備於一含有10mM CaCl₂及100mM對應之緩衝液(磷酸鹽，pH 2.0；檸檬酸，pH 3.0；檸檬酸，pH 4.0；磷酸鹽，pH 5.0；磷酸鹽，pH 6.0；磷酸鹽，pH 7.0；HEPES，pH 8.0；TAPS，pH 8.0；硼酸鹽，pH 9.0； CAPS(3-cyclohexylamino-1-propanesulfonic acid)，pH 10.0；CAPS，pH 11.0)之溶液中。剩餘的蛋白酶活性係藉由紙上杯碟瓊脂擴散法及5%脫脂牛奶洋菜膠盤予以檢測。

重組質體構築。該pHTPY2載體係藉由移除其選殖、TEV、 及部分6x His標記，並於α因子訊號序列、Kex2訊號切割位置、及Ste13訊號切割位置後右側插入經設計之接合獨立位置、TEV及8xHis標記予以修改(Wang et al.“Parallel Gene Cloning and Protein Production in Multiple Expression Systems”Biotechnol Progr(2009)25,1582-1586)。兩種不同之重組的台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶基因構築體係以PCR增幅並接合至修改後之pHTYP2。其中之一，pHTPY2_spr2261ic，含有抑制域及催化域(圖10A-B)及另一個，pHTPY2_spr2261c，僅含有催化域(圖11A-B)。該等重組質體pHTPY2_spr2261ic及pHTPY2_spr2261c於具有25μg/ml吉歐黴素(zeocin)低鹽LB洋菜膠盤上轉型入大腸桿菌DH5α中。該陽性轉殖株係藉由轉殖株PCR予以確認，並藉由DNA定序以確定其序列。

轉型。約35μg質體係以pmeI線性化，並於電穿孔法轉型至 P.pastoris X33菌株前，先以乙醇沉澱純化。該陽性轉殖株係從含有100μg/ml吉歐黴素之YPDS(Yeast Extract Peptone Dextrose Sorbitol)盤中於30℃挑出，並藉由MD/MM盤方法確定之。

小量角蛋白酶之生產。該陽性轉植株係培養於5ml之含有 100μg/ml吉歐黴素之YPD培養基中並於29℃黑暗中以300rpm進行攪拌。直到OD600達到2-6後，藉由離心收集細胞，並以含有100μg/ml青黴素(ampicillin)之BMM培養基(1.34% YNB、4 E-5%生物素(biotin)、0.5% 甲醇及100mM磷酸鉀，pH 5.0)稀釋，直到OD600值達到2。細胞係培養於30℃，並以300rpm進行攪拌。經一天培養後，該培養基係每日補充甲醇至終濃度為0.5%。該培養之上清液係每24小時收集直到第5天，並儲存於4℃。

SDS-PAGE及質譜分析。於480μl培養上清液中之蛋白質係藉 由加入120μl的100%三氯醋酸(trichloroacetic acid，TCA)於冰上沉澱10分鐘，接著進行離心。該沉澱物係以200μl之冷的丙酮清洗三次，並於進行SDS-PAGE電泳前在95℃培養5-10分鐘以移除剩餘之丙酮。於SDS-PAGE上觀察到之條帶於進行質譜特徵分析前，係以膠內胰蛋白分解予以處理。

紙上杯碟瓊脂擴散法分析經熱/pH前處理後之蛋白酶活性。 蛋白酶活性係藉由補充有溶於150mM NaCl₂、10mM CaCl₂及50mM HEPES緩衝液(pH8.0)之1%脫脂奶粉的1%洋菜膠予以偵測。將浸泡有培養後上清液之杯碟形濾紙輕輕地壓在洋菜膠表面，並置於55℃。環繞在每一碟形周圍之澄清區域即表示蛋白酶或角蛋白酶活性。

結果

台灣嗜熱菌WR-220之角蛋白酶活性

台灣嗜熱菌WR-220係與作為唯一養分之來源之不可溶羽毛共同培養於培養基中。混濁之培養基及羽毛之減少顯示發生降解作用(圖1A)，推測台灣嗜熱菌可產生酵素以消化羽毛(圖1)。進一步發現台灣嗜熱菌WR-220於2天內在55℃及65℃下可降解一半之3%羽毛並由羽毛中釋放游離胺基酸(圖1A-C)。

分離及鑑定角蛋白酶

台灣嗜熱菌係由生長培養基中移除，並進一步發現該角蛋白 酶之活性係存在於培養基中，推測角蛋白酶係以分泌形式被產生。總蛋白質係使用離子交換層析管柱由培養基予以分級(fractionated)。該分級後之蛋白質係進一步以蛋白電泳分離，接著進行酶譜法(圖2A-B)。該酶譜法清楚顯示於膠體多數區域可消化角蛋白/酪蛋白。吾人接著應用蛋白質體學方法以鑑定出於該等區域之蛋白質，藉由使用吾人的台灣嗜熱菌WR-220基因體序列結果(NCBI生物計畫提交ID：SUB251796)做為參考。該轉譯後之胺基酸序列係由預測之訊號胜肽、預測之抑制域及預測之催化域所組成，如圖8B所示(SEQ ID NO：4)。該交叉比對顯示該基因SPR2261係為可能的台灣嗜熱菌WR-220之角蛋白酶(圖8A；SEQ ID NO：3)，然而，該催化核心之序列僅與已知之角蛋白酶(源自Bacillus lifeniformis)享有約39%之相同性。

藉由大腸桿菌表現系統生產重組的角蛋白酶

該角蛋白酶基因(SPR2261)係以PCR增幅並選殖入含有一 起始密碼子及一用於大腸桿菌表現系統之融合標記的表現質體中(圖9A，SEQ ID NO：5)。該具有一預期分子量約為41.5KDa的重組角蛋白酶係表現於大腸桿菌BL21(DE3)Arctic細胞，並藉由親和性層析法純化。該蛋白電泳結果顯示該純化蛋白之分子量約為28.5kDa，推測為一截短型之選殖角蛋白酶(圖3)，其係與ESI-MS質譜儀所發現之28,468 Dalton一致。吾人進一步藉由蛋白質結晶圖像之角蛋白酶結構分析顯示截短型重組角蛋白酶起始於選殖之胺基酸序列中第102個殘基(圖9B，SEQ ID NO：6)。

重組角蛋白酶之廣泛蛋白酶活性及熱/pH前處理

該截短型重組角蛋白酶顯現了寬廣範圍之蛋白水解活性，其 不僅降解羽毛中之蛋白質，亦包含牛奶、酪蛋白及彈性蛋白中之蛋白質(圖4)。該重組角蛋白酶經加熱至95℃或先以酸性或鹼性溶液前處理後仍保有活性(圖5A-B)。

台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶基因選殖以用於酵母菌表現系統

該角蛋白酶之抑制及催化域基因(spr2261ic)及角蛋白酶之催化域之基因(spr2261c)，係分別與酵母菌之α因子訊號胜肽(SEQ ID NO：15)融合，其可使角蛋白酶分泌至培養基中。該構築之質體含有spr2261ic及spr2261c，係分別命名為pHTPY2_spr2261ic及pHTPY2_spr2261c(圖10及11)。該融合基因轉錄係由乙醇氧化酶1啟動子(alcohol oxidase 1 promoter，AOX1)的調控。該插入之基因係以DNA定序確認。

藉由P.pastoris X-33菌株生產重組角蛋白酶

挑選12個含有pHTPY2_spr2261ic之陽性轉殖株以進行重組角蛋白酶之生產。12個中之8個轉植株經培養，8個中之5個的培養上清液於紙上杯碟瓊脂擴散法中顯示蛋白酶活性，表示角蛋白酶係被產出(圖6)。該培養之上清液之SDS-PAGE電泳顯示兩條主要之蛋白條帶(圖7)。隨後之質譜特徵分析顯示兩個蛋白條帶含有台灣嗜熱菌角蛋白酶之催化域。基於吾人經驗及結晶結構，吾人相信於較上方之條帶中的蛋白質為具有連結子及8xHis標記之催化域，以及於較下方之條帶僅為催化域。該預測之蛋白分子量係基於SDS-PAGE上之條帶位置，顯示於蛋白生產過程中抑制域被移除。此結果係相似於使用大腸桿菌表現系統生產之角蛋白酶。該數據顯示由具有吾人構築之質體的P.pastoris所生產之主要分泌蛋白為台灣嗜熱菌角 蛋白酶之催化域。

重組角蛋白酶抑制域之需要以用於重組角蛋白酶生產

雖然該構築pHTPY2_spr2261ic質體含有抑制域及催化域， 該分泌蛋白顯示沒有N端抑制域之貼附。此現象於使用大腸桿菌表現系統生產台灣嗜熱菌角蛋白酶時已被觀察到。再者，該構築的pHTPY2_spr2261c質體不含有抑制域以致於無法生產角蛋白酶，推測抑制域是生產蛋白所需要者，雖然最終產物不含有該抑制域。

台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶之結構分析

吾人台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶之結晶結構顯示部分連結 子區域與催化域連結，且該His融合標記係位於鄰近角蛋白酶催化域之活性位置中(圖12A)。此數據顯示Ser221、His72及Asp39係為催化殘基(圖12B；僅有催化域殘基以號碼表示；該第一個殘基為Ala且第二個為Thr；SEQ ID NO：14)。再者，結構分析顯示Gly103、Ser104、Gly105、Ser106、Leu131、Gly132、Gly133、Gly134、Ala156、Gly158、Asn159、Ser221、Gly222、Thr223及Met225係涉及受質(substrate)之交互作用(圖12B)。該序列顯示於圖10B、11B中係由酵母菌系統中所生產。該結構分析係使用大腸桿菌表現系統所生產之角蛋白酶予以進行。該使用於酵母菌表現系統之連結子序列為GNLYFQS(SEQ ID NO：16)。於大腸桿菌系統中，該殘基G係以E取代。

本發明前述說明之示例性具體實施例僅用於闡述之目的及 說明，並非用於耗盡或限制本發明至所揭露之精確的形式。可藉由上述教示進行各種修改及變動。

所挑選之具體實施例及示例，用於說明及解釋本發明之原理 及其實際應用，可讓該領域具有技藝者可利用本發明及各種具體實施例，以及各種修改以適用於特定預期之用途。對於該等於該領域中具有技藝者，其他具體實施例也可藉由本發明得以明晰，且不背離本發明之精神及範疇。因此，本發明之範疇係藉由所附之申請專利範圍定義，而非由前述說明及其中說明之示例性具體實施例來定義。

部分參考文獻，可能包括專利、專利申請案、及各類發表文獻，皆引用及討論於本文之說明書中。引用及/或討論該等參考文獻，僅用於使本發明說明清楚，而不應認為該等參考文獻為本發明之「先前技術」。說明書中所引用及討論之所有參考文獻皆以全文引用的方式併入，其引用程度就如同將每一個參考文獻個別地以全文引用的方式併入。

<110> 中央研究院

<120> 熱穩定角蛋白酶及其用途

<130> 10011-00010

<150> 61859720

<151> 2013-07-29

<160> 34

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 1209

<212> DNA

<213> 台灣嗜熱菌(Meiothermus taiwanensis sp.nov.)

<400> 3

<210> 4

<211> 402

<212> PRT

<213> 台灣嗜熱菌(Meiothermus taiwanensia sp.nov.)

<400> 4

<210> 5

<211> 1203

<212> DNA

<213> 台灣嗜熱菌(Meiothermus taiwanensis sp.nov.)

<400> 5

<210> 6

<211> 400

<212> PRT

<213> 台灣嗜熱菌(Meiothermus taiwanensis sp.nov.)

<400> 6

<210> 7

<211> 4666

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pHTPY2_spr2261ic

<400> 7

<210> 8

<211> 490

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pHTPY2_spr2261ic對應之表現蛋白

<400> 8

<210> 9

<211> 4363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pHTPY2_spr2261c

<400> 9

<210> 10

<211> 389

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> pHTPY2_spr2261c對應之表現蛋白序列

<400> 10

<210> 11

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 抑制域DNA

<400> 11

<210> 12

<211> 834

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 催化域_DNA

<400> 12

<210> 13

<211> 100

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抑制域

<400> 13

<210> 14

<211> 278

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 催化域

<400> 14

<210> 15

<211> 90

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α因子

<400> 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 連接子序列

<400> 16

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> α-澱粉酶訊號胜肽

<400> 17

<210> 18

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> α-澱粉酶訊號胜肽

<400> 18

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖澱粉酶訊號胜肽

<400> 19

<210> 20

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 葡萄糖澱粉酶訊號胜肽

<400> 20

<210> 21

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> 血清白蛋白訊號胜肽

<400> 21

<210> 22

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 血清白蛋白訊號胜肽

<400> 22

<210> 23

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 菊糖酶訊號胜肽

<400> 23

<210> 24

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 菊糖酶訊號胜肽

<400> 24

<210> 25

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉化酶訊號胜肽

<400> 25

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轉化酶訊號胜肽

<400> 26

<210> 27

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 病毒毒殺訊號胜肽

<400> 27

<210> 28

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 病毒毒殺訊號胜肽

<400> 28

<210> 29

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 溶菌酶訊號胜肽

<400> 29

<210> 30

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 溶菌酶訊號胜肽

<400> 30

<210> 31

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 交配型因子α-1訊號胜肽

<400> 31

<210> 32

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 交配型因子α-1訊號胜肽

<400> 32

<210> 33

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 交配型因子α-2訊號胜肽

<400> 33

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 交配型因子α-2訊號胜肽

<400> 34

Claims (18)

1. 一種融合基因，其包含：(a)編碼一蛋白分泌訊號胜肽之第一DNA序列，其位於該融合基因之N端，其中該第一DNA序列編碼一酵母菌α因子訊號胜肽；(b)編碼一台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶抑制域(inhibitory domain)之第二DNA序列，其與第一DNA序列以可轉譯框架(translation frame)連結；及(c)編碼一台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域(catalytic domain)之第三DNA序列，其與第二DNA序列以可轉譯框架連結，其中該融合基因係為一種非自然存在之嵌合型DNA，以及該抑制域包含一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：13具有至少95%之相同性；以及該催化域包含一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：14具有至少95%之相同性。
2. 如申請專利範圍第1項之融合基因，其中該抑制域包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，及/或該催化域包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
3. 一種融合基因，其係由編碼台灣嗜熱菌(M.taiwanensis)WR-220角蛋白酶抑制域(inhibitory domain)之SEQ ID NO：13的胺基酸序列之DNA序列以及編碼台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域(catalytic domain)之SEQ ID NO：14的胺基酸序列之DNA序列所組成。
4. 一種蛋白表現載體，其包含：(a)如申請專利範圍第1或2項之融合基因；及 (b)一啟動子，係與該融合基因以可轉譯框架連結。
5. 如申請專利範圍第4項之蛋白表現載體，其中該啟動子係選自由乙醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)啟動子、甘油醛磷酸脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase)啟動子、轉譯延伸因子1-α(translational elongation factor 1-α)啟動子、Na⁺-耦聯磷酸鹽共同輸送子(Na⁺-coupled phosphate symporter)啟動子及甲醛去氫酶(formaldehyde dehydrogenase)啟動子所組成之群組。
6. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第4或5項所述之表現載體。
7. 一種細胞培養物，其包含：(a)一人工培養基；以及(b)如申請專利範圍第6項所述之宿主細胞，該宿主細胞分泌台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域至該人工培養基中。
8. 一種經分離的蛋白酶，其包含台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域之SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
9. 如申請專利範圍第8項之蛋白酶，其係由SEQ ID NO：14的胺基酸序列所組成。
10. 一種蛋白酶用於製備降解角蛋白質類物質的組合物之用途，該蛋白酶係台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域，其中該催化域包含一胺基酸序列，其與SEQ ID NO：14具有至少95%之相同性。
11. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該蛋白酶係以高於40℃但低於95℃之溫度進行前處理，且仍維持其活性。
12. 如申請專利範圍第10項之用途，其中該蛋白酶係以一具有pH值界於3至10之溶液進行前處理，且仍可保有其活性。
13. 如申請專利範圍第10、11或12項之用途，其中該角蛋白質類物質係選自由皮膚、毛髮、毛料、絲、指甲、鱗片、纖維、皮革及羽毛所組成之群組。
14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該蛋白酶尚可用於降解食物、牛奶、酪蛋白或彈性蛋白，或用於增加動物飼料中蛋白質之可消化性。
15. 一種用於製備台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域之方法，其包含：(a)培養該申請專利範圍第6項之宿主細胞於一培養基中，其在允許台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶的表現且分泌該催化域其進入培養基之條件下培養；(b)移除該宿主細胞以獲得含有台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域之上清液；及(c)從該上清液中分離出該催化域，或乾燥該上清液以獲得固體形式之催化域。
16. 一種蛋白表現載體，其包含：(a)如申請專利範圍第3項之融合基因；及(b)一啟動子，係與該融合基因以可轉譯框架連結。
17. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第16項所述之表現載體。
18. 一種用於製備台灣嗜熱菌WR-220角蛋白酶催化域之方法，其包含：(a)培養該申請專利範圍第17項之宿主細胞於一培養基中，其在 允許產生該催化域之條件下培養；及(b)收集該培養的宿主細胞，以從中獲得該催化域。