TWI544931B

TWI544931B - 對流行性感冒ｈ５血球凝集素之主要中和抗原決定部位有特異性之單株抗體

Info

Publication number: TWI544931B
Application number: TW100130161A
Authority: TW
Inventors: 普瑞巴克倫慕肯; 何放; 惠信吉米關
Original assignee: 淡馬錫生命科學研究院公司
Priority date: 2010-08-23
Filing date: 2011-08-23
Publication date: 2016-08-11
Also published as: CN103180341A; EP2609113B1; US8992929B2; SG187769A1; EP2609113A4; AU2010359618B2; CN103180341B; WO2012026878A8; JP6101204B2; WO2012026878A1; JP2013538056A; TW201216981A; AU2010359618A1; EP2609113A1; US20130202608A1

Description

對流行性感冒H5血球凝集素之主要中和抗原決定部位有特異性之單株抗體

[序列提交]

本申請案連同電子格式之序列表一起歸檔。序列表題名為2577_203_Sequence_Listing.txt，在2010年8月20日創建。序列表之電子格式的資訊以全文引用的方式併入本文中。

本發明係關於對流行性感冒H5血球凝集素之主要中和抗原決定部位有特異性之鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體及其活性片段。本發明亦係關於使用此等鼠類或嵌合或人類化單株抗體或其片段防治及治療H5N1流行性感冒之方法及組合物。

在本文中用於闡明本發明之先前技術或提供關於實踐之其他詳情的出版物及其他材料以引用的方式併入本文中，且為方便起見分別聚集在文獻目錄中。

新近出現之A型流行性感冒病毒之H5N1病毒株及由其引起之人類高死亡率已引起對未來流行性感冒大流行之可能性的關注。針對傳播性H5N1病毒株之預防及治療措施已在全球受到許多關注及作出諸多努力以預防另一大流行暴發。目前的疫苗策略已因流行性感冒病毒株之抗原性變異而受到阻礙。倘若發生大流行，則目前的需要內源性合成抗體之疫苗策略將不會提供針對H5N1感染之即刻保護。當前許可之抗病毒藥物包括M2離子通道抑制劑(金剛乙胺(rimantidine)及金剛烷胺(amantidine))及神經胺酸酶(neuraminidase)抑制劑(奧司他偉(oseltamivir)及紮那米韋(zanamivir))。已知H5N1病毒對M2離子通道抑制劑具有抗性(Beigel等人,2005)。正在分離較新H5N1病毒株，其亦對神經胺酸酶抑制劑，亦即奧司他偉及紮那米韋具有抗性(Le等人,2005；de Jong及Hien,2006)。神經胺酸酶抑制劑亦需要高劑量及延長治療(de Jong及Hien,2006)，從而增大產生不合需要之副作用的可能性。因此，批准治療流行性感冒之替代性策略。

使用單株抗體(mAb)之被動免疫療法(Passive immunotherapy)已被視為一種治療許多感染性疾病之可行選項。當前，對使用針對流行性感冒病毒之HA1蛋白之中和抗體的治療性方法已有許多關注。此蛋白易於靶向，因為其在病毒之表面上且針對此蛋白之抗體可高效中和病毒。因此，針對H5血球凝集素(HA)之中和抗原決定部位之單株抗體可為人類，尤其處於感染流行性感冒之高風險下的個體(即免疫功能降低(immunocompromised)之患者、嬰兒、幼童或老年人，其不能對主動免疫(active immunization)起充分反應)主動接種疫苗之一種有吸引力的替代物。藉由輸注人類恢復期血清進行之被動免疫伴有流行性感冒大流行期間死亡率降低50%且顯示可有效對抗H5N1流行性感冒A病毒感染(Kong及Zhou,2004；Luke等人,2006)。重要的是任何mAb產物應提供針對傳播性H5N1流行性感冒病毒株之廣泛保護且應防止活體內選擇中和逃避突變體(neutralization escape mutant)。

本發明係關於對流行性感冒H5血球凝集素之主要中和抗原決定部位有特異性之單株抗體及其活性片段。本發明亦係關於使用此等單株抗體或其片段防治及治療H5N1流行性感冒之方法及組合物。

因此，在第一態樣中，本發明提供對流行性感冒H5血球凝集素之主要中和抗原決定部位有特異性之單株抗體及其活性片段，亦即抗原結合片段(在本文中亦稱為抗體片段)。在一實施例中，單株抗體為鼠類單株抗體4C2。在第二實施例中，單株抗體為嵌合或人類化單株抗體。特定言之，嵌合或人類化單株抗體與H5血球凝集素之由鼠類單株抗體4C2所特異性結合的構形抗原決定部位特異性結合。在一實施例中，單株抗體(鼠類單株抗體或嵌合或人類化單株抗體)或其片段與H5血球凝集素(HA)之構形抗原決定部位特異性結合，其中該構形抗原決定部位包含成熟HA蛋白之胺基酸155(Ser)及189(Arg)。在另一實施例中，輕鏈可變區之互補決定區(CDR)(LCDR)位於如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列(在本文中亦稱為HM448828，其為小鼠輕鏈可變區之胺基酸序列)內。在另一實施例中，輕鏈可變CDR之胺基酸序列為：LCDR1：QDISGH(SEQ ID NO:5)；LCDR2：HGT(SEQ ID NO:6)；及LCDR3：VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)。在一實施例中，重鏈可變區之互補決定區(CDR)(HCDR)位於如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列(在本文中亦稱為HM448827，其為小鼠重鏈可變區之胺基酸序列)內。在另一實施例中，重鏈可變CDR之胺基酸序列為：HCDR1：GYTFTTYW(SEQ ID NO:8)；HCDR2：IDPYDSET(SEQ ID NO:9)；及HCDR3：VRGGST VAYFGV(SEQ ID NO:10)。

在一實施例中，編碼HM448828之DNA包含如SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列。在另一實施例中，編碼HM448827之DNA包含如SEQ ID NO:3所示之核苷酸序列。在一實施例中，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列。在另一實施例中，重鏈可變區包含如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列。在一實施例中，重鏈及輕鏈恆定區係藉由標準選殖技術自產生人類抗體之細胞獲得。在另一實施例中，人類重鏈恆定區為人類IgG1重鏈恆定區。在另一實施例中，人類IgG1重鏈恆定區包含如SEQ ID NO:22(GenBank寄存編號AAX09634.1)所示之胺基酸序列。在另一實施例中，編碼此胺基酸序列之核酸序列如SEQ ID NO:21(GenBank寄存編號AY885218.1)所示。在一實施例中，人類輕鏈恆定區為人類κ輕鏈恆定區。在另一實施例中，人類κ輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO:24(GenBank寄存編號AAA58989.1)所示之胺基酸序列。在另一實施例中，編碼此序列之核酸如SEQ ID NO:23(GenBank寄存編號J00241.1)所示。

在另一實施例中，本發明提供一種編碼本文所述之鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體或其抗原結合片段之核酸。核酸序列之實例包括本文所述之彼等核酸序列。在另一實施例中，本發明提供一種包含核酸之載體。在另一實施例中，本發明提供一種包含且表現該載體之細胞。

在第二態樣中，本發明提供使用此鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體或其片段防治及治療H5N1流行性感冒之方法及組合物。在一實施例中，本發明提供一種包含本文所述之鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑的醫藥組合物。在另一實施例中，該醫藥組合物包含本文所述之單株抗體之抗原結合片段及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含編碼該抗體或抗體片段之核酸分子及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含含有該核酸之載體及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含表現該載體之細胞及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。

在一實施例中，本發明提供一種減少個體之流行性感冒H5N1病毒感染、或降低個體之流行性感冒H5N1病毒感染之風險、抑制一或多種流行性感冒H5N1病毒株或分離株對個體之感染、或防治由一或多種流行性感冒H5N1病毒株或分離株引起之流行性感冒感染或疾病的方法。在此實施例中，方法包含向有需要之個體投與治療有效量的本文所述之鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體或其抗原結合片段、包含編碼該抗體或抗體片段之聚核苷酸的核酸分子；包含該聚核苷酸之載體；或表現該載體之細胞。在一實施例中，該個體為免疫功能降低者，為嬰兒、為幼童或為老年人。在另一實施例中，投藥提供治療益處。在另一實施例中，治療益處包含抑制流行性感冒病毒效價增加、減小流行性感冒病毒效價、抑制流行性感冒病毒複製增加、減少流行性感冒病毒複製、抑制流行性感冒病毒增殖增加或減少流行性感冒病毒增殖、或降低或減少個體之與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症狀或併發症的進展、嚴重性、頻率、持續時間或機率。在一實施例中，症狀或併發症係選自惡寒、發熱、咳嗽、喉嚨痛、鼻充血、鼻竇充血(sinus congestion)、鼻感染、鼻竇感染、身體痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳感染、耳痛及死亡。在另一實施例中，治療益處包含加速個體自流行性感冒H5N1病毒感染恢復。在另一實施例中，向個體投與之藥劑係在個體感染流行性感冒H5N1病毒之前、實質上同時或之後投與。

「經分離」意謂生物分子不含其天然產生時所伴隨之至少一些組分。

如本文所用之術語「抗體」為技術上公認之術語且應理解成指代與已知抗原結合之分子或分子活性片段，特定言之指代免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子之免疫活性部分，亦即含有特異性結合抗原之結合位點之分子。免疫球蛋白為包含實質上由該免疫球蛋白κ及λ、α、γ、δ、ε及μ恆定區基因以及無數種免疫球蛋白可變區基因編碼之一或多種多肽的蛋白質。輕鏈可分類為κ或λ。重鏈可分類為γ、μ、α、δ或ε，其又分別界定免疫球蛋白種類IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。此外，已知重鏈之子類。舉例而言，人類之IgG重鏈可為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4子類中之任一者。本發明之免疫球蛋白可為任何種類(IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及IgY)或子類(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)之免疫球蛋白分子。

如本文中關於某抗體所用之「特異性結合」意謂該抗體與其目標抗原結合之親和力大於其與結構不同之抗原結合之親和力。

已知典型免疫球蛋白結構單元包含四聚體。各四聚物由兩對相同多肽鏈構成，各對具有一條「輕」鏈(約25 kD)及一條「重」鏈(約50-70 kD)。各鏈之N端界定主要負責抗原識別之具有約100至110個或110個以上胺基酸的可變區。術語可變輕鏈(V_L)及可變重鏈(V_H)分別指代此等輕鏈及重鏈。

抗體以全長完整抗體形式或以藉由用各種肽酶或化合物消化所產生之許多經充分表徵之片段形式存在。因此，舉例而言，胃蛋白酶會在鉸鏈區中雙硫鍵以下消化抗體以產生Fab之二聚體F(ab')₂，Fab本身為藉由雙硫鍵與V_H-CH₁接合之輕鏈。可在溫和條件下還原F(ab')₂以斷開鉸鏈區中之雙硫鍵，藉此使F(ab')₂二聚體轉化成Fab'單體。Fab'單體基本上為具有鉸鏈區之一部分之Fab片段(關於其他抗體片段之更詳細描述，參見Fundamental Immunology,W. E. Paul編,Raven Press,N.Y.(1993))。儘管各種抗體片段係依據完整抗體之消化加以定義，但熟習此項技術者應瞭解多種抗體片段之任一者皆可用化學方法或藉由利用重組DNA方法重新合成。因此，如本文所用之術語抗體亦包括藉由修飾整個抗體產生或重新合成之抗體片段或藉由使用重組DNA方法獲得之抗體及片段。

在本發明範疇內意欲「抗體」包括嵌合或人類化單株抗體以及其活性片段。與已知抗原結合之分子之活性片段的實例包括經分離之輕鏈及重鏈、Fab、Fab/c、Fv、Fab'及F(ab')₂片段，包括Fab免疫球蛋白表現文庫之產物及以上提及之任何抗體及片段的抗原決定部位結合片段。

此等活性片段可藉由許多技術由本發明抗體獲得。舉例而言，單株抗體可用諸如胃蛋白酶之酶裂解，且進行HPLC凝膠過濾。可接著收集含有Fab片段之適當溶離份且藉由膜過濾及其類似技術加以濃縮。關於用於分離抗體活性片段之一般技術的其他描述，參見例如Khaw等人(1982)；Rousseaux等人(1986)。

重組製備之抗體可為習知全長抗體、由蛋白水解消化得知之活性抗體片段、獨特活性抗體片段(諸如Fv或單鏈Fv(scFv))、域缺失抗體及其類似物。Fv抗體大小為約50 Kd且包含輕鏈及重鏈之可變區。單鏈Fv(「scFv」)多肽為共價連接之VH::VL雜二聚體，其可自包括直接聯接或藉由肽編碼連接子聯接之VH編碼序列及VL編碼序列的核酸表現。參見Huston等人(1988)。許多結構可適於使天然聚集但自抗體V區化學分離之輕及重多肽鏈轉化成將摺疊成實質上類似於抗原結合位點結構之三維結構的scFv分子。參見例如美國專利第5,091,513號；第5,132,405號及第4,956,778號。

結合部位係指抗體分子之參與抗原結合的部分。抗原結合位點係由重(「H」)鏈及輕(「L」)鏈之N端可變(「V」)區之胺基酸殘基形成。抗體可變區包含稱為「高變區」或「互補決定區」(CDR)之3個高度散開的延伸部分，其插入在稱為「構架區」(FR)之較為保守的側接延伸部分之間。在抗體分子中，輕鏈之3個高變區(LCDR1、LCDR2及LCDR3)及重鏈之3個高變區(HCDR1、HCDR2及HCDR3)在三維空間中相對於彼此安置而形成抗原結合面或結合袋。因此，抗體結合部位表示組成抗體CDR之胺基酸及組成結合位點口袋之任何構架殘基。

可使用此項技術中熟知之方法確定特定抗體中組成結合部位之胺基酸殘基的身分。參見例如美國專利申請公開案第2010/0080800號。特定抗體中在CDR外部但因具有作為結合部位之內襯(lining)之一部分的側鏈(亦即其可用於經由結合部位進行連接)而仍然組成結合部位之一部分的胺基酸殘基之身分可使用此項技術中熟知之方法，諸如分子模型化及X射線結晶學加以確定。參見例如Riechmann等人(1988)。

嵌合抗體為抗體之一或多個區域來自一種動物物種且抗體之一或多個區域來自不同動物物種的抗體。較佳嵌合抗體為包括來自靈長類動物免疫球蛋白之區域之嵌合抗體。供人類臨床使用之嵌合抗體應通常理解為具有來自非人類動物(例如齧齒動物)之可變區，且恆定區來自人類。相反，人類化抗體使用來自非人類抗體之CDR，且大多數或所有可變構架區來自人類免疫球蛋白，且所有恆定區來自人類免疫球蛋白。人類嵌合抗體應通常理解為具有來自齧齒動物之可變區。典型人類嵌合抗體具有人類重恆定區及人類輕鏈恆定區，且重可變區與輕可變區兩者均來自齧齒動物抗體。嵌合抗體可包括對人類恆定區之天然胺基酸序列及天然齧齒動物可變區序列所作之一些變化。嵌合及人類化抗體可藉由此項技術中熟知之方法製備，該等方法包括CDR移植方法(參見例如美國專利第5,843,708號；第6,180,370號；第5,693,762號；第5,585,089號；第5,530,101號)、鏈改組策略(參見例如美國專利第5,565,332號；Rader等人(1998))、分子模型化策略(美國專利第5,639,641號)及其類似方法。

如本文中在兩鏈抗體情況下所用之「人類化抗體」為至少1條鏈經人類化之抗體。人類化抗體鏈具有一或多個構架區來自人類之可變區。單鏈人類化抗體為鏈具有一或多個構架區來自人類之可變區的抗體。人類化抗體鏈或其片段之可變區之非人類部分源於非人類來源，特定言之非人類抗體，通常為源於齧齒動物之非人類抗體。人類化抗體之非人類組成通常在形式上以散佈在源於一種(或一種以上)人類免疫球蛋白之構架區中的至少1個CDR區提供。此外，可改變構架支撐殘基以保留結合親和力。

人類化抗體可進一步包含恆定區(例如在輕鏈情況下，至少1個恆定區或其一部分；且在重鏈情況下，較佳3個恆定區)。人類化抗體之恆定區若存在，則其通常來自人類。獲得「人類化抗體」之方法為熟習此項技術者所熟知。參見例如美國專利申請公開案第2010/0080800號。

如本文所用之術語恆定區(CR)係指免疫球蛋白之恆定區基因。恆定區基因編碼抗體分子之賦予效應功能的部分。對於嵌合人類抗體及人類化抗體，通常非人類(例如鼠類)恆定區經人類恆定區取代。標的嵌合或人類化抗體之恆定區通常源於人類免疫球蛋白。重鏈恆定區可選自以下5個同型中之任一者：α、δ、ε、γ或μ。另外，各種子類之重鏈(諸如IgG子類之重鏈)負責不同效應功能且因此藉由選擇所要重鏈恆定區，可產生具有所要效應功能之抗體。可在本發明範疇內使用之恆定區為γ1(IgG1)，尤其γ1(IgG1)同型之Fc區；γ3(IgG3)；及尤其γ4(IgG4)。輕鏈恆定區可屬於κ或λ類型，較佳屬於κ類型。在一實施例中，輕鏈恆定區為人類κ恆定鏈(Hieter等人(1980))且重恆定鏈為人類IgG4恆定鏈。

如本文所用之術語可變區(VR)係指抗體中各對輕鏈及重鏈內之直接涉及於抗體與抗原之結合中的域。各重鏈在一端具有可變域(V_H)，繼之以許多恆定域。各輕鏈在一端具有可變域(V_L)且在其另一端具有恆定域；輕鏈之恆定域與重鏈之第一恆定域對準，且輕鏈可變域與重鏈之可變域對準。

如本文所用之術語構架區(FR)係指抗體之輕鏈及重鏈之可變區內的一或多個構架區(參見Kabat等人(1992)；Johnson and Wu(2001)；http：//immuno.bme.nwa.edu)。此等表述包括插入在抗體輕鏈及重鏈之可變區內的CDR之間的彼等胺基酸序列區。

根據標準序列定義(Kabat等人(1992))及結構定義(例如如Chothia及Lesk(1987)中所述)來確定CDR及FR殘基。當此2種方法產生對CDR之略微不同的鑑別時，則結構定義較佳，但藉由序列定義方法鑑別之殘基考慮為用於確定哪些構架殘基將引入共同序列中的重要FR殘基。

術語「單株抗體」亦在此項技術中得到充分認可且係指作為單選殖抗體產生細胞之產物的抗體。單株抗體通常係藉由使一般短命之抗體產生B細胞與快速生長之細胞，諸如癌細胞(有時稱為「永生」細胞)融合加以製備。所得雜交細胞或融合瘤快速繁殖，從而產生會產生抗體之純系。

術語「片段」係指抗體或抗體鏈之包含少於完整或完全抗體或抗體鏈之胺基酸殘基的部分。片段可經由化學或酶促處理完整或完全抗體或抗體鏈來獲得。片段亦可藉由重組手段獲得。例示性片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fabc及/或Fv片段。術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體之結合抗原或與完整抗體(亦即與其所源於之完整抗體)競爭結合(亦即特異性結合)抗原的多肽片段。結合片段係藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學裂解完整免疫球蛋白而產生。結合片段包括Fab、Fab'、F(ab')₂、Fabc、Fv、單鏈及單鏈抗體。

免疫原性降低之人類化抗體係指相對於親本抗體(例如鼠類抗體)，展現降低之免疫原性之人類化抗體。

實質上保留親本抗體之結合性質之人類化抗體係指保留特異性結合由用於產生此人類化抗體之親本抗體識別之抗原之能力的人類化抗體。較佳地，人類化抗體將展現與親本抗體相同或實質上相同之抗原結合親和力及親合力。理想地，抗體之親和力將不小於親本抗體親和力之10%，更佳不小於約30%，且最佳地，其親和力將不小於親本抗體之50%。用於檢定抗原結合親和力之方法在此項技術中為熟知的且包括半數最大結合檢定、競爭檢定及史卡查(Scatchard)分析。

另外，術語「治療有效量」係指在向人類或動物投與時，足以在該人類或動物中產生治療效應之抗體量。熟習此項技術者根據常規程序可容易地確定該有效量。

如本文所用，術語「治療」、「預防」係指由於投與防治性藥劑或治療劑而防止個體之病症之一或多種症狀的復發或發作。

在第一態樣中，本發明提供對流行性感冒H5血球凝集素之主要中和抗原決定部位有特異性之單株抗體及其活性片段，亦即抗原結合片段(在本文中亦稱為抗體片段)。在一實施例中，單株抗體為鼠類單株抗體4C2。鼠類單株抗體4C2係由小鼠融合瘤4C2產生。小鼠融合瘤4C2在2010年8月3日根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)之條款寄存在美國菌種保存中心(American Type Culture Collection),10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110,USA，且指定寄存編號為PTA-11241。本發明亦係關於產生鼠類單株抗體4C2之融合瘤。在第二實施例中，單株抗體為嵌合或人類化單株抗體。特定言之，嵌合或人類化單株抗體與H5血球凝集素之由鼠類單株抗體4C2所特異性結合的構形抗原決定部位特異性結合。在一實施例中，單株抗體(鼠類單株抗體或嵌合或人類化單株抗體)或其片段與H5血球凝集素(HA)之構形抗原決定部位特異性結合，其中該構形抗原決定部位包含成熟HA蛋白之胺基酸155(Ser)及189(Arg)。在另一實施例中，輕鏈可變區之互補決定區(CDR)(LCDR)位於如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列(在本文中亦稱為HM448828，其為小鼠輕鏈可變區之胺基酸序列)內。在另一實施例中，輕鏈可變CDR之胺基酸序列為：LCDR1：QDISGH(SEQ ID NO:5)；LCDR2：HGT(SEQ ID NO:6)；及LCDR3：VQYVQFPWT(SEQ ID NO:7)。在一實施例中，重鏈可變區之互補決定區(CDR)(HCDR)位於如SEQ IDNO:4所示之胺基酸序列(在本文中亦稱為HM448827，其為小鼠重鏈可變區之胺基酸序列)內。在另一實施例中，重鏈可變CDR之胺基酸序列為：HCDR1：GYTFTTYW(SEQ ID NO:8)；HCDR2：IDPYDSET(SEQ ID NO:9)；及HCDR3：VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO:10)。

在一實施例中，編碼HM448828之DNA包含如SEQ ID NO:1所示之核苷酸序列。在另一實施例中，編碼HM448827之DNA包含如SEQ ID NO:3所示之核苷酸序列。在一實施例中，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:2所示之胺基酸序列。在另一實施例中，重鏈可變區包含如SEQ ID NO:4所示之胺基酸序列。在一實施例中，重及輕恆定區來自人類。在另一實施例中，人類重鏈恆定區為人類IgG1重鏈恆定區。在另一實施例中，人類IgG1重鏈恆定區包含如SEQ ID NO:22(GenBank寄存編號AAX09634.1)所示之胺基酸序列。在另一實施例中，編碼此胺基酸序列之核酸序列如SEQ ID NO:21(GenBank寄存編號AY885218.1)所示。在一實施例中，人類輕鏈恆定區為人類κ輕鏈恆定區。在另一實施例中，人類κ輕鏈恆定區包含如SEQ ID NO:24(GenBank寄存編號AAA58989.1)所示之胺基酸序列。在另一實施例中，編碼此序列之核酸如SEQ ID NO:23(GenBank寄存編號J00241.1)所示。

在一實施例中，人類化抗體係藉由使用本文所述之技術以及熟習此項技術者熟知之技術組合人類重鏈及輕鏈恆定區與小鼠重鏈及輕鏈可變區來製備。在另一實施例中，製備人類化抗體，其中合成編碼人類化V_L及V_H序列之DNA序列，該等人類化V_L及V_H序列分別含有本文所述之小鼠輕鏈及重鏈可變區之CDR。

合成編碼已知序列之蛋白質之DNA的方法在此項技術中為熟知的。使用此等方法合成編碼本發明標的人類化抗體之DNA序列，且接著在適於表現重組抗體之載體系統中表現。此可在任何載體系統中實現，其提供本發明之標的人類化抗體序列，諸如表現包含締合以產生功能性(抗原結合)抗體之人類恆定域序列及小鼠可變域序列的融合蛋白。

表現載體、適於表現重組抗體及尤其人類化抗體之宿主細胞，及適於表現此等抗體之方法在此項技術中為熟知的。參見例如美國專利第7,074,406號。

已知能夠表現功能性免疫球蛋白之宿主細胞包括例如哺乳動物細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、骨髓瘤細胞)、細菌(諸如大腸桿菌(Escherichia coli))、酵母細胞(諸如釀酒酵母(Saccharom ycescerevisiae))以及其他宿主細胞。在此等細胞中，鑒於CHO細胞能夠有效表現及分泌免疫球蛋白，其被許多研究人員使用。

基本上，重組表現人類化抗體係藉由兩種一般方法之一實現。在第一方法中，宿主細胞係以一種提供與所選恆定區融合之重可變序列與輕可變序列兩者表現的載體轉染。在第二方法中，宿主細胞係以兩種分別提供與所選恆定區融合之可變重序列或可變輕序列表現的載體轉染。

在第二態樣中，本發明提供使用此鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體或其片段防治及治療H5N1流行性感冒之方法及組合物。在一個實施例中，本發明提供一種包含本文所述之鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑的醫藥組合物。在另一實施例中，該醫藥組合物包含本文所述之單株抗體之抗原結合片段及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含編碼該抗體或抗體片段之核酸分子及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含含有該核酸之載體及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。在另一實施例中，該醫藥組合物包含表現該載體之細胞及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。

在一個實施例中，本發明提供一種減少個體之流行性感冒H5N1病毒感染、或降低個體之流行性感冒H5N1病毒感染之風險、抑制一或多種流行性感冒H5N1病毒株或分離株對個體之感染、或防治一或多種流行性感冒H5N1病毒株或分離株引起之流行性感冒感染或疾病的方法。在此實施例中，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量的本文所述之鼠類單株抗體4C2或嵌合或人類化單株抗體或其抗原結合片段、包含編碼該抗體或抗體片段之聚核苷酸之核酸分子；包含該聚核苷酸之載體；或表現該載體之細胞。在一個實施例中，該個體為免疫功能降低者，為嬰兒，為幼童，或為老年人。在另一實施例中，投藥提供治療益處。在另一實施例中，治療益處包含抑制流行性感冒病毒效價增加、減小流行性感冒病毒效價、抑制流行性感冒病毒複製增加、減少流行性感冒病毒複製、抑制流行性感冒病毒增殖增加或減少流行性感冒病毒增殖、或降低或減少個體之與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症狀或併發症的進展、嚴重性、頻率、持續時間或機率。在一實施例中，症狀或併發症係選自惡寒、發熱、咳嗽、喉嚨痛、鼻充血、鼻竇充血、鼻感染、鼻竇感染、身體痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳感染、耳痛及死亡。在另一實施例中，治療益處包含加速個體自流行性感冒H5N1病毒感染恢復。在另一實施例中，向個體投與之藥劑係在個體感染流行性感冒H5N1病毒之前、實質上同時或之後投與。

本發明抗體可使用已知技術配製於生理學上可接受之調配物中且可包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。舉例而言，根據本發明及如本文所述之抗體(包括任何功能等效抗體或其功能性部分)與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑組合以形成治療組合物。適合醫藥載劑、稀釋劑及/或賦形劑在此項技術中為熟知的且包括例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)、各種類型之濕潤劑、無菌溶液等。

本發明醫藥組合物之調配可根據熟習此項技術者已知之標準方法達成。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy,第21版，D.B. Troy編，Lippincott,Williams & Wilkins,Baltimore,2006，其據此以引用的方式併入本文中。

本發明組合物可以適合醫藥有效劑量之固體、液體或氣霧劑形式向個體投與。固體組合物之實例包括丸劑、乳膏及可植入劑量單位。丸劑可經口投與。治療性乳膏可表面投與。可植入劑量單位可局部投與，例如在腫瘤部位處投與，或可植入以達成全身釋放治療組合物，例如皮下植入。液體組合物之實例包括適合於肌肉內、皮下、靜脈內、動脈內注射之調配物及適於表面及眼內投藥之調配物。氣霧劑調配物之實例包括適於向肺投與之吸入劑調配物。

組合物可藉由標準投藥途徑來投與。一般而言，組合物可藉由表面、經口、經直腸、經鼻、皮膚間(interdermal)、腹膜內或非經腸(例如靜脈內、皮下或肌肉內)途徑加以投與。此外，組合物可合併於持續釋放基質，諸如生物可降解聚合物中，該等聚合物植入在需要遞送之位置(例如在腫瘤部位處)附近。方法包括投與單一劑量、按預定時間間隔投與重複劑量、及在一段預定時間內持續投藥。如本文所用之持續釋放基質為由可藉由酶促水解或酸/鹼水解或藉由溶解而降解之物質(通常為聚合物)製成的基質。一旦基質插入身體中，酶及體液即會對其起作用。持續釋放之基質的理想選擇為生物相容物質，諸如脂質體、聚乳酸交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(乙醇酸之聚合物)、聚乳酸交酯共乙交酯(乳酸與乙醇酸之共聚物)、聚酸酐、聚(原)酯、多肽、玻尿酸(hyaluronic acid)、膠原蛋白(collagen)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)、羧酸、脂肪酸、磷脂、多醣、核酸、聚胺基酸、胺基酸(諸如苯丙胺酸、酪胺酸、異白胺酸)、聚核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯啶酮及聚矽氧。較佳的可生物降解基質為聚乳酸交酯、聚乙交酯或聚乳酸交酯共乙交酯(乳酸與乙醇酸之共聚合物)之一之基質。

該組合物可與其他組合物及用於治療疾病之程序組合投與，該等其他組合物包含生物活性物質或化合物，特定言之為至少一種選自由以下組成之群之化合物：對抗氧化應力(oxidative stress)之化合物、抗細胞凋亡化合物、金屬螯合劑、DNA修復抑制劑(諸如哌侖西平(pirenzepin))及代謝物、3-胺基-1-丙烷磺酸(3APS)、1,3-丙烷二磺酸酯(1,3PDS)、α-分泌酵素(secretase)活化劑、β-分泌酵素抑制劑及γ分泌酵素抑制劑、T蛋白、神經傳遞質、β片破壞劑、澱粉樣蛋白(amyloid)β清除性/耗盡性細胞組分之引誘劑、N端截短澱粉樣蛋白β(包括焦麩胺酸化澱粉樣蛋白β3-42)之抑制劑、消炎分子、「非典型性抗精神病藥」(諸如氯氮平(clozapine)、齊拉西酮(ziprasidone)、利培酮(risperidone)、阿立哌唑(aripiprazole)或奧氮平(olanzapine))或膽鹼酯酶(cholinesterase)抑制劑(ChEI)(諸如塔克林(tacrine)、雷斯替明(rivastigmine)、冬尼培唑(donepezil)及/或加蘭他敏(galantamine))、M1促效劑及其他藥物，包括任何澱粉樣蛋白或T改質性藥物及營養補充劑，諸如維生素B12、半胱胺酸、乙醯膽鹼前驅體、卵磷脂(lecithin)、膽鹼、銀杏(Ginkgo biloba)、乙醯基-L-肉鹼(acetyl-L-carnitine)、艾地苯醌(idebenone)、丙戊茶鹼(propentofylline)或黃嘌呤衍生物；以及本發明抗體及視情況醫藥學上可接受之載劑及/或稀釋劑及/或賦形劑。

蛋白醫藥活性物可以介於每劑1 ng與10 mg之間的量存在。一般而言，投藥方案應在介於0.1 μg與10 mg本發明抗體之間的範圍內，尤其在1.0 μg至1.0 mg之範圍內，且更尤其在介於1.0 μg與100 μg之間的範圍內，其中屬於此等範圍內之所有個別數值亦為本發明之一部分。若投藥經由連續輸注進行，則更適當的劑量可在介於每小時每公斤體重0.01 μg與10 mg單位之間的範圍內，其中屬於此等範圍內之所有個別數值亦為本發明之一部分。

投藥將通常為非經腸投藥，例如靜脈內投藥。適於非經腸投藥之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳液。非水性溶劑包括(但不限於)丙二醇、聚乙二醇、植物油(諸如橄欖油)及可注射有機酯(諸如油酸乙酯)。水性溶劑可選自由以下組成之群：水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水及緩衝介質。非經腸媒劑包括氯化鈉溶液、林格氏(Ringer's)右旋糖、右旋糖及氯化鈉、乳酸林格氏液(lactated Ringer's)或不揮發性油。靜脈內媒劑包括流體及營養補充劑、電解質補充劑(諸如基於林格氏右旋糖之補充劑)及其他媒劑。亦可存在防腐劑，諸如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。

醫藥組合物可進一步包含蛋白載劑(諸如血清白蛋白或免疫球蛋白)，特定言之為源於人類之蛋白載劑。視預定用途而定，本發明醫藥組合物中可存在其他生物活性劑。

在本發明中，藉由抗原決定部位定位來表徵一組針對HA2 gp之單株抗體(mAb)的各別抗原決定部位。在經HPAI H5N1病毒感染攻毒之小鼠中評估此等mAb之治療及防治功效。在鼠類模型中評估此等mAb之一針對來自分枝系1及2.1之2個高病原性H5N1病毒株的防治及治療功效。藉由觀測經感染小鼠之重量減輕、存活及肺中病毒負荷清除的動力學來測定功效。自此mAb製備嵌合或人類化mAb。

除非另外指示，否則本發明之實施採用屬於此項技術技能範圍內之化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學、免疫學、細胞生物學、細胞培養及轉殖基因生物學的習知技術。參見例如Maniatis等人，1982,Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook等人，1989,Molecular Cloning,第2版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Sambrook及Russell,2001,Molecular Cloning,第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Ausubel等人，1992,Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley & Sons,包括定期更新)；Glover,1985,DNA Cloning(IRL Press,Oxford)；Russell,1984,Molecular biology of plants: a laboratory course manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes,(Academic Press,New York,1992)；Guthrie及Fink,Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology(Academic Press,New York,1991)；Harlow及Lane,1988,Antibodies,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)；Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames及S. J. Higgins編1984)；Transcription And Translation(B. D. Hames及S. J. Higgins編1984)；Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney,Alan R. Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B. Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；論文Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Methods In Enzymology,第154及155卷(Wu等人編)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及Walker編,Academic Press,London,1987)；Handbook Of Experimental Immunology,第I-IV卷(D. M. Weir及C. C. Blackwell編，1986)；Riott,Essential Immunology,第6版，Blackwell Scientific Publications,Oxford,1988；Fire等人，RNA Interference Technology: From Basic Science to Drug Development,Cambridge University Press,Cambridge,2005；Schepers,RNA Interference in Practice,Wiley-VCH,2005；Engelke,RNA Interference(RNAi): The Nuts & Bolts of siRNA Technology,DNA Press,2003；Gott,RNA Interference,Editing,and Modification: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology),Human Press,Totowa,NJ,2004；Sohail,Gene Silencing by RNA Interference: Technology and Application,CRC,2004。

實例

藉由參考以下實例來描述本發明，該等實例以舉例方式提供且不意欲以任何方式限制本發明。利用此項技術中熟知之標準技術或以下具體描述之技術。

實例1 材料及方法

病毒：來自分枝系2.1之H5N1人類流行性感冒病毒A/印度尼西亞/CDC669/2006、A/印度尼西亞/TLL012/2006、A/印度尼西亞/TLL013/2006、A/印度尼西亞/TLL014/2006及A/印度尼西亞/CDC326/2006係自印度尼西亞衛生部(Ministry of Health，MOH)獲得。***來自不同分枝系之病毒(分枝系0-A/香港/156/97、分枝系1.0-A/香港/213/2004、分枝系4.0-A/鵝/貴陽/337/06及分枝系8.0-A/雞/河南/12/04)藉由反向遺傳學(RG)拯救(rescue)(WHO,2005)。簡而言之，將合成HA及NA基因選殖入雙重啟動子質體中以進行A型流行性感冒反向遺傳學研究。雙重啟動子質體係自美國喬治亞州亞特蘭大疾病控制與預防中心(Center for Disease Control and Prevention,Atlanta,GA,USA)獲得。藉由使用脂染胺(Lipofectamine)2000(Invitrogen Corp. USA)將含有HA及NA之質體連同源於A/波多黎各/8/34(H1N1)之其餘6個基因質體一起轉染入293T與MDCK細胞的共培養物中來拯救重配(reassortant)病毒。使儲備病毒在35℃下在11天大之受精雞卵(embryonated chicken egg)之尿囊腔中增殖3691個小時。所有用高病原性病毒之實驗皆在符合CDC/NIH及WHO推薦標準之BSL 3+封閉設施中進行且亦獲得新加坡農業食品及獸醫局(Agri-Food and Veterinary Agency)以及MOH核准。

MAb產生：按2週之定期間隔用處於0.1 ml磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的來自A/印度尼西亞/TLL014/2006之不活化完整病毒使BALB/c小鼠皮下免疫兩次，其中該磷酸鹽緩衝鹽水已用等體積之佐劑Montanide ISA563(SEPPIC,France)乳化。在脾細胞與SP2/0細胞融合之前3天，小鼠用相同病毒抗原增強免疫。將融合細胞接種於96孔板中，且藉由如以下所述之免疫螢光檢定篩檢其上清液。藉由限制稀釋來選殖可產生mAb之融合瘤至少3次。如以下所述測試陽性mAb之血球凝集抑制活性。如製造商方案中所述使用商用同型測定套組(commercial isotyping kit，Amersham Bioscience,England)來測定來自所選陽性mAb之免疫球蛋白的同型。使用蛋白A瓊脂糖珠粒(Millipore)純化mAb。藉由SDS-PAGE分析確認抗體純度。接著藉由如以下所述之標準血球凝集抑制檢定測試mAb之中和活性。

免疫螢光檢定(IFA)：用AIV H5N1病毒株感染於96孔板中培養之MDCK細胞。在感染後24-48小時，細胞在室溫下用4%多聚甲醛固定30分鐘且用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)(pH 7.4)洗滌3次。固定細胞在37℃下與融合瘤培養上清液一起培育1小時，用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)沖洗且接著與按1: 40稀釋之結合異硫氰酸螢光素(FITC)之兔抗小鼠免疫球蛋白(Dako,Denmark)一起培育。細胞再次於PBS中沖洗且藉由寬視場落射螢光顯微鏡術(wide-field epi-fluorescence microscopy，Olympus IX71)評估抗體結合。

血球凝集抑制檢定：如先前所述進行血球凝集抑制(HI)檢定(Webster等人,1991)。簡而言之，將mAb於V形底96孔板中連續稀釋(2倍)且與4 HA病毒單位之H5N1病毒混合。在室溫下培育板30分鐘，且添加1%雞RBC至各孔中。血球凝集抑制終點為最高mAb稀釋度，其中未觀測到凝集。

分離及分析逃避突變體：如先前所述藉由表徵逃避突變體來定位由mAb 4C2識別之抗原決定部位(Kaverin等人,2007)。簡而言之，將H5N1病毒與過量mAb一起培育1小時且接著接種入11天大之受精雞卵中。為了分離活體內逃避突變體，來自經處理小鼠之肺樣品直接接種入受精卵中。在37℃下培育卵48小時。收集病毒且用於以限制稀釋法在受精雞卵中選殖且對逃避突變體進行斑塊純化。自尿囊液提取RNA。血球凝集素基因經逆轉錄酶(RT)-PCR擴增並選殖入TA選殖載體(Promega)中且對若干純系進行定序。藉由與親本病毒之序列進行比較來分析個別純系之序列。

選殖嵌合IgG1表現質體：表現載體之設計如(Jostock等人,2004)所描述。簡而言之，使用以下引子擴增編碼κ輕鏈及IgG1重鏈之人類抗體恆定區：人類IgG1恆定重鏈：正向引子5'-CTCGAGCGACCTCCACCAAGG-3'(SEQ ID NO:11)及反向引子5'-TCTAGACTCGGAGAGGGACAGAG-3'(SEQ ID NO:12)；人類恆定κ輕鏈：正向引子5'-CTGCAGATCACGCGAACTGTGGCT GC-3'(SEQ ID NO:13)及反向引子5'-GGCGCGCCCGAAGTTGTCCCCTCTCACAATCATC ATC-3'(SEQ ID NO:14)。將κ輕鏈及IgG1重鏈之擴增之恆定區選殖入經改進pCMV/myc/ER質體中，其中腦心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus)之內部核糖體進入位點(IRES)插入在該等恆定區之間。引入獨特限制位點以允許重鏈及輕鏈之可變區與恆定區同框插入。自mAb 4C2融合瘤細胞製備mRNA且與隨機六聚物一起用於第一股cDNA合成中。總cDNA作為模板用於使用小鼠scFv重組抗體噬菌體系統(Amersham Biosciences)之引子及方案來擴增可變重鏈與輕鏈兩者。將所得產物選殖入pCR-Script(Stratagene,USA)中以用於定序。接著如下設計序列特異性引子：4C2特異性可變輕鏈：正向引子5'-GGTAAGGGGTTAACAGTAGCAGG-3'(SEQ ID NO:15)及反向引子5'-CTTTGGCCTC TCTGGGATAGAAG-3'(SEQ ID NO:16)；4C2特異性可變重鏈：正向引子5'-CACGATGATAATATGGCCACAACC-3'(SEQ ID NO:17)及反向引子5'-CACCG GTTGGGGGAAGTAGTACT-3'(SEQ ID NO:18)。此等引子用於擴增可變區，其接著選殖入表現載體中。4C2特異性可變輕鏈編碼序列如SEQ ID NO:3所示且4C2特異性可變重鏈編碼序列闡如SEQ ID NO:1所示。此構築體之表現導致產生含有33%如來自鼠類之小鼠可變區之序列及67%如人類IgG1恆定區之序列的嵌合抗體。

嵌合抗體之短暫表現及純化：使用Freestyle 293表現系統(Invitrogen,USA)表現嵌合抗體以獲得於確定之無血清培養基中產生之抗體。使用293fectin(Invitrogen,USA)將以上提及之構築體轉染入293-F細胞中且在轉染之後120小時收集上清液。使用蛋白A瓊脂糖珠粒(Millipore)純化嵌合抗體4C2(ch-mAb 4C2或ch4C2)。藉由SDS-PAGE確認嵌合抗體純度且使用標記HRP之抗人類Ig(DAKO)進行之免疫墨點分析用於確認人類恆定區之引入。

微量中和檢定：如先前所述藉由微量中和檢定分析單株抗體針對H5N1病毒株之中和活性(Prabakaran等人,2008)。簡而言之，進一步連續稀釋(2倍)已稀釋10倍之mAb且在室溫下與100 50%組織培養感染劑量(TCID50)之不同分枝系的H5N1病毒株一起培育1小時且一式兩份塗鋪於在96孔板中生長之MDCK細胞上。藉由Reed及Muench方法測定MDCK細胞培養物中各H5N1病毒株的TCID50。根據最高mAb稀釋度評估中和效價，其中藉由光學顯微鏡術未觀測到細胞病變效應。

攻毒研究：4-6週齡之近親配種SPF BALB/c小鼠用於攻毒研究。用5MLD50(小鼠50%致死量)之2個不同H5N1病毒株(來自分枝系1之RG-A/香港/213/2003及來自分枝系2.1之A/印度尼西亞/TLL013/06)鼻內感染小鼠(n=每組10隻小鼠)。所有動物實驗皆根據有關在NIID處進行動物實驗之指南及實驗方案進行。

防治功效：為了測定防治功效，在病毒攻毒之前，用2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg或0 mg/kg(PBS)之單株抗體(4C2或ch4C2)腹膜內預處理小鼠。在24小時之後，用5MLD50之2個不同H5N1病毒株對小鼠攻毒。每日觀測小鼠以監測體重及死亡率直至所有動物死亡或直至攻毒之後第14天。

治療功效。為了測定嵌合mAb之治療功效，用5MLD50之2個不同H5N1病毒株對小鼠組攻毒。在病毒攻毒之後24小時，經由腹膜內途徑用2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg或0 mg/kg(PBS)之單株抗體(4C2或ch4C2)處理小鼠。每日觀測小鼠以監測體重及死亡率直至所有動物死亡或直至攻毒之後第14天。

實例2 鼠類mAb 4C2之表徵及嵌合

針對高效中和不同H5N1病毒株來篩檢一組針對流行性感冒血球凝集素(HA)之mAb。利用中和逃避突變體之選擇來分析形成4C2 mAb之抗原決定部位中涉及之胺基酸。包括信號蛋白之HA蛋白之胺基酸序列如SEQ ID NO:19所示，且成熟HA蛋白之胺基酸序列如SEQ ID NO:20所示。對自4C2 mAb之多個逃避變異體分離之完全HA基因的定序表明完全HA在胺基酸位置155(Ser至Ile)及189(Arg至Lys)(就如SEQ ID NO:20所示之成熟HA蛋白而言)處攜帶單點突變。基於與H5N1病毒之反應性及高HI活性(表1)及中和效價(表2)選擇mAb 4C2用於在小鼠模型中進行治療研究。

用不同病毒量測鼠類mAb 4C2(1 mg/ml)之血球凝集抑制效價。

用不同分枝系之H5N1病毒量測mAb 4C2(1 mg/ml)之病毒微量中和作用。

*各n-mAb之濃度為1 mg/ml

^#100 TCID50之各病毒株用於微量中和檢定

實例3 用4C2 mAb之防治性治療保護小鼠免遭致死病毒攻毒

吾人在用分枝系1或分枝系2.1 H5N1病毒株攻毒之小鼠中檢查4C2 mAb之保護功效。在用5 MLD50之兩種分枝系之H5N1病毒作致死攻毒之後，所有用5 mg/kg或10 mg/kg單一劑量之4C2預處理之小鼠皆免遭死亡(100%保護)(圖1A、1B)，而截至攻毒之後第6天，所有未經處理之對照小鼠皆死於病毒感染。此外，用甚至最低濃度2.5 kg/mg之4C2預處理之小鼠亦顯示針對分枝系1(圖1A)及分枝系2.1(圖1B)病毒攻毒分別為70%及80%的保護。

實例4 用4C2之治療性治療保護小鼠免遭致死病毒攻毒

為了測定4C2 mAb針對H5N1致死攻毒之治療功效，用5 MLD50之分枝系1或分枝系2.1病毒株對小鼠攻毒。在病毒攻毒之後24小時，用2.5 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg之4C2處理小鼠。在5 mg/kg及10 mg/kg之濃度下，MAb 4C2能夠保護100%之小鼠免遭兩種分枝系之病毒的損害(圖2A及2B)。甚至在2.5 mg/kg下，其亦可保護80%之小鼠對抗用分枝系1及分枝系2.1病毒進行之致死攻毒。

實例5 鼠類mAb 4C2之嵌合

產生mAb之嵌合單株抗體(ch-mAb)以使恆定區經來自人類來源之恆定區置換但可變區保持來自鼠類來源。以此方式產生之嵌合mAb 66.6%經人類化。嵌合抗體仍然保留鼠類mAb之原始性質(結果未示)。以此方式，製備嵌合或人類化mAb。

實例6 用ch4C2之防治性治療保護小鼠免遭致死病毒攻毒

吾人在用分枝系1或分枝系2.1 H5N1病毒株攻毒之小鼠中檢查ch4C2之保護功效。在用5 MLD50之兩種分枝系之H5N1病毒作致死攻毒之後，所有用5 mg/kg或10 mg/kg單一劑量之ch4C2預處理之小鼠皆免遭死亡(100%保護)(圖3A、3B)，而截至攻毒之後第6天，所有未經處理之對照小鼠皆死於病毒感染。此外，用甚至最低濃度2.5 kg/mg之ch4C2預處理之小鼠亦顯示針對分枝系1(圖3A)及分枝系2.1(圖3B)病毒攻毒分別為80%及90%的保護。

實例7 用ch4C2之治療性治療保護小鼠免遭致死病毒攻毒

為了測定ch4C2針對H5N1致死攻毒之治療功效，用5 MLD50之分枝系1或分枝系2.1病毒株對小鼠攻毒。在病毒攻毒之後24小時，用2.5 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg之ch4C2處理小鼠。在5 mg/kg及10 mg/kg之濃度下，Ch4C2能夠保護100%之小鼠免遭兩種分枝系之病毒的損害(圖4A及4B)。甚至在2.5 mg/kg下，其亦可保護70%之小鼠免遭用分枝系1及分枝系2.1病毒進行之致死攻毒。

使用逃避突變體分析進行之抗原決定部位定位證明Ser155及Arg189為mAb 4C2之抗原決定部位之主要決定子。此外，抗原決定部位之胺基酸存在於高抗原性150環及189個胺基酸位置中可解釋其高中和能力。因此，在本研究中，吾人選擇鼠類抗體4C2進行對抗致死H5N1感染之防治性及治療性研究。此外，吾人選擇此抗體進行嵌合且隨後在對抗致死H5N1感染之防治性及治療性研究中使用嵌合抗體。此外，被動投與抗體仍為一種可針對大流行性流行性感冒被研究的策略。以單一劑量防治性或治療性投與4C2 mAb或ch4C2在小鼠模型中顯示對抗致死H5N1流行性感冒之100%保護。使用10 mg/kg及5 mg/kg之4C2或ch4C2，吾人觀測到對抗分枝系1及2.1 H5N1病毒的100%保護。5 mg/kg之劑量提供充分保護且在病毒攻毒之後9天內實現病毒去除，但10 mg/kg之劑量在病毒攻毒之後僅6天內即去除病毒。用4C2或ch4C2之療法可能有助於控制初始感染過程，因此允許動物產生有效免疫反應。吾人之研究表明使用利用mAb 4C2或嵌合mAb ch4C2進行之被動免疫療法可為一種在防治與治療高病原性H5N1感染兩者方面均有效的工具，從而提供為遏制未來流行性感冒大流行所需之即刻免疫性。本文中產生之嵌合抗體可藉由使用此項技術中熟知之技術移植互補決定區來進一步進行人類化。嵌合抗體可在類人靈長類動物中進行臨床前評估。在小鼠研究中單一劑量對於防治與治療兩者之有效性意味即使嵌合抗體本身引起免疫反應，抗體功效亦仍可得以維持。

除非本文中另有指示或上下文明顯相矛盾，否則在描述本發明之情形下(尤其在以下申請專利範圍之情形下)使用術語「一」及「該」及類似指示用詞皆應解釋為涵蓋單數與複數兩者。除非另有說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應解釋為開放式術語(亦即意謂「包括(但不限於)」)。除非本文中另外指示，否則本文中列舉數值範圍僅意欲充當個別地提及屬於該範圍內之各各別值的速記方法，且各各別值如同其在本文中個別列舉一般併入本說明書中。舉例而言，若揭示範圍10-15，則亦揭示11、12、13及14。除非本文中另有指示或另外上下文明顯相矛盾，否則本文所述之所有方法皆可以任何適合順序執行。除非另外主張，否則使用本文提供之任何及所有實例或例示性措辭(例如「諸如」)僅意欲更好地說明本發明且不會對本發明範疇施加限制。本說明書中之措辭皆不應解釋為指示任何非主張之要素為實施本發明所必需。

應瞭解本發明之方法及組合物可以多種實施例形式併入，其中僅少數實施例在本文中加以揭示。本文中描述本發明之實施例，包括本發明者已知之實施本發明之最佳模式。在閱讀先前描述之後，彼等實施例之變化形式可變得為一般技術者顯而易知。本發明者預期熟習此項技術者可在適當時採用此等變化形式，且本發明者意欲本發明以不同於本文中具體描述之方式來實施。因此，本發明包括隨附申請專利範圍中敍述之標的的如適用法律所允許之所有修改及等效形式。此外，除非本文中另有指示或另外上下文明顯相矛盾，否則本發明涵蓋上述要素之其所有可能變化形式之任何組合。

文獻目錄

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<130>　26956 FT

<140>　100130161

<141>　2011/08/23

<150>　PCT/SG2010/000306

<151>　2010/08/23

<160>　24

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　300

<212>　DNA

<213>　小家鼠

<220>

<221>　CDS

<222>　(1)..(300)

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(70)..(87)

<223>　輕可變鏈CDR1

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(139)..(147)

<223>　輕可變鏈CDR2

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(256)..(282)

<223>　輕可變鏈CDR3

<400>　1

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<212>　PRT

<213>　小家鼠

<400>　2

<210>　3

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<212>　DNA

<213>　小家鼠

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<221>　CDS

<222>　(1)..(324)

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(64)..(87)

<223>　重可變鏈CDR1

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(139)..(162)

<223>　重可變鏈CDR2

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(277)..(312)

<223>　重可變鏈CDR3

<400>　3

<210>　4

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<212>　PRT

<213>　小家鼠

<400>　4

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<213>　小家鼠

<400>　5

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<213>　小家鼠

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<213>　小家鼠

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<213>　小家鼠

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<211>　8

<212>　PRT

<213>　小家鼠

<400>　9

<210>　10

<211>　12

<212>　PRT

<213>　小家鼠

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<211>　21

<212>　DNA

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<211>　23

<212>　DNA

<213>　智人

<400>　12

<210>　13

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<212>　DNA

<213>　智人

<400>　13

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<212>　DNA

<213>　智人

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<211>　23

<212>　DNA

<213>　小家鼠

<400>　15

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<211>　23

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<213>　小家鼠

<400>　16

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<212>　DNA

<213>　小家鼠

<400>　17

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<211>　23

<212>　DNA

<213>　小家鼠

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<211>　566

<212>　PRT

<213>　A型流行性感冒病毒

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<211>　550

<212>　PRT

<213>　A型流行性感冒病毒

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<212>　DNA

<213>　智人

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<221>　CDS

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<400>　22

<210>　23

<211>　1209

<212>　DNA

<213>　智人

<220>

<221>　CDS

<222>　(336)..(656)

<400>　23

<210>　24

<211>　106

<212>　PRT

<213>　智人

<400>　24

圖1A及圖1B展示4C2 mAb在小鼠中之防治功效。在用5 MLD₅₀之來自分枝系1 A/HK/213/2003(圖1A)或分枝系2.1病毒A/TLL013/06(圖1B)的印度尼西亞HPAI H5N1小鼠適應株攻毒之前1天，各組小鼠用2.5 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg之4C2 mAb預處理。在整個14天觀測期期間監測小鼠之存活。結果以存活百分比表示。

圖2A及圖2B展示4C2 mAb在小鼠中之治療功效。在用來自分枝系1 A/HK/213/2003(圖2A)及分枝系2.1病毒A/TLL013/06(圖2B)的印度尼西亞HPAI H5N1小鼠適應株攻毒之後1天，各組小鼠用2.5 mg/kg、5 mg/kg及10 mg/kg之4C2 mAb處理，在整個14天觀測期期間監測小鼠之存活。結果以存活百分比表示。

圖3A及圖3B展示嵌合4C2在小鼠中之防治功效。在用5 MLD50之來自分枝系1 A/HK/213/2003(圖3A)或分枝系2.1病毒A/TLL013/06(圖3B)的印度尼西亞HPAI H5N1小鼠適應株攻毒之前1天，各組小鼠用2.5 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg之ch4C2預處理。在整個14天觀測期期間監測小鼠之存活。結果以存活百分比表示。

圖4A及圖4B展示嵌合4C2在小鼠中之治療功效。在用來自分枝系1 A/HK/213/2003(圖4A)及分枝系2.1病毒A/TLL013/06(圖4B)的印度尼西亞HPAI H5N1小鼠適應株攻毒之後1天，各組小鼠用2.5 mg/kg、5 mg/kg及10 mg/kg之ch4C2處理。在整個14天觀測期期間監測小鼠之存活。結果以存活百分比表示。

(無元件符號說明)

Claims

一種與H5血球凝集素之構形抗原決定部位特異性結合之單株抗體或抗體片段，其中該H5血球凝集素之構形抗原決定部位為寄存編號BCRC960430之融合瘤4C2所產生之鼠類單株抗體4C2所特異性結合者，其中該構形抗原決定部位包含成熟H5血球凝集素之胺基酸155(Ser)及胺基酸189(Arg)，及其中該抗體包含下列互補決定區：LCDR1：QDISGH(SEQ ID NO：5)；LCDR2：HGT(SEQ ID NO：6)；LCDR3：VQYVQFPWT(SEQ ID NO：7)；HCDR1：GYTFTTYW(SEQ ID NO：8)；HCDR2：IDPYDSET(SEQ ID NO：9)；及HCDR3：VRGGSTVAYFGV(SEQ ID NO：10)。
如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該單株抗體為寄存編號BCRC960430之融合瘤4C2所產生之鼠類單株抗體4C2。
如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該單株抗體或其片段為源於寄存編號BCRC960430之融合瘤4C2所產生之鼠類單株抗體4C2之嵌合或人類化單株抗體。
如請求項1之單株抗體或抗體片段，其中該H5血球凝集素包含SEQ ID NO：20所示之胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之單株抗體或抗體片段，其中輕鏈之互補決定區在SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列內。
如請求項1至4中任一項之單株抗體或抗體片段，其中重鏈之互補決定區在SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列內。
如請求項1至4中任一項之單株抗體或抗體片段，其中輕鏈之互補決定區在SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列內及重鏈之互補決定區在SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列內。
如請求項1至4中任一項之單株抗體或抗體片段，其中輕鏈之互補決定區包含SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之單株抗體或抗體片段，其中重鏈之互補決定區包含SEQ ID NO：4中所示之胺基酸序列。
如請求項1至4中任一項之單株抗體或抗體片段，其中輕鏈之互補決定區包含SEQ ID NO：2中所示之胺基酸序列及重鏈之互補決定區包含SEQ ID NO：4中所示之胺基酸序列。
一種核酸，其編碼如請求項1至10中任一項之單株抗體或抗體片段。
一種載體，其包含如請求項11之核酸。
一種細胞，其包含且表現如請求項12之載體。
一種醫藥組合物，其包含藥劑及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該藥劑係選自由以下組成之群：(a)如請求項1至10中任一項之單株抗體或抗體片段，(b)包含編碼該單株抗體或抗體片段之核酸的核酸分子，(c)包含該核酸之載體，及(d)表現該載體之細胞。
一種藥劑之用途，其係用於製造用以減少個體之流行性感冒H5N1病毒感染、或降低個體之流行性感冒H5N1病毒感染之風險、或抑制一或多種流行性感冒H5N1病毒株或分離株對個體之感染、或防治一或多種流行性感冒H5N1病毒株或分離株引起之流行性感冒感染或疾病的藥物，其中該藥劑係選自由以下組成之群：(a)如請求項1至10中任一項之單株抗體或抗體片段，(b)包含編碼該單株抗體或抗體片段之核酸的核酸分子，(c)包含該核酸之載體，及(d)表現該載體之細胞。
如請求項15之用途，其中該個體為免疫功能降低(immunocompromised)者、嬰兒、幼童或老年人。
如請求項15之用途，其中投與該藥物提供治療益處。
如請求項17之用途，其中該治療益處包含(a)抑制流行性感冒病毒效價增加，(b)減小流行性感冒病毒效價，(c)抑制流行性感冒病毒複製增加，(d)減少流行性感冒病毒複製，(e)抑制流行性感冒病毒增殖增加或減少流行性感冒病毒增殖，(f)減少個體與流行性感冒病毒感染相關之一或多種症狀或併發症的進行、嚴重性、頻率、持續時間或機率，或(g)加速個體自流行性感冒病毒感染恢復。
如請求項18之用途，其中症狀或併發症係選自惡寒、發熱、咳嗽、喉嚨痛、鼻充血、鼻竇充血(sinus congestion)、鼻感染、鼻竇感染、身體痛、頭痛、疲勞、肺炎、支氣管炎、耳感染、耳痛及死亡。