TWI543777B - 溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠及其製備方法 - Google Patents

Description

溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠及其製備方法

本發明係關於一種包覆青光眼藥物之親疏水兩性幾丁聚醣水凝膠，其可植入組織中來達到長時效的釋放治療。

傳統的青光眼藥物製劑，以滴點方式的眼藥水為主，此方式往往會出現大量藥物損失以及病患忘記施點的問題。Christopher等人已揭露可將青光眼藥物包覆於水凝膠(hydrogel)，但是所使用的材料並非甲殼素(幾丁聚醣)，而是以樹枝狀高分子PAMAM與PEG所合成，不具有可注射性，植入動物眼睛的方式較為困難(Christopher A.Holden,Puneet Tyagi,Ashish Thakur,Rajendra Kadam,Gajanan Jadhav,Uday B.Kompella,Hu Yang,“Polyamidoamine dendrimer hydrogel for enhanced delivery of antiglaucoma drugs”,Nanomedicine：Nanotechnology,Biology,and Medicine,2012,8,776-783)。另外雖已有前案將水凝膠注射應用於青光眼治療，但是其中並無包覆藥物進行釋放，而且治療機制也不同。FR2909285A1專利公開案主要是注射具抗細胞粘著與抗纖維化 的水凝膠來治療青光眼以及眼科手術傷口之癒合，而US2005277864A1專利公開案則主要是說明利用水凝膠植入眼睛的方式來達到治療青光眼。前述專利公開案皆未揭露將可注射性水凝膠用於藥物釋放以進一步達到治療青光眼。台灣專利案I386224揭露利用改質後之幾丁聚醣作為注射性凝膠的方法，但並未針對青光眼設計療程(如注射方式、注射位置、藥量等)，此外，其裝載藥物的構想係以磁敏性奈米膠囊儲存藥物，在磁場控制下將包裹的藥物分子釋出至可注射性智慧凝膠中，再由可注射性智慧凝膠中緩慢釋出，並非直接將幾丁聚醣溶液與藥物混合而直接製成包覆藥物之凝膠。

本發明發現親疏水兩性幾丁聚醣水凝膠除了具有可注射性之外，也可包覆水/脂溶性青光眼藥物並植入眼睛組織來達到長時效的釋放治療。

本發明之主要目的，在於揭示一種溫敏型可注射式青光眼藥物載體水凝膠，可注射進入人體組織，將水/脂溶性青光眼藥物分子固定於眼睛組織中，來達到藥物能緩慢且長時效的釋放，免除舊式滴點式眼藥水導致病患需頻繁施點的困擾或出現忘記施點之情形發生。此外，可注射式溫敏性水凝膠在植入眼睛組織所造成傷口較小，且具高含水性、高度生物相容性及生物可降解性，且無細胞毒性，不須經過開刀取出。本發明之可注射式溫敏性水凝膠材料成本低廉，且僅需簡易的製程與裝置，因此對於青光眼藥物製劑的開發極具發展性。

除非本文另外界定，否則本發明所用之科學及技術術語應具有一般熟 習此項技術者通常所理解之含義。該等術語之含義及範疇應為清晰的；然而，在任何潛在歧義之情況下，本文所提供之定義優於任何辭典或外在定義。

除非本文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

本文中所使用之術語「應變(Strain)」係意指當給予本發明之凝膠一作用力F時，所造成的水平位移與高的比值，即物體因受力所產生的變形率，通常以%表示。

本發明提供一種溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠之製備方法，其步驟包含：提供經由親疏水兩性改質之濃度為0.1~10%(w/v)的幾丁聚醣溶液；以及在4-20℃低溫下，於該幾丁聚醣溶液中加入濃度為50~1000μg/ml之水/脂溶性青光眼藥物、0.001~0.02%(w/v)之保存劑、5~20%(v/v)之選自甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙醇或乙二醇(glycol)或彼等之任意組合之溶劑以及10~50%(w/v)之鹼性結構安定劑(basic structural stabilizer)，以形成一包覆藥物之幾丁聚醣溶膠(sol)，當該幾丁聚醣溶膠由低溫回升至30-40℃時，即形成一固狀之幾丁聚醣凝膠(gel)。

在一較佳實施例中，該經由親疏水兩性改質之幾丁聚醣溶液之濃度為0.1~3%(w/v)；該幾丁聚醣溶液係由分子量為50kDa~250kDa、去乙醯化95%之幾丁聚醣粉末所製成。較佳地，該幾丁聚醣係以鹵乙酸類進行親水性改質，且該鹵乙酸類係一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、一溴乙酸、二溴乙酸或一溴一氯乙酸。較佳地，該幾丁聚醣係以碳數2-12長碳鏈之酸酐進行 疏水性改質，且該酸酐係乙酸酐或己酸酐。

在一較佳實施例中，該青光眼藥物為拉坦前列素(Latanoprost)或馬來酸噻嗎洛爾(Timolol maleate)。

在一較佳實施例中，該保存劑為氯化苯二甲羥銨(Benzalkonium chloride)。

在一較佳實施例中，該鹼性結構安定劑為β-甘油基磷酸鈉、綠槴子素(genipin)、碳酸氫鈉或彼等之任意組合。

在一較佳實施例中，該形成該幾丁聚醣凝膠之步驟後，更包含以照射劑量為3~10KGy之伽瑪射線照射該凝膠之步驟。

本發明亦提供一種溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠，包含：一高分子基質，包含親疏水兩性改質之幾丁聚醣；一添加物，分散於該基質中，其中該添加物包含一水/脂溶性青光眼藥物、一保存劑、一選自甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙醇或乙二醇(glycol)或彼等之任意組合之溶劑以及一鹼性結構安定劑；以及水。

在一較佳實施例中，該溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠係由前述之製備方法製備。較佳地，該藥物載體凝膠不含磁敏性奈米膠囊，並可製作成果凍狀或牙膏狀。

圖1顯示兩性甲殼素凝膠由低溫放置於37℃前後，液態與不可流動之凝膠之轉變。

圖2顯示有無添加保存劑氯化苯二甲羥銨(Benzalkonium chloride)的凝膠經過流變儀施予不同頻率下所檢測出來黏度變化之曲線。

圖3顯示添加有0.01%，0.02%氯化苯二甲羥銨之凝膠分別在4℃與25℃下從第一天到第七天並無出現出水現象。

圖4之(a)圖為有無添加保存劑氯化苯二甲羥銨的凝膠在體外藥物釋放之結果，有添加保存劑會比無添加保存劑藥物釋放來得快。圖4之(b)圖為凝膠在不同溫度下的體外藥物釋放之結果，藥物釋放會隨著溫度越高釋放越快。

圖5顯示照射伽瑪射線前後的凝膠在體外藥物釋放之結果，凝膠在照射伽瑪射線後，前7小時的藥物釋放量會明顯增加。

本發明可能以不同的形式來實施，並不僅限於下列文中所提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。

實施例1： 製備包覆青光眼藥物之凝膠

首先提供經由親疏水兩性改質之0.1~10%(w/v)(較佳為0.1~3%(w/v))的幾丁聚醣溶液。本發明中，是使用去分子量為50kDa~250kDa、去乙醯化 95%之幾丁聚醣粉末，並以鹵乙酸類進行親水性改質、以碳數2-12長碳鏈之酸酐進行疏水性改質。其中，鹵乙酸類可譬如為一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、一溴乙酸、二溴乙酸或一溴一氯乙酸；酸酐可譬如為乙酸酐或己酸酐。而此經改質之幾丁聚醣溶液係具有負電性(negative charge zeta potential)、生物降解性及自組裝(self-assemble)形成微胞之能力。幾丁聚醣溶液之溶劑，可由水或水與油類的混合物組成，即80~99.5%(w/v)的稀釋溶液中加入1~20%的有機溶劑(油類)，油類可譬如為二甲基亞碸(DMSO)、乙醇(alcohol)、乙二醇(glycol)或甘油(glycerol)。例如，甘油加入量為5~20%(v/v)，DMSO加入量為0.001~0.1%(v/v)。在本發明製程中混合溶質、溶劑之方式是利用電動式旋轉攪拌器與磁力攪拌器進行混合。

合成親疏水兩性改質的幾丁聚醣(Amphiphilic Chitosan，CHC)粉末之步驟例示如下：

1.在1000ml三頸圓底瓶中放入20g幾丁聚醣(chitosan)，加入200ml異丙醇(Isopropano)攪拌30分鐘，呈懸浮溶液。

2.然後，每五分鐘加入5ml 13.3N的氫氧化鈉(NaOH)溶液，共加入10次50ml。

3.攪拌30分鐘後，將100g氯乙酸分五等份在五分鐘之內加入瓶中，注意不可太快避免氯乙酸未完全溶解。

4.再油浴加熱至60℃。反應4小時後，以抽氣過濾方式收集產物，以 水：甲醇(體積比1：9)把產物邊過濾邊洗淨。

5.接著，於60℃烘箱內烘乾1天，產物為白色帶淡黃色之N,O-羧甲基幾丁聚醣(N，O-carboxymethyl chitosan，NOCC)粉末，可溶於水。

6.取4g NOCC於250ml反應瓶中，添加100ml純水完全攪拌溶解一天。

7.加入50ml甲醇混合均勻後，再加入2.8ml的己酸酐(hexanoyl anhydride)反應24小時。

8.反應完的溶液以透析帶收集，先以水比乙醇(1：4)透析一天後，再以純乙醇透析兩天去除酸及離子。

9.將產物收集後於60℃下烘乾一天，產物為兩性改質幾丁聚醣粉末。

利用改質後的親疏水兩性幾丁聚醣(甲殼素)其本身所具有負電性以及自組裝形成微胞之特性，在調配至0.1~10%(w/v)(較佳為0.1~3%(w/v))的改質幾丁聚醣溶液中，在4-20℃低溫下加入水/脂溶性之青光眼藥物(如拉坦前列素(Latanoprost)(濃度為50~1000μg/ml)、馬來酸噻嗎洛爾(Timolol maleate)等)以及保存劑(如氯化苯二甲羥銨(Benzalkonium chloride)，添加量為0.001~0.02%(w/v))或其他欲承載的分子進行包覆，並藉由加入具多個氫氧基(-OH)的甘油來與幾丁聚醣形成氫鍵而穩定凝膠之結構，接著加入β-甘油基磷酸鈉(濃度為10~50%(w/v))作為交鏈劑(鹼性結構安定劑)，再將兩性幾丁聚醣凝膠放置到37℃後，此凝膠將轉變成不可流動之凝膠，如圖1所示。依上述方法製成之凝膠在溫度低於20℃時為 可流動液體，升溫至高於30℃轉變成不可流動的凝膠。在凝膠中添加保存劑主要是為了延長凝膠與青光眼藥物的保存，氯化苯二甲羥銨(Benzalkonium chloride)係一般市售眼藥水產品常用的保存劑，其屬於胺鹽類保存劑，用途主要在於消毒與抗菌，其消毒程度雖低，但毒性、刺激性低且價格便宜。此外，該凝膠在本發明製程中可以因應實驗以及應用性質之設計，額外添加聚合(高分子)電解液與交鏈劑，如褐藻酸鈉與Genipin，藉以改變載體的特性；或者，也可以藉由調整添加物的比例來改變其物理性之硬度與流動性。

親疏水兩性幾丁聚醣凝膠的物理性質

本發明亦檢測兩性幾丁聚醣凝膠的流動與形變行為，這些與凝膠的黏度性、彈性以及結構強度有關。利用流變儀測量在不同剪切應力作用下，凝膠的黏度與流速等的變化，從中分析凝膠的物理性質，如圖2所示。其中可看出凝膠形變量為凝膠厚度的10%。

凝膠的穩定性

本發明亦探究凝膠添加保存劑氯化苯二甲羥銨後的保存與穩定性，因為氯化苯二甲羥銨屬於鹽類，可能會讓凝膠出現脫水現象，於是針對從凝膠成品的完成到保存在4℃與25℃的溫度環境下，第一天到第七天的保存情形進行觀察，其觀察情形如圖3所示。結果顯示從第一天到第七天並無出現出水現象。

以γ射線照射方式進行滅菌與消毒

考量到未來的應用，能夠將此凝膠實際注射到人體的眼睛組織或其他組織內，病患在使用時能夠安全無慮，並符合生醫與藥物的製劑劑型之規範，有鑑於此，本發明以伽瑪射線照射(照射劑量為3~10KGy)、處理的方式，針對此凝膠成品進行滅菌與消毒，藉以提升凝膠的使用安全性。

青光眼藥物之釋放

考量在未來的應用，能將此凝膠以植入眼睛組織的方式，以藥物長時效性釋放的功能進一步達到治療青光眼之效果，故先在體外進行凝膠的藥物釋放，以模擬此藥物凝膠在動物體內之環境與藥物釋放之行為，將0.5ml凝膠放置於1.5ml離心管內，再以1ml模擬人體體液之磷酸緩衝液(pH 7.4)進行實驗，於預先設定時間點更換全新的磷酸緩衝液，並將更換下來含有藥物的磷酸緩衝液以高效能液相層析儀(HPLC)進行定量分析，本發明以脂溶性青光眼藥物如拉坦前列素(Latanoprost)作為模式藥物，探究其釋放行為之趨勢。

凝膠之中的添加物對於其組成與結構是有影響的，這很有可能會進一步改變藥物的釋放行為，如圖4(a)所示，即為添加氯化苯二甲羥銨對於藥物釋放行為的影響。除了添加物會影響到凝膠的藥物釋放行為之外，由於此凝膠屬於溫度敏感性，且凝膠在未來應用的溫度環境可能有所改變，因此，將凝膠放置於不同溫度下進行藥物釋放，其釋放趨勢如圖4(b)所示。

此外，因為伽瑪射線屬於高能量的電磁輻射射線，很有可能對凝膠成品產生破壞、損害等影響，而進一步改變藥物釋放的行為，因此，勢必需要探究凝膠在伽瑪射線照射前後，其藥物釋放趨勢的變化，如圖5所示。

一個熟知此領域技藝者能很快體會到本發明可很容易達成目標，並獲得所提到之結果及優點，以及那些存在於其中的東西。本發明中之凝膠及其製造程序與方法乃較佳實施例的代表，其為示範性且不僅侷限於本發明領域。熟知此技藝者將會想到其中可修改之處及其他用途。這些修改都蘊含在本發明的精神中，並在申請專利範圍中界定。

本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。

說明書中提及之所有專利及出版品，都以和發明有關領域之一般技藝為準。所有專利和出版品都在此被納入相同的參考程度，就如同每一個個別出版品都被具體且個別地指出納入參考。

在此所適當地舉例說明之發明，可能得以在缺乏任何要件，或許多要件、限制條件或並非特定為本文中所揭示的限制情況下實施。所使用的名詞及表達是作為說明書之描述而非限制，同時並無意圖使用這類排除任何等同於所示及說明之特點或其部份之名詞及表達，但需認清的是，在本發 明的專利申請範圍內有可能出現各種不同的改變。因此，應了解到雖然已根據較佳實施例及任意的特點來具體揭示本發明，但是熟知此技藝者仍會修改和改變其中所揭示的內容，諸如此類的修改和變化仍在本發明之申請專利範圍內。

Claims (9)

1. 一種溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠之製備方法，其步驟包含：提供經由親疏水兩性改質之濃度為0.1~10%(w/v)的幾丁聚醣溶液；以及在4-20℃低溫下，於該幾丁聚醣溶液中加入濃度為50~1000μg/ml之水/脂溶性青光眼藥物、0.001~0.02%(w/v)之保存劑、5~20%(v/v)之選自甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙醇或乙二醇(glycol)或彼等之任意組合之溶劑以及10~50%(w/v)之鹼性結構安定劑(basic structural stabilizer)，以形成一包覆藥物之幾丁聚醣溶膠(sol)，當該幾丁聚醣溶膠由低溫回升至30-40℃時，即形成一固狀之幾丁聚醣凝膠(gel)；其中該幾丁聚醣溶液係以鹵乙酸類進行親水性改質，且該鹵乙酸類係一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、一溴乙酸、二溴乙酸或一溴一氯乙酸；其中該幾丁聚醣溶液係以碳數2-12長碳鏈之酸酐進行疏水性改質，且該酸酐係乙酸酐或己酸酐；其中該保存劑為氯化苯二甲羥銨(Benzalkonium chloride)，且該鹼性結構安定劑為β-甘油基磷酸鈉、綠槴子素(genipin)、碳酸氫鈉或彼等之任意組合。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該經由親疏水兩性改質之幾丁聚醣溶液之濃度為0.1~3%(w/v)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該幾丁聚醣溶液係由分子量為50kDa~250kDa、去乙醯化95%之幾丁聚醣粉末所製成。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該青光眼藥物為拉坦前列素(Latanoprost)或馬來酸噻嗎洛爾(Timolol maleate)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該形成該幾丁聚醣凝膠之步驟後，更包含以照射劑量為3~10KGy之伽瑪射線照射該凝膠之步驟。
6. 一種溫敏型可注射式青光眼藥物載體凝膠，包含：一高分子基質，包含親疏水兩性改質之幾丁聚醣；一添加物，分散於該基質中，其中該添加物包含一水/脂溶性青光眼藥物、一保存劑、一選自甘油、二甲基亞碸(DMSO)、乙醇或乙二醇(glycol)或彼等之任意組合之溶劑以及一鹼性結構安定劑；以及水；其中該幾丁聚醣係以鹵乙酸類進行親水性改質，且該鹵乙酸類係一氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、一溴乙酸、二溴乙酸或一溴一氯乙酸；其中該幾丁聚醣係以碳數2-12長碳鏈之酸酐進行疏水性 改質，且該酸酐係乙酸酐或己酸酐；其中該保存劑為氯化苯二甲羥銨(Benzalkonium chloride)，且該鹼性結構安定劑為β-甘油基磷酸鈉、綠槴子素(genipin)、碳酸氫鈉或彼等之任意組合。
7. 如申請專利範圍第6項所述之青光眼藥物載體凝膠，其係藉由申請專利範圍第1項所述之方法製備。
8. 如申請專利範圍第6項所述之青光眼藥物載體凝膠，其係製作成果凍狀或牙膏狀。
9. 如申請專利範圍第6項所述之青光眼藥物載體凝膠，其不含磁敏性奈米膠囊。