TWI533873B - 治療肝臟疾病之醫藥組成物 - Google Patents

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Description

治療肝臟疾病之醫藥組成物
本發明係關於一種用以治療肝臟疾病之醫藥組成物，其包含一包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物。此外，本發明亦關於前述微小RNA模擬物於治療肝臟疾病與降低特定酵素表現的應用。
全球人類在日漸過重以及肥胖的趨勢之下，非酒精性脂肪肝已經成為了普遍的肝臟疾病之一。從廣泛的定義來說，當肝臟細胞中以三酸甘油脂為主要成份的脂肪累積到其重量超出細胞總重量的百分之五時，就稱為非酒精性脂肪肝。在非酒精性脂肪肝的疾病進程中，隨著細胞內病態性的脂肪與油滴累積，會造成不同程度的發炎，進而導致肝纖維化，在臨床病理學上，肝纖維化會進一步惡化成肝硬化、肝癌、肝機能受損，且伴隨著極高的死亡風險。然而，由於目前並無標準藥物或專一性的治療方法可逆轉脂肪肝的發生。現今揭開肝臟中脂肪堆積的過程和預防脂肪肝的產生，已成為科學家的研究的課題。
甲硫胺酸腺苷基轉移酶(methionine adenosyltransferase，MAT)是一種細胞酶，可催化S-腺苷基甲硫胺酸(S-adenosyl methionine，SAM)的合成作用，SAM是生物主要的甲基供體，也是肝細胞增殖、 死亡及分化過程中的重要調控因子[1,2]。MAT1A及MAT2A這兩個哺乳類基因帶有兩個不同的MAT異構體(isoform)的基因編碼，而第三個基因MAT2B則帶有MAT2A之調控次單元的基因編碼。MAT1A在成人肝臟中有特異性的表現，而MAT2A的分布則相當廣泛[3-5]。由於MAT異構體的催化動力學及調控性質不同，在表現MAT1A的細胞中，SAM含量明顯高於表現MAT2A的細胞[6,7]。在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中，MAT1A的表現會降低，而MAT2A的表現會增加，這被稱為MAT1A：MAT2A轉換(MAT1A：MAT2A switch)[8-11]。這項轉換會伴隨著MAT2B表現增加，這會使SAM含量降低，而有利於肝腫瘤細胞的生長[2,4,6,12,13]。透過不同的剪接(splicing)，SAM可在肝腫瘤細胞中選擇性誘導促凋亡(pro-apoptotic)的Bcl-XS蛋白表現，但在正常的肝細胞中則否[14]。此外，MAT2B在HCC中的表現增加也會造成SAM含量降低，而促進癌細胞生長[15]。因為MAT2A和MAT2B在促進肝腫瘤細胞生長方面扮演關鍵角色，在抗贅瘤治療中，它們會是有效的目標。近年的研究顯示，利用小分子干擾RNA使MAT2A和MAT2B沉默(silencing)後，實質上會抑制肝腫瘤細胞生長並誘發其凋亡[16-19]。
另外，乙醯輔酶A羧化酶會催化乙醯輔酶A的羧化反應，而形成丙二醯輔酶A(malonyl-CoA)，它有α和β兩個異構物，分屬哺乳類動物的ACACA及ACACB基因。ACACA是一種細胞質酵素(cytosolic enzyme)，負責脂肪酸在促進脂肪生成的組織(lipogenic tissue)中合成的第一步[19]。肉鹼軟脂醯輔酶A轉移酶I(Carnitine-palmitoyl-CoA transferase I，CPT1)是一種會將長鏈脂肪醯輔酶A(long-chain fatty acyl-CoA)移入粒腺體進行氧化作用的限速酶(rate-limiting enzyme)，它很快地就被ACACB所產生的丙二醯輔酶A所抑制[20,21]。而三酸甘油酯的重要合成酵素二脂醯甘油醯基轉移酶(diglyceride acyltransferase，DGAT)在肝臟油滴累積的過程中扮演重要角色[22,23]。二脂醯甘油醯基轉移酶有兩個形式，分屬DGAT1及DGAT2基因。近年來的研究顯示，降低ACACA、ACACB或DGAT2的表現可緩和或逆轉脂肪肝[24,25]，說明對這些基因形成藥理上的抑制可能是個適用於治療非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)的方法。
小蘗鹼(berberine)是一種可從多種草藥(如黃連(Coptis chinensis))分離出來的異喹啉生物鹼，其藥用效果廣泛，包括抗癌、抗微生物、抗發炎及抗糖尿病的效果[28-29]。近年的研究著重於它的抗腫瘤效果，包括抗增生、抗侵犯(anti-invasion)以及誘發多種腫瘤細胞凋亡[29-38]。在HCC中，已有報告指出小蘗鹼係透過細胞週期停滯並活化自噬型與粒線體凋亡型的細胞死亡作用，而達到抑制細胞生長與存活的效果[39-41]。此外，亦有研究指出小蘗鹼具有降血糖、降血脂與降低密度膽固醇的功能，動物實驗證據也說明小蘗鹼可以降低肝臟中的脂肪含量。
微小RNA(MicroRNA，縮寫為miRNA)是一種非編碼(non-coding)RNA的小分子，其係由21-23個核苷酸所構成，在多種生物作用中扮演重要角色，包括發育、增殖、死亡的過程[42,43]。目前 已在多種人類癌症中觀察到miRNA表現失控的情形，因此，miRNA可能在腫瘤形成的過程中扮演腫瘤抑制劑或致癌基因的角色[44,45]。一般來說，成熟的miRNA會指揮其轉錄後抑制作用(posttranscriptional repression)，其係藉由使miRNA之種子區域(seed region)與目標基因之mRNA位於3’端的非編碼序列3’UTR產生配對結合，而使目標基因的mRNA變得不安定，而產生轉譯沉默(translational silencing)[46,47]。miRNA的種子區域是從其5’段算起第2-8個核苷酸，只要種子區域可與目標基因之3’UTR序列互補，即可發揮作用，不需要整段miRNA都與目標基因之3’UTR序列互補。在miRNA前體(pre-miRNA)之髮夾式結構形成的過程中，會產生雙股miRNA(miRNA duplex)，其係由引導股(guide strand)與過客股(passenger strand)(亦稱為miRNA及miRNA*)所組成。通常來說，引導股會選擇性地與Argonaute蛋白(AGO)結合，而形成一miRNA誘導沉默複合體(miRNA-induced silencing complex，miRISC)；至於過客股，由於它的安定態較低，一般是認為它會先被分解[48]。然而，最近的研究顯示有多種miRNA*會大量累積，而一般來說，內生性miRNA基因並不會將miRNA*從功能性miRISC複合體中排除，這表示我們仍應將這些miRNA*列入考慮[49-54]。
本發明係利用微小RNA的微陣列晶片進行實驗，發現人類肝癌細胞株(HepG2)及人類初代肝細胞(PHH)在經小檗鹼處理後，hsa-miR-21-3p的表現量都會上升。配合全基因微陣列晶片、生物資訊 軟體與一系列實驗後，發現在投予miR-21-3p(MIR21基因的其中一條成熟miRNA)的模擬物後，會降低肝癌細胞中MAT2A、MAT2B及EEF2K的表現，提高細胞內SAM濃度，而抑制肝癌細胞生長且誘導其細胞凋亡。此外，投予miR-21-3p的模擬物亦可降低人類初代肝細胞內的脂肪油滴含量，抑制ACACA、ACACB及DGAT2基因的表現，同時也會降低人類初代肝細胞內脂肪合成相關基因(如HLCS、MTOR、RPTOR)的表現，進而減少肝臟脂肪生合成、促進脂肪氧化，減緩脂肪肝。
本發明之又一目的係提供一種包含一微小RNA模擬物之醫藥組合物，其中前述微小RNA模擬物可用以抑制肝癌細胞生長且誘導其細胞凋亡，同時減少肝臟脂肪生合成，促進脂肪氧化，對脂肪肝產生療效。
本發明之另一目的係提供一種降低甲硫胺酸腺苷轉移酶MAT2A及MAT2B表現的方法，前述酵素係與抑制肝癌細胞生長且誘導其細胞凋亡有關，可應用於肝癌的治療。
本發明之再一目的係提供一種降低乙醯輔酶A羧化酶ACACA及ACACB、以及二脂醯甘油醯基轉移酶DGAT2的方法，前述酵素係與降低脂肪代謝與三酸甘油脂合成過程有關，可應用於脂肪肝的治療。
本發明係提供一種用以治療肝臟疾病之醫藥組成物，其包含一包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述醫藥組成物係包含 hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述微小RNA模擬物係經化學修飾而不會被核糖核酸酶分解；更佳者，前述微小RNA模擬物係經化學修飾而在核糖的二號氧原子與四號碳原子之間形成一亞甲基橋(O2',C4'-methy-lene bridge)，而形成穩定的鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)形式。這一類經化學修飾的核酸分子不需要藥物載體，可直接投予病患。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述之醫藥組成物係透過一般RNA藥物的遞送方式將本發明之微小RNA模擬物送入目標細胞，包括透過轉染及/或共軛結合遞送(conjugate delivery)方法將前述微小RNA模擬物送入目標細胞。前述轉染方法係包括利用如微脂體、外泌體(exosome)、奈米粒子、病毒等將本發明之微小RNA模擬物轉染到目標細胞內；前述奈米粒子包括脂質奈米粒子(lipid nanoparticle，LNP)、聚合物奈米粒子如殼聚糖等。而前述共軛結合遞送係使前述微小RNA模擬物與適配體或膽固醇結合後送入目標細胞，例如直接在本發明之微小RNA模擬物進行修飾，使之與適配體(aptamer)結合，送入體內後，適配體可與其目標細胞結合，而將本發明之微小RNA模擬物送入目標細胞；或者，可使本發明之微小RNA模擬物與膽固醇共價結合，如此在將前述結合分子送入肝臟後，前述結合分子可被表面具有低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)之受體的細胞攝入，而進入肝臟細胞內。另外，共軛結合遞送亦可與轉染方法結合，例如可將本發明之微小RNA模擬物與適配體結合後的共軛物與轉染 試劑(如微脂體)混合，再透過轉染送入目標細胞。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述醫藥組成物之給藥方式包括口服及非經口給藥；更佳者，係以注射方式投予患者；更佳者，係以靜脈注射方式投予患者。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述肝臟疾病包括肝癌及脂肪肝。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述醫藥組成物可降低甲硫胺酸腺苷轉移酶MAT2A及MAT2B的表現，而達到治療肝癌的效果。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述醫藥組成物可降低乙醯輔酶A羧化酶ACACA及ACACB，以及二脂醯甘油醯基轉移酶DGAT2的表現，而達到治療脂肪肝的效果。
本發明並提供一種將一包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物用於製備治療肝癌之藥物的用途。
本發明也提供一種將一包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物用於製備治療脂肪肝之藥物的用途。
本發明又提供一種降低乙醯輔酶A羧化酶ACACA及ACACB，以及二脂醯甘油醯基轉移酶DGAT2的表現的方法，其係透過投予小蘗鹼或一包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物而達成。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述降低ACACA、ACACB及DGAT2的方法係包括投予小蘗鹼或hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35) 之單股RNA分子的微小RNA模擬物。本發明另外提供一種降低甲硫胺酸腺苷轉移酶MAT2A及MAT2B的表現的方法，其係透過投予小蘗鹼或一包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物而達成。
在本發明之較佳具體實施態樣中，前述降低MAT2A及MAT2B的方法係包括投予小蘗鹼或hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物。
本發明係提供一種包含hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物的醫藥組成物，其中hsa-miR-21-3p的微小RNA模擬物可透過多種作用機制而改善肝臟功能，並使癌細胞凋亡，對於肝臟疾病的治療極具潛力。
第一A圖係顯示未經處理及經小蘗鹼處理之HepG2細胞株的miRNA表現圖譜的比較散射圖。箭頭顯示在經40μM小蘗鹼處理2h及4h後之HepG2細胞株中惟一有增加的miRNA就是hsa-miR-21-3p。對角斜線則顯示其倍數變化落在0.5-2倍之間。
第一B圖係顯示未經處理及經40μM小蘗鹼處理之HepG2細胞在8h內的時間變化。hsa-miR-21-3p及hsa-miR-21-5p的含量係以qRT-PCR加以測量，並以倍數變化來呈現。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第二圖是18種哺乳類動物之MIR21基因序列比較，顯示MIR21基因在哺乳類演化中被保留下來。星號*表示序列中的種子區域。
第三A圖係顯示利用miRanda演算法所預測之miR-21-3p的目標基因(mirSVR分數<-0.1)與在微陣列數據中顯示在經小蘗鹼處理之HepG2細胞中受到負向調控之基因的疊圖，兩者只有5個基因是重複的，即MAT2A、DIDO1、EEF2K、NBPF8及TMEM137。
第三B圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染後的MAT2A、DIDO1、EEF2K、NBPF8及TMEM137表現，其mRNA表現係以qRT-PCR加以測量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第三C圖顯示HepG2細胞先經100nM之miR-21-3p髮夾式結構抑制物或其陰性對照(NC)抑制物轉染24h，再以40μM小蘗鹼處理後從0-8h內的時間變化，其mRNA表現係以qRT-PCR加以測量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第四A圖顯示MAT1A、MAT2A及MAT2B基因3’UTR上各個種子序列互補位置的mirSVR分數。
第四B圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染24h及48h後的MAT1A、MAT2A及MAT2B表現，其mRNA表現係以qRT-PCR加以測量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第四C圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染72h後的MAT1A、MAT2A及MAT2B表現，其蛋白表現係以西方墨點法加以測量，GAPDH係為對照組。
第四D圖顯示HepG2細胞經100nM之miR-21-3p抑制物或其陰性對照(NC)抑制物轉染24h及48h後的MAT1A、MAT2A及MAT2B表現，其mRNA表現係以qRT-PCR加以測量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第四E圖顯示未經處理及經40μM小蘗鹼處理之HepG2細胞在8h內的MAT1A、MAT2A及MAT2B表現，其mRNA表現係以qRT-PCR加以測量。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第四F圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染72h後的細胞內SAM濃度，其係以倍數表現。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第五A圖係為MAT2A之3’UTR序列上hsa-miR-21-3p的可能結合位置示意圖。
第五B圖係為MAT2B之3’UTR序列上hsa-miR-21-3p的可能結合位置示意圖。
第五C圖係為MAT2A之3’UTR序列的種子序列結合位置突變示意圖，其係插入在pMIR報告載體的螢光素酶下游。此外亦顯示將圖中野生型或突變型pMIR載體、Renilla螢光素酶報告載體pRL-TK、以及hsa-miR-21-3p或其陰性對照模擬物三者共同轉染於HEK-293T與HepG2細胞後所測得的螢光素酶活性。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第五D圖係為MAT2B之3’UTR序列的種子序列結合位置突變示 意圖，其係插入在pMIR報告載體的螢光素酶下游。此外亦顯示將圖中野生型或突變型pMIR載體、Renilla螢光素酶報告載體pRL-TK、以及hsa-miR-21-3p或其陰性對照模擬物三者共同轉染於HEK-293T與HepG2細胞後所測得的螢光素酶活性。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第六A圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染48h後，以錐藍染劑排除測定法所定量之存活HepG2細胞數。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第六B圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染24h並與BrdU共同培養24h後，以BrdU掺入測定法所定量之細胞增殖倍數。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第六C圖顯示HepG2細胞經陰性對照(NC)模擬物轉染72h後，以流式細胞儀定量凋亡的細胞數目。
第六D圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p模擬物轉染72h後，以流式細胞儀定量凋亡的細胞數目。
第六E圖係為第六C及六D圖之量化比較圖。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第七A圖係為在微陣列數據中顯示經40μM小蘗鹼處理2h之PHH細胞中變化>1.5倍(與未經處理之PHH細胞比較)的微小RNA， 在3位捐贈者的PHH細胞中只有has-miR-21-3p的表現量都有上升。
第七B圖係顯示未經處理(CTL)及經40μM小蘗鹼處理之PHH細胞在2h時的has-miR-21-3p表現量，其mRNA表現係以qRT-PCR加以測量。以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第七C圖顯示PHH細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染72h後的細胞內油滴含量，其係以倍數表現。以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第七D圖顯示以HepG2細胞作為油酸誘導細胞內油滴形成之活體外肝模型的實驗流程圖。
第七E圖顯示經200μM油酸誘導油滴形成及未經處理之HepG2細胞中的油滴含量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第七F圖顯示在經油酸誘導油滴形成後，未經處理及經40μM小蘗鹼處理72h之HepG2細胞中的油滴含量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第七G圖顯示在經油酸誘導油滴形成後，以100nM之miR-21-3p髮夾式結構抑制物或其陰性對照(NC)抑制物轉染24h、再以40μM小蘗鹼處理48h後之HepG2細胞中的油滴含量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第七H圖顯示在經油酸誘導油滴形成後，以50nM之miR-21-3p 或其陰性對照(NC)模擬物轉染72h後之HepG2細胞中的油滴含量。三個獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第八圖係顯示未經處理(CTL)及經40μM小蘗鹼處理之PHH細胞在2h、4h、8h時的脂肪代謝基因mRNA表現量，以倍數表現。以四位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第九A圖顯示未經處理(CTL)及經40μM小蘗鹼處理之PHH細胞在2h、4h、8h時的ACACA及DGAT2基因mRNA表現量，以倍數表現。其中ACACA的數據係以四位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現，而DGAT2的數據係以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第九B圖顯示PHH細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染24h及48h後的ACACA、ACACB、DGAT2基因mRNA表現量，以倍數表現。以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第九C圖顯示HepG2細胞先經100nM之miR-21-3p髮夾式結構抑制物或其陰性對照(NC)抑制物轉染24h，再以40μM小蘗鹼處理後從0-8h內的ACACA、ACACB、DGAT2基因mRNA表現量，以倍數表現。以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第九D圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染24h後的ACACA、ACACB、DGAT2基因mRNA表現量，以倍數表現。以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
第九E圖顯示HepG2細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染72h後的ACACA、ACACB、DGAT2基因蛋白表現量。
第九F圖顯示HepG2及PHH細胞經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染72h後的細胞內丙二醯輔酶A濃度，以倍數表現。以三位捐贈者之PHH細胞進行獨立實驗的數據係以平均值±標準差的方式呈現。星號*表示具有顯著意義(P<0.05)。
本發明使用miRNA微陣列表現分析，發現在以小蘗鹼處理人類肝腫瘤細胞株HepG2後，miR-21-3p的表現量會增加。在整合經小蘗鹼處理之HepG2細胞的基因表現圖譜及透過定序miRNA目標預測軟體所產生的基因列表，我們定出了可能的miR-21-3p目標，亦即MAT2A、DIDO1、EEF2K、NBPF8及TMWM137。後續實驗證實miR-21-3p會直接抑制MAT2A的表現，其係透過與3’UTR結合來抑制MAT2B的表現。此外，miR-21-3p的過度表現會提高細胞內SAM的含量，而這已證實會減少肝腫瘤細胞的生長。我們也發現miR-21-3p會降低EEF2K的表現，目前已有報告顯示EEF2K是抗癌治療的可用標的，因為它會使腫瘤生長，並抵抗細胞死亡[55]。因此，miR-21-3p過 度表現會抑制HepG2細胞生長，並誘發凋亡。結果顯示，miR-21-3p係作為一腫瘤抑制劑，這說明它在HCC具有治療的潛力。
細胞培養及處理
在以下實施例中，所使用的人類HepG2細胞及HEK-293T細胞均得自美國細胞培養暨儲存中心(American Tissue Culture Collection，ATCC)。人類HCC的HepG2細胞株係以添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Invitrogen)、2.2g/L碳酸氫鈉(Sigma)、0.1mM非必須胺基酸(Caisson)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)及10ml/L青黴素-鏈黴素-兩性黴素溶液(Biological Industries)的Minimum Essential Medium Eagle培養基(Sigma)進行培養。人類HEK-293T細胞則是維持在添加10% FBS及3.7g/L碳酸氫鈉(Sigma)之高葡萄糖Dulbecco’s Modified Eagle培養基(Invitrogen)中。兩個細胞株都是在37℃及5% CO2的條件下培養。
得自高加索人種捐贈者的人類初代肝細胞(primary human hepatocyte，PHH)係購自Invitrogen，依照製造商所建議的方法進行培養。先將這些冷凍細胞解凍並移入冷凍肝細胞回復培養基(CM7000，Invitrogen)，在室溫下以100×g離心10分鐘，之後以平板培養基(plating medium)(CM3000，Invitrogen)稀釋成種入培養盤的密度，再加入經膠原蛋白I(collagen I)塗覆的培養盤(Invitrogen)。將這些培養盤在37℃及5% CO2的條件下培養4-6小時，使之長成單層細胞。之後，以培養用培養基(CM4000，內含0.35mg/mL GeltrexTM Matrix，購自Invitrogen)取代平板培養基，並每天 更換培養用培養基。在以下實施例中，係使用三到四位捐贈者的細胞進行相關實驗。
製備50mM小蘗鹼氯化物(berberine chloride)(Sigma-Aldrich)在二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)中的儲存溶液。細胞係以40μM小蘗鹼氯化物或0.08% DMSO(對照組)來進行處理。在培養細胞內誘導油滴(lipid drpplet)形成時，係在培養基中加入200μM油酸(Sigma-Aldrich)後培養24小時。
RNA分離製備
依照製造商所建議的方法，以TRIZOL試劑(Invitrogen)來萃取細胞的總RNA(total RNA)，並以NanoDrop ND-1000分光光度計(Nanodrop Technologies)來測量總RNA的量，再以Agilent 2100生物分析儀與RNA 6000 nano套組(Agilent Technologies)來測量總RNA的品質及完整度。
微陣列測定
使用含有866種人類miRNA的Agilent人類miRNA Microarray R14 V2定出miRNA圖譜。使用SurePrint G3人類GE 8×60K(Agilent Technologies)之miRNA微陣列系統的標準方法對總RNA進行標記(labeling)及雜合(hybridization)。之後用Agilent微陣列掃瞄方法來掃瞄微陣列，再以Agilent Feature Extraction軟體(Agilent Technologies)進行影像分析及定量。使用GeneSpring Gx軟體(Agilent Technologies)來鑑定那些在經小蘗鹼處理之樣本與未處理之樣本之間有不同表現的miRNA(倍數變化>2)。使用HumanHT-12 v4 Expression BeadChip(Illumina)來進行基因表現微陣列測定。利用RT-IVT Kit(Ambion)及TotalPrep RNA放大套組(Illumina)產生經標記之cRNA，之後依照製造商所建議的方法，使這些經標記之cRNA與微陣列進行雜合。使用GenomeStudio軟體(Illumina)來鑑定那些在經小蘗鹼處理之樣本與未處理之樣本之間有不同表現的miRNA(倍數變化>1.5，且P<0.05)。所有的微陣列數據均已存入NCBI GEO資料庫(GSE47822及GSE53416)。
定量式即時RT-PCR(qRT-PCR)測定 (1)微小RNA測定
利用TaqMan Small RNA Assays套組，以hsa-miR-21-3p-、hsa-miR-21-5p-或RUN6B-特異性引子(均購自Invitrogen)將總RNAs(1ng)反轉錄成cDNA。以RNU6B的量將微小RNA的表現量正規化。
(2)基因表現測定
依照製造商所建議的方法，利用M-MuLV反轉錄酶(Thermo)及Oligo(dT)12-18引子(Invitrogen)將總RNAs(1μg)反轉錄成cDNA。之後利用LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche)，使用表1的引子對這些cDNA進行即時PCR。之後以GAPDH量將基因表現量正規化。
微小RNA模擬物及抑制物的轉染
本發明並使用miRNA之模擬物(mimic)及抑制物(inhibitor)進行轉染實驗。miRNA模擬物可用以觀察miRNA所引發的效應，而miRNA抑制物則用以抑制細胞中內生性miRNA的表現，而使目標基因的表現更為明顯。
所有的miRNA模擬物及抑制物均購自Thermo Scientific Dharmacon，包括：
在轉染時，HepG2細胞係以每盤孔5×104個細胞的密度培養於24孔培養盤。依照製造商所建議的方法，利用DharmaFECT 4轉染試劑(Thermo Scientific Dharmacon)，以50nM之hsa-miR-21-3p(miR-21-3p mimic)或陰性對照模擬物(NC mimic)、或以100nM之hsa-miR-21-3p抑制物(miR-21-3p inhibitor)或陰性對照抑制物(NC inhibitor)來進行轉染。在進行RNA純化並分析基因表現之前，使細胞與微小RNA模擬物或抑制物共同培養24h或48h；若要分析蛋白表現，則要共同培養72h。
西方墨點法
以溶胞緩衝液(7M尿素、4% CHAPS、2M硫脲、40mM Tris、65mM 二硫代赤蘚醇)製備所有細胞的溶胞產物(lysate)。以12.5% SDS-PAGE分離蛋白樣本，之後將之轉移到PVDF膜上。使用下列初級抗體，包括兔子的多株抗體：抗MAT1A(1：800，GeneTex)、抗MAT2A(1：1000，GeneTex)、抗MAT2B(1：1000，GeneTex)、、抗ACACB(1：1000，Sigma)、抗DGAT2(1：1000，GeneTex)及抗GAPDH(1：3000，GeneTex)，以及小鼠的單株抗體：抗ACACA(1：1000，Millipore)。二級抗體為與HRP共軛結合之山羊多株抗兔或小鼠的IgG抗體(1：5000，abcam)。使用LAS-4000迷你螢光影像分析儀(Fujifilm)取得條帶的影像。西方墨點分析的定量則以Image J軟體來達成。以GAPDH量將蛋白表現量正規化。
螢光素酶報告質體的構築
利用PCR從HepG2細胞的基因體DNA放大MAT2A及MAT2B之3’UTR序列全長。
之後將PCR產物選殖到pMIR-REPORT螢光素酶miRNA表現報告載體(Invitrogen)，所有插入3’UTR構築體的序列都會以ABI PRISM DNA定序儀加以定序。
突變序列及質體的構築
依照製造商所建議的方法，利用Quikchange定位突變套組(Agilent)在MAT2A及MAT2B的3’UTR序列中針對hsa-miR-21-3p目標序列進行突變。
所有突變序列(包含MAT2A之位置1、位置2及其雙重突變，以及MAT2B的3’UTR變異構築體)都會透過DNA定序來加以確認。
雙重螢光素酶報告子的測定
在轉染的前一天，將HEK-293T及HepG2細胞以每盤孔5×104個細胞的密度種入24孔培養盤。使用Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen)，依照製造商所建議的方法，對HEK-293T及HepG2細胞進行三重轉染：(1)任一前文所述之pMIR-REPORT-3’UTR構築體(300ng)、(2)對照組Renilla螢光素酶報告質體pRL-TK(Promega)(10ng)、以及(3)50nM之hsa-miR-21-3p或陰性對照模擬物。依照製造商所建議的方法，利用Dual Luciferase報告子測定套組(Promega)及Paradigm偵測平台(Beckman)，在轉染48h後進行螢光素酶測定。以Renilla螢光素酶活性將螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase)的活性正規化。
細胞內SAM濃度的測量
在以50nM之hsa-miR-21-3p或陰性對照模擬物轉染72h後，將HepG2細胞以胰蛋白酶處理並進行計數。將5×104個HepG2細胞所形成之團塊中的細胞內SAM重新懸浮於30μL的萃取溶液(溶於ddH2O的0.2%過氯酸加0.08%(v/v)2-巰基乙醇)。細胞於室溫培養1h，每5分鐘震盪一次。將懸浮液於4℃、10000×g離心5分鐘，收集其上清液。之後依照製造商所建議的方法，以Bridge-It SAM螢光測定套組(Mediomics)來定量上清液中的SAM含量，並使用SpectraMax讀盤機(MolecularDevices)來進行偵測。
細胞增殖測定
在轉染的前一天，將HepG2細胞以每盤孔1×104個細胞的密度種入96孔培養盤。以50nM之hsa-miR-21-3p或陰性對照模擬物轉染24h後，將培養基更換為含有BrdU試劑的完全培養基，再培養24小時，以進行BrdU掺入(BrdU incorporation)。之後依製造商所建議的方法，使用BrdU細胞增殖比色ELISA套組(abcam)來定量BrdU掺入，並以MRXII微孔盤讀取儀(DYNEX)來進行偵測。
流式細胞儀對凋亡細胞及細胞內油滴的偵測
以50nM之hsa-miR-21-3p或陰性對照模擬物轉染72h後，將HepG2細胞以胰蛋白酶處理並進行計數。利用碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色後，在流式細胞儀上測量sub-G1的族群數目來偵測細胞凋亡情形。簡言之，細胞先以70%乙醇在冰上固定15分鐘，再以PI染液(溶於PBS的20μg/mL PI、0.1% Triton-X 100及0.2mg/mL RNase A)於室溫染色30分鐘，再以配有Summit軟體的CyAn ADP流式細胞儀(Beckman Coulter)進行分析。
細胞內的油滴則是透過BODIPY 493/503染色並使用流式細胞儀進行螢光強度的幾何測量來加以偵測。簡言之，細胞先於4℃以70%乙醇固定20分鐘，之後於室溫用BODIPY染液(溶於70%乙醇，濃度為10μg/mL)(Invitrogen)20分鐘，再以配有Summit軟體的CyAn ADP流式細胞儀(Beckman Coulter)進行分析。
細胞內丙二醯輔酶A濃度的偵測
在以50nM之hsa-miR-21-3p或陰性對照模擬物轉染72h後，將PHH 細胞或HepG2細胞以胰蛋白酶處理。之後依照製造商所建議的方法，以丙二醯輔酶A之ELISA套組(MyBioSource)來測量各樣本中的細胞內的丙二醯輔酶A(malonyl-CoA)濃度。
以下提供的實施例僅係進一步闡明本發明，而非以任何方式限制本文所揭露的內容。縱無進一步之闡述，該領域熟習此技藝之人士亦可根據此處之說明而充分實施本發明。在此引用的出版文獻均以其全文作為本發明之參考文獻。
實施例 實施例一，經小蘗鹼處理之HepG2細胞株中的miR-21-3p表現增加
近年來認為外源藥物(xenobiotic drug)所誘發之miRNA在引導藥理反應及毒性方面扮演重要的調控因子[56,57]，因此本發明在HCC的細胞中利用小蘗鹼處理來測試其miRNA表現是否有所不同。
使用含有866種人類miRNA探針的Agilent人類miRNA Microarray定出miRNA圖譜，來找出因小蘗鹼處理所誘發的miRNA。在2h及4h的處理後，將經40μM小蘗鹼處理之人類肝腫瘤細胞株HepG2的miRNA圖譜與對照組細胞樣本進行比對，結果顯示在經小蘗鹼處理後，之HepG2細胞株中，只有hsa-miR-21-3p(其中hsa代表人類；miR代表其係成熟的miRNA；21代表發現順序；3p則代表其miRNA前體所形成之兩條互補成熟miRNA(3p及5p)中的3p miRNA)(舊命名規則稱為miR-21*)有增加(增加4倍)(參第一A圖)。為進一步 評估小蘗鹼處理組中miR-21-3p的關聯性，使用qRT-PCR來測量HepG2在經小蘗鹼處理的刺激後，其miR-21-3p在長達8h時程中的表現，並將之與未處理的對照組進行比較。如第一B圖所示，在處理後1h，miR-21-3p量實質上開始增加(增加2.1倍)，在2h到達高峰(增加3.5倍)，並持續8h(增加2.8倍)。此外，miR-21-5p(同一miRNA前體所形成，與3p互補的miRNA，舊命名規則稱為miR-21)在處理後2h增加了2倍，但miR-21-5p表現在4h及8h時並沒有明顯的不同。以上結果顯示，小蘗鹼處理可明顯地增加miR-21-3p表現。
實施例二，miR-21-3p在哺乳類演化過程中被保留下來
miRNA*股(miRNA* strand)的命運是大量表現而成為功能性的引導miRNA、或是被分解成過客股，可能早在演化當中都已經註定[54]。在種子序列(seed sequence)中被保留下來的miRNA*股可能提供了進入調控網路的機會[52]。
如第二圖所示，我們在UCSC基因體瀏覽器上做了18種哺乳類基因體的比對，來分析MIR21基因，發現miR-21-3p在哺乳類演化過程中確實被保留下來。根據這些序列比對的結果，我們發現人類的MIR21與黑猩猩與恆河猴(rhesus macaques)的MIR21之間的演化關係是最密切的。又，與其他15種哺乳類相較之下，人類、黑猩猩與恆河猴之miR-21-3p的種子區域有一個核苷酸的置換。這個核苷酸置換是MIR21(+54 G→C)，是miR-21-3p之保留性種子區域中第五個核苷酸的置換，這可能改變了人類、黑猩猩與恆河猴之miR-21-3p的調控角色，而與其他15種哺乳類有所不同。
由第二圖可知，在本發明之微小RNA模擬物hsa-miR-21-3p中，種子區域之序列為ACCACC(SEQ ID No：44)。
實施例三，微小RNA-21-3p的目標預測及確認
找出特定miRNA的功能性重要目標基因、並了解其作用機制，對發掘其生物功能來說是必要的[58]。為預測miR-21-3p的可能目標，我們整合了HepG2細胞在經小蘗鹼處理後的基因表現圖譜，並將之與序列性miRNA目標預測軟體所得出的基因列表進行比較。如第三A圖所示，利用miRanda演算法及mirSVR分數閾值-0.1[59]來預測miR-21-3p之mRNA目標。其所預測的基因，會與利用微陣列測得在以40μM小蘗鹼處理4h的HepG2細胞中受到負面調控之基因(降低1.5倍以上，P<0.05)有所重疊。使用這個預測策略，共找出五個目標基因，包括MAT2A(甲硫胺酸腺苷基轉移酶II，alpha)、DIDO1(death inducer-obliterator 1)、EEF2K(eukaryotic elongation factor-2 kinase)、NBPF8(預測：Homo sapiens neuroblastoma breakpoint family,member 8)、以及TMEM137(預測：Homo sapiens transmembrane protein 137)。我們之後透過miRNA模擬物及抑制物的功能獲得(gain-of-function，GOF)和功能丟失(loss-of-function，LOF)實驗來確認這些預測，並確認miR-21-3p抑制物是否能降低所選定之目標基因表現量而使小蘗鹼失去應有的功能。第三B圖顯示將50nM之miR-21-3p模擬物轉染至HepG2細胞24小時，會使MAT2A及EEF2K的mRNA表現降低>50%，並使DIDO1、NBPF8及TMEM137的mRNA表現降低<50%。與未處理之對照處相較之下，將100nM之miR-21-3p髮夾式結構抑制物 (hairpin inhibitor)或陰性對照抑制物轉染至HepG2細胞24h後，再以40μM小蘗鹼處理達8h時程來刺激細胞。第三C圖顯示，miR-21-3p抑制物確可藉由降低預測目標之mRNA表現量，而成功地使小蘗鹼失去應有的功能。這項結果表示，MAT2A、DIDO1、EEF2K、NBPF8及TMEM137都是miR-21-3p的目標。在本發明中，我們鎖定了與肝細胞癌有高度相關的甲硫胺酸腺苷基轉移酶(MAT)進行後續實驗。
實施例四，微小RNA-21-3p會降低MAT2A及MAT2B的表現
在知道MAT2A可能是miR-21-3p的目標後，我們進一步研究了MAT家族成員的表現量，包括MAT1A、MAT2A及MAT2B，都可能受到miR-21-3p的影響。第四A圖的顯示了MAT1A、MAT2A及MAT2B之3’UTR序列上的種子互補位置(seed complementary site)的miRanda- mirSVR分數(score)。我們發現MAT2A及MAT2B的分數均低於-0.1，這表示MAT2B可能也是miR-21-3p的目標。為了解miR-21-3p與MAT家族表現量之間的關係，將miR-21-3p模擬物或陰性對照模擬物轉染到HepG2細胞中。MAT家族成員的mRNA及蛋白表現量分別使用qRT-PCR及西方墨點法加以測定。第四B圖顯示，將50nM的miR-21-3p模擬物轉染到HepG2細胞中48h後，會使MAT2A及MAT2B的mRNA表現降低>50%，但MAT1A則否。又，在將hsa-miR-21-3p模擬物轉染到HepG2細胞內72h後，MAT2A及MAT2B蛋白表現量分別降低了2.6倍及3.4倍，而MAT1A蛋白表現量增加了1.7倍(參第四C圖)。相對地，在功能丟失實驗中，係將miR-21-3p之髮夾式抑制物轉染到HepG2細胞中，以抑制內生性miR-21-3p的功 能，並以陰性對照抑制物作為對照組。如第四D圖所示，轉染24h後，miR-21-3p抑制物可將MAT1A降低1.3倍，但轉染48h後則否。而在轉染24h及48h後，MAT2A及MAT2B表現量都維持不變。根據第三A圖所示的微陣列數據比較結果，MAT2B表現量不會有明顯的改變，如。為估計小蘗鹼處理與MAT家族成員之表現量之間的關聯性，使用qRT-PCR測定法來測量HepG2細胞在以小蘗鹼處理刺激高達8h的時程當中的mRNA表現，並將之與未處理的對照組(0.08% DMSO)進行比較。如第四E圖所示，在處理後2h，MAT2A的量實質上開始降低(降低1.8倍)，在4h達到最低值(降低3.8倍)，並維持穩定到8h(增加2.2倍)。在小蘗鹼處理2h、4h及8h後，MAT2A量的減少與miR-21-3p量較高有關，其比較可參見第一B圖。然而，MAT1A及MAT2B表現量實質上不會改變，這與我們的微陣列數據一致。整體來說，我們的發現是顯示小蘗鹼處理能降低MAT2A的第一手證據，而過度表現miR-21-3p則會降低MAT2A及MAT2B兩者的表現。
實施例五，miRNA-21-3p在肝腫瘤細胞中使SAM的細胞內含量增加
已知MAT2A及MAT2B在HCC中的表現增加會使SAM量降低，並促進癌細胞生長[6,7,15]。在確定miR-21-3p會抑制MAT2A及MAT2B後，我們分析了HepG2細胞在轉染miR-21-3p模擬物及陰性對照模擬物(作為對照組)48h及72h後的細胞內SAM含量。如第四F圖所示，在轉染48h及72h後，miR-21-3p模擬物會使細胞內SAM含量增加1.6倍及3.0倍。這項結果顯示，過度表現miR-21-3p會提升細胞內SAM含量，而這已被證實會阻礙肝腫瘤細胞的生長。
實施例六，MAT2A及MAT2B是miR-21-3p的直接目標
由於在miR-21-3p模擬物轉染後，MAT2A及MAT2B會降低，我們進一步探討了miR-21-3p與MAT2A及MAT2B之3’UTR序列之間的關聯性。分別將MAT2A及MAT2B的野生型或變異型3’UTR序列選殖到螢光素酶報告載體上(分見於第五A圖及第五B圖)，並使用雙螢光素酶報告測定系統來定量報告子(reporter)的活性。第五C圖顯示，miR-21-3p會抑制含有MAT2A之3’UTR序列的螢光素酶報告子的表現(在HEK-293T細胞中降低1.6倍，在HepG2細胞中降低1.5倍)，這表示miR-21-3p會直接調控MAT2A之3’UTR序列。為了確認miR-21-3p是否透過miRNA：mRNA種子配對來切割MAT2A之3’UTR序列，針對位於MAT2A之3’UTR序列上的miR-21-3p可能結合序列進行定位突變(site-directed mutagenesis)。使用MicroRNA.org網站(http：//www.microRNA.org)(用以預測微小RNA目標的綜合資源)進行預測，發現miR-21-3p在MAT2A之3’UTR序列上的目標有2個位置(位置1：+180-200，位置2：+1267-1288)。這項結果顯示，miR-21-3p會抑制含有在MAT2A位置1進行突變的3’UTR序列之螢光素酶報告子的表現(在HEK-293T細胞及HepG2細胞中均降低1.5倍)。相反地，含有在MAT2A位置2進行突變的3’UTR序列之螢光素酶報告子的表現量不會有明顯的改變，這與含有在MAT2A位置進行雙重突變(位置1及位置2)的3’UTR序列的情況相似。這表示MAT2A之3’UTR序列上的位置2(+1267-1288)是miR-21-3p的主要切割位置(cleavage site)(參第五C圖)。此外，亦預測miR-21-3p會在MAT2B之3’UTR 序列形成一種子配對(seed match)(+399-418)。如第五D圖所示，miR-21-3p會抑制含有在MAT2B之3’UTR序列之螢光素酶報告子的表現(在HEK-293T細胞降低2.3倍，在HepG2細胞降低1.4倍)，但在HEK-293T細胞及HepG2細胞中，含有在MAT2B進行突變的3’UTR序列之螢光素酶報告子的表現量都維持不變。這表示在MAT2B之3’UTR序列上的種子配對(+399-418)是miR-21-3p的主要切割位置。以上結果顯示，MAT2A及MAT2B都是miR-21-3p的直接目標。
實施例七，微小RNA-21-3p會抑制肝腫瘤細胞生長並誘發其凋亡
為研究miR-21-3p對細胞生長及存活率的效果，我們使用BrdU掺入測定法(BrdU incorporation assay)及錐藍(Trypan blue)染劑排除測定法來測量細胞增殖與存活率。第六A圖顯示在轉染48h後，miR-21-3p模擬物會降低HepG2細胞的存活數目。此外，相較於轉染陰性對照模擬物的對照組，將miR-21-3p模擬物轉染至HepG2細胞24h後，再培養24h進行BrdU掺入，發現miR-21-3p模擬物會抑制細胞增殖(1.7倍)(參第六B圖)。miR-21-3p在凋亡及細胞週期的作用係以流式細胞儀來進行分析評估。在HepG2細胞以miR-21-3p及陰性對照模擬物(對照組)轉染72h後，定量進入sub-G1的凋亡細胞族群。如第六C、六D及六E圖所示，miR-21-3p會誘發HepG2細胞凋亡。
實施例八，微小RNA-21-3p會減少油滴在肝細胞中的堆積
目前已知小蘗鹼具有廣泛的藥理效用，其中包括降低脂肪的效用，能夠在活體內緩和脂肪肝的症狀[54-58]。使用與實施例一相同的方法，以微小RNA陣列來檢測小蘗鹼處理是否會改變未轉化 (non-transformed)之人類肝細胞中的miRNA表現。從3位過重或肥胖的男性捐贈者身上取得的初代人類肝細胞在經40μM小蘗鹼處理2小時後，與對照組樣本進行比較。結果發現，在三位捐贈者的miRNA表現圖譜中表現量都會增加的只有hsa-miR-21-3p(平均為3.36倍，第七A圖)。之後並以qRT-PCR確認小蘗鹼處理會使PHH細胞中的miR-21-3p增加(第七B圖)。
使用流式細胞儀，透過BODIPY 493/503染色[59]來檢測miR-21-3p在肝脂肪油滴含量方面的影響。透過轉染本發明之miR-21-3p模擬物，使miR-21-3p在PHH細胞中過量表現72h時，會使PHH細胞中脂肪油滴的含量減少(為對照組的40%~44%)，如第七C圖所示。
另外，實施例一已證明小蘗鹼處理會使人類HepG2肝癌細胞的miR-21-3p表現增加，這與本實施例中在PHH細胞觀察到的結果是一樣的。因此，本實施例亦使用HepG2細胞做出一個以油酸誘導細胞內油滴形成的活體外肝模型，來檢視脂肪肝與miR-21-3p之間的關聯性[60,61]。第七D圖顯示了相關實驗的設計，第一組先以油酸處理24h(1天)引發細胞內油滴形成，之後以40μM小蘗鹼處理72小時(3天)；第二組先以油酸處理24h(1天)引發細胞內油滴形成，再經100nM之miR-21-3p髮夾式結構抑制物或其陰性對照(NC)抑制物轉染24h(1天)，之後以40μM小蘗鹼處理48h(2天)；第三組則先以油酸處理24h(1天)引發細胞內油滴形成，再經50nM之miR-21-3p或其陰性對照(NC)模擬物轉染72小時(3天)。經前述處理後，分別收取細胞樣 本，以流式細胞儀觀察HepG2細胞內的油滴含量。
第七E圖顯示，加入油酸可成功地使HepG2細胞變成類似脂肪肝中那樣有脂肪堆積的細胞。在這個細胞模型中，72h的小蘗鹼處理會使細胞內油滴含量降低(為對照組的47%~57%)(第七F圖)。此外，第七G圖顯示，利用轉染miR-21-3p抑制物來抑制細胞中內生性的miR-21-3p後，由於小蘗鹼誘導出的miR-21-3p被抑制物抑制掉了，故無法降低細胞內油滴含量，這說明小蘗鹼是藉由誘導出miR-21-3p，進而使細胞內油滴含量下降。而第七H圖則顯示，miR-21-3p過度表現會使細胞內油滴含量降低(為對照組的50% to 58%)。即使HepG2細胞未經油酸誘導細胞內油滴形成的過程，也會得到類似的結果(數據未顯示)。整體言之，這些結果指出，miR-21-3p可減少肝細胞中的油滴含量。
實施例九，微小RNA-21-3p在初代肝細胞中的目標預測與確認
以40μM小蘗鹼處理來自三位捐贈者的PHH細胞2h、4h、8h後，分析其脂肪代謝基因的表現，並進一步分析其中8個基因的mRNA表現：ACACB、HLCS、MTOR、RPTOR、ACSM2A、NAMPT、IL6R、及SPEBF2(第八圖)。發現經小蘗鹼處理後，ACACB、HLCS、MTOR、RPTOR、IL6R及SPEBF2的mRNA表現量在4-8h時會降低，而ACSM2A則是在2-4h時明顯降低。相反地，NAMPT的mRNA表現量會在小蘗鹼處理後4-8h時上升。之後檢測了這些基因在HepG2細胞中的表現，發現只有ACACB在HepG2及PHH細胞中的表現都會降低(數據未顯示)。因此，在後續的實驗中，係針對乙醯輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase)來進行。
雖然在微陣列數據中並未找到ACACA，但在小蘗鹼處理8h後，3位捐贈者的ACACA表現都減少了2.1倍(第九A圖)。之後檢測miR-21-3p是否能夠調控ACACA及ACACB的表現，發現將50nM之miR-21-3p模擬物轉染至PHH細胞(三個樣本)48小時，會降低ACACA(1.6倍)及ACACB(1.8倍)的mRNA表現(第九B圖)。此外，將100nM之miR-21-3p髮夾式結構抑制物或陰性對照抑制物轉染至HepG2細胞24h後，再以40μM小蘗鹼處理達8h時程來刺激HepG2細胞。由於小蘗鹼誘導出的miR-21-3p被抑制物抑制掉了，故無法降低ACACA及ACACB基因之mRNA表現，這說明小蘗鹼是藉由誘導出miR-21-3p，進而使ACACA及ACACB基因之mRNA表現下降(第九C圖)。將本發明之miR-21-3p模擬物轉染至HepG2細胞24h後，會使ACACA及ACACB的mRNA表現量分別降低44%及50%(第九D圖)，並在72h時使其蛋白表現量分別降低2.3倍及1.6倍(第九E圖)。在轉染本發明之miR-21-3p模擬物72h後，HepG2細胞及PHH細胞中的丙二醯輔酶A濃度分別降低了1.6倍及2.2倍(第九F圖)。這些結果顯示，本發明之miR-21-3p模擬物會降低ACACA及ACACB的表現，而且會降低細胞內的丙二醯輔酶A濃度。
另外，在三酸甘油酯的重要合成酵素DGAT2方面，DGAT2基因的mirSVR分數是-0.2515，可能是miR-21-3p的目標基因。在PHH細胞中，小蘗鹼處理對DGAT2表現量的影響並不明顯(第九A圖)，這一點與微陣列數據是一致的。然而，將本發明之miR-21-3p模擬物轉染 至PHH細胞48h後，DGAT2之mRNA表現量會降低1.5倍(第九B圖)。當miR-21-3p在HepG2細胞中過量表現時，DGAT2之mRNA表現量會在24h後降低2.3倍(第九D圖)，而其蛋白表現量會在72h後降低3.3倍(第九E圖)。
我們亦使用與實施例六類似的技術來探討miR-21-3p與ACACA、ACACB及DGAT2之3’UTR序列之間的關聯性，發現miR-21-3p並非透過ACACA的3’UTR序列來影響其基因表現(數據未顯示)。進一步檢測mRNA安定性後，發現小蘗鹼會誘導miR-21-3p生成，而miR-21-3p會降低ACACA之mRNA的半生期。另外，miR-21-3p之種子區域不會與ACACB的3’UTR序列產生配對結合，而是透過與ACACB的外顯子23(exon 23)結合，而降低其表現(降低1.4倍)。然而，miR-21-3p確會與DGAT2的3’UTR序列產生配對結合，而降低其表現(降低1.4倍)。因此，miR-21-3p係藉由不同的方式降低ACACA、ACACB及DGAT2基因的表現，而達到減少肝細胞內油滴堆積的效果。
此外，在其他與小蘗鹼有關的脂肪代謝基因中，經50nM之miR-21-3p模擬物轉染24h後，已可降低MTOR及RPTOR基因的表現達1.4及1.6倍；而在轉染48h後，MTOR、RPTOR及HLCS基因的表現分別降低了2.5、2.2及1.5倍。這加強說明了本發明的miR-21-3p模擬物確實具有改善脂肪代謝的效果。
本發明之miR-21-3p模擬物會導向MAT2A及MAT2B的3’UTR 而直接降低其表現，而使miR-21-3p過度表現會增加細胞內SAM含量，而抑制HepG2細胞生長，並誘發HepG2細胞凋亡。此外，本發明之miR-21-3p模擬物亦係藉由降低ACACA之mRNA的半生期、並與ACACB的外顯子23及DGAT2的3’UTR序列結合，而達到減少肝細胞內油滴堆積的效果。因此，我們的結果顯示miR-21-3p可作為一腫瘤抑制劑及脂肪肝治療劑，而具有治療肝臟疾病的潛能。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 15
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 16
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 引子
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 23
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 24
<210> 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 25
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
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<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 27
<210> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 29
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 30
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 31
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 32
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 引子
<400> 33
<210> 34
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 34
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 35
<210> 36
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA
<400> 36
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 37
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 38
<210> 39
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 39
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 40
<210> 41
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 41
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 42
<210> 43
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 43
<210> 44
<211> 6
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> siRNA之種子區域
<400> 44

Claims (15)

  1. 一種用以治療肝臟疾病之醫藥組成物，其包含一hsa-miR-21-3p(SEQ ID NO：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述微小RNA模擬物係經化學修飾而不會被核糖核酸酶分解。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其係透過轉染及/或共軛結合遞送方法將前述微小RNA模擬物送入目標細胞。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之醫藥組成物，其中共軛結合遞送方法係搭配轉染方法將前述微小RNA模擬物送入目標細胞。
  5. 如申請專利範圍第3或4項所述之醫藥組成物，其中前述共軛結合遞送方法使前述微小RNA模擬物與適配體或膽固醇結合後送入目標細胞。
  6. 如申請專利範圍第3或4項所述之醫藥組成物，其中前述轉染係利用微脂體、外泌體、奈米粒子或病毒將前述微小RNA模擬物送入目標細胞。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之醫藥組成物，其中前述奈米粒子包括脂質奈米粒子或聚合物奈米粒子。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其係以注射方式投予患者。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中前述肝臟疾病包括肝癌及脂肪肝。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其可降低甲硫胺酸腺苷轉移酶MAT2A及MAT2B的表現，而達到治療肝癌的效果。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其可降低乙醯輔酶A羧化酶ACACA及ACACB，以及二脂醯甘油醯基轉移酶DGAT2的表現，而達 到治療脂肪肝的效果。
  12. 一種將一hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物用於製備治療肝癌之藥物的用途。
  13. 一種將一hsa-miR-21-3p(SEQ ID No：35)之單股RNA分子的微小RNA模擬物用於製備治療脂肪肝之藥物的用途。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之用途，其係透過降低甲硫胺酸腺苷轉移酶MAT2A及MAT2B的表現而達成。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之用途，其係透過降低乙醯輔酶A羧化酶ACACA及ACACB，以及二脂醯甘油醯基轉移酶DGAT2的表現而達成。
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