TWI532990B - 甲芬那酸用於作爲新穎基質的用途 - Google Patents

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甲芬那酸用於作為新穎基質的用途
本發明係關於一種甲芬那酸之用途，亦係作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法的用途。
基質輔助雷射脫附游離質譜法(Matrix-assisted laser desorption/ionization，簡稱MALDI)常被用於分析生物分子(如，DNA、蛋白質、胜肽或糖類)及大型有機分子；其主要作用機制係使一分析物(analyte)與一基質於真空環境中共同形成一結晶物，藉由高能量雷射光束照射該結晶物表面，使該結晶物被激發形成一氣相離子，該氣相離子經由電場加速後，可以進入一質量分析器，以偵測該氣相離子之質荷比(mass-to-charge ratio，簡稱m/z)，以獲得該分析物之分子量，進而可以推知該分析物之種類。
其中，基質必須具有吸光特性，以吸收來自高能量雷射光束之能量，並且於短時間內將吸收之能量傳遞至分析物，使該分析物得以受到激發，轉變形成為氣相離子，進而產生游離，並且進入質量分析器；並且，該基質更必須有效分隔該分析物，以利形成結晶物，而能夠有效傳遞能量及促使該氣相離子進行脫附游離。
用於基質輔助雷射脫附游離質譜法之習用基質係包含：3,5-二甲氧基-4-羥基苯丙烯酸(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid，又稱為sinapinic acid，簡稱SA)、2-氰基-4-羥基苯丙烯酸 (α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，簡稱CHCA)及2,5-羥基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，簡稱2,5-DHB)等，該些習用基質係適用於胜肽及蛋白質之分析使用；惟，針對分子量<3,000 Da之小分子分析物，受限於該些習用基質之背景訊號值較高，掩蓋該小分子分析物之訊號值，而導致分析結果不佳，是以，的確有必要開發新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，以提升小分子分析物之分析結果可信度。
呋喃甲酸(furoic acid，簡稱FA)，其IUPAC名稱為(2-amino-4,5-diphenylfuran-3-carboxylic acid)，常被添加於食品中，作為防腐劑或矯味劑；惟，尚未有報導指出呋喃甲酸可以作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法。
甲芬那酸(mefenamic acid，簡稱MA)隸屬於非類固醇類之消炎止痛藥物，可以減輕患部之發炎及紅腫現象，亦可以減輕子宮收縮之症狀；惟，亦未有報導指出甲芬那酸可以作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法。
本發明之主要目的係提供一種甲芬那酸之用途，係作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，以提升小分子分析物之分析可信度者。
為達到前述發明目的，本發明所運用之技術手段及藉由該技術手段所能達到之功效包含有：一種甲芬那酸之用途，係作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，其中，甲芬那酸係以體積比為1：1之比例溶解於含0.1%三氟乙酸之甲醇，且甲芬那酸係以分子比為1：1~1：103之比例混合一分析物，以共同形成一結晶物，且該結晶物較佳係以波長為337nm之高能量雷射光束激發形成一氣相離子。
本發明之甲芬那酸係容易吸收能量，並且將能量傳遞至小分子分析物，激發且游離該小分子分析物，是以可以作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，並且，該新穎基質具有較低背景訊號強度，不易掩蓋該小分子分析物之訊號值，進而達到提升分析可信度功效。
第1圖：係本發明新穎基質之光譜分析結果圖。
第2圖：係本發明新穎基質及習用基質之質譜分析結果圖。
第3圖：係本發明新穎基質及習用基質用以分析三磷酸腺苷之質譜分析結果圖。
第4圖：係本發明新穎基質及習用基質用以分析觀黴素之質譜分析結果圖。
第5圖：係本發明新穎基質及習用基質用以分析磺胺甲噁唑之質譜分析結果圖。
第6圖：係本發明新穎基質及習用基質用以分析短杆菌肽D之質譜分析結果圖。
第7圖：係本發明新穎基質及習用基質用以分析穀胱甘肽之質譜分析結果圖。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下；本發明之呋喃甲酸及甲芬那酸係可以作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，以分析小分子分析物；其中，該些新穎基質係能夠與小分子分析物共同形成結晶物，並吸收來自電子光束之能量，以將該能量傳遞至該小分子分析物，進而使該小分子分析物受到激發及游 離，是以可以藉由分析該小分子分析物之荷質比，推得該小分子分析物之性質及種類。
為證實本發明之新穎基質係可以應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，遂以習用基質CHCA及習用基質2,5-DHB作為控制組，進行以下試驗：
(A)本發明新穎基質之基本性質
基質必須可以有效吸收高能量雷射光束(特別是針對波長為337nm之高能量雷射光束)，使該基質之發色團中心(chromophore center)產生離域π電子(delocalized π electron)，是以，係分析本發明之新穎基質的UV吸收光譜，其結果如第1圖所示，本發明之新穎基質於波長337nm具有較佳吸光效率，據此，本發明之呋喃甲酸及甲芬那酸確實具有作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法之潛力。
請參照第1表所示，續以一基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間質譜儀(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometer，簡稱MALDI-TOF MS，購自Microdlex、Daltonics Bruker、Bremen)分析各組之基質。
詳而言之，係將本試驗各組基質以體積比為1：1之比例溶解於含0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid，簡稱TFA)之甲醇，而後置於一樣品托盤(target plate)，分別形成結晶物，並以波長為337nm之一高能 量雷射光束照射各組結晶物，使其轉變形成氣相離子，另以+20kV之電場加速該些氣相離子，使其進入長度為1.25公尺之飛行管，各組試驗結果如第2圖所示。
請參照第2圖所示，第A1組之習用基質2,5-DHB係於質荷比137.1([DHB-H2O+H]+)、155.2([DHB+H]+)、177.0([DHB+Na]+)、200.0([DHB+2Na]+)、264.0([DHB+H-CO2]+)及273.3 Da([DHB-2H2O+H]+)位置均具有雜訊；第A2組之習用基質CHCA則於質荷比146.0([CHCA+H-H2O-HCN]+)、172.0([CHCA+H-H2O]+)、190.0([CHCA+H]+)、212.0([CHCA+Na]+)、234.0([CHCA-H+2Na]+)、335.0([2CHCA+H-CO2]+)及379.0 Da([2CHCA+H]+)位置產生雜訊；而相對於前述二習用基質，第A3組之本發明呋喃甲酸僅於質荷比279.1([FA+H]+)及260.0 Da([FA-H2O+H]+)位置發生雜訊，而本發明之甲芬那酸則於質荷比241.5([Ma+H]+)及264.5 Da([Ma+Na]+)位置出現雜訊。
根據質譜儀分析結果，相較於習用基質2,5-DHB及習用基質CHCA，本發明之新穎基質較不易受到高能量雷射光束之照射而產生團簇離子(cluster ion)或碎片離子(fragment ion)，是以，較不會產生干擾分析結果之雜訊，因而適合用以協助分析小分子分析物之性質及種類。
根據上述試驗結果，本發明新穎基質係可以有效吸收波長為337nm之高能量雷射光束，並且，應用於質譜儀分析時，不易產生干擾分析結果之團簇離子或碎片離子，是以適用於作為基質，應用於分析小分子分析物；是以，接下來續以三磷酸腺苷、觀黴素、磺胺甲噁唑、短杆菌肽D及穀胱甘肽等小分子分析物進行測試。
(B)本發明新穎基質之用於分析三磷酸腺苷之結果
請參照第2表所示，本試驗係選用三磷酸腺苷(adenosine-5’-triphosphate，簡稱ATP，其荷質比係為551.1 Da)作為小分 子分析物，其用量係10nmol(總體積為0.5μL)，並將該小分子分析物與50mM之各組基質進行混合(混合之體積比為1：1，分子比為1：1~103)，使各組基質與該小分子分析物(三磷酸腺苷)共同形成結晶物，以波長為337nm之高能量雷射光束照射該結晶物，使該結晶物形成激發之氣相離子，並以基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間質譜儀偵測該氣相離子之質荷比。
請參照第2表及第3圖所示，第B1及B2組之習用基質於質荷比552.0 Da([ATP-2Na+H]+)位置均可以產生訊號，而第B3組之本發明新穎基質呋喃甲酸由於雜訊之干擾，無法於相對應位置產生訊號，第B4組之本發明新穎基質甲芬那酸則可以分別於質荷比551.1([ATP+2Na+H]+)及814.6 Da([MA+ATP+Na]+)位置產生解析度較高訊號。
是以，本發明甲芬那酸係可以作為新穎基質，用以分析小分子分析物三磷酸腺苷。
(C)本發明新穎基質之用於分析觀黴素之結果
請參照第3表所示，本試驗係選用觀黴素(spectinomycin，其荷質比係為332.3 Da)作為小分子分析物，其用量係14nmol(總體積為0.5μL)，並將該小分子分析物與50mM之各基質進行混合(混合之體積比為1：1，分子比為1：1~103)，使各組基質與該小分子分析物(觀黴素) 共同形成結晶物，以波長為337nm之高能量雷射光束照射該結晶物，使該結晶物形成激發之氣相離子，並以基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間質譜儀偵測該氣相離子之質荷比。
請參照第3表及第4圖所示，本試驗之各組基質均可以於質荷比333.0 Da([Spect+H]+)位置產生訊號。
是以，本發明呋喃甲酸及甲芬那酸係可以作為新穎基質，用以分析小分子分析物觀黴素。
(D)本發明新穎基質之用於分析磺胺甲噁唑之結果
請參照第4表所示，本試驗係選用磺胺甲噁唑(sulfamethazole，簡稱SMT)作為小分子分析物，其用量係2nmol(總體積為0.5μL)，並將該小分子分析物與50mM之各組基質進行混合(混合之體積比為1：1，分子比為1：1~103)，使各組之基質與該小分子分析物(磺胺甲噁唑)共同形成結晶物，以波長為337nm之高能量雷射光束照射該結晶物，使該結晶物形成激發之氣相離子，並以基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間質譜儀偵測該氣相離子之質荷比。
請參照第4表及第5圖所示，本試驗之各組基質均可以於質荷比271.0([SMT+H]+)及294.0 Da([SMT+Na]+)位置產生訊號；惟，第D2組之習用基質CHCA另於461.0 Da([SMT+α-CHCA+H]+)位置產生訊號，而第D4組之本發明新穎基質甲芬那酸另於241.0 Da([MA+H]+)位置產生訊號。
是以，本發明呋喃甲酸及甲芬那酸係可以作為新穎基質，用以分析小分子分析物磺胺甲噁唑。
(E)本發明新穎基質之用於分析短杆菌肽D之結果
請參照第5表所示，本試驗係選用短杆菌肽D(gramicidin D)作為小分子分析物，其用量係9nmol(總體積為0.5μL)，並將該小分子分析物與50mM之各組基質進行混合(混合之體積比為1：1，分子比為1：1~103)，使各組之基質與該小分子分析物(短杆菌肽D)共同形成結晶物，以波長為337nm之高能量雷射光束照射該結晶物，使該結晶物形成激發之氣相離子，並以基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間質譜儀偵測該氣相離子之質荷比。
請參照第5表及第6圖所示，本試驗之各組基質均可以於質荷比1882.3([GD+H]+)、1905.0([GD+Na]+)及1921.0 Da([GD+K]+)位置產生訊號；惟，第E1及E2組之習用基質另於1936.7 Da([GD+K+H2O]+)位置產生訊號。
是以，本發明呋喃甲酸及甲芬那酸係可以作為新穎基質，用以分析小分子分析物短杆菌肽D，且相較於習用基質2,5-DHB及CHCA，本發明呋喃甲酸及甲芬那酸具有較低背景訊號強度，因而具有較高分析可信度。
(F)本發明新穎基質之用於分析穀胱甘肽之結果
請參照第6表所示，本試驗係選用穀胱甘肽(glutathione，簡稱GSH，其荷質比係為307.3 Da)作為小分子分析物，其用量係9nmol(總體積為0.5μL)，並將該小分子分析物與50mM之各組基質進行混合(混合之體積比為1：1，分子比為1：1~103)，使各組之基質與該小分子分析物(穀胱甘肽)共同形成結晶物，以波長為337nm之高能量雷射光束照射該結晶物，使該結晶物形成激發之氣相離子，並以基質輔助雷射脫附離子化-飛行時間質譜儀偵測該氣相離子之質荷比。
請參照第6表及第7圖所示，本試驗之各組基質均於290.0 Da([GSH-NH3+H]+)位置產生訊號；惟，第F1組之習用基質2,5-DHB另於615.0([GSSG]+)、636.9([2GSH+Na]+)及652.9 Da([2(GSH-H)+Na+H2O]+) 位置產生訊號；第F2組之習用基質CHCA另於468.0 Da([2GSH-Glutamic+H]+)位置產生訊號；而第F3組之本發明新穎基質呋喃甲酸則於615.0([GSSG]+)、308.0([GSH+H]+)、494.0([2GSH-Cystein+H]+)及449.9 Da([2GSH-Cystein-CO2+H]+)位置產生訊號。
是以，本發明呋喃甲酸係可以作為新穎基質，用以分析小分子分析物穀胱甘肽，且相較於習用基質2,5-DHB及CHCA，本發明甲芬那酸具有較低背景訊號強度，因而具有較高分析可信度。
綜合上述，本發明之甲芬那酸係容易吸收能量，並且將能量傳遞至小分子分析物，激發且游離該小分子分析物，是以可以作為基質輔助雷射脫附游離質譜法之基質，並且，甲芬那酸具有較低背景訊號強度，不易掩蓋該小分子分析物之訊號值，進而達到提升分析可信度功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (2)

  1. 一種甲芬那酸之用途，係作為新穎基質，應用於基質輔助雷射脫附游離質譜法，其中，甲芬那酸係以體積比為1：1之比例溶解於含0.1%三氟乙酸之甲醇，且甲芬那酸係以分子比為1：1~1：103之比例混合一分析物，以共同形成一結晶物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之甲芬那酸之用途，其中，該結晶物係以波長為337nm之高能量雷射光束激發形成一氣相離子。
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