TWI522613B - 酵素型感測器之感測電極及其製備方法 - Google Patents

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Description

酵素型感測器之感測電極及其製備方法
本發明係關於一種酵素型感測器之感測電極，特別是，利用該酵素型感測器之感測電極製得一種於室溫中可穩定保存之高靈敏度酵素型電化學感測器，以及該酵素型感測器之感測電極之製備方法。
生活水準的提升、平均壽命的增加，讓現代人開始認真思考並追求高醫療品質與高生活品質，對於健康狀況或是環境污染的監測即為追求高品質生活的體現。
健康狀況的監控，更具體地，譬如可利用生化感測器以提供生理即時訊息，促使人們自我健康管理。舉例來說，譬如糖尿病的患者需要每日數次、定時地監控血糖變化，以提醒糖尿病患者注意因食物攝取而導致的血糖值的大幅度波動。因此，操作簡便、容易攜帶、快速又靈敏的血糖感測器商品已成為當今市場主流，而其中電化學感測器發展相對而言較為成熟。
電化學感測器主要透過電極表面的活性感測材料和待測物反應，再藉由傳感器輸出成電位或電流供使 用者判別，由於仰賴電極作為主要的偵測工具，因此電極材料的選擇十分地重要。
一般電化學感測器主要有四項指標：首先是穩定性(stability)，感測器在使用一段時間之後，會因環境因子的影響，譬如溫度、濕度、或是化學等等因素而使其穩定性降低，因此，受到環境因子影響越小者，表示其穩定性越佳；第二是選擇性(selectivity)，通常生物檢體中含有數種化學物質，譬如血液中同時含有多巴胺、尿酸、抗壞血酸等物質，當選擇偵測果糖纈胺酸時，若多巴胺、尿酸、抗壞血酸等物質的應答電流相對小很多，則表示對於果糖纈胺酸有良好的選擇性；第三則是靈敏度(sensitivity)，指的是感測系統對待測物質的辨識程度，其公式為：靈敏度S=△I/(△C×A)，其中，△I代表應答電流(response current,μA或mA)，△C代表待測物濃度(μM或mM)，而A則代表電極表面積(cm2)；最後則是應答時間(response time)，係指當待測化學物質進入電化學感測器系統後，到達穩定應答電流(response current)值90%所需的時間。
而近年來，甚至有研究嘗試將電化學感測器與酵素結合。因此，電化學感測器可依據結合酵素與否，大略區分為非酵素型電化學感測器及酵素型電化學感測器。
非酵素電化學感測器具有較低的偵測極限，待測檢體濃度小的時候敏感度高，也能夠承受較大的酸鹼度變化，且保存條件也較為寬鬆，然而在靈敏度方面還有很大的改善空間，且對於干擾物(譬如抗壞血酸、多巴胺、 尿酸等因子)的影響僅能減緩而無法完全排除；相對而言，酵素型電化學感測器承襲酵素高專一性、高靈敏度的特性，能夠有效地監控血液中血糖的濃度，使其對於待測檢體的專一性大幅提升，並避免干擾物影響測定結果。然而，酵素對於保存的環境也有較為嚴格的限制，一般而言，酵素需要存放在低溫之下(譬如4℃)，而室溫環境將使得酵素失去其原本的活性，因此限制了酵素型電化學感測器的發展。
但由於酵素型感測器所具備的的專一性是非酵素型感測器較難以擁有的特性，因此仍有許多研究積極地針對酵素型感測器的缺點加以改善。本案即是為了要解決上述酵素型感測器之缺點而提出的發明。
本發明之主要目的係在提供一種酵素型感測器之感測電極，以利用該酵素型感測器之感測電極製得一種可穩定保存於室溫之高靈敏度酵素型電化學感測器，並且提供該酵素型感測器之感測電極之製備方法。
具體而言，本發明透過碳材與奈米金屬顆粒的結合，並進一步加入離子液體層，藉由離子液體高離子導電性、與碳材之間良好的交互作用、以及與酵素結合所產生提升酵素活性並增加酵素穩定性等效果，從而提升酵素型感測器之感測電極的靈敏度並大幅地改善該感測電極的穩定性。
為達成上述目的，本發明之酵素型感測器之感 測電極，包括：電極基材以及酵素感測層，其中，該酵素感測層係覆蓋於該電極基材之上，且該酵素感測層包括於該電極基材上依序層疊之：第一碳材-奈米金屬層，其包括一碳材與一奈米金屬顆粒；離子液體層，其包括由一陰離子與一陽離子所組成之一離子液體；第二碳材-奈米金屬層，其包括一碳材與一奈米金屬顆粒；以及酵素層。換言之，該離子液體層係以三明治方式夾置於第一碳材-奈米金屬層與第二碳材-奈米金屬層之間。
關於碳材並無特別限制。具體而言，可為：石墨烯、碳黑、多壁奈米碳管、單壁奈米碳管、活性碳、碳球等奈米碳材料。於上述碳材中，較佳為使用石墨烯或奈米碳管作為碳材，雖然奈米碳管在製作時容易殘留金屬觸媒於碳管中，且即使經過後續處理金屬顆粒仍然十分容易殘留，但奈米碳管的研究發展相對石墨烯成熟，目前奈米碳管在各領域也有十分廣泛的應用；至於石墨烯雖然是一種許多特性都尚待釐清的新穎的材料，然而石墨烯具有大的比表面積，可做為反應的活性位置，加上其具有雙極性特性，可作為材料的化學閘門，上述兩種特性意味著分子在石墨烯上的分解將容易被偵測到，本發明中，較佳為使用石墨烯作為碳材。
於本發明中，對於奈米金屬顆粒的種類並無任何限制，只要具有良好催化能力之奈米顆粒均可使用，譬如金奈米顆粒、銀奈米顆粒、鉑奈米顆粒及鈀奈米顆粒。具體而言，本發明中之一實施例以金奈米顆粒為例，藉由 金奈米複合材增加酵素穩定性，保持活性，並提供良好的催化性質。
關於離子液體，其定義為100℃下時，其化合物組成全為離子並以液態方式存在的鹽類，並且，離子液體的極性、親疏水性、黏度與溶劑可溶性可經由不同的陽離子與陰離子組合而調配成具有所欲的物理化學特性。一般而言，陽離子碳鍊越長越疏水，離子液體可分為疏水性離子液體及親水性離子液體兩大類，主要以陰離子種類作為區分：譬如PF6-、TFSI-類屬於疏水性離子液體；DCA-、I-、Cl-類則屬於親水性離子液體；但也有如BF4 -、CF3SO3 -的親疏水性會隨陽離子碳鍊的長度而改變，一般而言若搭配6個碳以上長碳鍊的陽離子屬於疏水性，反之若搭配較短碳鍊的陽離子則呈現親水性。於本發明中，形成該離子液體層之離子液體係由一陰離子與一陽離子所組成，其中，組成離子液體之陽離子舉例可為：N-烷基-N-烷基吡咯烷陽離子(N-alkyl-N-alkyl-pyrrolidinium)、1-烷基-3-烷基咪唑陽離子(1-alkyl-3-alkyl-imidazolium)、N-烷基-N-烷基哌啶陽離子(N-alkyl-N-alkyl-piperidinium)、四烷基銨陽離子(tetraalkylammonium)、四烷基鏻陽離子(tetraalkylphosphonium)、1,2-二烷基吡唑陽離子(1,2-dialkylpyrazolium)、N-烷基噻唑陽離子(N-alkylthiazolium)、或三烷基鋶陽離子(trialkylsufonium)；陰離子舉例可為：雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺陰離子(bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide,TFSI)、雙氰胺陰離子 (dicyanamide,DCA)、三氟甲基磺酸陰離子(trifluoromethanesulfonate)、四氟硼酸陰離子(tetrafluoroborate)、或六氟磷酸陰離子(hexafluorophosphate)。具體而言，由上述一陰離子與一陽離子之任意組合所形成之離子液體均可用於本發明中，譬如：N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)、或1-乙基-3-甲基咪唑雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(1-ethyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，EMITFSI)等。
至於酵素層，可使用一葡萄糖氧化酶或一果糖纈胺酸氧化酶。其中葡萄糖氧化酶係藉由與葡萄糖反應產生葡萄糖內酯及過氧化氫，並藉由偵測過氧化氫的電流來標定葡萄糖的濃度。然而，血液中的血糖值常隨著進食而有所影響，因此，對應為2至3個月的平均血糖而不會因單日的葡萄糖攝取量而產生大幅度的變動之糖化血紅素(HbAlc)便成為理想的生物指標，可提供更為精確的診斷。糖化血紅素為葡萄糖與血紅素反應的產物，更具體地，係為葡萄糖的酮基與血紅素N端纈胺酸的胺基進行縮合反應，最後形成穩定的果糖纈胺酸。因此，當果糖纈胺酸與果糖纈胺酸氧化酶反應後將會產生纈胺酸、葡糖酮醛以及過氧化氫，透過偵測過氧化氫的電流可標定果糖纈胺酸的濃度，從而偵測長期糖化血紅素指標。
本發明亦提供一種酵素型感測器之感測電極 之製備方法，包括：(A)將一漿料塗覆於一電極基材上方，以形成第一碳材-奈米金屬層，該漿料包括一碳材以及一奈米金屬顆粒；(B)塗佈一離子液體於該第一碳材-奈米金屬層上以形成一離子液體層，該離子液體係由一陰離子與一陽離子所組成；(C)再次塗佈步驟(A)之漿料於該離子液體層上以形成一第二碳材-奈米金屬層，使步驟(B)之該離子液體層夾置於該第一碳材-奈米金屬層與第二碳材-奈米金屬層之間；以及(D)形成一酵素層於該第二碳材-奈米金屬層之表面上。
有鑒於超臨界流體具有液體和氣體的性質、高擴散係數、低黏度、介面張力趨近於零等特性，步驟(A)之該碳材與該奈米金屬顆粒較佳為於超臨界二氧化碳環境下形成一碳材-奈米金屬複合材料，使奈米金屬顆粒均勻地分散於碳材上，大幅度地增加反應表面積。
至於，該酵素型感測器之感測電極之製備方法中所使用的碳材、奈米金屬顆粒、離子液體以及酵素等，已於前文中詳細說明，因此不再贅述。
此外，於步驟(C)之後，可更依序重複步驟(B)及(C)以形成多層結構。
圖1A至1E係以不同離子液體固定之酵素型葡萄糖感測器之感測電極，並利用循環伏安法感測不同濃度之葡萄糖之結果。
圖1F至1J係以不同離子液體固定之酵素型果糖纈胺酸感測器之感測電極，並利用循環伏安法感測不同濃度之果糖纈胺酸之結果。
圖2A係以不同離子液體固定之酵素型葡萄糖感測器之感測電極之葡萄糖濃度與應答電流線性校正關係圖。
圖2B係以不同離子液體固定之酵素型果糖纈胺酸感測器之感測電極之果糖纈胺酸濃度與應答電流線性校正關係圖。
圖3A、4A係以不同離子液體固定之酵素型葡萄糖感測器之感測電極之壽命測試。
圖3B、4B係以不同離子液體固定之酵素型果糖纈胺酸感測器之感測電極之壽命測試。
圖5A、5B係利用循環伏安法偵測干擾物對本發明一較佳實施例之酵素型果糖纈胺酸感測器之感測電極之影響。
本發明之目的、特徵及其效果將透過下述之實施例及實驗例更詳細地加以描述。然而，下述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於下述實施例，對於本發明相關領域之技術人員，可於不悖離本發明之申請專利範圍所定義之精神與範疇之條件下進行各種變化以及調整。
<實施例1-1>
以Staudenmaier法製備石墨烯作為碳材之用，其係將市售之天然石墨(純度99.9%，150mesh以上)取一定量，加入硫酸、硝酸做為氧化劑，氯酸鉀為插層劑，維持96小時並控溫。之後以大量去離子水及硫酸反覆洗滌，再以去離子水沖洗烘乾，將得到的氧化石墨烯以瑪瑙研缽研磨後送入高溫爐，通入惰性氣體(氬氣)及反應氣體(氫氣)之混合氣體，以每分鐘攝氏60度進行升溫還原。約在攝氏溫度300度時即可撐開石墨層間距，持續升溫至攝氏1100度後持溫一小時，隨後爐冷，獲得石墨烯。
利用超臨界二氧化碳製備金奈米粒子，作為奈米金屬顆粒之用。其實驗之操作溫度及壓力分別為：以50℃，100bar，49mL的甲醇(>99.9%,methanol,TEDIA)為溶劑；26mg的三水合氯化金(Gold(III)chloride trihydrate,16961-25-4,HAuCl4．3H2O,Aldrich)為金前驅物；40mg的石墨烯為負載材料；還原劑係二甲基胺硼烷(>95.0%,Dimethylamine Borane,DMAB,TCI)加入1mL去離子水配成濃度為1.36M之水溶液。
將石墨烯加至甲醇溶液中，以超音波震盪10分鐘使得石墨烯均勻分散後，置於超臨界反應腔體中，再加入金前驅物與還原劑，並加壓至100bar。在50℃的溫度下，於超臨界二氧化碳中進行一小時的反應，最後使用甲醇反覆離心收集合成之石墨烯-金複合材料並將其烘乾乾燥。
接著，取1mg石墨烯-金複合材料加入260μm 之異丙醇(>99.5,isopropyl alcohol,IPA,TEDIA)做為溶劑；40μm離子交換樹脂(5wt% Nafion,Aldrich)當作與電極基板之接合劑。置於超音波震盪器中，經過一小時以上均勻混合成所需要之漿料。
接著，於手套箱中(Glove box,Innovation Technology,O2<0.1ppm，濕度<0.1ppm)，取適當量之N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide,BMPTFSI)離子液體(IL)稀釋於異丙醇(IPA)中(IL/IPA，v/v=1/10)。
取一直徑為5mm、0.196cm2之拋棄式網印電極，將上述置備完成之漿料8μL均勻地塗佈於該拋棄式網印電極上，並加入7μL經稀釋之離子液體，再二次塗佈上述漿料7μL，其中，該兩次塗佈之漿料體積維持於15μL，自然風乾後，使用100μL之磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer solution,PBS)將4.5mg的葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,type X-S,lyophilized powder,100-250units/mg solid)配成酵素溶液，滴8μL葡萄糖氧化酶溶液至該風乾之漿料上，相當於每支感測電極上有約50units葡萄糖氧化酶，放入4℃冰箱晾乾4小時，完成感測電極製備。
<實施例1-2>
除了以1-乙基-3-甲基咪唑雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(1-ethyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide,EMITFSI)離子液體(IL) 取代N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)外，利用與實施例1-1相同之步驟製得一感測電極。
<實施例1-3>
除了以N-丁基-N-甲基吡咯烷雙氰胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium dicyanamide，BMPDCA)離子液體(IL)取代N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)外，利用與實施例1-1相同之步驟製得一感測電極。
<實施例1-4>
除了以1-乙基-3-甲基咪唑二氰胺(1-ethyl-3-methylimidazolium dicyanamide，EMIDCA)離子液體(IL)取代N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)外，利用與實施例1-1相同之步驟製得一感測電極。
<比較例1-1>
除了不包括離子液體層外，利用與實施例1-1相同之步驟製得一感測電極。
<實施例2-1>
利用與實施例1-1相同之步驟製得包括石墨烯-金複合材料之漿料以及稀釋於異丙醇(IPA)中之N-丁基 -N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)之離子液體(IL)。
接著，取一直徑為3mm、0.071cm2之拋棄式網印電極，將上述置備完成之漿料2μL均勻地塗佈於該拋棄式網印電極上，並加入2μL經稀釋之離子液體，再二次塗佈上述漿料2μL，其中，該兩次塗佈之漿料體積維持於5μL，自然風乾後，使用150μL之磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer solution，PBS)將10units的果糖纈胺酸氧化酶(Fructosyl-Amino Acid Oxidase，recombinant，expressed in E.Coli，lyophilized powder，0.45units/mg protein)配成酵素溶液，滴3μL酵素溶液至該風乾之漿料上，相當於每支感測電極上有約0.2units果糖纈胺酸氧化酶，放入4℃冰箱晾乾4小時，完成感測電極製備。
<實施例2-2>
除了以1-乙基-3-甲基咪唑雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(1-ethyl-3-methylimidazolium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，EMITFSI)離子液體(IL)取代N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)外，利用與實施例2-1相同之步驟製得一感測電極。
<實施例2-3>
除了以N-丁基-N-甲基吡咯烷雙氰胺 (N-butyl-N-methyl pyrrolidinium dicyanamide，BMPDCA)離子液體(IL)取代N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)外，利用與實施例2-1相同之步驟製得一感測電極。
<實施例2-4>
除了以1-乙基-3-甲基咪唑二氰胺(1-ethyl-3-methylimidazolium dicyanamide，EMIDCA)離子液體(IL)取代N-丁基-N-甲基吡咯烷雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺(N-butyl-N-methyl pyrrolidinium bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide，BMPTFSI)外，利用與實施例2-1相同之步驟製得一感測電極。
<比較例2-1>
除了不包括離子液體層外，利用與實施例2-1相同之步驟製得一感測電極。
於下文中，將針對表1中不同離子溶液對於酵素型葡萄糖感測器與酵素型果糖纈氨酸感測器特性之影響進行討論。
使用三極式反應槽(three-electrode cell)，恆電位儀為AUTOLAB PGSTAT302N(Metrohm)。將上述實施例及比較例所製備完成之感測電極作為工作電極(working electrode)，並以白金絲為輔助電極(counter electrode)、Ag/AgCl(3M KCl)為參考電極(reference electrode)，電解液則為0.1M磷酸鹽緩衝溶液(該磷酸鹽緩衝溶液係以Na2HPO4(>99.0%,SHOWA)、NaH2PO4(>99.0,SHOWA)及KCl(>99.0%,SHOWA)配製而成)。當感測物質為葡萄糖(>98.0%,D(+)-glucose(Dextrose Anhydrous),SHOWA)時，對應其酵素為葡萄糖氧化酶；當感測物質為果糖纈胺酸(98.0%,Fructose Valine,TRC)時，對應其酵素為果糖纈胺酸氧化酶。
實驗例1：離子液體輔助
下文中，以包括不同離子液體之實施例及比較例之感測電極作為工作電極，探討有無包括離子液體層之感測電極之電特性差異。於通入30分鐘氮氣的0.1M PBS緩衝溶液中，利用以不同離子液體固定之酵素型葡萄糖感 測器之感測電極或以不同離子液體固定之酵素型果糖纈胺酸感測器之感測電極，以循環伏安法掃描50mV分別感測不同濃度(0~10mM)的葡萄糖或不同濃度(0~2mM)的果糖纈胺酸。
圖1A至1E分別代表實施例1-1、實施例1-2、實施例1-3、實施例1-4、比較例1-1之感測電極，係於反應槽中加入葡萄糖以後，溶液中的氧氣與上述感測電極上之葡萄糖氧化酶反應產生葡萄糖內酯和過氧化氫，偵測過氧化氫的電流來標定葡萄糖的濃度；至於圖1F至圖1J則分別代表實施例2-1、實施例2-2、實施例2-3、實施例2-4、比較例2-1之感測電極，則是於反應槽中加入果糖纈胺酸以後，溶液中的氧氣與上述感測電極上被固定的果糖纈胺酸氧化酶反應產生纈胺酸、葡糖酮醛、以及過氧化氫，並偵測過氧化氫的電流以標定果糖纈胺酸的濃度。
習知有許多種可用以偵測過氧化氫的方法，本實施例中係利用偵測還原過氧化氫的方式，其反應機構如下：H 2 O 2 +2e - +2H + →2H 2 O
使用循環伏安法，其掃描方向由0V向-0.8V掃，先遇到氧氣還原的電位產生陰極還原電流，接著明顯的陰極還原峰係為葡萄糖氧化酶(圖1A至1E)及果糖纈胺酸氧化酶(圖1F至圖1J)，習知過氧化氫還原較無完整的峰，因此擷取電流的電位定在-0.7V，不受氧氣干擾及酵素還原峰的影響，而從-0.8V回掃向0V經過的氧化峰為酵素的氧 化峰。
如圖1A至1E所示，包括離子液體層之感測電極(1A至1D，分別代表實施例1-1、實施例1-2、實施例1-3、實施例1-4)之循環伏安圖曲線比未包括離子液體層之感測電極(1E，代表比較例1-1)之循環伏安圖曲線之對稱性較佳，表示電活化物質在電極表面反應的可逆程度較佳，而在圖1F至圖1J亦可觀察到同樣的趨勢，即，包括離子液體層之感測電極(圖1F至圖1I，分別代表實施例2-1、實施例2-2、實施例2-3、實施例2-4)之循環伏安圖曲線比未包括離子液體層之感測電極(1J，代表比較例2-1)具有較佳的對稱性，其電活化物質在電極表面反應的可逆程度較佳。
此外，分別將圖1A至1D的實施例1-1至1-4、以及1F至1I的實施例2-1至2-4，與圖1E的比較例1-1、1J的比較例2-1相比，顯見實施例1-1至1-4及實施例2-1至2-4在偵測過氧化氫(H2O2)時皆具有較大的電流，且能夠抑制氧氣的干擾(電位約為-0.45V)。
接下來，探討以不同離子液體固定之酵素型葡萄糖感測器以及果糖纈胺酸感測器之電極靈敏度及偵測極限。
圖2A係以不同離子液體固定之酵素型葡萄糖感測器之感測電極之葡萄糖濃度與應答電流線性校正關係圖。其中，應答電流值為電位-0.7V的電流值扣除未加待測物的背景電流值，該些感測電極之電極靈敏度及偵測極限， 如表2所示。
由表2可清楚發現：包括離子液體層之感測電極(實施例1-1、實施例1-2、實施例1-3、實施例1-4)之電極靈敏度及偵測極限均大幅度地優於無離子液體層之感測電極(比較例1-1)，並且，進一步比較疏水性與親水性離子液體之電極靈敏度及偵測極限，可發現使用疏水性離子液體之實施例1-1、實施例1-2優於使用親水性離子液體之實施例1-3、實施例1-4。
圖2B係以不同離子液體固定之酵素型果糖纈胺酸感測器之感測電極之果糖纈胺酸濃度與應答電流線性校正關係圖，可清楚地發現，在酵素型果糖纈胺酸感測器也有與酵素型葡萄糖感測器相似的結果，即包括離子液體層之感測電極(實施例2-1、實施例2-2、實施例2-3、實施例2-4)之電極靈敏度及偵測極限均大幅度地優於無離子液 體層之感測電極，而當進一步比較疏水性與親水性離子液體之電極靈敏度及偵測極限，可發現使用疏水性離子液體之實施例2-1、實施例2-2優於使用親水性離子液體之實施例2-3、實施例2-4。如下表3所示。
實驗例2：存放時間
如上所述，酵素感測器最為人讚揚的是其對於待測物的專一性，然而酵素電極的存放環境嚴格，室溫環境會使酵素失去活性。因此，於下述實驗中，將實施例1-1至1-4及比較例1-1之感測電極存放於嚴苛的環境下(即室溫25℃空氣環境中)，存放時間與偵測葡萄糖的應答電流維持百分比，以探討離子液體對於酵素於室溫下存放時間的影響。
如圖3A所示，對實施例1-1、實施例1-2、實施例1-3、實施例1-4、以及比較例1-1之感測電極進行壽命測試，放置環境係室溫25℃空氣環境中，時間分別為製備 好馬上測量的電極(0小時)、以及一天(24小時)。圖3A中，包括最疏水的離子液體層BMPTFSI之電極(實施例1-1)在24小時後感測的電流依然能維持在95%以上，而EMITFSI(實施例1-2)則為約90%；而如BMPDCA(實施例1-3)、EMIDCA(實施例1-4)於24小時後感測的電流亦較未包括離子液體層之感測電極(比較例1-1)高，顯見包括離子液體層者，特別是包括疏水性離子之離子液體層者(實施例1-1、實施例1-2)能使酵素維持較高的酵素活性。
類似的結果亦可於酵素型果糖纈胺酸感測器中觀察到，如圖3B所示，24小時小時之後感測的電流依序為實施例2-1>實施例2-2>實施例2-3>實施例2-4>比較例2-1。
由於觀察到疏水性離子液體維持酵素活性的效果卓越，因此在接下來的實驗中，進一步比較放置於室溫25℃空氣環境中，分別對製備好馬上測量的感測電極(0小時)、以及120小時後之感測電極進行壽命測試。由圖4A可清楚發現，包括最疏水的離子液體層BMPTFSI之電極(實施例1-1)在120小時後感測的電流依然能維持在90%以上，而EMITFSI(實施例1-2)則為約70%；同樣地，圖4B中，包括最疏水的離子液體層BMPTFSI之電極(實施例2-1)在120小時後感測的電流依然能維持在85%左右，而EMITFSI(實施例2-2)則為約60%，均比未包括離子液體層之感測電極(比較例1-1、比較例2-1)具有更高的感測的電流。顯見包括離子液體層與否影響酵素型感測器之感測電極甚 大，包括離子液體層者能使酵素維持較高的酵素活性，從而使得包括離子液體層之感測電極具有優異的特性，且其中，特別是包括疏水性離子層之感測電極於25℃空氣環境中更能有效地保持酵素活性。
實驗例3：干擾物的影響
於本段中測試干擾物對於酵素型果糖纈胺酸感測器的影響。具體而言，係利用實施例2-1之感測電極，利用循環伏安法感測1mM果糖纈胺酸(FV)，加入與人體血液中接近濃度為1mM的抗壞血酸(AA)、2μM的多巴胺(DA)、及200μM的尿酸(UA)作為干擾物，電解液為0.1M PBS緩衝溶液，掃描速率為50mV/s。
如圖4所示，實施例2-1之感測電極，在干擾物抗壞血酸(AA)、多巴胺(DA)、及尿酸(UA)存在的情況下，依然能夠維持97%的應答電流。說明本發明之酵素型果糖纈胺酸感測器可排除干擾物的影響，穩定地偵測長期糖化血紅素指標。

Claims (9)

  1. 一種酵素型感測器之感測電極，包括：一電極基材；以及一酵素感測層，其係覆蓋於該電極基材之上，且該酵素感測層包括於該電極基材上依序層疊之：一第一碳材-奈米金屬層，其包括一碳材與一奈米金屬顆粒；一離子液體層，其包括由一陰離子與一陽離子所組成之一離子液體，其中，該離子液體之陽離子為：N-烷基-N-烷基吡咯烷陽離子(N-alkyl-N-alkyl-pyrrolidinium)、1-烷基-3-烷基咪唑陽離子(1-alkyl-3-alkyl imidazolium)、N-烷基-N-烷基哌啶陽離子(N-alkyl-N-alkyl-piperidinium)、四烷基銨陽離子(tetraalkylammonium)、四烷基鏻陽離子(tetraalkylphosphonium)、1,2-二烷基吡唑陽離子(1,2-dialkylpyrazolium)、N-烷基噻唑陽離子(N-alkylthiazolium)、或三烷基鋶陽離子(trialkylsufonium)；且該離子液體之陰離子係為：雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺陰離子(bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide,TFSI)、雙氰胺(dicyanamide,DCA)陰離子、三氟甲基磺酸陰離子(trifluoromethanesulfonate)、四氟硼酸陰離子(tetrafluoroborate)、或六氟磷酸陰離子(hexafluorophosphate)；一第二碳材-奈米金屬層，其包括一碳材與一奈米金屬顆粒；以及 一酵素層。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之感測電極，其中，該碳材係選自由：石墨烯、碳黑、多壁奈米碳管、單壁奈米碳管、活性碳、及碳球所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之感測電極，其中，該奈米金屬顆粒係選自由：金奈米顆粒、銀奈米顆粒、鉑奈米顆粒及鈀奈米顆粒所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之感測電極，其中，該酵素係一葡萄糖氧化酶或一果糖纈胺酸氧化酶。
  5. 一種酵素型感測器之感測電極之製備方法，包括：(A)將一漿料塗覆於一電極基材上方，以形成第一碳材-奈米金屬層，該漿料包括一碳材以及一奈米金屬顆粒；(B)塗佈一離子液體於該第一碳材-奈米金屬層上以形成一離子液體層，該離子液體係由一陰離子與一陽離子所組成，其中，該離子液體之陽離子為：N-烷基-N-烷基吡咯烷陽離子(N-alkyl-N-alkyl-pyrrolidinium)、1-烷基-3-烷基咪唑陽離子(1-alkyl-3-alkyl imidazolium)、N-烷基-N-烷基哌啶陽離子(N-alkyl-N-alkyl-piperidinium)、四烷基銨陽離子(tetraalkylammonium)、四烷基鏻陽離子(tetraalkylphosphonium)、1,2-二烷基吡唑陽離子(1,2-dialkylpyrazolium)、N-烷基噻唑陽離子(N-alkylthiazolium)、或三烷基鋶陽離子(trialkylsufonium)；且該離子液體之陰離子係為：雙{(三氟甲基)磺醯基}醯胺陰離子(bis(trifluoromethyl)sulfonyl imide,TFSI)、雙氰胺 (dicyanamide,DCA)陰離子、三氟甲基磺酸陰離子(trifluoromethanesulfonate)、四氟硼酸陰離子(tetrafluoroborate)、或六氟磷酸陰離子(tetrafluoroborate)；(C)再次塗佈步驟(A)之漿料於該離子液體層上以形成一第二碳材-奈米金屬層，使步驟(B)之該離子液體層夾置於該第一碳材-奈米金屬層與第二碳材-奈米金屬層之間；以及(D)形成一酵素層於該第二碳材-奈米金屬層之表面上。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之製備方法，其中，步驟(A)之該碳材與該奈米金屬顆粒係於超臨界二氧化碳環境下形成一碳材-奈米金屬複合材料。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之製備方法，其中，於步驟(A)之該碳材係選自由：石墨烯、碳黑、多壁奈米碳管、單壁奈米碳管、活性碳、及碳球所組成之群組。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之製備方法，其中，該奈米金屬顆粒係選自由：金奈米顆粒、銀奈米顆粒、鉑奈米顆粒及鈀奈米顆粒所組成之群組。
  9. 如申請專利範圍第5項所述之製備方法，其中，該酵素層係包括一葡萄糖氧化酶或一果糖纈胺酸氧化酶。
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