TWI510784B - 組織蛋白酶ｃ之用途 - Google Patents

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Description

組織蛋白酶C之用途
本發明係有關組織蛋白酶C之用途；本發明其他態樣係有關篩選醫藥劑、診斷疼痛敏感性及治療疼痛等方法。
於西方世界，慢性疼痛係破壞數百萬人民健康及幸福之重要未解決之健康問題。慢性疼痛對罹患個體之安康造成嚴重困擾且常伴隨或隨後常導致抑鬱之心理症狀。慢性疼痛結果產生巨大程度之個人苦惱及社會經濟損失。現行藥理學上之疼痛療法就效力及安全性而言廣泛地無法令人滿意。
鑑於與疼痛治療技藝狀況相關之嚴重缺點，業界對於治療進行中之疼痛、診斷及預知有關慢性疼痛可能進展之新穎選擇有極大需求。尤其鑑於疼痛神經生物學理解之快速進展與提供不具治療技藝狀況缺點之有效治療上未令人滿足之臨床需求間存在巨大差距，業界努力之方向需針對發現新穎類別止痛劑之新目標。
因此，本發明之目的在於提供開發及供應新類別疼痛調節藥物之新穎方法。
此目的藉由使用組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物以鑑定調節疼痛之化合物而獲得解決。
本發明乃基於發明人等令人驚奇之發現，於小鼠模式中第一次證明組織蛋白酶C表現與神經性疼痛之疼痛敏感性密切相關。
疼痛，依照國際疼痛研究協會之界定，係與實際或潛在組織傷害相關或就此等傷害所述之不愉快感覺及情感體驗。疼痛通常係專用於檢測及編碼組織傷害或潛在傷害之感痛神經系統被活化的結果。因此疼痛為身體警告系統之一部分，用於引發反應使對身體之實際或潛在傷害減至最小。疼痛可為醫療狀況之初始症狀或為疾病狀況之續發效應，常不具任何生物學意義。
疼痛可為急性或慢性。急性疼痛乃表示潛在或實際傷害之生理信號，伴隨組織傷害、感染、發炎或其他急性病因而發生，於身體受傷或功能失常後使個體所有警覺。急性疼痛若未適當處理，則可能導致慢性疼痛。
慢性疼痛係具有不同起因、持續時間、強度與特定症狀之疾病狀態。
慢性疼痛可能具感痛來源、為炎性或神經性。感痛性疼痛被認為與對體腔或內臟疼痛敏感的神經纖維之持續活化相當。神經性疼痛係起因於任何種類之周邊或中樞神經組織傷害之疼痛；一般相信為持續之周邊神經系統、CNS、或二者之異常體感過程(疼痛機制之概述參閱例如Scholz and Woolf,2002；Julius and Basbaum,2001,Woolf and Mannion,1999；Wood,J.D.,2000；Woolf and Salter,2000.)。
不同病患間之慢性神經痛具多變性。最近之數據指出，個人之疼痛敏感性在個人受痛苦之量上扮演重要角色，亦即對疼痛(特別是對神經痛之進展)存在重要之遺傳體質。本發明乃根據本發明人等於慢性疼痛之齧齒動物模式中致力於鑑定疼痛敏感性基因(亦即決定於所示、固定程度組織傷害存在下感覺到之疼痛量之基因)之精深研究。本發明人等所用之齧齒動物模式及實驗設定考慮到不同個體間a)可精確地控制神經傷害之性質與一致性及b)遺傳與環境變異性可減至最小之實驗條件。
組織蛋白酶C(CTSC；替代標題：二肽基(胺基)肽酶I、DPPI；(EC3.4.14.1))係一種溶酶體蛋白酶。
組織蛋白酶C之基因位點係在染色體11q14.1-q14.3上(參閱Rao et al.,1997)。組織蛋白酶C之基因體序列可自公開之NCBI核苷酸資料庫取得，其係歸入：NW_925129(包含人類組織蛋白酶C序列之基因體序列，SEQ ID NO：3)或NW_001030863(包含小鼠組織蛋白酶C之基因體DNA序列)。
編碼組織蛋白酶C之多核苷酸序列可自公開之NCBI核苷酸資料庫取得，其列入數個登入號碼中，例如：NM_001814(智人組織蛋白酶C轉錄本變異體1 mRNA)、BC113897(智人組織蛋白酶C之完整編碼序列(cds)，轉錄本變異體2，mRNA)、BC109386(智人組織蛋白酶C，mRNA，完整cds)、NM_009982(小家鼠組織蛋白酶C mRNA)。熟習此項技藝人士瞭解如何自該NCBI資料庫檢索組織蛋白酶C進一步之編碼序列(其他物種之組織蛋白酶C；若存在之組織蛋白酶C之突變體或各種同功型)。下文中論及組織蛋白酶C編碼序列時，可意指上述任何mRNA或編碼序列；較佳為，係意指根據索引編號NM_001814(人類)(SEQ ID NO：1)或NM_009982(小鼠)之序列。
組織蛋白酶C之蛋白質序列可自公開之NCBI蛋白質資料庫取得，例如歸入下述登入號碼：智人(hs)：完整cds：CAA6067、AAL48191、AAL48192、AAL38195、AAH54028、AAQ08887、AAI00893、AAI00894、AAI00892、AAI00895、AAI09387、AAI10072、AAI13851；hs同功型CRA_b：EAW59364；hs同功型CRA_a：EAW59363；hs組織蛋白酶C同功型a前蛋白原：NP_001805；hs同功型b前驅體：AAI13898或NP_680475。鼠科動物(小家鼠)組織蛋白酶C：AAH67063；前蛋白原：NP_034112；同功型CRA-b(小家鼠)：EDL06796；同功型CRA-a(小家鼠)：EDL06795。此外，蛋白質序列可自公開之UniprotKB資料庫(www.beta.uniprot.org )取得，登入號碼為：P53634(人類_CATC，人類組織蛋白酶C，SEQ ID NO：2)、或P97821(CATC_小鼠，鼠科動物組織蛋白酶C)。下文中論及組織蛋白酶C蛋白質或胺基酸序列時，可意指上述任何蛋白質序列；較佳為，係意指根據索引編號P53634(人類序列)或P97821(鼠科動物序列)之序列。
NCBI係生物技術資訊之全國性中心(郵政地址：National Centre for Biotechnology Information,National Library of Medicine,Building 38A,Bethesda,MD 20894,USA；網址：www.ncbi.nhm.nih.gov )。更多序列(例如帶有SwissProt或EMBL登入號碼之序列)可從UniProtKB資料庫檢索，網址為www.beta.uniprot.org 。
hs組織蛋白酶C之選殖由Paris等於1995年發表；鼠科動物組織蛋白酶C之選殖由Pham等於1997年發表。5' 側邊區域(啟動子/促進子)由Rao等於1997年發表(尤其是參閱第10263頁圖4及該頁下方之詳細說明，其併入本文以資參考；例如從-1127開始上達至+1之基因序列)。組織蛋白酶C在肺、腎及胎盤中高量表現，在多種其他器官中(包括免疫系統之細胞)表現程度較小(Rao et.al.,1997)。
組織蛋白酶C係能自蛋白質基質胺基端移除二肽之溶酶體蛋白酶。組織蛋白酶C涉及顆粒絲胺酸蛋白酶(彼等於免疫系統之骨髓衍生之效應細胞中表現)之活化；並涉及T-淋巴細胞顆粒酶A(GZMA)與B(GZMB)及顆粒酶C之處理(processing)與活化；進一步功能為各種溶酶體組織蛋白酶之處理、利用移除抑制性N端二肽殘基之各種絲胺酸蛋白酶(似胰凝乳蛋白酶之絲胺酸蛋白酶)(例如上述顆粒酶、組織蛋白酶C本身、嗜中性白血球彈性蛋白酶、蛋白酶-3、肥大細胞凝乳酶與胰蛋白酶)之活化(Toomes et al.,1999,Pham and Ley 1999,Turk et al,2000,Henningsson et al,2003；McGuire et al.,1993；Adkison et al.,2002；Wolters et al,2001；Pham et al,2004；DeHaar et al,2004；Sheth et al,2003,Methot et al.,2007)。其功能通常包括：蛋白酶活性、肽酶活性例如二肽基肽酶、外肽酶或內肽酶活性；絲胺酸蛋白酶(例如下述一或多種：彈性蛋白酶、組織蛋白酶G及顆粒酶A與B、神經胺酸苷酶及因子XIII)之活化。
組織蛋白酶C為200kD四聚體蛋白(Paris et al.,1995)，與其他組織蛋白酶(例如組織蛋白酶B、H、L與S)對照下，為小單體酵素。組織蛋白酶C蛋白質係蛋白前驅體型，經處理成為具蛋白水解活性之酵素。組織蛋白酶C之成熟單體型由重鏈、輕鏈及與該活性酵素相關之殘留原肽(propeptide)組成(Wolters et al.,1998；Cigic et al.,2000)；四個該等組織蛋白酶C單體形成具蛋白水解活性之200kD組織蛋白酶C四聚體。
組織蛋白酶C基因剔除小鼠(Dppi-基因剔除小鼠)之產生由Pham與Ley於1999年發表(參閱材料與方法部分，從第8627至8629頁，尤其是第8627頁右欄下半部至第8628頁左欄上半部有關DPPI標靶載體之構築及DPPI -/-小鼠之產生；亦參閱Heusel et al,1994；Mansour et al.,1988及Soriano et al.,1991；其中Pham and Ley,1999係論及胚胎幹細胞產生)。
根據本發明之用途得以鑑定用於預防及/或治療疼痛(尤其是神經性疼痛)之新穎物質。根據本發明之用途包括鑑定具有所需特性(亦即降低疼痛感)之化合物以及鑑定具有不為所欲之特性(亦即增加疼痛感)之化合物。此外，本發明容許進一步鑑定已確定可用於預防及/或治療任何疾病或疾病狀態之化合物。於此情形下，本發明可例如用於排除確定具有有害副作用(亦即增加疼痛感)之活性化合物：對既定疾病之候選化合物可例如描述其對組織蛋白酶C之影響(蛋白質及/或核酸、表現及/或功能等)。
擬用於本發明各種態樣之化合物/測試化合物/活性化合物可為利用生物化學或分子生物方法純化、部分純化、合成或製造之任何生物性或化學物質或天然產物萃取物。
於本發明各態樣之感覺中被視為具有調節疼痛活性之化合物可為對組織蛋白酶C諸功能之一者或對細胞中組織蛋白酶C量(蛋白質或核酸)、對組織蛋白酶C表現、轉錄後修飾作用(例如N-糖基化作用或處理(例如排外功能部位之裂離，例如於位置58或61))、單體之寡聚作用、蛋白質摺疊或活化具影響力之任何物質。
欲達此目的，該物質可調節組織蛋白酶C之任何功能(例如上文或下文列舉者)。組織蛋白酶C蛋白質活性可利用該物質予以調節，例如利用直接與組織蛋白酶C多肽/蛋白質或其片段相互作用及進行干擾。該物質亦可調節組織蛋白酶C表現，例如於轉錄(開始、延長、處理等)、轉錄本穩定性、轉譯層次上；此外其可調節轉錄後修飾作用、從不具活性至活性型之處理(使前蛋白原型裂離成為三多肽形成活性單體)及/或使單體寡聚成為四聚體型、以及組織蛋白酶C之蛋白質摺疊等。該物質可直接或間接發揮上述效應(間接意指利用對組織蛋白酶C功能/蛋白質活性/表現等具影響力之天然傳訊級聯進行干擾(正面或負面)等)。
組織蛋白酶C之功能包括上述列舉者，例如蛋白酶活性；自一或多個蛋白質基質胺基端移除二肽之能力；與一或多個蛋白質基質特異性地相互作用(蛋白質-蛋白質相互作用)之能力，例如上述列舉者；裂離及/或活化一或多個蛋白質基質之能力，例如上述列舉者；處理蛋白質基質之能力，例如上述列舉者。
組織蛋白酶C之功能通常亦包括組織蛋白酶C蛋白質或核酸或其片段與其他分子(包括，惟不限於：蛋白質、核酸、合成分子)相互作用之能力，較佳為有關其與蛋白質基質相互作用及將其裂離之能力。
於本申請案之名詞中，酵素之基質乃可被酵素修飾之任何分子。於本發明範圍內，天然存在之基質係相當於彼等於天然生理或病理環境中存在形式之分子(例如顆粒絲胺酸蛋白酶、GZMA、GZMB)，彼等亦能被各個酵素修飾。
疼痛之調節可為減少或增加。
根據與本發明相關組群間之一態樣，可使用組織蛋白酶C之片段或衍生物。片段可為蛋白質、多肽或多核酸之片段。
蛋白質或多肽之片段係相較於全長組織蛋白酶C帶有一或多個終端(n端及/或c端)及/或一、二或多個胺基酸內部缺失之蛋白質或多肽；片段包括，例如1.其胺基酸鏈中帶有二肽Xaa-Yaa、Zaa-之n端缺失之組織蛋白酶C片段，尤其當Xaa為Arg或Lys，或Yaa或Zaa為Pro時除外；2.其中缺失訊息肽(胺基酸鏈之胺基酸1-24)之組織蛋白酶C片段或由胺基酸25-463組成之組織蛋白酶C片段；3.包含或由根據SEQ ID NO：2之胺基酸鏈(二肽基-肽酶1排外功能部位鏈)位置25-134組成之組織蛋白酶C片段；4.其中缺失原肽(胺基酸135-230)之組織蛋白酶C片段；5.包含或由二肽基肽酶1重鏈(胺基酸231-394)組成之組織蛋白酶C片段；6.包含或由二肽基肽酶1輕鏈(胺基酸395-463)組成之組織蛋白酶C片段；7.包含二肽基肽酶1輕鏈(胺基酸395-463)與重鏈(胺基酸231-394)之組織蛋白酶C片段；8.包含二肽基肽酶1輕鏈(胺基酸395-463)與重鏈(胺基酸231-394)之組織蛋白酶C片段。
上述片段之位置參照SEQ ID NO：2；上述片段之較佳實例係有關根據SEQ ID NO：2之蛋白質之片段。
組織蛋白酶C蛋白質之功能性片段乃具有全長蛋白質(尤其是如上文列舉者)之至少一或多個功能特性之此蛋白質之任何片段。
多核苷酸之片段係相較於全長基因體或編碼序列帶有一或多個終端(5’-及/或3’-)及/或一、二或多個核苷酸內部缺失之多核苷酸或寡核苷酸。組織蛋白酶C核酸之功能性片段乃具有全長多核酸(mRNA、基因體或編碼序列)之至少一或多個功能特性之任何片段。
組織蛋白酶C之衍生物一詞包含相較於天然存在之形式(尤其是相較於未缺失之根據SEQ ID NO：1或SEQ ID NO2之組織蛋白酶C)之任何類型之組織蛋白酶C之修飾作用。組織蛋白酶C之功能性衍生物乃具有未修飾蛋白質之至少一個，較佳為二或多個功能特性之此蛋白質之任何衍生物。衍生物包括，例如導使例如多肽或多核苷酸穩定(例如核酸主鏈之硫代磷酸修飾作用或胺基酸間之鍵結交換等)、或使多肽或多核苷酸特異性標靶導向特定細胞或促進其進入細胞中或被細胞攝入(例如細胞滲透性磷肽類，鄰位偶聯於細胞滲透性肽載體，例如以觸足(antennapedia)/滲透、TAT與訊息肽係序列為基礎；或偶聯於特異性轉運子或輸入子之配位體部分)之胺基酸或核苷酸序列之修飾作用或任何其他種類之修飾作用(例如化學或生物性修飾作用)。
本發明亦包含組織蛋白酶C諸片段之功能性衍生物。
本發明另一態樣係有關使用非人類基因選殖動物異源表現之組織蛋白酶C或其功能性片段鑑定或分析調節疼痛化合物之用途。
非人類動物可為任何非人類動物；較佳為齧齒動物例如大鼠或小鼠。
基因選殖動物乃其基因體中帶有已謹慎移入之外來DNA之動物。外來DNA之引入動物基因體中可根據標準程序進行(參閱例如Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook.C.A.Pinkert,editor；Academic Press Inc.,San Diego,California,1994(ISBN：0125571658))。
異源表現一詞係指與宿主生物中正常基因表現不同之表現(關於所表現基因之穩定狀態程度、量、時序或組織分佈或關於所表現基因之類型(亦即該基因通常根本不在宿主中表現))。異源表現可為構成性或誘導性。適當之誘導性表現系統為此項技藝中悉知(例如四環素可誘導系統等)。該生物可為細胞或非人類動物。
根據另一態樣、本發明係有關使用非人類基因選殖動物異源表現之組織蛋白酶C或其功能性片段作為增強疼痛敏感性模式系統之用途。
本發明又一態樣係有關使用非人類組織蛋白酶C基因剔除動物鑑定或分析調節疼痛化合物之用途。
基因剔除生物(例如動物或細胞)係指其中基因之表現或功能部分或完全缺失及包含基因體以及功能性剔除、可誘導以及構成性剔除之生物。基因剔除生物之產生為此項技藝中悉知，用於產生基因剔除生物之細胞或動物亦然。組織蛋白酶C-基因剔除小鼠之產生見述於Pham and Ley,1999。
本發明之進一步態樣係有關使用非人類組織蛋白酶C基因剔除動物作為模式系統以降低疼痛敏感性之用途。
使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞鑑定調節疼痛化合物之用途為本發明之另一態樣。
細胞可為任何原核生物或真核生物細胞，例如能被核酸載體轉染及能表現報導基因之細胞。彼等主要包括初級細胞及得自細胞培養之細胞，例如包含衍生自多細胞生物與組織(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物例如酵母(例如裂殖酵母(S.pombe )或釀酒酵母(S.cerevisiae ))等細胞之真核生物細胞培養物、或原核生物細胞培養物(較佳為畢赤酵母(Pichia )或大腸桿菌)。衍生自組織之細胞與試樣可利用悉知技術取得，例如採血、組織穿刺或外科手術。
根據一具體實例，係使用相較於其未修飾狀態，具有較低組織蛋白酶C活性之修飾細胞。以此方式，例如，可測試欲測試之化學化合物是否可提高或恢復已降低或徹底被破壞之組織蛋白酶C活性；或可測試該物質是否能於降低疼痛敏感性狀況下執行其功能(例如疼痛調節或甚至另一疾病狀態或疾病環境中之功能)。
修飾作用可為導使組織蛋白酶C活性、組織蛋白酶C轉錄本穩定狀態程度(亦即利用活化組織蛋白酶C轉錄或轉錄本穩定化)或組織蛋白酶C蛋白質穩定狀態程度(亦即利用活化組織蛋白酶C轉譯或其轉譯後處理；利用調節組織蛋白酶C轉譯後修飾作用或活化其穩定性或抑制其降解)降低之任何類型之修飾作用(穩定性或短暫性，較佳為穩定性)；此可藉由使用組織蛋白酶C之顯性抑制突變體、反義寡核苷酸、組織蛋白酶C之RNAi構築體、利用產生功能性或基因體組織蛋白酶C剔除(其可為例如可誘導)或此項技藝內已知之其他適當技術達成。上述技術之綜述可參閱例如：Current protocols in Molecular biology(2000)J.G.Seidman,Chapter 23,Supplemtent 52,John Wiley and Sons,Inc.；Gene Targeting：apractical approach(1995),Editor：A.L.Joyner,IRL Press；Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000；Antisense Therapeutics,1996；Scherr et al,2003。
根據一具體實例，係使用組織蛋白酶C基因剔除細胞。用於產生基因剔除之適當細胞株為此項技藝中悉知，參閱例如Current protocols in Molecular Biology(2000)J.G.Seidman,Chapter 23,Supplement 52,John Wiley and Sons,Inc；或Gene Targeting a practical approach.(1995)Ed.A.L.Joyner,IRL Press。組織蛋白酶C(DPPI)基因剔除細胞之產生亦發表於Pham and Ley,1999(參閱第8628頁，左欄上半部，DPPI鼠科動物胚胎幹細胞基因剔除選殖株之產生)。
本發明另一態樣係有關使用組織蛋白酶基因剔除細胞鑑定或分析調節疼痛化合物之用途。
再者，使用組織蛋白酶基因剔除細胞作為降低疼痛敏感性模式系統之用途乃與本發明相關組群間之另一態樣。
根據本發明另一具體實例，相較於參照細胞(例如呈其未修飾狀態之相同細胞)，細胞可具有較高量之組織蛋白酶C。由於組織蛋白酶C表現量與疼痛敏感性相關，因此此細胞系可用於模擬增強疼痛敏感性之狀態。
因此本發明亦有關使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞作為增強疼痛敏感性模式系統之用途。
本發明亦有關使用異源表現可表現地連接於組織蛋白酶C啟動子及/或促進子或其功能性片段的報導基因之細胞鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。
本發明之上述態樣乃根據此項技藝中一般已知之典型報導基因測定法。欲達此目的，將所選擇之啟動子嵌入適用於選定宿主細胞類型之表現載體中所選擇報導基因上游，俾使於啟動子具活性時，得以表現報導基因。接著將該構築體引入所選擇宿主細胞中。轉形或轉染之適當方法為此項技藝中悉知，細胞培養及報導基因表現之檢測亦然(參閱例如下文列舉之標準文獻)。適當條件為此項技藝中悉知，載體、報導基因及需要之試劑亦市售可得。
載體為圓形或線型多核苷酸分子，例如DNA質體、噬菌體或粘接質體，用於使多核苷酸片段(例如自其他載體切割出或利用PCR擴增及嵌入選殖載體中)特異性地於適當細胞或生物中擴增。表現載體俾使所關注基因(例如報導基因)於宿主細胞或生物中異源表現。細胞或生物類型主要取決於目的，其選擇隸屬熟習此項技藝者知識範圍之內。用於擴增核酸之適當生物為例如具有高增殖率之多數單細胞生物，例如細菌或酵母。適當之生物亦可為自多細胞組織單離及培養之細胞，例如自多樣生物產生之細胞株(例如得自草地黏蟲(Spodoptera frugiperda )之SF9細胞等)。適當之選殖載體為此項技藝中已知，可自不同生物科技供應廠商購得，例如Roche Diagnostics、New England Biolabs、Promega、Stratagene等等。適當細胞株可自例如美國菌種保存中心(ATCC)購得。
就蛋白質或多肽之異源表現而言，細胞可為能被核酸載體轉染及表現所關注基因(例如報導基因)之任何原核生物或真核生物細胞；彼等主要包括初級細胞及得自細胞培養之細胞，較佳為真核生物細胞培養物包括衍生自多細胞生物與組織之細胞(例如HEK293、RIN-5F、HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵母)、或原核生物細胞培養物(較佳為畢赤酵母或大腸桿菌)。衍生自組織之細胞與試樣可利用悉知技術取得，例如採血、組織穿刺或外科手術。
於本申請案說明書中，「轉染」一詞係指將核酸載體引入宿主細胞(原核生物或者真核生物細胞)中，因此包含「轉形」一詞。
轉染可為穩定或短暫轉染。
組織蛋白酶C啟動子為組織蛋白酶C基因之一部分，若將其引入基因產物編碼序列適當表現載體上游，能驅動所關注基因產物表現。較佳為，組織蛋白酶C啟動子包含或由根據如Rao et al.,1997第10263頁圖4發表之核苷酸序列-1127至+1所組成。組織蛋白酶C啟動子之功能性片段為若引入基因產物編碼序列適當表現載體上游，能驅動所關注基因產物表現之組織蛋白酶C啟動子之任何片段。較佳片段包括如Rao et al.,1997第10263頁圖4發表之組織蛋白酶C啟動子之功能性片段。
報導基因可為得以容易定量其基因產物之任何基因。用於真核生物或原核生物宿主之各式各樣報導基因以及檢測方法與必要試劑為此項技藝中已知及市售可得。彼等包括例如β內醯胺酶(lacZ)、蟲螢光素酶、綠或藍螢光蛋白(GFP或BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1或LEU2或β半乳糖苷酶等之基因。彼等基因編碼可利用看得見(顏色或螢光)之反應容易地予以檢測之蛋白質(例如lacZ、蟲螢光素酶)；包括可利用看得見(顏色或螢光)之反應容易地予以檢測之基因產物或表現時賦予對例如胺苄青黴素或康黴素(Kanamycin)等抗生素之抗性之基因產物。其他報導基因產物使得表現之細胞於特定條件下生長，例如營養缺陷型基因。
報導基因之功能性片段為得以容易定量其基因產物之既定報導基因之任何片段。
於本申請案說明書中，「轉染」一詞係指將核酸載體引入宿主細胞(原核生物或者真核生物細胞)中，因此包含「轉形」一詞。
轉染可為穩定或短暫轉染。
細胞可為能被核酸載體轉染及表現報導基因之任何原核生物或真核生物細胞；彼等主要包括初級細胞及得自細胞培養之細胞，較佳為真核生物細胞培養物包括衍生自多細胞生物與組織之細胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵母)、或原核生物細胞培養物(較佳為畢赤酵母或大腸桿菌)。衍生自組織之細胞與試樣可利用悉知技術取得，例如採血、組織穿刺或外科手術。
於本發明上述態樣之說明書中，對照載體可為包含報導基因或其功能性片段，惟其中報導基因表現不被(功能性)組織蛋白酶C啟動子驅動之任何適當載體；此可例如意謂該報導基因或其功能性片段未操作性地偶聯於功能性組織蛋白酶C啟動子(亦即或為完全缺乏組織蛋白酶C啟動子、包含非功能性組織蛋白酶C啟動子或啟動子片段、或其中啟動子與報導基因之偶聯不具功能性)。另一可能性為報導基因或其功能性片段係操作性地偶聯於另一啟動子而非組織蛋白酶C啟動子(例如SV40或另一標準啟動子)。功能性載體及對照載體亦可被轉染至相同細胞，惟於此情形下，報導基因必須不同。
根據上述用途之化合物之鑑定可例如根據如下文敘述或如此項技藝中已知之測定法進行。
測定法為監測生物程序之任何類型分析方法或系統。適當地，代表部分生理代謝路徑以及病理狀況之分子級聯與機制係於細胞或生化(試管內)系統中複製。潛在醫藥劑化合物之藥理活性因此亦根據其干擾或調節彼等級聯或機制之能力予以測定。
用於藥物篩檢，尤其是新穎醫藥化合物之高速篩檢時，該測定法必須可再現及較佳為亦具可擴展性及穩健性。於本發明範圍內，高速篩檢意指根據本發明方法係呈極小規模進行，例如於96、386或1536槽盤上，試樣容積小至呈數毫升至數奈升(nanoliters)不等或甚至更少。因此，可於短時間內進行極大量試樣之分析。高速量篩檢通常包括利用單一測定法針對特定能力篩檢大約500.000個不同化合物。該測定法較佳為適用於高速篩檢化學物質調節研究中之標靶分子活性之能力。測定法之類型取決於例如所用標靶分子(例如多肽或多核苷酸)之類型及「讀數(read out)」，亦即據以測定標靶分子活性之參數(參閱下文)。
不同類型之此等測定法通常為此項技藝中已知及可向市面上之供應商購得。
供不同目的之適當測定法包括放射性同位素或螢光測定法，例如螢光極化測定法(例如由Panvera市售供應者)或Packard BioScience(HTRF；ALPHAScreenTM )，係用於測量標記成員與未標記成員之相互作用(例如標記蛋白與其未標記蛋白-配位體之相互作用)。
更多實例包含細胞系測定法，其中細胞株穩定地(可誘導與否；染色體性或游離基因體性)或短暫地表現所關注之重組蛋白。彼等測定法包括例如報導基因測定法，其中訊息轉導級聯成員之特定啟動子或訊息轉導路徑之調控係根據報導子酵素之活性測定，其表現在該特定啟動子之控制下。針對此類測定法，必須構築含有於其本身被研究或被所研究傳訊級聯調控之界定啟動子控制下的報導基因之重組細胞株。適當之報導子酵素通常為此項技藝中已知及包括螢火蟲蟲螢光素酶、水母蟲螢光素酶(例如市售可得之Packard試劑)、β-半乳糖苷酶。適當細胞株視測定法之目的而定，惟包括容易轉染及容易培養之多數細胞株，例如HeLA、COS、CHO、NIH-3T3等。
關於測定蛋白酶活性，已知之典型蛋白酶測定方式如下：例如使用於基質之一部位帶有報導子標記(例如發光/螢光或其他訊息發射蛋白/肽或實體)及於另一部位帶有抑止子(實體(例如只要該基質完整/未裂離，即能抑制報導子標記之訊息發射之另一肽))之基質；於適當條件下使基質與組織蛋白酶C一起培養，俾使由於抑止子與報導子標記分離引致基質裂離而導使發射可檢測訊息(例如光發射)。
其他類型測定法及其他類型之「讀數」為此項技藝中悉知。
根據本發明之測定法係有關：
鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，該方法包括下述步驟：a.提供至少兩個試樣；b.使含有組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物之一試樣與化合物接觸；c.於化合物存在下，測定組織蛋白酶C之活性；d.於化合物不存在下，測定組織蛋白酶C之活性；及e.比較根據c)與根據d)之組織蛋白酶C活性；
鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.使組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物與測試化合物接觸；及b.測定該測試化合物是否調節組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之活性；
鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.使具有可檢測之組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物量或活性之細胞與測試化合物接觸；及b.測定該測試化合物是否能調節存在該細胞中之組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物之量或活性；
鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.於具轉錄活性之系統中使編碼組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之核酸與測試化合物接觸；及b.測定於該測試化合物存在下，存在該系統中之編碼組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之mRNA之量；及c.測定該化合物是否能於該系統中調節編碼組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段或衍生物之mRNA之量。
具轉錄活性之系統為至少具有執行轉錄單元之轉錄反應能力之任何生化或細胞系統。此等系統為此項技藝中悉知及包含市售可得之細胞以及試管內轉錄系統或套組(例如以細胞萃取液為基礎者)。
鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法包括：a.提供被包含操作性地偶聯於報導基因或其功能性片段之組織蛋白酶C或其功能性片段啟動子之核酸載體轉染之細胞；b.提供被包含未操作性地偶聯於功能性組織蛋白酶C啟動子之報導基因或其功能性片段之對照載體轉染之細胞；c.於測試化合物存在下，測定根據a)與b)之細胞之報導基因活性；d.於測試化合物不存在下，測定根據a)與b)之細胞之報導基因活性。
鑑定或分析調節疼痛化合物之方法包括：a.選定調節組織蛋白酶C活性之化合物作為測試化合物；b.投與具疼痛感之病患該測試化合物以確定疼痛是否被調節。
鑑定或分析調節及/或預防病患疼痛化合物之方法，包括：a.於一或多種測試化合物存在下測定組織蛋白酶C或其功能性片段或衍生物之生物活性以鑑定調節組織蛋白酶C生物活性之一或多種調節化合物；及b.測試該一或多種調節化合物減少病患疼痛、疼痛感或疼痛敏感性之能力。
本發明之進一步態樣係有關將病患組群分類及協助醫師適應/改進其治療個別病患之藥物基因體方法，例如：分析個體疼痛閥值之方法包括分析該個體採樣中組織蛋白酶C之量相較於一或多個參考試樣，是否存在該試樣中之組織蛋白酶C mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參考試樣不同；若存在較高量表示該個體疼痛敏感性增加，存在較低量表示疼痛敏感性降低；調整用於預防及/或治療個體疼痛之醫藥劑劑量之方法，該方法包括檢測個體採樣有關是否存在該試樣中之組織蛋白酶C mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參考試樣不同，該劑量視存在個體採樣中蛋白質及/或mRNA之量是否與一或多個參考試樣不同而調整；其中個體採樣中較高量之組織蛋白酶C表示需要較高劑量，個體採樣中較低量之組織蛋白酶C表示需要較低劑量。
本文所用之「採樣」一詞係指自一或多個個體(人類或非人類動物)身體取得/分離之生物試樣。生物材料及生物試樣包括，例如細胞、組織或器官(例如腦、血液、肝、脾、腎、心、血管等)之製劑或部分，較佳為係衍生自脊椎動物，更佳為衍生自哺乳動物包括人類；亦包括得自細胞培養之細胞，較佳為真核生物細胞培養物包括衍生自多細胞生物與組織之細胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3細胞)或單細胞生物例如酵母(例如裂殖酵母或釀酒酵母)等細胞之真核生物細胞培養物、或原核生物細胞培養物(較佳為畢赤酵母或大腸桿菌)。衍生自組織之細胞與試樣可利用悉知技術取得，例如採血、組織穿刺或外科手術。重組分子之製備與得自細胞或組織之天然存在分子之純化、以及細胞-或組織萃取物之製備為熟習此項技藝人士悉知(亦參閱例如下文列舉之標準文獻)。
「參考試樣」一詞係指具有已知既定疼痛表現型之得自一或多個個體之生物試樣或係指試管內生物試樣(例如源自試管內細胞或組織培養之試樣(例如培養細胞))，其於特定特性上(例如其組織蛋白酶C活性、量或表現程度)與既定疼痛表現型(例如高疼痛敏感性或低疼痛敏感性)一致。
本發明又一態樣係有關使用檢測組織蛋白酶C之工具測定增強個體疼痛敏感性之用途，其藉由分析取自欲檢測個體之生物試樣。
檢測組織蛋白酶C之工具可為能特異性地檢測存在生物試樣中之組織蛋白酶C多肽/蛋白質或核酸之任何工具。
特異性地檢測組織蛋白酶C蛋白質或多肽之工具可為能特異性地檢測任一野生型組織蛋白酶C蛋白質/多肽之任何工具及亦可為特異性地檢測相較於野生型多肽/蛋白質，帶有有關大小或胺基酸序列之一或多個突變之組織蛋白酶C蛋白質/多肽之工具。此等工具之較佳實例為例如用於免疫組織學或免疫組織化學技術之能特異性地檢測組織蛋白酶C蛋白質之抗體(例如組織學組織切片中之組織蛋白酶C蛋白質或其特定突變之檢測或固定於適當載劑如膜、晶片(chips)、ELISA盤等上之組織蛋白酶C蛋白質之檢測)。組織蛋白酶C抗體為市售可得，例如Goat Anti-Human Cathepsin C,Catalog# AF1071,R&D Systems(Minneapolis,USA)、Goat Anti-Mouse Cathepsin C,Catalog# BAF1034,R&D Systems(Minneapolis,USA)。
特異性地檢測組織蛋白酶C核酸之工具可為例如檢測野生型亦或相較於野生型組織蛋白酶C核酸帶有有關其長度或其核酸序列之一或多個突變之組織蛋白酶C mRNA/cDNA或基因體DNA之工具。彼等工具可為例如特異性地檢測及/或定量組織蛋白酶C mRNA[較佳為包含或為能擴增組織蛋白酶C DNA或例如用於PCR定序(用於檢測核苷酸序列中之突變)或能擴增組織蛋白酶C cDNA，例如用於RT PCR(用於檢測及/或定量組織蛋白酶C mRNA表現)之特異性組織蛋白酶C核酸探針或引子組]之工具。另外之工具可為例如於標準條件下能特異性地與組織蛋白酶C mRNA或cDNA雜交(例如用於北方墨點法或晶片雜交技術)之核酸探針。
野生型一詞係指於自然界中發現或於標準實驗室貯存之既定生物之基因型或表現型。根據一較佳具體實例，組織蛋白酶C之野生型序列為根據SEQ ID NOs：1、2、3之序列。
適當引子之設計與合成為此項技藝中悉知(亦參閱上文)。根據本發明之較佳具體實例，該工具為用於擴增組織蛋白酶C核酸(例如人類組織蛋白酶C核酸)之引子組，較佳為含有至少一個根據SEQ ID No.4及/或5的引子之引子組。
根據本發明之進一步較佳具體實例，該工具為用於檢測組織蛋白酶C核酸之探針，較佳為具有根據SEQ ID No.6之序列之探針。適當探針之設計與合成為此項技藝中悉知(亦參閱下文之標準文獻)。
根據本發明之又另一較佳具體實例，該工具為用於特異性檢測組織蛋白酶C蛋白質或多肽之抗體。適當抗體或其功能性片段之製備亦為此項技藝中悉知，例如以組織蛋白酶C蛋白質或其片段對哺乳動物(例如兔子)，適當時於例如弗氏佐劑(Freund’s adjuvant)及/或氫氧化鋁凝膠存在下，進行免疫處理(參閱，例如Diamond,B.A.et al.(1981)The New England Journal of Medicine：1344-1349)。免疫反應結果於動物中形成之多株抗體隨後可使用悉知方法自血液中分離及，例如，利用管柱層析法予以純化。單株抗體可，例如，根據Winter & Milstein之已知方法(Winter,G.& Milstein,C.(1991)Nature,349,293-299)製備。製造單株抗體之適當程序亦為此項技藝中悉知(參閱例如下文列舉文獻之標準方法)。於本發明說明書中，抗體或抗體片段一詞亦包含經重組製造及適當時經修飾之抗體或其抗原結合部分，例如嵌合型抗體、人類化抗體、多功能抗體、雙特異性或寡特異性抗體、單股抗體及F(ab)或F(ab)2 片段(參閱，例如，EP-B1-0368684、US 4,816,567、US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213或WO 98/24884)。
本發明另一態樣係有關用於測定個體疼痛敏感性之診斷套組，該測試套組包含用於檢測生物試樣中之組織蛋白酶C之至少一種工具。
於本發明說明書中，測試套組欲被瞭解為係本申請案中鑑定之諸成分之任何組合物，彼等成分於空間共存成為功能性單元及可含有進一步成分。
於本發明說明書中，測試套組包含用於檢測生物試樣中之組織蛋白酶C(例如量/或突變)之至少一種工具，適當地連同用於進行檢測反應(例如利用抗體之組織蛋白酶C之免疫檢測、用於測定組織蛋白酶C活性之酵素反應等)之適當緩衝劑及/或試劑、及/或試樣製備、與視需要之進行各個檢測技術之操作手冊。
本發明之其他態樣係有關諸治療方法，例如：一種用於治療罹患疼痛病患之疼痛之方法，該方法包括投與該病患治療有效量之降低該病患之組織蛋白酶C量或活性之組成物。此可為組織蛋白酶C全部量或活性或特定組織例如神經組織、淋巴組織或免疫系統細胞例如肥大細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、T-細胞(例如CD8+ T-細胞)等中之量或活性；其中治療有效量包括足以改善個體之疼痛感或敏感性之量。
本發明又另一態樣係有關降低病患之疼痛敏感性之方法，該方法包括投與該病患治療有效量之降低該病患之組織蛋白酶C之量(例如表現、半衰期)或活性(例如於免疫系統中之淋巴或神經組織或細胞中)之組成物。
此外，本發明係有關調節非人類雌性對象之後代之疼痛敏感性之方法，該方法包括轉移(例如電穿孔)賦與調節組織蛋白酶C表現之核酸至接合子中，轉移該接合子至非人類育雛母體中，及根據其組織蛋白酶C表現特性(相較於野生型病患，例如小鼠，表現較低或徹底破壞之組織蛋白酶C)挑選後代。
本發明另一態樣係有關能降低組織蛋白酶C活性及/或表現以治療疼痛之化合物。
組織蛋白酶C之抑制劑為此項技藝中已知，例如肽腈抑制劑(參閱例如Methotetal.,2007，此文獻併入本文以資參考；參閱尤其是第20839頁圖1有關不同組織蛋白酶C抑制劑之結構，例如Gly-Phe-DMK、Gly4-(I)Phe-DMK及該圖之化合物1*與化合物2*)。
關於藥劑之製造，本發明組織蛋白酶C之調節劑視投與種類而定，可與適當添加劑或輔助物質例如生理緩衝液(如氯化鈉溶液)、脫礦質水、安定劑(例如蛋白酶或核酸酶抑制劑，較佳為抑肽酶、ε-胺基己酸或胃蛋白酶抑制素A)或分離劑例如EDTA、凝膠調配劑例如白凡士林、低黏性石蠟及/或黃蠟等一起調配。
適當之進一步添加劑為，例如，去垢劑舉例而言如Triton X-100或去氧膽酸鈉、以及多元醇舉例而言如聚乙二醇或甘油、糖類舉例而言如蔗糖或葡萄糖、兩性離子化合物舉例而言如胺基酸例如甘胺酸或特別是牛磺酸或甜菜鹼及/或蛋白質舉例而言如牛或人類血清白蛋白；以去垢劑、多元醇及/或兩性離子化合物較佳。
生理緩衝液較佳為具有約6.0-8.0之pH，尤其是約6.8-7.8之pH，特別是約7.4之pH，及/或約200-400毫滲量/公升，較佳為約290-310毫滲量/公升之滲透壓。藥劑之pH通常使用適當有機或無機緩衝劑調整，舉例而言，如，較佳為使用磷酸鹽緩衝劑、tris緩衝劑(參(羥甲基)胺甲烷)、HEPES緩衝劑([4-(2-羥乙基)哌基]乙磺酸)或MOPS緩衝劑(3-嗎啉基-1-丙磺酸)。各個緩衝劑之選擇通常取決於所需之緩衝劑莫耳濃度，例如，磷酸鹽緩衝劑適當用於注射及輸注溶液。
藥劑可以習知方式投與，例如使用口服劑量型舉例而言如錠劑或膠囊、經由黏膜例如鼻腔或口腔、呈埋置於皮膚下之貯劑(dispositories)型、使用含根據本發明藥劑之注射液、輸注液或凝膠；進一步亦可進行藥劑之局部投與以治療如上述之特定關節疾病(適當時，呈脂質體複合物之形式)；再者，可利用得以經時控制釋放藥劑之經皮治療系(TTS)；TTS可自例如EP 0 944 398 A1、EP 0 916 336 A1、EP 0 889 723 A1或EP 0 852 493 A1得知。
注射液通常於只需投與(身體)相當少量溶液或懸浮液(例如約1至約20毫升)時使用。輸注液通常於欲投與大量溶液或懸浮液(例如1公升或1公升以上)時使用。由於相較於輸注液，於注射液情形下僅投與數毫升，因此注射中血液或組織液pH及滲透壓之微小差異就疼痛感而言並不顯著，或僅為無足輕重之程度；因此，使用之前通常不需要稀釋根據本發明之調配劑。然而，於投與相當大量之情形下，則必須於投與之前稀釋根據本發明之調配劑到至少獲得大約等張溶液之程度。等張溶液之實例為0.9%強度之氯化鈉溶液。於輸注之情形下，稀釋可例如使用無菌水進行而投與可例如經由所謂分流術(bypass)進行。
根據本發明不同態樣之一較佳具體實例，可使用組織蛋白酶C，其衍生物或片段作為單離分子。
於本發明說明書中，尤其是有關組織蛋白酶C之「單離分子」一詞係指自天然來源純化之組織蛋白酶C多核苷酸或多肽以及純化之重組分子(其中純化一詞包含部分純化以及完全純化)。
重組多肽或多核苷酸分子之製備與得自細胞或組織之天然存在分子之純化，以及細胞-或組織萃取物之製備為熟習此項技藝人士悉知(亦參閱例如下文列舉之標準文獻)。
彼等包括例如根據所公告基因體或編碼多核苷酸序列，經由聚合酶連鎖反應(PCR)擴增所需長度之多核苷酸；接著於宿主細胞中選殖所製造之多核苷酸(參閱例如下文列舉之標準文獻)。
於本發明說明書中，「多肽」一詞係指由利用肽鍵結互相結合之胺基酸組成之含有至少50個胺基酸呈線型模式互相連接形成多肽鏈之分子；此類型之較短分子稱為肽類。「蛋白質」一詞係指含有至少一個多肽鏈之分子惟亦指含有相聯或互相結合之一個以上多肽鏈之分子。因此，「蛋白質」包含「多肽」。
茲於下文利用實例更詳細說明本發明，惟彼等實例不擬構成侷限。
 實例： 材料與方法： 所用小鼠品系：
使用五種不同之近親交配小鼠品系：AKR/J(AKR)、CBA/J(CBA)、C3H/HeJ(C3H)、C57BL/6J(B6)與C58/J(C58)。小鼠係得自The Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)。彼等小鼠品系被證實於有關數種活體內疼痛之測量上明顯不同(Mogil et al 1999)。
總RNA單離：
根據廠商操作指南，使用PicopureTM RNA Isolation Kit(Arcturus)，從DRG(背根神經節)單離總RNA。使用2100 Bioanalyze及RNA 6000 Nano LabChipTM 套組(Agilent)評估RNA品質。
Affymetrix GeneChip TM 微陣列：
根據廠商之操作指南，使用500奈克根據Baugh,L.R,Hill,A.A.,Brown,E.L.and Hunter,C.P.(2001)Nucleic Acids Res .29 ,e29之具100pM T7-(dT)24寡聚物(GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-dT24 SEQ ID NO：4)之總RNA與SuperScript II反轉錄酶進行第一股cDNA合成。合成雙股cDNA，然後使用苯酚-氯仿萃取，隨後進行乙醇沉澱步驟。根據廠商之操作指南，以該雙股cDNA試樣，使用BioArray High Yield RNA Transcription Labeling套組(Enzo)進行試管內轉錄反應。於37℃培育該轉錄反應16小時。使用純化RNA用之RNeasyTM Mini套組(Qiagen)實驗流程純化cRNA並以分光光度計定量。使用RNA段裂化緩衝液(200mM Tris-乙酸鹽，500mM KOAc，150mM MgOAc，pH 8.1)段裂化生物素-標記cRNA。根據廠商之操作指南，進行小鼠基因體430 2.0 GeneChipsTM (Affymetrix)之雜交及染色。使用GeneChipTM 3000 Scanner掃瞄微陣列，輸入掃瞄數據，使用Resolver v5.1表現數據分析軟體(Rosetta Biosoftware)進行分析。
L5脊髓神經橫斷及模擬手術程序：
暴露麻醉小鼠之左L5脊髓神經，然後移除部分橫突(transverse process)。與L4脊髓神經分離後，將L5脊髓神經橫斷。模擬手術與L5脊髓神經橫斷手術相同，然而，L5脊髓神經未橫斷(參閱DeLeo et al.2000)。
爪退縮疼痛閥值之測定：
使用蹠觸覺測定儀(參閱Szabo et al.2005)評估爪退縮疼痛閥值(PWTs)。於金屬網眼地板隔間適應環境後，將刺激物(stimulator)置於動物後爪下方，以由電動式促動器驅動之平直金屬絲接觸蹠表面，施加逐漸增強之力度至動物移開其爪為止(爪退縮疼痛閥值，PWT)。針對同側、手術側及對側之後爪評估PWT。每隻動物一種情況只用一次。所有動物實驗均遵守有意識動物研究之道德指導方針，諸程序均為當地道德委員會認可。
相關性分析：
進行相關性分析時，界定各神經-橫斷動物(鍾氏動物，Chung animal)之「疼痛表現型」為C1-S1 ，其中C1 =ln(同側PWT/對側PWT) 及S1 =平均 相同品系所有模擬動物 ln(同側PWT/對側PWT) 。
界定各鍾氏動物及根據其強度表現數據之各測量基因差別轉錄調控之二測量。使用於解析器表現數據分析軟體(v5.1)計算之強度測量作為各個基因及動物之「原始強度測量」。以ln(C2/S2) 計算特定基因及鍾氏動物之「比率對數值測量」，其中C2 =鍾氏動物表現強度及S2 =平均 相同品系所有模擬動物 模擬表現強度 。
計算相關性之前，過濾基因組以排除表現在雜訊標準(noise level)以下且無顯著(Chung vs.sham，鍾氏動物vs.模擬動物)調控之基因。合格之基因必須於至少60%絕對差異倍數(fold-change)=>1.5之鍾氏動物中或於至少20%絕對差異倍數=>2.0之鍾氏動物中被調控。而且，由各別強度p-值<0.001之相對基因表現必須於至少五隻動物中可檢測(「呈現」)。
使用R套裝軟體(http：//www.r-project.org/ )計算各基因於疼痛表現型記分與所界定轉錄調控測量之一者間之Pearson相關性係數。據此，依照Storey et al.(2002)之方法產生統計顯著性之p-值與對應之錯誤發現率(FDRs)。於「比率對數值測量」或「強度測量」下FDR<0.05之基因被視為顯著相關。
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標準實驗室方法文獻
除非未另行指示，否則標準實驗室方法係或可根據下述標準文獻進行：Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.545 pp；Current Protocols in Molecular Biology；regularly updated,e.g.Volume 2000；Wiley & Sons, Inc；Editors：Fred M.Ausubel,Roger Brent,Robert Eg.Kingston,David D.Moore,J.G.Seidman,John A.Smith,Kevin Struhl.Current Protocols in Human Genetics；regularly uptdated；Wiley & Sons,Inc；Editors：Nicholas C.Dracopoli,Honathan L.Haines,Bruce R.Korf,Cynthia C.Morton,Christine E.Seidman,J.G.Seigman,Douglas R.Smith.Current Protocols in Protein Science；regularly updated；Wiley & Sons,Inc；Editors：John E.Coligan,Ben M.Dunn,Hidde L.Ploegh,David W.Speicher,Paul T.Wingfield.Molecular Biology of the Cell；third edition；Alberts,B.,Bray,D.,Lewis,J.,Raff,M.,Roberts,K.,Watson,J.D.；Garland Publishing,Inc.New Yorlk & London,1994；Short Protocols in Molecular Biology,5th edition,by Frederick M.Ansubel(Editor),Roger Brent(Editor),Robert E.Kingston(Editor),David D.Moore(Editor),J.G.Seidman(Editor),John A.Smith(Editor),Kevin Struhl(Editor),October 2002,John Wiley & Sons,Inc.,New York“Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook.C.A.Pinkert,editor；Academic Press Inc.,San Diego,California,1994 (ISBN：0125571658)Gene targeting：A Practical Approach,2nd Ed.,Joyner AL,ed.2000.IRL Press at Oxford University Press,New York；Manipulating the Mouse Embryo：A Laboratory Manual.Nagy,A,Gertsenstein,M.,Vintersten,K.,Behringer,R.,2003,Cold Spring Harbor Press,New York；Remington' s Pharmaceutical Sciences,17th Edition,1985(for physiologically tolerable salts(anorganic or organic),see esp.p.1418)
實驗室方法標準文獻：
除非未另行指示，否則實驗室方法係或可根據下述標準文獻中列舉之標準方法進行：Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second edition.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY.545 pp or Current Protocols in Molecular Biology；Current Protocols in Molecular Biology；regularly updated,e.g.Volume 2000；John Wiley & Sons,Inc；Editors：Fred M.Ausubel,Roger Brent,Robert Eg.Kingston,David D.Moore,J.G.Seidman,John A.Smith,Kevin Struhl.Current Protocols in Human Genetics；regularly uptdated,e.g.Volume 2003；John Wiley & Sons,Inc；Editors：Nicholas C.Dracopoli,Honathan L.Haines,Bruce R.Korf,Cynthia C.Morton,Christine E.Seidman,J.G.Seigman,Douglas R.Smith.Current Protocols in Protein Science；regularly updated,e.g.Volume 2003；John Wiley & Sons,lnc；Editors：John E.Coligan,Ben M.Dunn,Hidde L.Ploegh,David W.Speicher,Paul T.Wingfield.Molecular Biology of the Cell；third edition；Alberts,B.,Bray,D.,Lewis,J.,Raff,M.,Roberts,K.,Watson,J.D.；Garland Publishing,lnc.New York & London,1994；Gene Targeting：a practical approach(1995),Editor：A.L.Joyner,IRL Press Remington' s Pharmaceutical Sciences,Edition 17,1985。
 圖1：組織蛋白酶C-相關性作圖
圖1顯示每一各別小鼠之神經性疼痛表現型(機械式痛覺過敏，X-軸)與L5 DRG中組織蛋白酶C之對應基因調控(比率對數值(鐘氏動物vs.模擬對照組)，Y-軸)。小鼠數據根據所用品系進行顏色編碼。進行Pearson相關性分析後顯示疼痛表現型及組織蛋白酶C基因調控二參數間之顯著正相關性；此意謂就各別小鼠而言，於鍾氏手術神經性小鼠中組織蛋白酶C之L5 DRG表現愈高，則於行為測試中展現更顯著之機械式痛覺過敏。此顯著相關性指出組織蛋白酶C基因表現於誘發神經性疼痛表現型上之因果關係。
圖2：組織蛋白酶C-強度數據
品系AKR、CBA與C57之各別小鼠於鍾氏手術或模擬手術後L5神經節中組織蛋白酶C表現之絕對值。
圖3：利用Affymetrix探針組1416382_at(小鼠基因體430 2.0微陣列)所檢測之小鼠組織蛋白酶C mRNA片段(SEQ ID NO.7)
圖4：根據NM_001814之組織蛋白酶C cDNA序列(SEQ ID NO.1)
圖5：根據Swiss-Prot人類_CATC P53634之組織蛋白酶C蛋白質序列(SEQ ID NO.2)
圖6：用於檢測根據SEQ ID NO.1之人類組織蛋白酶C cDNA之引子組(SEQ ID NOs 4與5)
圖7：用於檢測小鼠組織蛋白酶C cDNA之探針(SEQ ID NO.6)
<110> sanofi-aventis <120> 組織蛋白酶c之用途 <130> DE2008/026 <150> 08290285.9 <151> 2008-03-26 <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1924 <212> DNA <213> 智人 <400> 1 <210> 2 <211> 463 <212> PRT <213> 智人 <400> 2 <210> 3(Desciption ID No.4) <211> 30 <212> DNA <213> 智人(前置) <400> 3<210> 4(Desciption ID No.5) <211> 30<212> DNA <213> 智人(反置) <400> 4<210> 5(desciption ID No.6) <211> 40 <212> DNA <213> 小家鼠 <400> 5<210> 6(Desoiption ID No.7) <211> 360 <212> DNA <213> 小家鼠 <220> <221> 各項特徵 <222> (157)..(157) <223> n為a,c,g,或t <400> 6

Claims (21)

  1. 一種使用組織蛋白酶C或其功能性片段鑑定調節疼痛之化合物之用途。
  2. 一種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之非人類基因選殖動物鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。
  3. 一種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之非人類基因選殖動物作為增強疼痛敏感性模式系統之用途。
  4. 一種使用非人類組織蛋白酶C基因剔除動物鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。
  5. 一種使用非人類組織蛋白酶C基因剔除動物作為降低疼痛敏感性模式系統之用途。
  6. 一種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞鑑定調節疼痛之化合物之用途。
  7. 一種使用異源表現組織蛋白酶C或其功能性片段之細胞作為增強疼痛敏感性模式系統之用途。
  8. 一種使用組織蛋白酶C基因剔除細胞鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。
  9. 一種使用組織蛋白酶C基因剔除細胞作為降低疼痛敏感性模式系統之用途。
  10. 一種使用異源表現可表現地連接於組織蛋白酶C啟動子及/或促進子或其功能性片段的報導基因之細胞鑑定或分析調節疼痛之化合物之用途。
  11. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，該方法包括下述步驟： a.提供至少兩個試樣；b.使含有組織蛋白酶C或其功能性片段之一試樣與化合物接觸；c.於化合物存在下，測定組織蛋白酶C之活性；d.於化合物不存在下，測定組織蛋白酶C之活性；及e.比較根據c)與根據d)之組織蛋白酶C活性。
  12. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.使組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段與測試化合物接觸；及b.測定該測試化合物是否調節組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段之活性。
  13. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.使具有可檢測數量或活性之組織蛋白酶C或其功能性片段的細胞與測試化合物接觸；及b.測定該測試化合物是否能調節存在該細胞中之組織蛋白酶C或其功能性片段之量或活性。
  14. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.於具轉錄活性之系統中使編碼組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段之核酸與測試化合物接觸；及b.測定於該測試化合物存在下，存在該系統中之編碼組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段之mRNA之量；及c.測定該化合物是否能於該系統中調節編碼組織蛋白酶C蛋白質或其功能性片段之mRNA之量。
  15. 一種鑑定或分析調節及/或預防疼痛之化合物之方法，包括：a.提供被包含操作性地偶聯於報導基因或其功能性片段之組織蛋白酶C或其功能性片段啟動子之核酸載體轉染之細胞；b.提供被包含未操作性地偶聯於功能性組織蛋白酶C啟動子之報導基因或其功能性片段之對照載體轉染之細胞；c.於測試化合物存在下，測定根據a)與b)之細胞之報導基因活性；d.於測試化合物不存在下，測定根據a)與b)之細胞之報導基因活性。
  16. 一種鑑定或分析調節及/或預防病患疼痛之化合物之方法，包括：a.於一或多種測試化合物存在下測定組織蛋白酶C或其功能性片段之生物活性以鑑定調節組織蛋白酶C生物活性之一或多種調節化合物；及b.測試該一或多種調節化合物減少病患疼痛、疼痛感或疼痛敏感性之能力。
  17. 一種分析個體疼痛閥值之方法，該方法包括分析該個體採樣中組織蛋白酶C之量相較於一或多個參考試樣，是否存在該試樣中之組織蛋白酶CmRNA及/或蛋白質之量與一或多個參考試樣不同，其中存在較高量表示該個體疼痛敏感性增加，存在較低量表示疼痛敏感性降低。
  18. 一種調整用於預防及/或治療個體疼痛之醫藥劑劑量之方法，該方法包括檢測個體採樣有關是否存在該試樣中之組織蛋白酶C mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參考試樣不同，該劑量視存在個體採樣中蛋白質及/或mRNA之量是否與一或多個參考試樣不同而調整；其中個體採樣中較高量之組織蛋白酶C表示需要較高劑量，且個體採樣中較低量之組織蛋白酶C表示需要較低劑量。
  19. 一種使用檢測組織蛋白酶C之工具用於診斷增強個體疼痛敏感性之用途，其藉由分析取自欲檢測個體之生物試樣，其中該工具為a.一種用於檢測組織蛋白酶C DNA之工具，其選自由引子或引子組、適當探針及序列特異性抗-DNA抗體所組成之群組，b.一種用於檢測存在生物試樣中之組織蛋白酶C mRNA之工具，其選自由能擴增組織蛋白酶CcDNA之特異性組織蛋白酶C核酸探針及引子組所組成之群組，或c.一種用於檢測存在生物試樣中之組織蛋白酶C蛋白質之抗體。
  20. 一種用於診斷個體疼痛敏感性之測試套組的用途，該測試套組包含用於檢測生物試樣中之組織蛋白酶C之至少一種工具，其中該工具為a.一種用於檢測組織蛋白酶C DNA之工具，其選自由引子或引子組、適當探針及序列特異性抗-DNA抗體所組成之群組， b.一種用於檢測存在生物試樣中之組織蛋白酶C mRNA之工具，其選自由能擴增組織蛋白酶C cDNA之特異性組織蛋白酶C核酸探針及引子組所組成之群組，或c.一種用於檢測存在生物試樣中之組織蛋白酶C蛋白質之抗體。
  21. 一種能降低組織蛋白酶C活性及/或表現以治療疼痛之化合物，其中該化合物為組織蛋白酶C之二肽α-胺基乙腈抑制劑。
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