TWI508954B - 雜環融合蒽醌衍生物、其製備方法與醫藥組合物 - Google Patents

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Description

雜環融合蒽醌衍生物、其製備方法與醫藥組合物
本發明係有關於一種雜環融合蒽醌衍生物，尤其是一種用以抑制非核苷類端粒酶進而可治療癌症之雜環融合蒽醌衍生物及其製備方法與包含其之醫藥組合物。
癌症，主要是由於細胞的異常病變或是部分細胞有不正常的增生，當其集結形成腫塊，則稱之為腫瘤。腫瘤可簡單分為兩大種類：良性腫瘤與惡性腫瘤，一般來說良性腫瘤其生長較為緩慢，且不影響鄰近的正常組織，大體而言是無致命的風險，除非其生長在人體要害部位，但大多數可以藉由手術切除，不易復發。惡性腫瘤則是俗稱的癌症，而增生的癌細胞，除了集結成腫塊，有些還會局部侵入周圍的組織，甚至經由體內循環系統或淋巴系統轉移到其他地方。因此癌症若是未經妥善的治療，通常易導致死亡。而近年來癌症發生率持續的上升，相對的治療方面就更趨重要。
一般而言，治療癌症的方式可分成三種：手術切除(surgery)、放射療法(radiation therapy)、化學療法(chemotherapy)，不同的方式取決於腫瘤的位置、發展程度與病人身體狀態。而近年來也發展出許多新興的實驗療法，例如：基因療法(gene therapy)、分子標靶療法(molecular targeted therapies)、抗血管新生抑制劑(angiogenic therapy)等。
另外，在大多數的生物體中，複製與維持染色體尾端的端粒長度，必須依賴端粒酶(telomerase)。許多研究指出，人類端粒酶活性僅存在一些具高度增生能力的細胞中，例如：生殖細胞(germ cell)、造血細胞、部分幹細胞(stem cell)、大部分的不死細胞(immortalized cell)及絕大部分的腫瘤細胞。反之，在一般體細胞中是不含有端粒酶活性的，因此端粒會隨細胞分裂次數的增加而逐漸減短，當端粒短至一定程度時，細胞便會停止分裂而進入老化階段，最終走向死亡，此時期稱之為M1期(mortality stage 1)。
若於M1期，細胞內之抑制腫瘤基因(tumor suppressor gene)發生 突變，如p53和Rb，會促使細胞逃離老化階段而繼續進行細胞分裂，此時期稱之為M2期(mortality stage 2)。此時期因不具端粒酶活性的存在，因此端粒長度仍會縮短，而此時端粒無法保護染色體末端的完整性，進而導致染色體不穩定現象產生，細胞無法完整的將遺傳訊息傳遞而逐漸死亡，因此M2期又稱之為危機期(crisis)；大部分的細胞會於M2期死亡，僅有少數細胞會因端粒酶活性的表達而存活，此細胞可不受限制的持續性分裂，成為不死細胞(或癌細胞)。
因此，由於端粒酶在大部分正常細胞中不帶有活性甚至沒有存在，反之幾乎在所有人類的腫瘤細胞中都帶有活性，導致端粒酶在標靶治療的相關研究中，成了許多新興標靶治療藥物的目標。
在一些生長快速或過度增生的細胞中，由於需不斷的進行DNA的轉錄與轉譯，所以其超螺旋結構也相對的必需經常解開與纏繞，也因此負責這一方面的酵素一拓樸酶，就被視為一種標靶治療的目標；主要是利用當DNA纏繞解開形成的斷裂部分，若使其無法再接合起來，則可以藉此來達到抑制快速分裂的細胞，例如癌細胞。而對於拓樸酶的抑制機轉，基本上有三種形式，第一種：藥物先與DNA片段接合，接著拓樸酶II接合在藥物與DNA形成的複合體；第二種：拓樸酶II先與DNA片段接合，然後藥物再與拓樸酶II和DNA的複合體結合；最後一種：藥物先會接合在拓樸酶II上，緊接著所形成的複合體會與DNA片段接合。綜合三種路徑，最後皆會形成拓樸酶與藥物和DNA片段的四級複合體構形(ternary complex)；而關於這作用的主要機制，是由一開始雙股DNA經拓樸酶的作用被切斷，接著拓樸酶與藥物的複合體停留在DNA上，由於被切開的DNA尚未接回，所以當複製進行至此，便會因斷裂而使的酵素無法進行作用，最後被細胞判別為DNA斷裂進而導致細胞死亡。
承上，由於蒽環類藥物的細胞毒性機制擁有多效性，且其抑制細胞生長之意義似乎極為具體，諸多如柔紅黴素、阿黴素等蒽環類藥物已廣泛作為抗腫瘤藥物，然而因其強烈之心臟毒性與耐受性囿限著其臨床用途。
進一步來說，阿黴素和柔紅黴素等第一代蒽環類藥物，但其運用 於臨床上有如雙刃劍般，偏偏某些腫瘤病症必須以此類藥物作為首選，在長期投與此類藥物後，反倒誘發心肌症與心臟衰竭。後來，表阿黴素、艾達黴素等第二代蒽環類藥物，雖然已經改善了治療指數，但是療程中誘發心肌症之危機並未消除。
有鑑於此，本發明致力於合成非核苷類端粒酶抑制劑，企圖經由結構修改方式，研發更具抗癌療效潛力之酶抑制劑。蒽醌衍生物係具潛力之拓撲異構酶抑制劑與端粒酶抑制劑，經由不同酶類抑制劑之探討，發現蒽醌環與雜環融合結構或形成雜環化之衍生物呈現顯著之抗癌活性潛力，可能於腫瘤化療扮演著不同活性機制。腫瘤細胞於多重藥物耐受性導致P-醣蛋白之過度表現，係與抗癌藥物之結構有關。雜環衍生物可顯著地增加阿黴素之累積，且可經由多重藥物耐受性細胞而抑制P-醣蛋白之表現。此等多重藥物耐受性細胞之可逆性機制，係抑制P-醣蛋白功能且增加抗癌藥物之累積。因此，與多重藥物耐受性相關細胞毒素及多重藥物耐受性之調變器結合之療程，可作為臨床上處理多重藥物耐受性之策略。
詳細地來說，本發明提供一種噻二唑融合蒽醌衍生物，其係由式I所示：
式I中，R1代表氫原子、鹵系元素、烷基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基、金屬鹽或由式II所示之取代基：
式II中，R2代表胺基、氧基或硫基，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、硝基、甲硫基或巰基取代。
在本發明之一實施例中，其中當R1為烷基胺基、烷基硫基或鹵烷基時，其烷基可選擇自由C1-10直鏈烷基、C3-10支鏈烷基、C3-10環狀烷基所組成之群組，而鹵基可選擇自由氟、氯、溴與碘所組成之群組。
在本發明之一實施例中，其中R1為氯基、磺酸鈉、氧化鉀、二乙基胺基、丙基胺基、四氫吡咯-1-基、二甲基胺基乙基胺基、乙基哌嗪基、哌嗪基、六氫吡啶-1-基、丁基胺基、乙基胺基、硫代嗎啉基、乙基硫基、正丙基硫基或異丙基硫基。
在本發明之一實施例中，其中R2為胺基，且R1可為3-氯基苯基胺基、2-甲基苯基胺基、3-甲基苯基胺基、4-甲基苯基胺基、4-氯基苯基胺基或4-氯基-2-氟基苯胺基。
在本發明之一實施例中，其中R2為氧基，且R1可為對甲基苯基氧基。
在本發明之一實施例中，其中R2為硫基，且R1可為苯硫基、2,5-二甲基苯基硫基、苄基硫基、4-氯基苯基硫基、2-甲氧基苯基硫基、4-溴基苯基硫基、2,4-二甲基苯基硫基、4-異丙基苯基硫基、2-溴基苯基硫基、4-氟基苯基硫基、苯基乙基硫基、2,3-二氯基苯基硫基、4-第三丁基苯基硫基、2-氯基苯基硫基、2-氟基苯基硫基、2,4,5-三氯基苯基硫基、2,5-二氯基苯基硫基、2-巰基苯基硫基、3-氯苯基硫基、3-氟苯基硫基、2,4-二氟苯基硫基、3-溴苯基硫基、4-甲氧基苯基硫基、3,4-二甲基苯基硫基、4-甲硫基苯基硫基、4-甲基苯基硫基、4-硝基苯基硫基、3-甲氧基苯基硫基、間-甲基苯基硫基、鄰-甲基苯基硫基、3,5-二甲基苯基硫基、3-乙氧基苯基硫基、2-乙基苯基硫基、2-異丙基苯基硫基、4-(2-氯基苄基硫基)、4-乙基苯基硫基、2,6-二甲基苯基硫基、4-氯基苄基硫基、4-第三丁基苄基硫基或吡啶-2-基硫基。
本發明之另一目的在於提供一種製備雜環融合蒽醌衍生物的方法，其步驟如下。首先，使1,2-二胺基蒽醌與亞硫醯氯反應，再經三乙胺催化以形成一第一產物。接著，使第一產物與一包含有鹵系元素之化合物反應以得到一第二產物。隨後，將第二產物溶於無水四氫呋喃 之N,N-二異丙基乙胺混合溶液或乙二醇之其中一者以形成一混合溶液，再加入包含有烷基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基、金屬鹽或由下式所示取代基之化合物之其中一者至混合溶液中：
式中，R2代表胺基、氧基或硫基，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、硝基、甲硫基或巰基取代。最後，攪拌混合溶液並過濾沈澱。
在本發明之一實施例中，其中上述第一產物為蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮，且上述包含有鹵系元素之化合物為氯酸鉀，此時上述第二產物為4-氯基蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮。
本發明之再一目的在於提供一種用以治療癌症之醫藥組合物，包含由式I所示之噻二唑融合蒽醌衍生物或其藥學上可接受之鹽與賦形劑：
式I中，R1代表氫原子、鹵系元素、烷基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基、金屬鹽或由式II所示之取代基：
式II中，R2代表胺基、氧基或硫基，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、硝基、甲硫基或巰基取代。
在本發明之一實施例中，其中R1為氯基、磺酸鈉、氧化鉀、二乙基胺基、丙基胺基、四氫吡咯-1-基、二甲基胺基乙基胺基、乙基哌嗪基、哌嗪基、六氫吡啶-1-基、丁基胺基、乙基胺基、硫代嗎啉基、乙基硫基、正丙基硫基或異丙基硫基。
在本發明之一實施例中，其中R2為胺基，且R1可為3-氯基苯基胺基、2-甲基苯基胺基、3-甲基苯基胺基、4-甲基苯基胺基、4-氯基苯基胺基或4-氯基-2-氟基苯胺基。
在本發明之一實施例中，其中R2為氧基，且R1可為對甲基苯基氧基。
在本發明之一實施例中，其中R2為硫基，且R1可為苯硫基、2,5-二甲基苯基硫基、苄基硫基、4-氯基苯基硫基、2-甲氧基苯基硫基、4-溴基苯基硫基、2,4-二甲基苯基硫基、4-異丙基苯基硫基、2-溴基苯基硫基、4-氟基苯基硫基、苯基乙基硫基、2,3-二氯基苯基硫基、4-第三丁基苯基硫基、2-氯基苯基硫基、2-氟基苯基硫基、2,4,5-三氯基苯基硫基、2,5-二氯基苯基硫基、2-巰基苯基硫基、3-氯苯基硫基、3-氟苯基硫基、2,4-二氟苯基硫基、3-溴苯基硫基、4-甲氧基苯基硫基、3,4-二甲基苯基硫基、4-甲硫基苯基硫基、4-甲基苯基硫基、4-硝基苯基硫基、3-甲氧基苯基硫基、間-甲基苯基硫基、鄰-甲基苯基硫基、3,5-二甲基苯基硫基、3-乙氧基苯基硫基、2-乙基苯基硫基、2-異丙基苯基硫基、4-(2-氯基苄基硫基)、4-乙基苯基硫基、2,6-二甲基苯基硫基、4-氯基苄基硫基、4-第三丁基苄基硫基或吡啶-2-基硫基。
在本發明之一實施例中，其中該可接受之鹽係為與無機或有機酸或鹼之生理上可接受之鹽，無機酸可選擇自由鹽酸、溴酸、硫酸、磺酸與磷酸所組成之群組，有機酸則可選擇自由檸檬酸、醋酸、馬來酸，富馬酸、葡萄糖酸、甘醇酸、甲基磺酸、丁二酸與半乳糖所組成之群組。
在本發明之一實施例中，其中載劑為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。較佳地，上述賦形劑包含微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、玉 米澱粉、修飾澱粉、羧甲澱粉鈉、樹脂、糊化澱粉、糖類、聚乙二醇、聚乙烯醇、羥丙纖維素、甲基纖維素、氫氧甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素。
在本發明之一實施例中，本發明所提供者係一用以抑制非核苷類端粒酶之醫藥組合物。
在本發明之一實施例中，其中本發明所提供之醫藥組合物係為一粉末、一顆粒、一液體、一膠體或一膏體。
在本發明之一實施例中，其中本發明所提供之醫藥組合物係透過口服、經皮吸收、注射或吸入之方式進行傳輸。
由下文的說明，可更進一步瞭解本發明的特徵及其優點，閱讀時請參考第一圖及相關表格。
本發明提供一種噻二唑融合蒽醌衍生物，其係由式I所示：
式I中，R1代表氫原子、鹵系元素、烷基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基或金屬鹽。
進一步來說，當R1為烷基胺基、烷基硫基或鹵烷基時，其烷基可選擇自由C1-10直鏈烷基、C3-10支鏈烷基、C3-10環狀烷基所組成之群組，而鹵基可選擇自由氟、氯、溴與碘所組成之群組。
也就是說，R1可為甲烷基、乙烷基、正丙烷基、異丙烷基、正丁烷基、異丁烷基、仲丁烷基、叔丁烷基、正戊烷基、異戊烷基、叔戊烷基、新戊烷基、正己烷基、異己烷基、叔己烷基、新己烷基、正庚烷基、異庚烷基、叔庚烷基、正辛烷基、異辛烷基、叔辛烷基、甲基胺基、乙基胺基、丙基胺基、甲基硫基、乙基硫基、丙基硫基、氟基甲基、氟基乙基、氟基丙基、氯基甲基、氯基乙基、氯基丙基、溴 基甲基、溴基乙基、溴基丙基、碘基甲基、碘基乙基或碘基丙基。
較佳地，R1為氫原子、氯基、磺酸鈉、氧化鉀、二乙基胺基、丙基胺基、四氫吡咯-1-基、二甲基胺基乙基胺基、乙基哌嗪基、哌嗪基、六氫吡啶-1-基、丁基胺基、乙基胺基、硫代嗎啉基、乙基硫基、正丙基硫基或異丙基硫基，但本發明並不欲以此為限。
進一步來說，R1亦可為式II所示之取代基：
式II中，R2代表胺基、氧基或硫基，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、硝基、甲硫基或巰基取代。此時的雜環融合蒽醌衍生物由於其R2與苯環間存在一條碳鏈，此種支鏈較長的特性，可能會使此化合物較容易深入所作用之酵素的活化位，增加其作用之效果。且，又由於其尾端接了一個苯環，可進一步幫助於此化合物固定於酵素的活化位，延長其作用之時間。
進一步來說，烷氧基可為甲烷氧基、乙烷氧基、正丙烷氧基或異丙烷氧基，但本發明人並不欲以此為限。另外，在較佳實施例中，當R2為胺基時，R1可為3-氯基苯基胺基、2-甲基苯基胺基、3-甲基苯基胺基、4-甲基苯基胺基、4-氯基苯基胺基或4-氯基-2-氟基苯胺基。
在較佳實施例中，當R2為氧基時，R1可為對甲基苯基氧基。
在較佳實施例中，當R2為硫基時，R1則可為苯硫基、2,5-二甲基苯基硫基、苄基硫基、4-氯基苯基硫基、2-甲氧基苯基硫基、4-溴基苯基硫基、2,4-二甲基苯基硫基、4-異丙基苯基硫基、2-溴基苯基硫基、4-氟基苯基硫基、苯基乙基硫基、2,3-二氯基苯基硫基、4-第三丁基苯基硫基、2-氯基苯基硫基、2-氟基苯基硫基、2,4,5-三氯基苯基硫基、2,5-二氯基苯基硫基、2-巰基苯基硫基、3-氯苯基硫基、3-氟苯基硫基、2,4-二氟苯基硫基、3-溴苯基硫基、4-甲氧基苯基硫基、3,4-二甲基苯基硫基、4-甲硫基苯基硫基、4-甲基苯基硫基、4-硝基苯基硫基、3-甲氧基苯基硫基、間-甲基苯基硫基、鄰-甲基苯基硫基、3,5-二甲基苯基硫 基、3-乙氧基苯基硫基、2-乙基苯基硫基、2-異丙基苯基硫基、4-(2-氯基苄基硫基)、4-乙基苯基硫基、2,6-二甲基苯基硫基、4-氯基苄基硫基、4-第三丁基苄基硫基或吡啶-2-基硫基。
據此，本發明所提供之一系列的噻二唑融合蒽醌衍生物整理如表一，表一中所列為在發明較佳實施例之六十五種化合物C1~C65中的R1，然而本發明並不欲以此為限，未脫離上述揭露實質精神之等效實施或變更，均應包含於本發明範圍內。
另外，請參考第一圖，第一圖為化合物C1~C65的製備流程圖。如圖所示，本發明進一步提供上述雜環融合蒽醌衍生物的製備方法如下說明，但本發明並不欲以之為限，合先敘明。首先，取1.19g(5mmole)化合物1,2-二胺基蒽醌(1,2-diaminoanthraquinone)溶於30mL四氫呋喃(Tetrahydrofuran,THF)，滴加0.15g(20mmol)亞硫醯氯(thionyl chloride)後，再添加3mL三乙胺(triethylamine)催化，室溫下攪拌反應24小時。將完成反應之混合液倒入冰水(200mL)，過濾收集沉澱物，將沉澱物以熱酒精再進行結晶，獲得黃色化合物C1，產率74%。
接著，取0.05g(2mmole)化合物C1加入5mL濃鹽酸以20mL冰醋酸以90℃加熱迴流45分鐘後，加入1.50g(12mmole)氯酸鉀(potassium chlorate,KClO3)至滾沸的混合液，令混合液加熱迴流反應4小時。將完全反應的混合液置入冰水浴，並加入少量氫氧化鉀(KOH)中和酸度，產生沉澱粗產物，過濾收集沉澱物經醋酸再結晶，獲得橙黃色化合物C2，產率72%。隨後，將化合物C2視反應所需而溶於無水四氫呋喃之N,N-二異丙基乙胺混合溶液或乙二醇之其中一者以形成一混合溶液，再加入包含有烷基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基或金屬鹽等取代基的化合物之其中一者至混合溶液中。最後，視反應及參與反應的化合物所需，進一步進行加熱回流、冰浴、濃縮、沖洗、過濾沈澱等步驟以得到化合物C3~C18。
更甚者，當所加入的化合物具有下式取代基時，例如：對-氯苯胺、對-甲基苯酚、苯硫醇類型的化合物，則最終得到化合物C19~C65：
式中，R2代表胺基、氧基或硫基，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、硝基、甲硫基或巰基取代。
本發明將進一步提供化合物C3,4,5,10,15~21,58~61的製備方法如下說明，但本發明並不欲以任一劑量、比例或反應時間為限，於相同範疇內簡單改變反應參數以達到相同目的者亦屬於本發明之範疇，合先敘明。
實施例1
蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮4-磺酸鈉(化合物C3)
首先，取4.58g(40mmole)亞硫酸氫鈉(sodium bisultite,NaHSO3)溶於水形成4.5N之均勻溶液。接著，取2.66g(10mmole)化合物C1，添加30ml水、0.5ml吡啶(pyridine)與9ml亞硫酸氫鈉溶液，煮沸3小時。再加入4g(68.96mmole)氯化鈉(sodium chloride)，置冷，將灰黃色鈉鹽沉澱過濾。依序以5%氯化鈉溶液、乙醇、乙醚洗滌，獲得3.29g雙羥基(OH)之中間產物，產率88%。
接著，將0.5ml濃鹽酸與0.4ml之30%亞硝酸鈉(sodium nitrite)混合形成均勻酸溶液。取0.37g(0.001mole)中間產物懸浮於17ml水溶液，添加上述酸溶液，煮沸3分鐘。再添加30ml飽和氯化鈉溶 液，置冷，將磺酸鈉鹽結晶，以5%氯化鈉溶液、水、乙醇分別洗滌，獲得0.31g化合物C3，產率77%。
熔點(melting point)：293~295℃(dec.)
分子量(Mol.Wt.)：367.95(C14H5NaN2O5S2)
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,DMSO-d 6)δ(ppm)：7.93-7.97(2H,m,Ar-H),8.20-8.24(2H,m,Ar-H),8.72(1H,s,Ar-H5),9.09(1H,s,-SO3OH)
實施例2
蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮4-氧化鉀(化合物C4)
首先，取0.12g(2mmole)氫氧化鉀溶於4ml蒸餾水形成0.5N之均勻溶液。取0.3g(1mmole)化合物C2，室溫下以4ml氫氧化鉀攪拌，30分鐘令完全溶解。將該藍色溶液置冷藏室，過夜，獲得化合物C4，產率83%。
分子量(Mol.Wt.)：367.95(C14H5KN2O3S2)
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,DMSO-d 6)δ(ppm)：7.54(1H,s,Ar-H5),7.76-7.80(2H,m,Ar-H),8.10-8.15(2H,m,Ar-H),10.59(1H,s,Ar-OH)
實施例3
4-(二乙基胺基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C5)
取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述乙二醇溶液攪拌均勻，添入0.09g diethylamine(1mmole)，混合液加熱至160℃，迴流反應0.5小 時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得紫紅色化合物C5，產率80%。
熔點(melting point)：204-205℃
分子量(Mol.Wt.)：337.40
薄層色譜法比移值(Rf)：0.63(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
高解析度電子撞擊式質譜儀HRMS(EI)m/z：calcd[M]+,337.0885(C18H15N3O2S+)；found,337.0888.
核磁共振氫譜1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ ppm 1.43(6H,t,J=7.2Hz,-CH3),4.05(4H,q,J=6.9Hz,-NCH2),7.33(1H,s,Ar-H5),7.70(1H,td,J=7.5Hz,J=1.2Hz，Ar-H8),7.79(1H,td,J=7.4Hz,J=1.5Hz,Ar-H9),8.21(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.2Hz,Ar-H10),8.35-8.38(1H,m,Ar-H7)
核磁共振碳譜13C NMR(75MHz,CDCl3)：δ ppm 13.15,47.40,102.08,102.54,112.84,126.71,127.27,132.72,132.81,134.59,135.12,138.60,145.78,155.44,179.69,185.22
實施例4
4-嗎啉基蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C10)
首先取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述乙二醇溶液攪拌均勻，添入0.09g(1mmole)嗎啉(morpholine)，混合液加熱至160℃，迴流反應0.5小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷(dichloromethane/H2O)水溶液萃取，以硫酸鎂(MgSO4)脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得深咖啡色化合物C10，產率70%。
熔點(melting point)：259-260℃
分子量(Mol.Wt.)：351.38(C18H13N3O3S)
薄層色譜法比移值(Rf)：0.84(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C18H13N3O3S+[M]+=351.0678，Found：351.0682
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：3.98-4.01(2H,m,-NCH2-),4.05-4.08(2H,m,-OCH2-),7.55(1H,s,Ar-H5),7.76(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H9),7.81(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H8),8.24(1H,dd,J=6.75Hz,J=1.2Hz,Ar-H10),8.36(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.2Hz,Ar-H7)
核磁共振碳譜(13C-NMR)(75MHz,CDCl3)δ(ppm)：49.88,66.89,105.32,121.65,126.97,127.43,128.75,132.68,133.33,138.18,134.02,134.42,147.54,150.84,182.34,184.67
實施例5
4-硫代嗎啉基蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C15)
首先，取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述乙二醇(ethylene glycol)溶液攪拌均勻，添加0.10g(1mmole)硫代嗎啉，混合液加熱至160℃，迴流反應0.5小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得淺咖啡色化合物C15，產率62%。
熔點(melting point)：219-220℃
分子量(Mol.Wt.)：367.44(C18H13N3O2S2)
薄層色譜法比移值(Rf)：0.60(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C18H13N3O2S2 +[M]+=367.0449，Found：367.0444
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：1.84(4H,t, J=4.5Hz,-SCH2),4.08(4H,t,J=5.4Hz,-NCH2-),7.51(1H,s,Ar-H5),7.70-7.83(2H,m,Ar-H8,9),8.23(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H10),8.35-8.38(1H,m,Ar-H7)
核磁共振碳譜13C NMR(75MHz,CDCl3)：δ ppm 27.65,53.09,105.68,115.68,121.65,127.43,127.68,132.54,133.61,133.81,134.02,135.17,138.42,147.10,182.31,184.93.
實施例6
4-(乙基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C16)
取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添加0.10g 1mmole的ethanethiol，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得深咖啡色化合物C16(產率88%).
熔點：188-189℃(EtOH).
核磁共振氫譜1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ ppm 1.57(3H,t,J=7.5Hz,-CH3),3.35(2H,q,J=7.5Hz,-SCH2),7.78-7.90(2H,m,Ar-H8,9),8.14(1H,s,Ar-H5),8.15-8.31(1H,m,Ar-H10),8.34-8.43(1H,m,Ar-H7)
高解析度電子撞擊式質譜儀HRMS(EI)m/z：calcd[M]+,326.0184(C20H10N2O2S3 +)；found,326.0184.
薄層色譜法比移值(Rf)：0.78(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
分子量(Mol.Wt.)：326.39
實施例7
4-(正丙基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C17)
取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添加0.10g 1mmole的propane-1-thiol，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得深咖啡色化合物C17(產率85%)。
核磁共振氫譜1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ ppm 1.20(3H,t,J=7.2Hz,-CH3),1.94(2H,sext,J=7.2Hz,-CH2-),3.29(2H,t,J=7.2Hz,-SCH2),7.80-7.88(2H,m,Ar-H8,9),8.14(1H,s,Ar-H5),8.28(1H,dd,J=1.2Hz,J=7.2Hz,Ar-H10),8.36(1H,dd,J=1.2Hz,J=7.2Hz,Ar-H7).
高解析度電子撞擊式質譜儀HRMS(EI)m/z：calcd[M]+,340.0340(C20H10N2O2S3 +)；found,340.0338.
薄層色譜法比移值(Rf)：0.80(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
分子量(Mol.Wt.)：340.42
實施例8
4-(異丙基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C18)
取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添加0.10g 1mmole的propane-2-thiol，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得黃色化合物C18(產率88%)。
熔點：193-194℃(EtOH)..
高解析度電子撞擊式質譜儀HRMS(EI)m/z：calcd[M]+,340.0340 (C20H10N2O2S3 +)；found,340.0345.
薄層色譜法比移值(Rf)：0.88(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
分子量(Mol.Wt.)：340.42
核磁共振氫譜1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ ppm 1.57(6H,s,-CH3),1.94(2H,sext,J=7.2Hz,-CH2-),4.02-4.07(1H,m,-CH(CH3)2),7.81-7.86(2H,m,Ar-H8,9),8.23(1H,s,Ar-H5),8.28(1H,d,J=7.5Hz,Ar-H10),8.37(1H,d,J=7.5Hz,Ar-H7).
實施例9
4-(苯硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C19)
將0.5ml N,N-二異丙基乙胺以25ml無水四氫呋喃混合形成均勻溶液，待用。取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添入0.11g(1mmole)苯硫醇，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得橘黃色化合物C19，產率76%。
熔點(melting point)：105~106℃(EtOH)
分子量：374.44
薄層色譜法比移值(retention factor,Rf)：0.57(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C20H10N2O2S2 +[M]+=374.0184，found：[M]+=374.0184
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：7.49-7.52(4H,m,Ar-H7,Ar-H8,Ar-H9,Ar-H10),7.30(1H,s,Ar-H5),7.22-7.33(5H,m,Ar’-H2,Ar’-H3,Ar’-H4,Ar’-H5,Ar’-H6)
核磁共振碳譜(13C NMR)(75MHz,CDCl3)：δ ppm 119.96,126.62,127.08,127.27,127.47,127.62,127.84,130.69,130.90,134.06,134.36,134.91,134.96,135.93,140.50,,143.62,180.51,182.41.
實施例10
4-(2,5-二甲基苯基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C20)
將0.5ml N,N-二異丙基乙胺以25ml無水四氫呋喃混合形成均勻溶液，待用。取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添入0.14g(1mmole)2,5-二甲基苯硫酚，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得深咖啡色化合物C20，產率47%。
熔點(melting point)：243-244℃
分子量：402.49
薄層色譜法比移值(Rf)：0.74(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
核磁共振氫譜1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：2.40(6H,s,-CH3),7.32-7.41(2H,d,m,Ar’-H3,4),7.51-7.53(2H,m,Ar-H5,Ar’-H6),7.76-7.85(2H,m,Ar-H8,9),8.16(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.8Hz,Ar-H10),8.35(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.2Hz,Ar-H7)
核磁共振碳譜13C NMR(75MHz,CDCl3)：δ ppm 20.11,20.85,111.14,126.99,127.42,127.75,129.65,131.75,132.45,134.05,134.92,135.12,136.22,137.52,137.99,140.58,143.96,149.25,156.50,,164.42,180.41,183.51.
高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for
C22H14N2O2S2 +[M]+=402.0497,found[M]+=402.0506
實施例11
4-(苄基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C21)
取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添入0.12g(1mmole)苯基甲硫醇，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得淺咖啡色化合物C21(產率88%)。
薄層色譜法比移值(Rf)：0.72(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
熔點：243-244℃
分子量：388.46
高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C21H12N2O2S2 +[M]+=388.0340,found：[M]+=388.0340
核磁共振氫譜1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：3.97(2H,s,-CH2-),7.69(1H,s,Ar-H5),7.31-6.65(5H,m,Ar-H’2,3,4,5,6),7.70(1H,td,J=7.5Hz,J=1.2Hz,Ar-H9),7.72(1H,td,J=7.5Hz,J=1.2Hz,Ar-H8),8.20-8.23(1H,m,Ar-H10),8.29-8.32(1H,m,Ar-H7)
核磁共振氫譜13C-NMR(75MHz,CDCl3)δ(ppm)：28.15,125.76,126.13,127.40,127.58,128.16,128.73,129.32,130.12,131.23,132.01,132.43,133.21,133.45,134.45,135.88,136.34,151.32,154.70,183.02,185.71
實施例12
4-(吡啶-2-基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C58)
將0.5ml N,N-二異丙基乙胺以25ml無水四氫呋喃混合形成均勻溶液，待用。取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與N,N-二異丙基乙胺混合溶液攪拌均勻，添入0.11g(1mmole)2-巰基吡啶，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得橘紅色化合物C58(產率37%)。
熔點(melting point)：225-226℃
薄層色譜法比移值(Rf)：0.72(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C19H9N3O2S2 +[M]+=375.0136，found：375.0130
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：7.31-7.35(1H,m,Ar’-H4),7.62(1H,dt,J=7.8Hz,J=1.2Hz,Ar’-H6),7.75-7.88(1H,m,Ar-H8,9,Ar’-H5),8.22-8.25(1H,m,Ar-H10),8.35-8.338(1H,m,Ar-H7),8.45(1H,s,Ar-H5),8.62(1H,dd,J=4.8Hz,J=0.9Hz,Ar-H3).
實施例13
4-(對甲基苯基氧基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C59)
將0.5ml吡啶以25ml無水四氫呋喃混合形成均勻溶液，待用。取0.3g(1mmole)化合物C2溶於上述無水四氫呋喃與吡啶混合溶液攪拌均勻，添入0.11g(1mmole)對-甲基苯酚，混合液加熱至65℃，迴流反應2~4小時。將完全反應之混合液減壓濃縮，以二氯甲烷之水溶液萃取，以硫酸鎂脫水後，經減壓濃縮之粗產物，以乙醇再結晶，過濾收集，獲得紅紫色化合物C59，產率35%。
熔點(melting point)：244-245℃
分子量(Mol.Wt.)：372.06(C21H12N2O3S)
薄層色譜法比移值(Rf)：0.57(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
實施例14
4-(4-氯基苯基胺基)蒽醌[2,1-c1[1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C60)
取0.57g(2mmole)化合物C2溶於乙二醇溶液攪拌均勻，添加 0.77g(6mmole)對-氯苯胺，混合液加熱至160℃，迴流反應0.5小時。置冷卻至80℃，快速以熱水使沉澱析出後過濾，乾燥後之粗產物，以乙醇再結晶，獲得紫紅色化合物C60，產率55%。
熔點(melting point)：306-307℃
分子量(Mol.Wt.)：391.83(C20H10ClN3O2S)
薄層色譜法比移值(Rf)：0.37(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：7.42(2H,d,J=7.8Hz,Ar’-H3,5),7.48(2H,d,J=7.8Hz,Ar’-H2,6),7.72-7.78(1H,m,Ar-H9),7.80-7.85(1H,m,Ar-H8),7.85(1H,s,Ar-H5),8.22(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H10),8.35-8.38(1H,m,Ar-H7).
高解析度電子撞擊式質譜儀HRMS(EI)m/z：calcd[M]+,391.0182(C20H10ClN3O2S+)；found,391.0183.
實施例15
4-(2-甲基苯基胺基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮(化合物C61)
取0.57g(2mmole)化合物C2溶於乙二醇溶液攪拌均勻，添加0.84ml(6mmole)2-甲基苯胺，混合液加熱至160℃，迴流反應0.5小時。置冷卻至80℃，快速以熱水使沉澱析出後過濾，乾燥後之粗產物，以乙醇再結晶，獲得紫紅色化合物C61，產率28%。
熔點(melting point)：177-178℃
分子量(Mol.Wt.)：371.41(C21H13N3O2S)
薄層色譜法比移值(Rf)：0.49(ethyl acetate：n-hexane=2：3)
核磁共振氫譜1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ ppm 2.37(3H,s,-CH3),7.29(1H,d,J=7.2Hz,Ar’-H6),7.34-7.40(2H,m,Ar’-H4,5),7.49(1H,s,Ar-H5),7.52(1H,d,J=7.2Hz,Ar’-H3),7.72(1H,td,J=7.0Hz,J=1.5Hz,Ar-H9),7.80(1H,td,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H8),8.19(1H,dd,J=7.8Hz,J=1.2Hz,Ar-H10),8.36(1H,d,J=7.8Hz,Ar-H7).
核磁共振碳譜13C NMR(75MHz,CDCl3)：δ ppm 17.86,115.84,125.01,126.82,126.93,127.30,127.71,131.87,131.95,132.71,133.25,133.392,134.35,134,67,136.57,139.74,142.68,150.15,153.25,180.52,184.54.
另外，本發明更提供了化合物C29,C53,C56,C57之相關物理數據，以進一步佐證經由本發明所提供之製備方法所製備之雜環融合蒽醌衍生物。首先，經由本發明所提供之方法所製備的化合物C29，其產率(Yield)為62%，熔點(melting point)：119-120℃，分子量(Mol.Wt.)：402.49(C22H14N2O2S2)，其他數據如下：薄層色譜法比移值(Rf)：0.84(ethyl acetate：n-hexane=2：3)；高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. For C22H14N2O2S2 +[M]+=402.0497，found：402.0491；核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：3.11(2H,t,J=7.5Hz,-CH2-),3.58(2H,t,J=7.5Hz,-SCH2-),7.23-7.37(5H,m,Ar’-H2,3,4,5,6),7.81-7.88(2H,m,Ar-H8,9),8.22(1H,s,Ar-H5),8.25(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H10),8.37(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H7).
接著，化合物C53的產率(Yield)為81%，熔點(melting point)：254-255℃，分子量(Mol.Wt.)為422.91(C21H11ClN2O2S2)，其他數據如下：薄層色譜法比移值(Rf)：0.92(ethyl acetate：n-hexane=2：3)；高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C23H16N2O2S2 +[M]+=421.9950，found：421.9954；核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：4.67(2H,s,-CH2-),7.52-7.28(2H,dd,J=7.2Hz,J=1.8Hz,Ar’-H3,6),7.44-7.47(1H,m,Ar’-H5),7.56-7.59(1H,m, Ar’-H4),7.80-7.86(2H,m,Ar-H8,9),8.26(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H10),8.27(1H,s,Ar-H5),8.35(1H,dd,J=7.5Hz,J=1.5Hz,Ar-H7)。
化合物C56的產率(Yield)為82%，熔點(melting point)：261-262℃，分子量(Mol.Wt.)為422.91(C21H11ClN2O2S2)，其他數據如下：薄層色譜法比移值(Rf)：0.86(ethyl acetate：n-hexane=2：3)；高解析度電子撞擊式質譜儀(EIHR-MS)m/z calcd. for C22H14N2O2S2 +[M]+=421.9950，found：421.9942；核磁共振氫譜(1H-NMR)(300MHz,CDCl3)δ(ppm)：4.52(2H,s,-CH2-),7.34(2H,d,J=8.4Hz,Ar’-H2,6),7.48(2H,d,J=7.8Hz,Ar’-H3,5),7.81-7.86(2H,m,Ar-H8,9),8.24(1H,s,Ar-H5),8.27(1H,d,J=7.2Hz,Ar-H10),8.36(1H,d,J=7.2Hz,Ar-H7)。
化合物C57的產率(Yield)為62%，熔點(melting point)：256-257℃，分子量(Mol.Wt.)為444.57，其他數據如下：薄層色譜法比移值(Rf)：0.91(ethyl acetate：n-hexane=2：3)；高解析度電子撞擊式質譜儀HRMS(EI)m/z：calcd[M]+,444.0966(C25H20N2O2S2 +),found,444.0970；核磁共振氫譜1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ ppm 1.31(9H,s,-CH3),4.26(2H,s,-CH2-),7.39(2H,d,J=8.4Hz,Ar’-H2,6),7.346(2H,d,J=8.4Hz,Ar’-H3,5),7.83(2H,td,J=7.5Hz,J=1.8Hz,Ar-H8,9),8.27-8.30(2H,m,Ar-H5,10),8.36(1H,d,J=7.2Hz,Ar-H7)。
此外，本發明也利用了不同的方法來合成一系列的化合物，意即化合物本由C1氯化後形成C2後再來合成出一系列的化合物，但後來本發明也可以直接利用C1作為起始物來合成一系列的衍生化合物(C3-C65)，整個一步驟反應加入了金屬作為催化劑，例如：copper acetate(I)和ferric chloride，因為是一個步驟的所以也相對的減少了總反應時間，且相對的產率也提高很多。
再者，本發明進一步提供包含式I所示之雜環融合蒽醌衍生物或其藥學上可接受之鹽與賦形劑，且可用以治療癌症的醫藥組合物。
較佳地，上述受之鹽係為與無機或有機酸或鹼之生理上可接受之鹽，無機酸可選擇自由鹽酸、溴酸、硫酸、磺酸與磷酸所組成之群組，有機酸則可選擇自由檸檬酸、醋酸、馬來酸，富馬酸、葡萄糖酸、甘醇酸、甲基磺酸、丁二酸與半乳糖所組成之群組。
較佳地，上述為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。較佳地，上述賦形劑包含微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、玉米澱粉、修飾澱粉、羧甲澱粉鈉、樹脂、糊化澱粉、糖類、聚乙二醇、聚乙烯醇、羥丙纖維素、甲基纖維素、氫氧甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素。
另外，如前文所述，本發明所提供者係一用以抑制非核苷類端粒酶之醫藥組合物，且其係為一粉末、一顆粒、一液體、一膠體或一膏體，並可透過口服、經皮吸收、注射或吸入之方式進行傳輸。
在藥理試驗方面，進一步將利用本發明所提供之雜環融合蒽醌衍生物，進行藥理活性試驗以說明本發明之包含式I所示之雜環融合蒽醌衍生物的醫藥組合物確實具有治療癌症的功效與發展。亦即，經由體 外實驗之細胞存活率分析(SRB assay)以及美國癌症研究所(National.Cancer Institute,NCI)篩選平台進行人類腫瘤細胞株進行細胞毒性評估，分別如表二(PC-3前列腺癌細胞株)的50%癌細胞增生抑制之樣品濃度(IC50)與表三(one-dose單一濃度初篩)所示。
首先，磺醯羅丹明(Sulforhodamine)B蛋白質分析法(SRB assay)藉由細胞質中蛋白質含量計量總和代表樣本中細胞總數，可用於量測細胞增生與存活率。利用磺醯羅丹明(Sulforhodamine B,SRB)染劑中磺酸基之陰性蛋白質，於弱酸環境下與細胞質蛋白質之鹼性胺基酸鍵結而呈色，以弱鹼溶液萃取細胞內SRB並測量其吸光值，使用酵素免疫分析儀(ELISA reader)在波長490nm處測量吸收值，依據細胞濃度-吸收度檢量線換算，獲得真正細胞數目圖，統計計算其50%癌細胞增生抑制之樣品濃度。
基本上細胞存活率分析方法大致如下：建立標準曲線，以實驗用培養基(DMEM*)將一已知濃度細胞液(104~105)連續2倍稀釋，使96孔盤中每一孔盤細胞液體積為100μL，培養24小時後，移除舊的培養基。於各孔盤內加入100μL、10%冰三氯醋酸(trichloroacetic acid,TCA)，於4℃培養30分鐘後，用水洗滌5次以去除TCA、培養基以及死細胞。完全乾燥後(可將孔盤置於37℃烘箱內烘乾)於每個孔盤加入50μL、4%(w/v)SRB染劑，靜置15分鐘後(需避光)，孔盤內之細胞以1%醋酸勻洗除去未鍵結之SRB，直到孔盤內無多餘未鍵結SRB。完全乾燥後，每一孔盤再重新加入100μL 10mM三羥甲基胺基甲烷緩衝液(Tris buffer)(pH 10.5)溶解與細胞鍵結的染劑。於震盪器上震盪15~30分鐘使染劑再懸浮後，以酵素免疫分析儀測定波長490mm處的吸收值，建立細胞濃度-吸收度檢量線。再由酵素免疫分析儀所讀取之數據為每個樣本的螢光吸光度值，將此值與預先建立之細胞濃度-吸收度檢量線對照，即可求得樣本細胞濃度如表二。
接著，美國癌症研究所(National.Cancer Institute,NCI)篩選平台進行人類腫瘤細胞株進行細胞毒性評估，其細胞株分別為急性成淋巴细胞性白血病細胞株(CCRF-CEM)、前骨髓性白血病細胞株(HL-60,TB)、急性淋巴母细胞白血病細胞株(MOLT-4)、標危型細胞株 (Standard Risk,SR)、細胞株(PRMI-8226)、細胞株(K562)等白血病癌(Leukemia)細胞株。非小细胞肺癌細胞株(Non-Small Cell Lung Cancer)包括EKVX、HOP-62HOP-92、NCI-H226、NCI-H23、NCI-H322M、NCI-H460、NCI-H522、A549/ATCC等系列。直腸腫瘤細胞株(COLO 205)，結腸腫瘤細胞株(HCC-2998、HCT-116、HCT-15、KM12、SW-620)，大腸腫瘤(Colon Cancer)細胞株(HT29)等系列。中樞神經系統腫瘤細胞株(CNS CANCER)包括SF-268、SF-295、SF-539、SNB-19、SNB-75，膠質腫瘤細胞株(U251)等。黑色素腫瘤(Melanoma)細胞株包括LOX IMVI、MALME-3M、M14、UACC-62、UACC-257，皮膚黑色素瘤細胞株SK-MEL-2、SK-MEL-28、SK-MEL-5等細胞株。卵巢癌(Ovarian Cancer)細胞株包括IGROV1、OVCAR-3、OVCAR-4、OVCAR-5、OVCAR-8、SK-OV-3等細胞株。腎細胞瘤(Renal Cancer)包括腎透明細胞腺瘤(786-0、CAKI-1)細胞株，腎瘤細胞株(A489、ACHN、SN12C、TK-10、UO-31RXF、393)等細胞株。前列腺瘤(Prostate Cancer)細胞株為DU145、PC-3。乳瘤(Breast Cancer)細胞株包括MCF7、HS 578-T、MDA-MB-231/ATCC、MDA-MB-468、NCI/ADR-RES，乳腺管瘤細胞株BT-549、T-47D、MDA-MB-435等。以目前美國癌症中心的數據來看，我們可以看到在結構修飾後的一系列衍生化合物中，有些化合物的活性遠比起始物C1和C2的抗癌活性還要好，使這些化合物具有更佳的潛力成為抗癌活性化合物。
在細胞存活率分析中，我們可以發現主要結構皆上苯環以及中間有一個碳和兩個碳做一個連接子再接上苯環後，我們可以發現這三大類的化合物以有兩個碳作連接子的化合物在PC-3這個前列腺癌細胞中表現最好，舉例來說可以比較沒有碳化合物C19(IC50>15M)，連接子為一個碳的化合物C21(IC50>15M)和連接子為兩個碳的化合物C29(IC50=19M)，這三者中以化合物C29表現最好。化合物C32和化合物C33相比(IC50分別>15M和5.48M)，此二者皆在鄰位的地方有氯取代基，比較有無連接子的這兩個化合物可以發現具有連接子的化合物表現比較好。化合物C22與化合物C56相比也具有相同的 規律，故可以得到一個SAR(structure and activity relationship)在抗癌細胞毒殺能力來看，整體的主要結構必須要有一個連接子來做一個支鏈延伸的連結。此外，在體外實驗之細胞存活率分析(SRB assay)數據中，我們可以看到確切的IC50的值，有一些化合物的IC50甚至到達小於1M的等級。
上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本發明之專利範圍中。
第一圖顯示化合物C1~C65的製備流程圖。

Claims (19)

  1. 一種雜環融合蒽醌衍生物，其係由式I所示： 式I中，R1代表丁基胺基、乙基胺基、烷基硫基、哌嗪基、嗎啉基、金屬鹽或由式II所示之取代基，其所述烷基為C3-10鏈狀烷基； 式II中，R2代表-NH-、-O-則n為0~2；R2代表-S-則n為0~2，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、烷基、硝基、甲硫基或巰基取代；其中，當R2代表-S-時，該雜環融合蒽醌衍生物不包含4-(苯硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮、4-(4-甲基苯基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮。
  2. 如申請專利範圍第1項之雜環融合蒽醌衍生物，其中當R1為烷基硫基時，其烷基可選擇自由C3-10直鏈烷基、C3-10支鏈烷基所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項之雜環融合蒽醌衍生物，其中R1為氧化鉀、乙基哌嗪基、六氫吡啶-1-基、硫代嗎啉基、乙基硫基、正丙基硫基或異丙基硫基。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之雜環融合蒽醌衍生物，其中R2為-NH-，且R1可為3-氯基苯基胺基、2-甲基苯基胺基、3-甲基苯基胺基、4-甲基苯基胺基、4-氯基苯基胺基或4-氯基-2-氟基苯胺基。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之雜環融合蒽醌衍生物，其中R2為-O-，且R1可為對甲基苯基氧基。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之雜環融合蒽醌衍生物，其中R2為-S-，且R1可為2,5-二甲基苯基硫基、苄基硫基、4-氯基苯基硫基、2-甲氧基苯基硫基、4-溴基苯基硫基、2,4-二甲基苯基硫基、4-異丙基苯基硫基、2-溴基苯基硫基、4-氟基苯基硫基、苯基乙基硫基、2,3-二氯基苯基硫基、4-第三丁基苯基硫基、2-氯基苯基硫基、2-氟基苯基硫基、2,5-二氯基苯基硫基、2-巰基苯基硫基、3-氯苯基硫基、3-氟苯基硫基、2,4-二氟苯基硫基、3-溴苯基硫基、4-甲氧基苯基硫基、3,4-二甲基苯基硫基、4-甲硫基苯基硫基、4-硝基苯基硫基、3-甲氧基苯基硫基、間-甲基苯基硫基、鄰-甲基苯基硫基、3,5-二甲基苯基硫基、3-乙氧基苯基硫基、2-乙基苯基硫基、2-異丙基苯基硫基、4-(2-氯基苄基硫基)、4-乙基苯基硫基、2,6-二甲基苯基硫基、4-氯基苄基硫基、4-第三丁基苄基硫基。
  7. 一種製備如申請專利範圍第1項所述雜環融合蒽醌衍生物之方法，其步驟如下：使1,2-二胺基蒽醌與亞硫醯氯反應，再經三乙胺催化以形成一第一產物；蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮使該第一產物與一包含有鹵系元素之化合物反應以得到一第二產物；4-氯基蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮將該第二產物溶於無水四氫呋喃之N,N-二異丙基乙胺混合溶液或乙二醇之其中一者以形成一混合溶液；加入包含有烷基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基、金屬鹽或由下式II所示取代基之化合物之其中一者至該混合溶液中： 式II中，R2代表-NH-、-O-則n為0~2，；R2代表-S-則n為0~2，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、烷基、硝基、甲硫基或巰基取代，攪拌該混合溶液；以及過濾沈澱。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之方法，其中該第一產物為蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮，且該包含有鹵系元素之化合物為氯酸鉀，此時該第二產物為4-氯基蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮。
  9. 一種用以治療癌症之醫藥組合物，包含由式I所示之噻二唑融合蒽醌衍生物或其藥學上可接受之鹽與賦形劑： 式I中，R1代表鹵系元素、丁基胺基、乙基胺基、烷基硫基、鹵烷基、哌嗪基、磺酸基、嗎啉基、金屬鹽或由式II所示之取代基： 式II中，R2代表-NH-、-O-則n為0~2；R2代表-S-則n為0~2，且式II中苯基的氫元素可部分地由鹵系元素、烷氧基、烷基、硝基、甲硫基或巰基取代；其中，當R2代表-S-時，該雜環融合蒽醌衍生物不包含4-(苯硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮、4-(4-甲基苯基硫基)蒽醌[2,1-c][1,2,5]噻二唑-6,11-二酮。
  10. 如申請專利範圍第9項之醫藥組合物，其中R1為氯基、磺酸鈉、氧化鉀、二乙基胺基、丙基胺基、四氫吡咯-1-基、二甲基胺基乙基胺基、乙基哌嗪基、六氫吡啶-1-基、丁基胺基胺基、乙基胺基、硫代嗎啉基、乙基硫基、正丙基硫基或異丙基硫基。
  11. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中R2為-NH-，且R1可為3-氯基苯基胺基、2-甲基苯基胺基、3-甲基苯基胺基、4-甲基苯基胺基、4-氯基苯基胺基或4-氯基-2-氟基苯胺基。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中R2為-O-，且R1可為對甲基苯基氧基。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中R2為-S-，且R1可為苯硫基、2,5-二甲基苯基硫基、苄基硫基、4-氯基苯基硫基、2-甲氧基苯基硫基、4-溴基苯基硫基、2,4-二甲基苯基硫基、4-異丙基苯基硫基、2-溴基苯基硫基、4-氟基苯基硫基、苯基乙基硫基、2,3-二氯基苯基硫基、4-第三丁基苯基硫基、2-氯基苯基硫基、2-氟基苯基硫基、2,4,5-三氯基苯基硫基、2,5-二氯基苯基硫基、2-巰基苯基硫基、3-氯苯基硫基、3-氟苯基硫基、2,4-二氟苯基硫基、3-溴苯基硫基、4-甲氧基苯基硫基、3,4-二甲基苯基硫基、4-甲硫基苯基硫基、4-甲基苯基硫基、4-硝基苯基硫基、3-甲氧基苯基硫基、間-甲基苯基硫基、鄰-甲基苯基硫基、3,5-二甲基苯基硫基、3-乙氧基苯基硫基、2-乙基苯基硫基、2-異丙基苯基硫基、4-(2-氯基苄基硫基)、4-乙基苯基硫基、2,6-二甲基苯基硫基、4-氯基苄基硫基、4-第三丁基苄基硫基。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中該可接受之鹽係為與無機或有機酸或鹼之生理上可接受之鹽，該無機酸可選擇自由鹽酸、溴酸、硫酸、磺酸與磷酸所組成之群組，該有機酸則可選擇自由檸檬酸、醋酸、馬來酸，富馬酸、葡萄糖酸、甘醇酸、甲基磺酸、丁二酸與半乳糖所組成之群組。
  15. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其中該載劑為賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之醫藥組合物，其中該賦形劑包含微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、玉米澱粉、修飾澱粉、羧甲澱粉鈉、樹脂、糊化澱粉、糖類、聚乙二醇、聚乙烯醇、羥丙纖維素、甲基纖維素、氫氧甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素。
  17. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，其係用以抑制非核苷類端粒酶之醫藥組合物。
  18. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，係為一粉末、一顆粒、一液體、一膠體或一膏體。
  19. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組合物，係透過口服、經皮吸收、注射或吸入之方式進行傳輸。
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