TWI487540B - Modified microcarriers and their use - Google Patents

Description

經修飾的微載體及其用途

本發明是有關於一種微載體(microcarrier)，特別是指一種經透明質酸(hyaluronic acid)修飾的微載體及其作為細胞遞送系統的用途。

由於一般治療受損組織的移植手術(例如角膜移植手術)具有相當風險，因此通常會以細胞治療(cell-based therapy)取代移植手術，但僅注射細胞往往難以維持細胞的駐留時間，因此通常需要一細胞載體(cell carrier)遞送細胞，以克服上述問題。例如Tissue Engineerig：Part A ,17,2981-2997(2011)揭示一種三維支架載體，適用於承載於脂肪間質幹細胞(adipose-derived mesenchymal stem cell)。然而，細胞在該三維支架載體上的生長速度明顯不佳。因此，傳統細胞載體在提升細胞生長速度、促進細胞分泌細胞外基質(extracellular matrix)以及維持細胞的表現型(phenotype)等方面仍有待更一步的改進。

因此，申請人發展出一種經透明質酸修飾的微載體，適合作為一細胞載體，以達到修復受損組織並治療 眼睛疾病的效果。

因此，本發明之第一目的，即在提供一種經修飾的微載體，是經氧化的透明質酸透過化學修飾而覆蓋在一微球(microsphere)的表面上所形成，其中，該微球是由羧基與胺基相互交聯的明膠所形成。

本發明之第二目的，即在提供一種細胞遞送系統，其包含有一如上所述的經修飾的微載體以及一附著型細胞(adherent cell)。

本發明之第三目的，即在提供一如上所述的細胞遞送系統供應用於製備一用來治療和/或預防眼睛疾病之醫藥品的用途。

本發明之第四目的，即在提供一種用於治療一具有或被懷疑具有眼睛疾病的方法，包含對一個體投藥以一如上所述的細胞遞送系統。

本發明之功效在於：藉由眼內注射該貼附有細胞的經修飾的微載體作為細胞遞送系統，能修復受損的眼睛細胞而達到治療眼睛疾病的功效。

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示運用掃瞄式電子顯微鏡觀測得的微載體的表面形態，其中對照組表示比較合成例製得的經交聯之明膠微球；及實驗組表示合成例製得的經修飾的微載體； 圖2顯示經注射手術後角膜內皮細胞的密度隨著時間的變化，其中正常對照組表示經注射均衡鹽溶液；對照組表示經注射經交聯之明膠微球；及實驗組表示經注射經修飾的微載體；圖3顯示吸光值(波長450 nm)隨著時間的變化，其中對照組表示以經交聯之明膠微球進行細胞培養；實驗組表示以經修飾的微載體進行細胞培養；以及“＊”表示：當與對照組作比較，p <0.05；圖4顯示膠原蛋白分泌量隨著時間的變化，其中對照組表示以經交聯之明膠微球進行細胞培養；實驗組表示以經修飾的微載體進行細胞培養；以及“＊”表示：當與對照組作比較，p <0.05；圖5顯示使用經修飾的微載體來培養RCK細胞後所測得的ALDH1A1基因的表現位準，其中對照組1表示被處理以1 ng/mL TGF-β之培養於平膜載體上的RCK細胞；對照2表示未被處理之培養於平膜載體上的RCK細胞；實驗組1表示被處理以1 ng/mL TGF-β之培養於經修飾的微載體上的RCK細胞；實驗組2表示未被處理之培養於經修飾的微載體上的RCK細胞；以及“＊”表示：當與對照組作比較，p <0.05；圖6顯示白兔眼睛之角膜基質組織的型態隨時間的變化，其中對照組表示注射PBS並施予眼藥水治療；及實驗組表示注射貼附有RCK細胞的經修飾的微載體溶液並施予眼藥水治療； 圖7顯示白兔眼睛之角膜厚度隨時間的變化，其中對照組表示注射PBS並施予眼藥水治療；及實驗組表示注射貼附有RCK細胞的經修飾的微載體溶液並施予眼藥水治療；及圖8顯示白兔眼睛之角膜基質在治療後第14天時的組織型態，其中對照組表示注射PBS並施予眼藥水治療；及實驗組表示注射貼附有RCK細胞的經修飾的微載體溶液並施予眼藥水治療。

本發明經修飾的微載體是經氧化的透明質酸透過化學修飾而覆蓋在一微球的表面上所形成，其中，該微球是由羧基與胺基相互交聯的明膠所形成。

較佳地，該微球的直徑範圍為5~500 μm。當該微球的直徑小於5 μm時，該微球因尺寸過小而不足以承載足量的細胞；當該微球的直徑大於500 μm時，該微球因尺寸過大而不利於生物降解。更佳地，該微球的直徑範圍為50~100 μm。在本發明之具體實施例中，該微球的直徑約為55 μm。

為使該微球的結構型態更為穩固，以利於承載細胞，較佳地，該微球是經由一羰基活化劑而交聯，且該羰基活化劑包括碳二亞胺(carbodiimide)，可用於活化明膠上的羧基以與明膠上的胺基交聯，並可避免活化劑殘存於該微球中所可能導致的毒性。更佳地，該碳二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺 [1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide,EDC]，且該羰基活化劑還包括N -羥基琥珀醯亞胺(N -hydroxysuccinimide,NHS)。

較佳地，該經氧化的透明質酸包含至少二醛基，藉以透過化學修飾而覆蓋在該微球的表面。

本發明細胞遞送系統包含有一如上所述的經修飾的微載體以及一附著型細胞。

依據本發明，該附著型細胞包括那些為熟習此項技藝者可易於獲得的附著型細胞株(例如，可購自於國內或國外寄存機構者)，或者利用本技藝中所慣用的細胞分離方法而從天然來源中所分離純化出的附著型細胞株。在此方面，可以參照，例如，The Journal of Biological Chemistry ,262,53-58(1987)。較佳地，該附著型細胞是選自於由下列所構成的群組：纖維母細胞(fibroblast)、上皮細胞(epithelial cell)、內皮細胞(endothelial cell)、星狀細胞(astrocyte)、腎細胞(kidney cell)、肝細胞(hepatocyte)、表皮細胞(epidermal cell)，角膜基質細胞(corneal keratocyte)、角膜內皮細胞(corneal endothelial cell)、角膜上皮細胞(corneal epithelial cell)、視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelial cell)，以及它們的組合。更佳地，該附著型細胞是選自於由下列所構成的群組：角膜基質細胞、角膜內皮細胞、角膜上皮細胞、視網膜色素上皮細胞，以及它們的組合。在本發明之具體實施例中，該附著型細胞是角膜基質細胞。

本發明細胞遞送系統可以經由一選自於下列的非經腸道的途徑(parenteral routes)來遞送細胞：角膜內注射(intra-corneal injection)、眼前房注射(anterior chamber injection)、視網膜內注射(intra-retinal injection)、視網膜下注射(subretinal injection)、玻璃體內注射(intravitreal injection)、脈絡膜上腔注射(suprachoroidal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、表皮內注射(intraepidermal injection)、肌肉內注射(intramuscular injection)、腹腔注射(intrapentoneal injection)、腹膜內注射(intraperitoneal injection)、胸膜內注射(intrapleural injection)、關節內注射(intraarticular injection)、滑液內注射(intrasynovial injection)、胸骨內注射(intrasternal injection)、椎管內注射(intrathecal injection)、病灶內注射(intralesional injection)以及顱內注射(intracranial injection)。

為了非經腸道地遞送細胞，本發明細胞遞送系統可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一注射品(injection)，例如，無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)。

該注射品是藉由將該細胞遞送系統與一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)相混合而被製備。

該藥學上可接受的載劑可包含有一或多種選自於下列的試劑：溶劑(solvent)(諸如無菌水)、緩衝液(buffer)[諸如眼科均衡鹽溶液(ophthalmic balanced salt solution)、 磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)、林格氏液(Ringer’s solution)以及漢克氏溶液(Hank’s solution)]、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、pH調整劑(pH adjusting agent)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、防腐劑(preservative)、稀釋劑(diluent)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

另外，在開發可用於治療和/或預防眼睛疾病的醫藥品上，申請人亦發現到：如上所述的細胞遞送系統具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明亦預期如上所述的細胞遞送系統供應用於製備一用來治療和/或預防眼睛疾病之醫藥品的用途。較佳地，該醫藥品是呈一供眼內(intraocular)注射的劑型。

當紐西蘭白兔(New Zealand white rabbits)的經誘發受損(發炎)的角膜基質層被注射該細胞遞送系統[含有兔子角膜基質細胞(rabbit corneal keratocyte,RCK)]時，該細胞遞送系統能夠在該角膜基質層內修復受損的組織，使得白兔的眼內壓(intraocular pressure,IOP)以及角膜厚度有效地減少。

本發明將就以下實施例作進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅為例示說明之用，而不應被解釋為本發明實施之限制。

實施例 <合成例> [經交聯之明膠微球(gelatin microcarrier,GMC)的合成]

將2 g明膠(購自於Sigma-Aldrich，品名為Gelatin type A from porcine skin，300 bloom，重量平均分子量為100,000)溶於50℃的20 mL去離子水中，得到澄清的明膠溶液。在300 rpm的攪拌轉速下，將該明膠溶液緩緩加入100 mL橄欖油中，接著置於60℃水浴中1小時，之後以冰浴快速冷卻並持續攪拌30分鐘，再加入150 mL丙酮攪拌30分鐘以除水。最後將懸浮液進行抽濾並以100 mL丙酮清洗30分鐘，再經過真空乾燥隔夜後得到明膠微球初產物。

在25℃及避光下，將500 mg明膠微球初產物懸浮於40 mL含有10 mM EDC及5 mM NHS的80%乙醇水溶液中反應24小時後，以1000 rpm的轉速離心3分鐘並移除上清液。最後將沉澱物以95%乙醇清洗三次(每次10分鐘)以移除未反應的試劑，再經過真空乾燥隔夜後，分別以100 μm及50 μm的不鏽鋼篩網篩得直徑為50-100 μm的產物，得到經交聯之明膠微球(GMC)。依照Materials Science and Engineering C ,30,677-685(2010)的方法計算本實施例中GMC的交聯指數(cross-linking index)，結果為71.6±2.2%。

[經氧化的透明質酸的合成]

將1 g透明質酸(購自於Sigma-Aldrich，重量平均分子量為1,100,000)溶於100 mL去離子水中，逐滴加入5 mL 0.4 M過碘酸鈉水溶液，在室溫及避光下攪拌反應2小時後，再加入1 mL 1,2-乙二醇持續攪拌1小時以使未反應的過碘酸鈉失去活性。最後以去離子水進行透析處理3天，再經過冷凍乾燥得到經氧化的透明質酸。

該經氧化的透明質酸是透過如Polymer ,40,3575-3584(1999)所揭示的TNBS測定法(TNBS assay)測量波長334 nm的吸收，並換算得到其氧化度(degree of oxidation)為10.4%，顯示透明質酸中部分的羥基已被氧化成醛基。

[經修飾的微載體(mGMC)的合成]

將300 mg上述經交聯之明膠微球懸浮於40 mL含有160 mg上述經氧化的透明質酸的80%乙醇水溶液中，在室溫下反應24小時後，以1000 rpm的轉速離心3分鐘，移除上清液(含有未反應的經氧化的透明質酸)後以去離子水回溶，重複上述離心-移除上清液-回溶步驟三次。最後將沉澱物以95%乙醇水溶液清洗二次，再經過真空乾燥後得到一經修飾的微載體(mGMC)。

分別將10 mg上述經交聯之明膠微球及10 mg上述經修飾的微載體置於微量離心管中，分別以含有1%(w/v)艾爾遜藍(alcian blue 8GX，購自於Sigma-Aldrich)染劑的3%醋酸水溶液(pH 2.5)溶液染色30分鐘，接著以去離子水清洗三次及以95%乙醇水溶液清洗二次，並使用冷凍 切片機(購自於LEICA，型號為CM 3050 S)進行切片，並以光學顯微鏡(購自於Nikon，型號為TS100)觀察後可以發現(數據未顯示)：與該經交聯之明膠微球相比，該經修飾的微載體的表面含有經氧化的透明質酸，顯示該經氧化的透明質酸可藉由上述合成方法覆蓋在該經交聯之明膠微球的表面上。

[電子顯微鏡觀察]

以掃描式電子顯微鏡(SEM，購自於Hitachi，型號為S-3000 N，加速電壓為12 kV)分別觀察表面濺鍍上金的該經交聯之明膠微球(對照組)及該經修飾的微載體(實驗組)，結果如圖1所示，該經交聯之明膠微球及該經修飾的微載體的直徑皆約為55 μm，該經交聯之明膠微球表面較不平整，而該經修飾的微載體的表面較平滑，顯示在該經修飾的微載體中，該經氧化的透明質酸是覆蓋在該微球的表面上，有利於細胞貼附於該經修飾的微載體的表面上。

<比較合成例>

將200 μL上述合成例中的明膠溶液(0.1 g/mL)注入一24-井培養盤(24-well plate)的井中，經過真空乾燥後，加入1.6 mL含有10 mM EDC及5 mM NHS的80%乙醇水溶液中反應24小時，再以去離子水清洗三次後，加入1 mL含有10.66 mg上述經氧化的透明質酸的80%乙醇水溶液，並以1 M氫氧化鈉水溶液調整pH值至9後反應24小時，最後以去離子水清洗後得到一薄膜狀的平膜載體。

<一般實驗材料與方法> 1.實驗動物：

下面實驗中所使用的紐西蘭白兔(New Zealand white rabbits)(16至20週大，體重約為3至3.5 kg)是購自於國家實驗動物繁殖及研究中心(National Laboratory Animal Breeding and Research Center)。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、溫度維持在21至24℃以及濕度維持在45至75%的獨立空調的動物房內，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的飼養環境、處理以及一切實驗程序均符合實驗動物委員會以及視覺與眼科學研究協會(Association for Research in Vision and Ophthalmology,ARVO)的準則。

2.麻醉方法：

該等白兔是以舒泰(Zoletil,Virbac,Carros,France)(劑量為2.5 mg/kg體重)、鹽酸賽拉嗪(xylazine hydrochloride)(劑量為1 mg/kg體重)的肌肉內注射(intramuscular injection)及0.5%鹽酸丙美卡因(proparacaine hydrochloride)(劑量為2滴)的局部投藥而被麻醉。

3.兔子角膜基質細胞的來源與培養：

下面實驗中所使用的兔子角膜基質細胞(RCK)是分離自成年雄性紐西蘭白兔(購自於國家實驗動物繁殖及研究中心)的角膜基質層，在此方面，可以參照，例如，International Journal of Nanomedicine ,7,1101-1114(2012)當中所述方法來進行細胞分離。

RCK細胞被培養於含有KSFM(keratinocyte serum-free medium)[添加有10,000 U/mL盤尼西林(penicillin)、10 mg/mL鏈黴素(streptomycin)以及25 μg/mL雙性黴素B(amphotericin B)]的培養皿(petri dish)中，接著在培養條件被設定為37℃與5% CO2的培養箱中進行培養。之後，大約每隔2天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80%匯聚(confluence)時，移除培養基並以磷酸鹽緩衝生理鹽水(Phosphate Buffered Saline,PBS)來洗滌細胞共計3次，接著加入胰蛋白酶-EDTA(trypsin-EDTA)以使細胞自培養皿的底部脫離。之後，加入新鮮的培養基來中和胰蛋白酶的活性並以量吸管(pipette)反覆地吸沖培養基以充分打散細胞，然後將所形成的細胞懸浮液分配到新的培養皿中，並在培養條件被設定為37℃與5% CO₂ 的培養箱中進行培養。

4.統計學分析：

在下面的實施例中所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±平均值的標準誤差(standard error of the mean,SEM)”來表示。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)來作分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p <0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。

<測試> [活體內生物相容性測試]

將上述<一般實驗材料與方法>的第1項「實 驗動物」白兔分成正常對照組、對照組及實驗組，經由上述<一般實驗材料與方法>的第2項所述的「麻醉方法」進行麻醉後，分別對各組白兔的單側眼進行以下手術：對正常對照組注射200 μL均衡鹽溶液(BSS)；對對照組注射含有10 mg經滅菌的GMC之等量BSS；對實驗組注射含有10 mg經滅菌的mGMC之等量BSS。分別於術前(即第0天)、術後第1天、術後第7天及術後第14天，利用狹縫燈顯微鏡(slit lamp microscope，購自於Topcon Optical，Japan，型號為DC-3)觀察各組白兔被注射的眼睛之角膜內皮細胞的型態，並藉由角膜內皮細胞顯微鏡(specular microscope，購自於Topcon Optical，Japan，型號為SP-2000P)測量角膜內皮細胞的密度。經由觀察結果(未顯示)可以發現各組白兔被注射的眼睛之角膜內皮細胞皆沒有出現任何的型態異常(morphological abnormalities)，且如圖2所示，各組白兔被注射的眼睛之角膜內皮細胞的密度隨著時間皆無顯著變化，顯示該經交聯之明膠微球(對照組)及該經修飾的微載體(實驗組)皆不會影響角膜內皮細胞的生長。

[細胞培養測試]

分別將10 mg上述經交聯之明膠微球及10 mg上述經修飾的微載體置於1.7 mL的微量離心管中，在無菌操作台中以75%乙醇水溶液及紫外光照射2小時進行滅菌，分別作為對照組及實驗組。

分別將1 mL含有5×10⁴ 個依據上面<一般實驗材料與方法>的第3項「兔子角膜基質細胞的來源與培養 」來進行繼代培養的RCK細胞的培養液接種入含有1 mL的KSFM(添加有10,000 U/mL盤尼西林、10 mg/mL鏈黴素以及25 μg/mL雙性黴素B)之上述對照組及實驗組的微量離心管中，接著在37℃下培養1天、3天及5天後，進行以下A-B的測試。

A.細胞增生測試

對照組及實驗組中RCK細胞的細胞增生是透過如Analytical Biochemistry ,419,266-270(2011)所揭示的WST-1測定法量測，步驟簡述如下：分別以含有10%(v/v)WST-1的PBS(pH 7.4)取代原培養液進行培養4小時後，測量波長450 nm的吸收值，以上各組皆進行四次重複測試，結果如圖3所示。

參見圖3，第1天時，對照組及實驗組之間沒有明顯差異，顯示RCK細胞在該經交聯之明膠微球(對照組，GMC)及該經修飾的微載體(實驗組，mGMC)表面上的RCK細胞貼附數量相近；第3天時，該經修飾的微載體表面上的RCK細胞貼附數量略多於該經交聯之明膠微球；第5天時，該經修飾的微載體表面上的RCK細胞貼附數量明顯多於該經交聯之明膠微球，表示RCK細胞在mGMC表面的生長速度較在GMC表面更快。

B.膠原蛋白分泌量測試

對照組及實驗組中RCK細胞的膠原蛋白分泌量是透過Clinical Biochemistry ,29,225-229(1996)所揭示的比色法量測，步驟簡述如下：藉由離心分別收集原培養液 的懸浮液，與1 N氯胺T(chloramine T)及Erlich試劑反應15分鐘後，測量波長550 nm的吸收值，參照羥脯胺酸(hydroxyproline)(1-50 μg/mL)的標準曲線，可換算得到膠原蛋白分泌量，以上各組皆進行三次重複測試，結果如圖4所示。

參見圖4，第1天、第3天及第5天時，該經修飾的微載體表面上RCK細胞(實驗組)分泌之膠原蛋白量皆多於該經交聯之明膠微球表面上RCK細胞(對照組)之分泌量，顯示貼附於mGMC的RCK細胞因受到mGMC的刺激，因此相較貼附於GMC的RCK細胞而言能分泌更多的膠原蛋白，有利於修復受損的眼睛細胞。

[經修飾的微載體在維持角膜基質細胞的表現型(phenotype)上的效用評估]

在本實施例中，申請人選用兔子角膜基質細胞來進行活體外試驗，並以醛去氫酶1家族成員A1(aldehyde dehydrogenase 1 family member A1,ALDH1A1)的基因表現位準(gene expression level)來作為角膜基質細胞的表現型的指標，俾以評估本發明的經修飾的微載體在維持角膜基質細胞的表現型上的效用。

<實驗方法> A.使用經修飾的微載體來培養RCK細胞

首先，分別將10 mg依據上面比較合成例所得到的平膜載體及10 mg依據上面合成例所得到的經修飾的微載體置於24-井培養盤中，在無菌操作台中以75%乙醇進 行滅菌歷時4小時。

接著，將依據上面<一般實驗材料與方法>的第3項「兔子角膜基質細胞的來源與培養」來進行繼代培養的RCK細胞分成4組，其中包括2個對照組(亦即，對照組1與2)以及2個實驗組(亦即，實驗組1與2)。將對照組的細胞分別以一為5×10⁴ 細胞/井的數量接種至含有平膜載體以及1 mL的KSFM(添加有10,000 U/mL盤尼西林、10 mg/mL鏈黴素以及25 μg/mL雙性黴素B)的24-井培養盤的井中，而將實驗組的細胞分別以一為5×10⁴ 細胞/井的數量接種至含有經修飾的微載體以及1 mL的KSFM(添加有10,000 U/mL盤尼西林、10 mg/mL鏈黴素以及25 μg/mL雙性黴素B)的井中，繼而將適量的轉變生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)分別添加至對照組1以及實驗組1中，而使得它們分別具有一最終濃度為1 ng/mL的TGF-β。

各組細胞在培養箱(37℃、5% CO₂ )中進行培養歷時7天後，收取細胞培養物並將之拿來進行下面第B項的實驗。

B. ALDH1A1基因表現位準的測定

對在上面第A項中所得到的各組的細胞使用TRIzol^TM 試劑並依據製造商所提供的操作指引來進行總RNAs(total RNAs)的萃取。由此所得到的各組的總RNAs分別被拿來進行下面的反轉錄反應(reverse transcription reaction)以合成第一股cDNA(first-strand cDNA)。

有關第一股cDNA的合成是使用ImProm-II^TM 反轉錄系統(ImProm-II^TM Reverse Transcription System)(Promega,Madison,WI,USA)並且依據製造商所提供的操作指引來進行。簡言之，取1 μg的總RNAs並加入1 μL的寡(dT)₁₅ 引子[oligo(dT)₁₅ primer]，接著加入焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水將體積補足至13 μL並予以混合均勻。然後，將所形成的混合物置於一PCR機器(購自於basic life，型號為BL3002)中並於65℃下作用歷時5分鐘，繼而轉移至冰上靜置歷時2分鐘。接著，加入7 μL的混合物溶液(mixture solution)[含有200 U的SuperScript^TM 反轉錄酶、4 μL的5X第一股緩衝溶液(first strand buffer)、1 μL的10 mM dNTPs以及2 μL的0.1 M DTT]，然後置於PCR機器中並於37℃下進行反轉錄反應歷時55分鐘，最後於70℃下作用歷時55分鐘以終止酵素反應，藉此而得到第一股cDNA。

接著，以所得到的第一股cDNA作為模版(template)，並且使用一組針對穴兔(Oryctolagus cuniculus )的ALDH1A1基因(NCBI登錄編號NM_001082013.1)的核苷酸殘基位置746至851處所設計出的專一性引子對(specific primer pair)ALDH1A1-F引子(序列辨識編號：1)與ALDH1A1-R引子(序列辨識編號：2)來進行定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，以下簡稱定量即時PCR)。另外，甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的基 因表現被使用作為內部對照組(internal control)。有關該等引子對的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小、對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表1中。

定量即時PCR是使用一LightCycler儀器(LightCycler instrument)(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,U.S.)並依據製造商的操作指引來執行，而有關定量即時PCR的操作條件與反應條件被顯示於下面的表2中。

由此所得到的PCR產物藉由SYBR Green(雙股DNA結合染料)的螢光(fluorescence)來進行偵測，而分別得到各個PCR產物的循環閾值[cycle threshold(C _t )value]。相對的mRNA表現位準(relative mRNA expression level)是從各個PCR產物的循環閾值被計算出，並且使用比較性C _t 方法(comparativeC _t method)而以GAPDH基因所得到的PCR產物的循環閾值來予以標準化。接著，各組的ALDH1A1基因的表現位準以相對於對照組2所具者的倍數被計算出。

之後，依照上面<一般實驗材料與方法>的第4項「統計學分析」當中所述的方法來分析所得到的實驗數據。

[ALDH1A1基因表現位準的測定]

圖5顯示使用經修飾的微載體來培養RCK細胞後所測得的ALDH1A1基因的表現位準。由圖5可見，實驗組2的ALDH1A1基因的表現位準顯著地高於對照組2所具者，而實驗組1的ALDH1A1基因的表現位準亦顯著地高於對照組1所具者。特別地，對照組1的ALDH1A1基因的表現位準幾乎接近於零。申請人據此而推論：使用經交聯之微球型態的經修飾的微載體來培養角膜基質細胞能夠提升 其ALDH1A1基因的表現位準，使得角膜基質細胞可以有效地抵抗由TGF-β的調控所誘導之非所欲的增生反應，而可保持角膜基質細胞的表現型。

[經修飾的微載體對於細菌性角膜炎修復效用的評估]

以下實驗是以金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )誘發兔子角膜基質受損作為動物模式，以評估該經修飾的微載體對於角膜炎的治療效用。

將20隻上述白兔以克他明(ketamine)及若朋(rompun)進行全身麻醉，再於其眼睛表面以愛爾卡因(alcaine)進行局部麻醉，接著，參考Ophthalmic Research ,2005,37,328-334當中所述方法來進行誘發。簡言之，以30G針頭於該等白兔之右眼的角膜基質層施打1000 cfu/20 μL的金黃色葡萄球菌[購自於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)之金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)]，當注射後6小時，角膜產生嚴重發炎及瘢痕組織，表示角膜基質受損已被誘發。

依照上面[細胞培養測試]的方法，將培養5天後的實驗組的微量離心管的培養液置換為PBS，得到一mGMC溶液。

將該等已誘發角膜基質受損的白兔分成對照組及實驗組，接著開始進行治療：對於對照組的角膜基質層注射20 μL上述的PBS，並連續三天每6小時施予一次的眼藥水治療[含有0.3%環丙沙星(ciprofloxacin)，每次1滴] ；對於實驗組的角膜基質層注射20 μL上述貼附有5×10⁴ 個RCK細胞的mGMC溶液，並連續三天每6小時施予一次的眼藥水治療(含有0.3%環丙沙星，每次1滴)。分別於開始治療後第1天、第3天、第7天及第14天，利用狹縫燈顯微鏡(購自於Topcon Optical，Japan，型號為DC-3)觀察二組白兔受損並經治療的眼睛之角膜基質組織的型態，結果如圖6所示；分別於開始治療後第1天、第3天、第7天及第14天，利用角膜厚度儀(購自於SONOMED，型號為PacScan 300P)測量二組白兔受損並經治療的眼睛之角膜厚度，結果如圖7所示；於治療後第14天各犠牲5隻對照組及實驗組的白兔，對於二組白兔受損並經治療的眼睛之角膜基質組織進行組織切片，並透過HE(hematoxylin and eosin)染色後觀察其組織型態，結果如圖8所示。

參見圖6，對照組及實驗組中的瘢痕組織皆有隨時間逐漸淡化，其中實驗組中瘢痕組織的淡化速度明顯較對照組更快。另外，於開始治療後第14天後，對照組中仍可觀察到顯著的血管新生現象，而實驗組中的血管新生現象已隨時間逐漸淡化，表示該貼附有RCK細胞的經修飾的微載體具有較佳的促進組織修復的效果。

參見圖7，對照組及實驗組的角膜厚度隨時間逐漸下降而恢復，其中實驗組中角膜厚度的下降速度明顯較對照組更快，表示該貼附有RCK細胞的經修飾的微載體具有較佳的促進組織修復的效果。

參見圖8，於開始治療後第14天時，對照組的 組織切片中仍可觀察到血管新生現象(如圖8中實線箭頭所指)及發炎細胞(如圖8中虛線箭頭所指)，而實驗組的組織切片中顯示其組織型態已恢復為正常型態(不具有血管新生現象及發炎細胞)，表示該貼附有RCK細胞的經修飾的微載體具有較佳的促進組織修復的效果。

綜上所述，本發明經修飾的微載體不會影響角膜內皮細胞的生長，且能促進RCK細胞分泌較多的膠原蛋白，有利於修復受損的眼睛細胞，並且適用於承載細胞以作為該細胞遞送系統，而該細胞遞送系統能有效促進組織修復以達到治療眼睛疾病的功效，故確實能達成本發明之目的。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

<110> 長庚大學

<120> 經修飾的微載體及其用途

<130> 經修飾的微載體

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於定量即時PCR的ALDH1A1基因的前向引子ALDH1A1-F

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於定量即時PCR的ALDH1A1基因的反向引子ALDH1A1-R

<400> 2

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於定量即時PCR的GAPH基因的前向引子GAPDH-F

<400> 3

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於定量即時PCR的GAPDH基因的反向引子GAPDH-R

<400> 4

Claims (9)

1. 一種經修飾的微載體，是經氧化的透明質酸透過化學修飾而覆蓋在一微球的表面上所形成，其中，該微球是由羧基與胺基相互交聯的明膠所形成，該經氧化的透明質酸包含至少二醛基。
2. 如請求項1所述的經修飾的微載體，其中，該微球的直徑範圍為5~500μm。
3. 如請求項2所述的經修飾的微載體，其中，該微球的直徑範圍為50~100μm。
4. 如請求項1所述的經修飾的微載體，其中，該微球是經由一羰基活化劑而交聯，且該羰基活化劑包括碳二亞胺。
5. 如請求項4所述的經修飾的微載體，其中，該碳二亞胺是1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺，且該羰基活化劑還包括N -羥基琥珀醯亞胺。
6. 一種細胞遞送系統，其包含有一如請求項1的經修飾的微載體以及一附著型細胞。
7. 如請求項6的細胞遞送系統，其中，該附著型細胞是選自於由下列所構成的群組：角膜基質細胞、角膜內皮細胞、角膜上皮細胞、視網膜色素上皮細胞，以及它們的組合。
8. 一如請求項7的細胞遞送系統供應用於製備一用來治療和/或預防眼睛疾病之醫藥品的用途。
9. 如請求項8的用途，其中，該醫藥品是呈一供眼內注射 的劑型。