TWI471331B - 核酸共軛物的液相合成法 - Google Patents

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TWI471331B
TWI471331B TW101149607A TW101149607A TWI471331B TW I471331 B TWI471331 B TW I471331B TW 101149607 A TW101149607 A TW 101149607A TW 101149607 A TW101149607 A TW 101149607A TW I471331 B TWI471331 B TW I471331B
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Tzu Pin Wang
Ni Chien Ko
Yu Chih Su
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Univ Kaohsiung Medical
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Description

核酸共軛物的液相合成法
本發明攸關一種核酸共軛物的合成技術，且特別係關於一種核酸共軛物的液相合成法。
核酸是由多個核苷酸以磷酸雙酯鍵(phosphodiester bond)連接組成的巨分子，並可參與生物體內遺傳訊息的儲存、表現及傳遞，因此核酸已廣泛地應用於臨床或研究上。
為因應這些應用的需求，核酸經常有目的地連接一特殊分子。舉例而言，核酸作為基因篩選的探針時，其共價鍵結像是螢光素醯胺(fluorescein amidite，FAM)等可被偵測的標誌分子，且連同標誌分子送至體內後，利用標誌分子對體內的目標基因定性或定量。又舉例而言，核酸作為治療疾病或預防細菌成染的藥物時，其共價鍵結像是Tat、Antennapedia或CyLop-1等穿膜胜肽(cell-penetrating peptide，CPP)，且於連同穿膜胜肽送至體內時，利用穿膜胜肽提升個體對核酸的攝取。
目前，將核酸連接分子的技術主要是採用化學合成法。如2007年A.Grandas等人提出的固相合成法，係先將一胜肽組裝於一固體基質(solid substrate)，再將一核酸鍵結胜肽的自由羥基。但是，A.Grandas等人提出的方法有高製造成本的問題，因而無法普及。本發明人之一於2010年7月提出一種液相合成法，係利用磷酸醯胺反應(phosphoramidation)將一胜肽鍵結至一核酸5’端(請參閱中華民國發明專利公開號第201229511號、Bioconjugate Chem.21；1642-1655)。此方法如流程1所示。於pH 6.0的溶 液中，一核酸1a的5’端先與1-(3-二甲基胺基丙基)-1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbondiimide hydrochloride，EDC)反應，而形成一中間物1b。於同樣條件下，中間物1b再與咪唑反應，而形成一磷酸咪唑化合物1c。最後，於pH 8.5的溶液中，磷酸咪唑化合物1c與一親核劑1d反應，以形成一核酸共軛物1e。此方法的製造成本雖然比A.Grandas等人提出的方法低，但其問題在於得到之核酸共軛物的產率低，因此同樣無法普及。
本發明係針對本發明人之一於2010年7月提出之液相合成法做出的改良。經改良後，本發明提出一種新穎之核酸共軛物的液相合成法，而其製得的核酸共軛物不僅具有高產率，更具有生物功能。
於是，本發明之一構想提供一種核酸共軛物的合成法，其包括以下步 驟：於一第一緩衝液存在下，一核酸與一選自於由4(5)-羥基甲基咪唑(4(5)-hydroxymethyl imidazole)、2-乙基咪唑(2-ethylimidazole)、2-乙基-4-甲基咪唑(2-ethyl-4-methyl imidazole)、4(5)-甲基咪唑(4(5)-methyl imidazole)、2-甲基咪唑(2-methyl imidazole)及4-甲基-5-咪唑甲醇鹽酸鹽(4-methyl-5-imidazolemethanol hydrochloride)所組成之咪唑衍生物群組進行第一反應，使咪唑衍生物鍵結於核酸5’端，而得到一5’-咪唑衍生物-核酸；以及於一第二緩衝液存在下，5’-咪唑衍生物-核酸與一親核劑進行第二反應，使親核劑取代5’-咪唑衍生物-核酸中的咪唑衍生物鍵結於5’-咪唑衍生物-核酸中的核酸5’端，而得到一5’-親核劑-核酸。
根據本發明之構想，核酸可為去氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
根據本發明之構想，第一緩衝液至少包含EDC，而核酸為DNA時，第一緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質(co-solute)；核酸為RNA時，第一緩衝液含前述之共溶質。
根據本發明之構想，第一反應是於室溫下進行。
根據本發明之構想，親核劑至少具有一-NH2 基，並以一由-NH2 基形成的-NH-鍵鍵結於5’-咪唑衍生物-核酸中的核酸5’端，而親核劑的例子可以為胜肽、蛋白質、螢光標記或其他核酸標定化合物。
根據本發明之構想，第二緩衝液至少包含乙二胺四乙酸(EDTA)及4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-丙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-propanesulfonic acid，EPPS)，而核酸為DNA時，第二緩衝液不含選自尿素、Tween 20、 Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質；核酸為RNA時，第二緩衝液含前述之共溶質。
根據本發明之構想，第二反應是於41-55℃下進行。
本發明之另一構想提供一種核酸共軛物的合成法，其包括以下步驟：於一第一緩衝液存在下，一核酸與一選自於由4(5)-羥基甲基咪唑、2-乙基咪唑、2-乙基-4-甲基咪唑、4(5)-甲基咪唑、2-甲基咪唑及4-甲基-5-咪唑甲醇鹽酸鹽所組成之咪唑衍生物群組進行第一反應，使咪唑衍生物鍵結於核酸5’端，而得到一5’-咪唑衍生物-核酸；於一第二緩衝液存在下，5’-咪唑衍生物-核酸與一親核劑進行第二反應，使親核劑取代5’-咪唑衍生物-核酸中的咪唑衍生物鍵結於5’-咪唑衍生物-核酸中的核酸5’端，而得到一5’-親核劑-核酸；於一第三緩衝液存在下，5’-親核劑-核酸與N-順丁烯二醯基胺基酸丁二醯亞胺酯(N-maleoyl amino acid succinimidyl ester，AMAS)進行第三反應，使AMAS鍵結於5’-親核劑-核酸中的親核劑，而得到一5’-AMAS-親核劑-核酸；以及於一第四緩衝液存在下，5’-AMAS-親核劑-核酸與一有半胱胺酸的胜肽進行第四反應，使胜肽藉由其半胱胺酸與5’-AMAS-親核劑-核酸中之AMAS的馬來醯亞胺基團(maleimide group)作用並鍵結於5’-AMAS-親核劑-核酸中的AMAS，而得到一5’-胜肽-AMAS-親核劑-核酸。
根據本發明之構想，核酸可為DNA或RNA。
根據本發明之構想，第一緩衝液至少包含EDC，而核酸為DNA時，第一緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質；核酸為RNA時，第一緩衝液含前述之共溶質。
根據本發明之構想，第一反應是於室溫下進行。
根據本發明之構想，親核劑至少具有一-NH2 基，並以一由-NH2 基形成的-NH-鍵鍵結於5’-咪唑衍生物-核酸中的核酸5’端，而親核劑的例子可以為胜肽、蛋白質、螢光標記或其他核酸標定化合物。
根據本發明之構想，第二緩衝液至少包含EDTA及EPPS，而核酸為DNA時，第二緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質；核酸為RNA時，第二緩衝液含前述之共溶質。
根據本發明之構想，第二反應是於41-55℃下進行。
根據本發明之構想，第三緩衝液至少包含EPPS。
根據本發明之構想，第三反應是於室溫下進行。
根據本發明之構想，第四緩衝液至少包含EPPS。
根據本發明之構想，第四反應是於室溫下進行。
綜上所述，本發明提出的方法係利用咪唑衍生物替代咪唑，如此一來，提升了核酸共軛物的產率。此外，經生物測試後，此些方法得到的核酸共軛物具有生物活性。
為讓本發明上述及/或其他目的、功效、特徵能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，作詳細說明。
【實施例1：四聚甘胺酸之二胺基衍生物的合成】
{2-[2-(2-第三-丁氧基羰基胺基-乙醯基胺基)-乙醯基胺基]-乙醯基胺基}-乙酸 ({2-[2-(2-tert-butoxycarbonylamino-acetylamino)-acetylamino]-acetylamino}-acetic acid)
化合物2b的製備如流程2所示。取50毫克四聚甘胺酸2a溶解於16毫升二氧化二伸乙基/氫氧化鈉/水(4：2：2)溶液，待其完全溶解後，緩緩加入355毫克二-第三-丁基二碳酸酯(di-tert-butyldicarbonate)，反應2小時。反應結束後，以減壓濃縮機去除混合液中的溶劑，而得到白色粉體產物2b。1 H-NMR(400MHz)(DMSO-d 6 )δ：8.32(t,1H,GIy4 -NH),8.26(t,1H,Gly3 -NH),7.33(t,1H,GIy2 -NH),7.05(t,1H,Gly1 -NH),3.74(d,2H,Gly4α -H),3.68(d,2H,Gly3α -H),3.59(d,2H,Gly2α -H),3.32(d,2H,Gly1α -H),1.37[s,9H,CO2 C(CH3 )3 ].13 C-NMR(DMSO-d 6 )δ：171.2,169.9,169.3,167.7,155.9,79.2,78.2,43.8,43.4,42.3,42.1,28.2.HRMS(ESI)calculated for C13 H22 N4 O7 Na,[M+Na]+ 369.1386(calcd.),369.1388(found)。
[({[({[(2-第三-丁氧基羰基胺基-乙基胺基甲醯基)-甲基]-胺基甲醯基}-甲基)-胺基甲醯基]-甲基}-胺基甲醯基)-甲基]-胺基甲酸-第三-丁酯 ([({[({[(2-tert-butoxycarbonylamino-ethylcarbamoyl)-methyl]-carbamoyl}-methyl)-carbamoyl]-methyl}-carbamoyl)-methyl]-carbamic acid tert-butyl ester)
化合物2c的製備如流程2所示。取70毫克化合物2b溶解於20毫升二甲基甲醯胺(dimethylformamide，DMF)，待其完全溶解後，放入冰浴中。再加入40毫克EDC及60毫克N-羥基苯並三唑(N-hydroxybenzotriazole，HOBt)至得到的混合液，反應15分鐘。接著，加入溶於5毫升DMF的單-第三-丁氧基羰基-乙二胺(80毫克，mono-t -Boc-ethylenediamine)及N,N-二異丙基乙胺(0.035毫升，N,N-diisopropylethylamine，DIPEA)至混合液，於室溫下攪拌6小時。反應結束後，以減壓濃縮機移除得到之混合物中的DMF，再以矽膠管柱層析法加以純化，沖提液比例為二氯甲烷：甲醇=3：1。純化得到的產物，而得到淡黃色固體產物2c。1 H-NMR(400MHz)(DMSO-d 6 )δ：8.17(t,1H,CONH CH2 CH2 ),8.10-8.04(m,2H,Gly1 -NH ,CH2 CH2 NH CO2 C(CH3 )3 ),7.80(t,1H,Gly4 -NH),6.99(t,1H,GIy3 -NH),6.80(t,1H,Gly2 -NH),3.74(t,4H,Gly4α -H,Gly1α -H),3.66(d,2H,Gly3α -H),3.58(d,2H,Gly2α -H),3.08(q,2H,NHCH 2 ),2.98(q,2H,CH 2 NH),1.37[d,18H,CO2 C(CH3 )3 ].13 C-NMR(DMSO-d 6 )δ：169.9,169.4,169.0,168.8,155.8,155.6,78.2,77.7,48.6,43.3.,42.1,42.1,42.0,40.1,28.2,28.2.HRMS(ESI)calculated for C20 H36 N6 O8 Na,[M+Na]+ 511.2492(calcd.),511.2490(found)。
[6-(2-{2-[2-(2-第三-丁氧基羰基胺基)-乙醯基胺基]-乙醯基胺基}-乙醯基胺基)-己基]-胺基甲酸-第三-丁酯 ([6-(2-{2-[2-(2-tert-Butoxycarbonylamino-acetylamino)-acetylamino]-acetylamino}-acetylamino)-hexyl]-carbamic acid tert-butyl ester)
化合物2d的製備如流程2所示。取70毫克化合物2b溶解於20毫升DMF，待其完全溶解後，放入冰浴中。再加入110毫克EDC及78毫克HOBt至得到的混合液，反應15分鐘。接著，加入溶於5毫升DMF的單-第三-丁氧基羰基-己二胺(80毫克，mono-t -Boc-hexanediamine)及DIPEA(0.1毫升)至混合液，於室溫下攪拌6小時。反應結束後，以減壓濃縮機移除得到之混合物中的DMF，再以矽膠管柱層析法加以純化，沖提液比例為二氯甲烷：甲醇=9：1。純化得到的產物，而得到淡黃色固體產物2d。1 H-NMR(400MHz)(DMSO-d 6 )δ：8.16(t,1H,CONH CH2 CH2 ),8.04-8.08[m,2H,Gly4 -NH ,NH CO2 C(CH3 )3 ],7.70(t,1H,Gly3 -NH),7.00(t,1H,Gly1 -NH),6.75(t,1H,GIy2 -NH),,3.75(d,2H,Gly1α -H),3.72(d,2H,Gly4α -H),3.65(d,2H,Gly3α -H),3.58(d,2H,Gly2α -H),3.03(q,2H,NHCH 2 ),2.88(q,2H,CH 2 NH),1.37[d,22H,CO2 C(CH3 )3 ,NHCH2 CH 2 ].1.21-1.23(m,4H,CH 2 ).13 C-NMR(DMSO-d 6 )δ：169.9,169.4,169.0,168.4,155.9,155.6,78.2,77.3,43.3,42.2.,42.1,42.0,38.9,38.5,29.5,29.1,28.3,28.2,26.1,26.0.HRMS(ESI)calculated for C24 H44 N6 O8 Na,[M+Na]+ 567.3118(calcd.),567.3115(found)。
2-胺基-N-{[({[(2-胺基-乙基胺基甲醯基)-甲基]-胺基甲醯基}-甲基)-胺基甲醯基]-甲基}-乙醯胺 (2-amino-N-{[({[(2-amino-ethylcarbamoyl)-methyl]-carbamoyl}-methyl)-carbamoyl]-methyl}-acetamide)
化合物2e的製備如流程2所示。取50毫克化合物2c溶於4毫升三氟乙酸/二氯甲烷(1：1)溶液，並於0℃下攪拌反應1小時，再於室溫下反應1 小時。待反應結束後，以減壓濃縮機移除得到之混合液中的三氟乙酸，得到的產物再以氯仿、乙醚清洗，之後再以減壓濃縮機移除產物中的乙醚，而得到黃色油狀三氟乙酸鹽。將三氟乙酸鹽溶解於5毫升二氯甲烷/甲醇(1：1)溶液，再加入0.14毫克Amberlyst A21並搖晃反應30分鐘。反應結束後，將得到之混合物中的Amberlyst A21過濾移除，並以減壓濃縮機移除混合物中的液體，而得到白色固體產物2e。1 H-NMR(400MHz)(DMSO-d 6 )δ：8.65(t,1H,NH CH2 CH2 ),8.32(t,1H,Gly4 -NH),8.17(t,1H,GIy3 -NH),8.06(t,1H,Gly2 -NH),7.80-8.02(br,4H,Gly1 -NH2 ,CH2 CH2 N H2 ),3.85(d,2H,Gly4α -H),3.77(d,2H,Gly3α -H),3.71(d,2H,Gly2α -H),3.62(s,2H,Gly1α -H),3.30(q,2H,CH 2 NH),2.85(q,2H,NHCH 2 ).13 C-NMR(DMSO-d 6 )δ：169.6,169.1,168.8,166.4,42.0,42.0.,42.0,39.0,38.5,36.3.HRMS(ESI)calculated for C10 H21 N6 O4 ,[M+H]+ 289.1624(calcd.),289.1626(found)。
2-胺基-N-{[({[(6-胺基-己基胺基甲醯基)-甲基]-胺基甲醯基}-甲基)-胺基甲醯基]-甲基}-乙醯胺 (2-amino-N-{[({[(6-amino-hexylcarbamoyl)-methyl]-carbamoyl}-methyl)-carbamoyl]-methyl}-acetamide)
化合物2f的製備如流程2所示。取60毫克化合物2d溶於4毫升三氟乙酸/二氯甲烷(1：1)溶液，並於0℃下攪拌反應1小時，再於室溫下反應1小時。待反應結束後，以減壓濃縮機移除得到之混合液中的三氟乙酸，產物再以氯仿、乙醚清洗，之後再以減壓濃縮機移除產物中的乙醚，而得到褐色油狀三氟乙酸鹽。將三氟乙酸鹽溶解於5毫升二氯甲烷/甲醇(1：1)溶液，再加入0.14毫克Amberlyst A21並搖晃反應30分鐘。反應結束後，將得到之混合物中的Amberlyst A21過濾移除，並以減壓濃縮機移除混合物中的液體，而 得到白色固體產物2f。1 H-NMR(400MHz)(DMSO-d 6 )δ：8.68(t,1H,NH CH2 CH2 ),8.33(t,1H,Gly4 -NH),8.13(t,1H,Gly3 -NH),7.84-8.08(br,4H,GIy1 -NH2 ,CH2 CH2 NH 2 ),7.79(t,1H,Gly2 -NH),3.84(d,2H,Gly4α -H),3.75(d,2H,Gly3α -H),3.66(d,2H,Gly2α -H),3.62(s,2H,Gly1α -H),3.04(q,2H,CH 2 NH),2.76(t,2H,CH 2 NH2 ),1.18-1.60(m,8H,CH2 ).13 C-NMR(DMSO-d 6 )δ：169.0,168.9,168.5,166.5,42.1,42,5,42.0,40.2,38.8,38.4,28.9,27.0,25.8,25.5.HRMS(ESI)calculatedfor C14 H29 N6 O4 ,[M+H]+ 345.2250(calcd.),345.2251(found)。
【實施例2：AMAS的合成】
化合物3b的製備如流程3所示。取69毫克(2,5-二氧-2,5-二氫-吡咯-1-基)-乙酸3a((2,5-dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-acetic acid)及103毫克N-羥基琥珀硫亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)溶解於10毫升三氟乙酸，並於攪拌同時，逐滴加入溶於10毫升三氟乙酸的184毫克N,N’-二環己基碳二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide，DCC)。於室溫下反應至隔夜後，加入約3滴冰醋酸至得到的混合液，攪拌1小時，再過濾混合液以移除其上清液。以減壓濃縮機濃縮得到的濾液，產物先以乙醇清洗二次，並於攪拌同時，再懸浮於30毫升2-丙醇，接著過濾取出產物的上清液。以丙醇清洗得到的固體，並經乾燥，而得到白色產物3b。1 H-NMR(400MHz)(DMSO-d 6 )δ：7.20(s,2H,CHCH),4.73(s,2H,CH2 ),2.81(s 4H, CH2 CH2 ).13 C-NMR(DMSO-d 6 )δ：169.7,169.7,164.4,135.1,36.3,25.4.HRMS(ESI)calculated for C10 H8 N2 O6 Na,[M+Na]+ 275.0280(calcd.),275.0279(found)。
【實施例3：含氫硫基之生物素衍生物的合成】
5-(2-氧基-六氫-噻吩[3,4-d]咪唑-4-基)-戊酸(2-{2-[5-(2-氧基-六氫-噻吩[3,4-d]咪唑-4-基)-戊醯基胺基]-乙基二巰基}-乙基)-醯胺 (5-(2-oxo-hexahydro-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-pentanoic acid(2-{2-[5-(2-oxo-hexahydro-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-pentanoylamino]-ethyldisulfanyl}-ethyl)-amide)
化合物4b的製備如流程4所示。取0.19克5-(2-氧基-六氫-噻吩[3,4-d]咪唑-4-基)-戊酸2,5-二氧基-吡咯烷-1-基酯4a(5-(2-Oxo-hexahydro-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-pentanoic acid 2,5-dioxo-pyrrolidin-1-yl ester)溶解在7毫升熱DMF中，待其完全溶解後，將得到的混合液回溫至室溫，加入1毫升含胱胺二鹽酸鹽(0.068克)及三乙胺(0.14克)的DMF溶液。於反應至隔夜後，以減壓濃縮機移除得到之產物中的DMF。得到的固體以20毫升異丙醇加熱回溶，待得到的溶液回到室 溫後，將溶液置於4℃下，並靜置至隔夜析出沉澱物。以異丙醇清洗沉澱物，而得到產物4b。1 H-NMR(400MHz)(DMSO)δ：8.01(s,2H,CONH),6.54(s,2H,CONH),6.39(s,2H,CONH),4.31(t,2H,CHN),4.15(t,2H,CHN),3.11(dd,2H,CHS),2.85(d,2H,CH HS),2.78(t,4H,CH2 S),2.58(d,2H,CH HS),2.09(t,4H,CH2 CO),1.31-1.61(m,12H).13 C-NMR(100.67MHz)(DMSO)δ：172.26,162.74,61.04,59.21,55.43,41.10,37.88,37.31,35.15,28.11,25.23.HRMS(ESI)calculated for C24 H40 N6 O4 S4 Na,[M+Na]+ 627.1891(calcd.),627.1893(found)。
5-(2-氧基-六氫-噻吩[3,4-d]咪唑-4-基)-戊酸(2-巰基-乙基)-醯胺 (5-(2-oxo-hexahydro-thieno[3,4-d]imidaz0l-4-yl)-pentanoic acid(2-mercapto-ethyl)-amide)
化合物4c的製備如流程4所示。將0.14克化合物4b溶在8毫升熱DMF中，其完全溶解後，將得到的混合液回溫至室溫，並加入0.11克DL-二硫酥糖醇(DL-dithiothreitol，DTT)及0.002克三乙胺。於反應1小時後，加入0.11克DTT至得到的反應產物，並再反應2小時。以減壓濃縮機乾燥得到的產物，得到的固體以20毫升二氯甲烷清洗三次，並經減壓濃縮後，而得到產物4c。1 H-NMR(400MHz)(DMSO)δ：7.98(s,1H,CONH),6.45(s,1H,CONH),6.38(s,1H,CONH),4.32(t,1H,CHN),4.14(t,1H,CHN),3.19(t,2H,CH 2 SH),3.11(dd,1H,CHS),2.83(d,1H,CH HS),2.58(d,1H,CH HS),2.37(t,1H,SH),1.32-1.61(m,6H).13 C-NMR(100.67MHz)(DMSO)δ：172.38,162.81,61.07,59.23,55.44,42.04,35.14,28.21,28.03,25.25,23.52.HRMS(FAB)calculated for C17 H30 O5 N5 SNa,[M+Na]+ 439.5112(calcd.),439.1865(found)。
【實施例4：核酸的製備及標記】
GMP-primed TW17 RNA是自行利用T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase)合成，GMP-primed TW171-17 RNA是購自Bioneer(大田，南韓)，3’primer DNA是購自百力生物科技股份有限公司(台灣)，而其序列請見檢附的序列表。為利用urea-PAGE分析，此些核酸於核酸共軛物的製備前先標記上P32 於其5’端上；另為利用流式細胞儀分析及螢光顯微鏡分析，此些核酸於核酸共軛物的製備前先標記上螢光標記於其5’端上。
【實施例5：共溶質對核酸共軛物產率的影響】 核酸為RNA
先將0.32nmol GMP-primed TW17 RNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC、0.1M咪唑及10-32.4%共溶質，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-咪唑-RNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA、100mM EPPS及10-32.4%共溶質，並加入1微升化合物1d(187.2mM，溶於DMF)，於41℃下反應3小時。反應得到的5’-化合物1d-RNA(下文，以「RNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以8% urea-PAGE分析RNA共軛物。
如第1圖所示，此些緩衝液含15% Triton X-100時，得到的RNA共軛物產率最高。
核酸為DNA
先將0.32 nmol 3’primer DNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC、0.1M咪唑及10-32.4%共溶質，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-咪唑-DNA，再溶於5.5微升緩衝液 (pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA、100mM EPPS及10-32.4%共溶質，並加入1微升化合物1d(187.2mM，溶於DMF)，於45℃下反應3小時。反應得到的5’-化合物1d-DNA(下文，以「DNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以20%urea-PAGE分析DNA共軛物。
如第2圖所示，此些緩衝液不含共溶質時，得到的DNA共軛物產率最高。
【實施例6：咪唑衍生物對核酸共軛物產率的影響】 核酸為RNA
先將0.32nmol GMP-primed TW17 RNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC、15% Triton X-100及0.1M咪唑或咪唑衍生物，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-咪唑-RNA或5’-咪唑衍生物-RNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA、100mM EPPS及15% Triton X-100，並加入1微升化合物1d(187.2mM，溶於DMF)，於41℃下反應3小時。反應得到的5’-化合物1d-RNA(下文，以「RNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以8% urea-PAGE分析RNA共軛物。
如第3圖所示，使用4(5)-甲基咪唑時，得到的RNA共軛物產率最高，此現象我們推估是此咪唑衍生物的親核力及立體障礙所造成的。
核酸為DNA
先將0.32 nmol 3’primer DNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC及0.1M咪唑或咪唑衍生物，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-咪唑-DNA或5’-咪唑衍生物-DNA，再溶 於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA及100mM EPPS，並加入1微升化合物1d(187.2mM，溶於DMF)，於45℃下反應3小時。反應得到的5’-化合物1d-DNA(下文，以「DNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以20% urea-PAGE分析DNA共軛物。
如第4圖所示，使用4(5)-甲基咪唑時，得到的DNA共軛物產率最高，此現象我們推估是此咪唑衍生物的親核力及立體障礙所造成的。
【實施例7：反應溫度對核酸共軛物產率的影響】
先將0.32 nmol 3’primer DNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC及0.1M 4(5)-甲基咪唑，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-4(5)-甲基咪唑-DNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA及100mM EPPS，並加入1微升化合物1d(187.2mM，溶於DMF)，於45-60℃下反應3小時。反應得到的5’-化合物1d-DNA(下文，以「DNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以20% urea-PAGE分析DNA共軛物。
如第5圖所示，反應溫度為55℃時，得到的DNA共軛物產率最高。另一方面，根據Bioconjugate Chem.21；1642-1655的實驗結果，已證實反應溫度為41℃時，得到的RNA共軛物產率最高。
【實施例8：親核劑對核酸共軛物產率的影響】 核酸為RNA
先將0.32 nmol GMP-primed TW17 RNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC、15% Triton X-100及0.1M 4(5)-甲基咪 唑，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-4(5)-甲基咪唑-RNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA、100mM EPPS及15% Triton X-100，並加入1微升親核劑(187.2mM，溶於DMF)，於41℃下反應3小時。反應得到的5’-親核劑-RNA(下文，以「RNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以8% urea-PAGE分析RNA共軛物。
如第6圖所示，使用化合物2e及2f時，得到的RNA共軛物產率最高，此現象我們推估是化合物2e及2f之多親核基團所造成的。
核酸為DNA
先將0.32 nmol 3’primer DNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC及0.1M 4(5)-甲基咪唑，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-4(5)-甲基咪唑-DNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有2mM EDTA及100mM EPPS，並加入1微升親核劑(187.2mM，溶於DMF)，於55℃下反應3小時。反應得到的5’-親核劑-DNA(下文，以「DNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以20% urea-PAGE分析DNA共軛物。
如第7圖所示，使用化合物2e及2f時，得到的DNA共軛物產率最高，此現象我們推估是化合物2e及2f之多親核基團所造成的。
【實施例9：核酸共軛物的合成】 核酸為RNA
本實驗是依實施例5-8之結論而設計的。首先，將0.32nmol GMP-primed TW17 RNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC、15% Triton X-100及0.1M4(5)-甲基咪唑，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-4(5)-甲基咪唑-RNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 7.5)，且此緩衝液的成分有5mM EDTA、600mM EPPS及15% Triton X-100，並加入1微升Tat48-57 胜肽(20mM，溶於水)，於41℃下反應3小時。反應得到的5’-Tat48-57 -RNA(下文，以「RNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以8% urea-PAGE分析RNA共軛物。
核酸為DNA
本實驗是依實施例5-8之結論而設計的。首先，將0.32 nmol 3’primer DNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.0425M EDC及0.1M 4(5)-甲基咪唑，並於室溫下靜置反應90分鐘。接著，用酒精純化得到的5’-4(5)-甲基咪唑-DNA，再溶於5.5微升緩衝液(pH 8.0)，且此緩衝液的成分有5mM EDTA及600mM EPPS，並加入1微升Tat48-57 胜肽(20mM，溶於水)，於55℃下反應3小時。反應得到的5’-Tat48-57 -DNA(下文，以「DNA共軛物」稱之)經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中。最後，以20% urea-PAGE分析DNA共軛物。
如第8圖所示，得到的RNA共軛物或DNA共軛物具有介於47-75%的產率。
【實施例10：核酸共軛物的合成】 5’-胱胺-DNA
先將0.32 nmol 3’primer DNA溶於4微升緩衝液(pH 6.0)，而此緩衝液的成分有1.3M EDC及0.1M 4(5)-甲基咪唑，並於室溫下靜置反應90分鐘。用酒精純化得到的5’-4(5)-甲基咪唑-DNA，再溶於27.5微升緩衝液(pH 8.0)，且此緩衝液的成分有5mM EDTA及600mM EPPS，並加入5微升胱胺(187.2mM，溶於水)，於55℃下反應3小時。反應得到的5’-胱胺-DNA經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中，並以20% urea-PAGE分析之。
如第9圖所示，得到的5’-胱胺-DNA具有約72%的產率。
5’-化合物4a-胱胺-DNA
先將900 pmol 5’-胱胺-3’primer DNA溶於22.5微升緩衝液(pH 7.3)，而此緩衝液的成分有600mM EPPS，並加入不同濃度(0.01-1M)的9微升化合物4a，之後用錫箔紙包好，於室溫下搖晃反應90分鐘。反應得到的5’-化合物4a-胱胺-3’primer DNA經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中，並以20% urea-PAGE分析之。
如第9圖所示，當化合物4a與DNA的莫耳比為1,000：1時，得到的5’-化合物4a-胱胺-DNA產率最高。依此，我們推估後續使用的AMAS與核酸的莫耳比以1,000：1為適當。
5’-化合物4c-AMAS-胱胺-DNA
先將900 pmol 5’-AMAS-胱胺-3’primer DNA溶於50微升緩衝液(pH 7.3)，而此緩衝液的成分有600mM EPPS，並加入不同濃度(36-3600μM)的50微升化合物4c，於室溫下搖晃反應16小時。反應得到的5’-化合物4c-AMAS-胱胺-3’primer DNA經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中，並以20% urea-PAGE分析之。
如第9圖所示，當化合物4c與DNA的莫耳比為20：1時，得到的5’-化合物4c-AMAS-胱胺-3’primer DNA產率最高。依此，我們推估後續使用之有半胱胺酸的胜肽與核酸的莫耳以20：1為適當。
【實施例11：核酸共軛物的合成】 核酸為RNA
本實驗是依實施例10之結論而設計的。先將0.22nmol 5’-胱胺-TW171-17 RNA溶於5.55微升緩衝液(pH 7.3)，而此緩衝液的成分有600mM EPPS，並加入2.2微升AMAS(10mM，溶於二甲基亞碸)，之後用錫箔紙包好，於室溫下搖晃反應90分鐘。反應得到的5’-AMAS-胱胺-TW171-17 RNA經酒精沉澱後，回溶於50微升緩衝液(pH 7.3)，而此緩衝液的成分有600mM EPPS，並加入50微升EcCPP-3胜肽(88μM，溶於焦碳酸乙二酯)，於室溫下搖晃反應16小時。反應得到的5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-TW171-17 RNA經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中，並以20% urea-PAGE分析之。
核酸為DNA
本實驗是依實施例10之結論而設計的。先將900 pmol 5’-胱胺-3’primer DNA溶於22.5微升緩衝液(pH 7.3)，而此緩衝液的成分有600mM EPPS，並加入90微升AMAS(10mM，溶於二甲基亞碸)，之後用錫箔紙包好，於室溫下搖晃反應90分鐘。反應得到的5’-AMAS-胱胺-3’primer DNA經酒精沉澱後，回溶於50微升緩衝液(pH 7.3)，而此緩衝液的成分有600mM EPPS，並加入50微升EcCPP-3胜肽(360μM，溶於焦碳酸乙二酯)，於室溫下搖晃反應16小時。反應得到的5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-3’primer DNA經酒精沉澱後，回溶於5% Triton X-100中，並以20% urea-PAGE分析之。
如第10圖所示，得到的5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-核酸具有約59-75%的產率。
值得提出的是，本實施例的優點在於：(1)過去文獻已知含雙硫鍵的物質較容易被攝入細胞，因此透過5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-核酸之胱胺的雙硫鍵有助於其攝入細胞；(2)5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-核酸的雙硫鍵於細胞內容易還原斷裂，因而有助於細胞內釋放核酸；(3)相較於實施例9提出的方法，本實施例提出之方法使用的胜肽相對於核酸的比例相對地低。
【實施例12：細胞毒性分析】
本實驗係利用MTT(3-(4,5-cimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)分析法觀察實施例9的5’-Tat48-57 -3’primer DNA對細胞存活的影響。如第11圖所示，以高濃度5’-Tat48-57 -3’primer DNA處理人類A549細胞24小時後，我們發現其對A549細胞仍無明顯的細胞毒性。
【實施例12：ex vivo細胞攝入分析】
本實驗係利用流式細胞儀及螢光顯微鏡觀察實施例9之5’-Tat48-57 -3’primer DNA對細胞攝入的影響。如第12圖所示，以5μM 5’-Tat48-57 -3’primer DNA處理人類A549細胞24小時後，我們發現其已成功地攝入A549細胞內。
上述實施例僅例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改與變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後述之申請專利範圍所列者。
第1圖係8% urea-PAGE的分析結果，以說明不同共溶質對RNA共軛物產率的影響；其中，數字1：尿素；數字2：Tween 20；數字3：Triton X-100；數字4：PEG 6000；數字5：PEG 8000；數字6：丙三醇；箭頭a：RNA； 箭頭b：5’-化合物1d-RNA。
第2圖係20% urea-PAGE的分析結果，以說明不同共溶質對DNA共軛物產率的影響；其中，實心方塊：尿素；三角：Tween 20；空心圓：Triton X-100；橢圓：PEG 6000；實心圓：PEG 8000；空心方塊：丙三醇。
第3圖係8% urea-PAGE的分析結果，以說明不同咪唑衍生物對RNA共軛物產率的影響；其中，數字1：4(5)-羥基甲基咪唑；數字2：2-乙基咪唑；數字3：2-乙基-4-甲基咪唑；數字4：4(5)-甲基咪唑；數字5：2-甲基咪唑；數字6：4-甲基-5-咪唑甲醇鹽酸鹽；箭頭a：RNA；箭頭b：5’-化合物1d-RNA。
第4圖係20% urea-PAGE的分析結果，以說明不同咪唑衍生物對DNA共軛物產率的影響；其中，數字1：4(5)-羥基甲基咪唑；數字2：2-乙基咪唑；數字3：2-乙基-4-甲基咪唑；數字4：4(5)-甲基咪唑；數字5：2-甲基咪唑；數字6：4-甲基-5-咪唑甲醇鹽酸鹽；箭頭c：DNA；箭頭d：5’-化合物1d-DNA。
第5圖係20% urea-PAGE的分析結果，以說明不同反應溫度對DNA共軛物產率的影響；其中，箭頭a：DNA；箭頭b：5’-化合物1d-DNA。
第6圖係8% urea-PAGE的分析結果，以說明不同親核劑對RNA共軛物產率的影響；其中，數字1：化合物1d；數字2：化合物2a；數字3：化合物2e；數字4：化合物2f；箭頭a：RNA；箭頭b：5’-化合物2a-RNA；箭頭c：5’-化合物6a或6b-RNA；箭頭d：5’-化合物1d-RNA。
第7圖係20% urea-PAGE的分析結果，以說明不同親核劑對DNA共軛物產率的影響；其中，數字1：化合物1d；數字2：化合物2a；數字3： 化合物2e；數字4：化合物2f；箭頭e：DNA；箭頭f：5’-化合物2a-DNA；箭頭g：5’-化合物6a或6b-DNA；箭頭h：5’-化合物1d-DNA。
第8圖係urea-PAGE的分析結果，以說明核酸共軛物的產率；其中，箭頭a：DNA；箭頭b：5’-Tat48-57 -DNA；箭頭c：RNA；箭頭d：5’-Tat48-57 -RNA。
第9圖係20% urea-PAGE的分析結果，以分別說明胱胺、AMAS及有半胱胺酸的胜肽相對於DNA之莫耳比對核酸共軛物產率的影響；其中，箭頭a：DNA；箭頭b：5’-胱胺-DNA；箭頭c：5’-化合物4a-胱胺-DNA；箭頭d：5’-化合物4c-AMAS-胱胺-DNA。
第10圖係20% urea-PAGE的分析結果，以分別說明核酸共軛物的產率；其中，箭頭e：DNA或RNA；箭頭f：5’-胱胺-DNA或RNA；箭頭g：5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-DNA；箭頭h：5’-EcCPP-3-AMAS-胱胺-RNA。
第11圖係MTT分析法的結果，以說明核酸共軛物對細胞存活的影響。
第12圖係流式細胞儀及螢光顯微鏡的分析結果，以說明核酸共軛物對細胞攝入的影響。
<110> 高雄醫學大學
<120> 核酸共軛物的液相合成法
<160> 5
<210> 1
<211> 87
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMP-primed TW17 RNA
<400> 1
<210> 2
<211> 17
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMP-primed TW171-17 RNA
<400>2
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3’primer DNA
<400> 3
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人類免疫缺陷病毒
<220>
<223> Tat48-57
<400> 4
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EcCPP-3
<400> 5

Claims (9)

  1. 一種核酸共軛物的合成法，係包括：於一第一緩衝液存在下，一核酸與一咪唑衍生物進行第一反應，使該咪唑衍生物鍵結於該核酸5’端，而得到一5’-咪唑衍生物-核酸；其中，該第一緩衝液至少包含1-(3-二甲基胺基丙基)-1-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-1-ethylcarbondiimide hydrochloride，EDC)，而該咪唑衍生物為4(5)-甲基咪唑(4(5)-methyl imidazole)；以及於一第二緩衝液存在下，該5’-咪唑衍生物-核酸與一親核劑進行第二反應，使該親核劑取代該5’-咪唑衍生物-核酸中的咪唑衍生物鍵結於該5’-咪唑衍生物-核酸中的核酸5’端，而得到一5’-親核劑-核酸；其中，該第二緩衝液至少包含乙二胺四乙酸(EDTA)及4-(2-羥基乙基)哌嗪-1-丙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-propanesulfonic acid，EPPS)，而該親核劑至少具有一-NH2 基，並以一由該-NH2 基形成的-NH-鍵鍵結於該5’-咪唑衍生物-核酸中的核酸5’端。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之合成法，其中該核酸為去氧核糖核酸(DNA)時，該第一緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質；該核酸為核糖核酸(RNA)時，該第一緩衝液含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之合成法，其中該核酸為DNA時，該第二緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質；該核酸為RNA時，該第二緩衝液含選自尿素、Tween 20、 Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之合成法，其中該親核劑係為胜肽、蛋白質或螢光標記。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之合成法，其中該核酸係為DNA。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之合成法，其中該該第一緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質，且該第二緩衝液不含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質。
  7. 如申請專利範圍第4項所述之合成法，其中該核酸係為RNA。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之合成法，其中該第一緩衝液含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質，而該第二緩衝液含選自尿素、Tween 20、Triton X-100、PEG 6000、PEG 8000或丙三醇的共溶質。
  9. 一種核酸共軛物的合成法，係包括：於一第三緩衝液存在下，如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的5’-親核劑-核酸與N-順丁烯二醯基胺基酸丁二醯亞胺酯(N-maleoyl amino acid succinimidyl ester，AMAS)進行第三反應，使該AMAS鍵結於該5’-親核劑-核酸中的親核劑，而得到一5’-AMAS-親核劑-核酸；其中，該第三緩衝液至少包含EPPS；以及於一第四緩衝液存在下，該5’-AMAS-親核劑-核酸與一有半胱胺酸的胜肽進行第四反應，使該胜肽藉由其半胱胺酸與該5’-AMAS-親核劑-核酸中之AMAS的馬來醯亞胺基團(maleimide group)作用並鍵結於該 5’-AMAS-親核劑-核酸中的AMAS，而得到一5’-胜肽-AMAS-親核劑-核酸；其中，該第四緩衝液至少包含EPPS。
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Ghosh et. al.,"Use of Maleiimide-Thiol Coupling Chemistry for Efficient Syntheses of Oligonucleotide-Ezyme Conjugate Hybridization Probes",Bioconjugate Chem,1990,1,71-76. *

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