TWI458973B - 用於液相層析系統及毛細管電泳層析系統的堅固的毛細管管柱及穿隧式擋板之組合及其製造方法、分離物質以進行分析之系統及方法 - Google Patents
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Description
本發明係關於一種液相層析管柱的製作,特別關於一種用於超高效能液相層析管柱的製作。
蛋白質體學的新發現對於生物標記、藥物的發展及其相關研究帶來新的曙光。近來,液相層析質譜儀(LC-MS)成為鑑定蛋白質的主要方法之一。在液相層析系統中,藉由填充具有化學官能基的靜相顆粒於管柱中,樣品內的化合物將會與此些靜相顆粒進行吸附作用。利用沖提動相溶液於填充管柱中,可使得不同的化合物因與靜相顆粒和動相溶液的不同競爭作用力,而可以將樣品內的不同化合物依序沖提出管柱做樣品分離,並於後端銜接上質譜儀偵測器做分子偵測。至今,液相層析質譜儀技術的發展已被廣泛的應用在蛋白質體的研究領域中。結合蛋白質分離、同位素標定及液相層析質譜儀等技術,在短時間內即可進行大量蛋白質的鑑定及定量。在液相層析質譜儀中,在液相層析分離時的高解析度及高靈敏度是普遍在進行蛋白質體定性及定量的決定因素。當液相層析質譜儀應用於蛋白質領域時,由於毛細管液相層析管柱對於胜肽具有高解析分離度,所以此種毛細管液相層析管柱是液相層析質譜儀中不可或缺的元件。
針對應用於蛋白質體的毛細管式液相層析質譜儀而言,在液相層析系統中具有前端的樣品捕捉式管柱(trap column)以及後端的分析式管柱(analytical column)。捕捉式管柱對於液相層析質譜分析系統是相當重要的元件。捕捉式管柱通常為一內徑較大(100~300 μm)但較短的毛細管管柱(1 cm~2 cm),管柱內需填充靜相顆粒。此捕捉式管柱之主要目的為將樣品前濃縮及去鹽以利後端的分析式管柱進行分析。因此奈米流速級的液相層析質譜分析系統的分析式管柱的上游通常係設置一分析物捕捉式管柱。然而,捕捉式管柱常在大量樣品分析後,因樣品溶液中的無法溶解物質或粒子未移除完全而導致管柱的阻塞。或是在多次樣品分析之後因樣品的汙染而導致濃縮倍數降低。而分析式管柱也常因樣品的汙染導致分離效率的降低。因此,奈米流速級的液相層析質譜分析系統的填充式管柱必須常常更換以維持實驗數據品質。因此,毛細管填充管柱對於一個需要常常分析蛋白質樣品的實驗室來說,是一項極大的花費。
為了將靜相粒子保留在毛細管管柱內,通常可使用一端拉尖方式(尖頭)或使用擋板設計的毛細管管柱。所謂「尖頭(tapered tip)」,意指將毛細管柱兩端施以拉力,並用雷射或是火焰照射毛細管某一段區域,該處將因受力與受熱同時作用而逐漸由內徑為75 μm或50 μm縮小成內徑為10-20 μm的尖頭端,以形成拱心石效果(keystone effect)來保留住靜相粒子。尖頭式毛細管的製作簡單且可減少管柱連接處可能產生的死腔體積(dead volume),進而降低由於縱向擴散所造成之樣品帶擴張(band broadening)。且此尖頭可以直接當作電噴灑頭,利用加電壓方式使毛細填充管柱流出液進行電噴灑,將分析物離子化後送入質譜儀分析。然而,在使用一段時間之後,一但尖頭端受到破壞或污染,必須置換整根填充式管柱以維持穩定及靈敏的電噴灑游離效率。此外,此種尖頭式管柱因一頭的尖頭端易碎而無法鎖入管柱連接系統,因此只適用於後端的分析式管柱製備,而無法應用於前端樣品捕捉式管柱的製備。相較之下,使用含擋板(frit)的管柱來保留填充物對於填充分析式管柱及捕捉式管柱皆有極大的好處。在含擋板之管柱設計中,可將矽膠顆粒送入毛細管中,並在毛細管的末端以高溫燒結的方式使管柱內的矽膠顆粒產生熔結並固定於毛細管中。然而在高溫燒結方式中,使石英玻璃毛細管具有可彎曲性的聚亞醯胺樹脂(polyimide)表面塗層會因高溫被去除,使得毛細管在該處相當脆弱而易折斷。為保留管柱的聚亞醯胺樹脂塗層以維持管柱的可彎曲性與強度,另一種擋板製作方式為,利用矽酸鉀、矽酸鈉溶液或其它溶膠凝膠溶液送入管柱的一小段區域,並以高溫烘烤方式使此溶液進行溶膠-凝膠作用(sol-gel reaction)以與毛細管壁鍵結並由縮合反應形成高密度網狀固體結構而形成擋板並固定於毛細管中(J. High Resol Chro,1999,22,438: Anal. Chem. 2003,75,4292)。由於上述兩種擋板式填充管柱的一端皆設有擋板,所以可以將填充物質反向沖出再更換新的填充物質後重複使用。
然而,目前擋板的製造技術上並無一個具有高度再現性的方法,如此將會導致管柱分離效能不一致,以及管柱製作不易。
近來,將乾燥的含矽樹脂混合溶膠-凝膠溶液並送入毛細管管柱中,即可開發出一種簡單、低背壓(backpressure)及低成本的擋板製備方法(Proteomics 2008,8,1758)。但此種擋板會因無法承受高壓而被沖出。
在奈米流速級液相層析質譜分析系統(nano-LC-MS)或奈米流速級超高效能液相層析質譜分析系統(nano-UPLC-MS)中,由於使用粒徑為3 μm或1.7 μm,孔徑100的粒子,因此會造成約5,000到9,000 psi之間極高的管柱背壓。為因應如此高壓的系統,製造捕捉式管柱時,捕捉式管柱必須具備某些特殊的性質。首先,在超高壓供應的情況下,在管壁一端必須保留完整的聚亞醯胺樹脂的塗層以防止管柱在鎖上連接系統時斷裂。此外,對於超高壓的阻力,擋板需具有高機械強度與低背壓特性以減少靜相顆粒填充管柱時的難度。
有鑑於上述課題,本發明之目的為提供一種用於在填充管柱中形成具高再現性、高機械強度及低背壓之擋板的新方法及手段。本發明為一擋板中有一通道可以連接管柱內與管柱外。此種穿隧式擋板(tunneled frits)的捕捉式管柱(trap columns)或分析式管柱(analytical columns)係能應用於液相層析系統,包含超高壓系統(UPLC)及應用於毛細管電泳(CE)系統等,以分離及解析各種胜肽或是化合物。
在一實施態樣中,本發明係關於一種堅固的毛細管管柱(capillary column),其適用於在管柱一端具有一穿隧式擋板的奈米流速級超高效能液相層析儀(nanoflow UPLC)系統。穿隧式擋板能相對地具產生低背壓特性並用以滯留住靜相顆粒於管柱中。經過固化(curing)適當含有矽或其他可聚合的物質之溶膠-凝膠混合物(sol-gel mixture),以形成一堅硬、緊密的擋板並與毛細管管壁鍵結,同時擋板本身具有一可連通管柱內部及外部之一通道(tunnel)。以適當的材料製成的一金屬線係被用於產生連通毛細管管柱內部及外部的通道,金屬線在後續的製程中會被抽出。較佳地係以直徑介於15 μm及25 μm之間的一鎢線來產生通道。通道的內徑係相對地小於擋板的內徑,且較佳地,通道的內徑與擋板的內徑之比值係介於0.07至0.3之間。操作時,捕捉式管柱或分析式管柱與穿隧式擋板結合後對於微米流速及/或奈米流速之LC的分離時能支撐高達11,000 psi的壓力。
在本發明另一實施態樣中,另提供一種堅固的且適用於奈米流速或微米流速之LC系統的毛細管管柱之製造方法。一般來說,任何聚合反應或燒結的方法及材料可被用於製造一具有一通道之擋板或孔洞,其中,通道的內徑係小於管柱之內徑,且該擋板能保留住管柱內的粒子或填充物。因此,一種合適的金屬線插入毛細管管柱之一端。一合適的溶膠-凝膠係於金屬線周圍產生反應或發生聚合,使溶膠-凝膠充滿在毛細管管柱之一端並與毛細管管柱形成鍵結。之後,移除金屬線,以產生連通毛細管管柱內外的一通道,藉以形成穿隧式擋板。擋板可以是自任何適合的聚合物或燒結材料(sintering material)所生成。較佳地,所使用之溶膠-凝膠包含無機樹脂材料及預聚合物(pre-polymers)及其他適合的材料如填充物質、光聚合物質如烷氧化物(alkoxides),烷氧化物溶液會進行一般所熟知的聚合反應,當固化時會產生緊密的石英玻璃(dense silica glass)或聚合物。舉例來說,鎢線能維持其本身形狀,因此當它自擋板中抽取出來時能產生一合適的通道。其他具有與鎢線相似性質之其他材料亦包含於本發明所涵蓋的範圍中。
在毛細管管柱一端所形成的穿隧式擋板係較佳地在一稍高的溫度下固化而成,較佳地係介於50-90℃之間,最佳地係在介於50-70℃之間的溫度維持數分鐘(約10-60分鐘之間)直到擋板生成。之後,穿隧式擋板以一高溫進行熱處理,較佳地係介於50至120℃,而最佳地係介於75-100℃之間作用約4到50小時,其視將擋板完全固化之需要來決定。
實際上,依據本發明所製成之穿隧式擋板係可用於11,000 psi壓力的UPLC系統。由此可證,擋板係堅固的且可持續使用。
在本發明又一實施態樣中,係提供一種分離胜肽的方法,包含在一高壓下將含物質之胜肽通入一填充式毛細管管柱,且管柱內的填充物係被保留並且透過管柱一端的穿隧式擋板維持低背壓。然後根據已知的技術對取得的不同片段進行分析。
在另一實施態樣中,本發明揭露利用一種非金屬製的擋板,相較於習知技術金屬製之擋板可增進偵測磷酸化胜肽時之靈敏度。
在本發明另一實施例中,本發明係提供了一種系統係包含至少一作為捕捉式管柱之毛細管管柱及至少一作為分析式分離管柱之毛細管管柱,其中,這些毛細管管柱其中之一或兩者的一端係具有穿隧式擋板。
以下將參照相關圖式,說明依本發明較佳實施例之低背壓且堅固的管柱內穿隧式擋板並可用於超高效能液相層析管柱的製作。
甲醯胺(formamide)購自RDH Chemicals(Poole,UK)。矽酸鉀(potassium silicate)購自PQ Corporation(Valley Forge,PA)。以LC-MS分析時,含有0.1%甲酸(formic acid,LC-MS grade,J. T. Baker,Phillipsburg,NJ)的乙腈(acetonitrile,ACN)以及含有0.1%甲酸的水作為流動相(mobile phase)。去離子水(18.1 MΩ‧cm電阻率)係以Milli-Q system(Millipore,Bedford,MA)製備,使用於全程的實驗。
圖1係為穿隧式擋板製作之流程圖。首先製作一捕捉式管柱。將直徑18 μm的鎢線11前5 mm長度插入毛細管管柱12的一端(8-10 cm,365 μm od,180 μm id)(步驟S1)。一直徑為15 μm的鎢線11則係用於製作一分析式管柱的穿隧式擋板(35 cm,365 μm od,75 μm id,Polymicro Technologies,Phoenix,AZ)。將矽酸鉀及甲醯胺混合溶液震盪混合1分鐘。製成溶膠-凝膠混合物13後取2 μL滴在毛細管管柱12的一端(步驟S2)。請同時參照圖2所示,藉由毛細作用,溶膠-凝膠混合物13的溶液會沿插入的鎢線11往毛細管管柱12內移動(如圖2(a)所示),但必須注意的是,溶膠-凝膠混合物13在毛細管管柱12內移動的距離不要超過鎢線11插入的長度。當溶膠-凝膠混合物13形成並且在60℃下作用20-30分鐘後,一個明顯的通道14(約20 μm)會清楚地呈現在擋板13’內(如圖2(b)所示)。毛細管管柱12在進行80℃隔夜處理前,將鎢線11自毛細管管柱12中拉出(步驟S3)。接著,具有穿隧式擋板13,的毛細管管柱12連接一幫浦並通入甲醇,流速控制在0.1 mL/分鐘做清洗動作。擋板13’的長度可藉由顯微鏡下觀察測得(如圖2(c)所示)。最後,從毛細管管柱12另一端填充靜相顆粒15(步驟S4)。
具穿隧式擋板13’的填充管柱套設在壓力槽(pressure vessel)中。用於填充捕捉式管柱的靜相粒子溶液係將2 mg,粒徑為5 μm之靜相顆粒(Symmetry C18,5 μm,Waters,Milford,MA)15溶於1 mL甲醇,而用於分析式管柱的靜相粒子溶液(BEH C18,1.7 μm,75 μm×250 mm,Waters,Milford,MA)溶於1 mL甲醇中,兩者以超音波震盪5分鐘以避免粒子聚集,接著轉移到壓力槽中,以壓力管連接到氮氣瓶。一旦高壓氮氣開始供應(對分析式管柱係供應1,000 psi,而捕捉式管柱係供應300 psi),C18靜相粒子(ODS particles)15係被灌入毛細管管柱12並被保留在管柱12中。填充一特定長度後(捕捉式管柱填充2 cm,分析式管柱填充約25 cm),填充好的管柱自壓力槽上卸除並供後續使用。
液相層析質譜分析係以奈米流速LC系統(nanoACQUITY UPLC,Waters,Millford,MA)連接三段四級棒式飛行時間質譜儀(hybrid Q-TOF mass spectrometer,Synapt HDMS,Waters,Manchester,U.K.)進行。烯醇酶經過胰蛋白酶水解之胜肽片段(tryptic enolase)係被分別注入一商業化之捕捉式管柱及穿隧式擋板捕捉式管柱,並以5 μL/分鐘之流速進行前濃縮,並同時以一反相商業化分析式管柱(reverse-phase analytical column)或一穿隧式擋板分析式管柱進行樣品分離,以300 nl/分鐘流速由A溶液(100%水+0.1%甲酸)與B溶液(100%乙腈+0.1%甲酸)做連續梯度沖提。在23分鐘內由12%濃度的B溶液(含88%的A溶液)上升到80%濃度的B溶液(含20%的A溶液)通入管柱中。
根據毛細管管柱的內徑,通道的內徑被認為與管柱填充時的「拱心石」效果有關。對於內徑大於75 μm(正常情況下係用於捕捉式管柱)的毛細管管柱而言,需以直徑18 μm的金屬線來製造內徑為18 μm的通道。對於內徑小於75 μm(正常情況下係用於分析式管柱)的毛細管管柱,建議使用直徑15 μm而非18 μm的鎢線,因為內徑15 μm的通道對於內徑較小的毛細管管柱可產生較為顯著的拱心石效果。以長約2 mm的穿隧式擋板通以流速0.1 mL/分鐘的甲醇所測得的背壓係為一可再現的數值約為120-160 psi(n=5),此數值相似於內徑為20 μm(背壓約為116 psi)及內徑為15 μm(背壓約為160 psi)的毛細管管柱所產生之背壓。這說明了,擋板內通道內徑的大小受金屬線直徑所決定,且其測量值可藉由計算具穿隧式擋板的管柱之擋板長度來推得。此外,也可藉由切去管柱的出口端並磨平以減緩在管柱連接時死腔體積所導致的峰帶變寬(peak broadening)程度來決定擋板長度。除最後在烘箱中進行固化的培養時間外,穿隧式擋板的製造過程快速,並可同時進行多個穿隧式擋板的製造。因此,本發明提供一種簡單及可大量生產並具高度再現性及機械穩定的穿隧式擋板-毛細管管柱。
當固定相中的粒子大小逐漸由5 μm縮小為1.7 μm,可獲得較高的分離解析度(separation resolution)、峰強度(peak intensity)及峰容量(peak capacity),因此可改善偵測微量蛋白質或胜肽混合物之靈敏度。當固定相粒子縮小到1.7 μm時,所使用的分析式管柱的填充長度為25公分情況下,在標準操作流速300 nL/分鐘時,幫浦壓力將會提升至9,000 psi。因此為測試穿隧式擋板在此超高壓力下的穩定性,利用穿隧式擋板捕捉式管柱(以C18粒子填充2cm)並透過超高壓微密封管套(micro tight union,UH-432,IDEX Health & Science,Oak Harbor,WA)連接於超高壓幫浦做壓力測試。如圖3所示,以溶劑50%甲醇,流速為50 μL/分鐘流通,對於此穿隧式擋板填充管柱產生11,000psi背壓(最大壓力測試值)。液流可以持續超過一週卻無任何粒子流失及壓力不穩定的現象。在如此高的壓力下所保持的穩定度說明了穿隧式擋板的高物理性強度係適用於超高壓系統及如分析蛋白質體學的奈米流速級-UPLC-MS及代謝質體學的UPLC-MS等方面之應用。
裝備用於奈米流速級超高壓液相層析系統的捕捉式管柱,所有的接頭及套接管均必須係能容忍超高壓力。為能方便地更換捕捉式管柱,裝置係如圖4所示。在此設計中,兩個可耐超高壓力的毛細管柱連接套件(UH-432)461係用於連接捕捉式管柱47。為避免峰帶變寬,分別於分析式管柱48分離時的上游及下游使用一死腔體積為零的T形管462及ZDV管套463,最後噴霧尖端(spray tip)係對準質譜儀入口MS。相較於置換商業化的捕捉式管柱,本發明之捕捉式管柱的置換係既簡單又快速,僅需透過微密封套件的動作。藉由偵測流動相的組成及流速所造成之背壓來檢測系統中是否有液體洩漏。若無任何液體洩漏,則即使把接頭調緊背壓也不會再上升。利用99%水,流速300 nL/分鐘之條件流通捕捉式管柱及分析式管柱的情況來說,幫浦的壓力會上升至8,000-8,400 psi,此壓力與使用商業化的捕捉式管柱系統時相同。
為示範穿隧式擋板應用於捕捉式管柱之可行性,將經過胰蛋白酶(trypsin)消化的烯醇酶(enolase)胜肽片段以奈米流速級UPLC-MS系統進行分析。如圖5(a)及圖5(b)所示,分別係以相同的靜相顆粒來填充的商業化捕捉式管柱及具穿隧式擋板的捕捉式管柱,兩者並分別接於相同的分析式管柱上,進行樣品分析。如預期,兩種系統的分析結果係相似的,但穿隧式擋板捕捉式管柱的停滯時間延遲了1分鐘,這可歸因於相較於商業化的捕捉式管柱(180 μm id,管柱長2 cm,2 cm填充長度),穿隧式擋板捕捉式管柱(180 μm id,管柱長4 cm,填充長度2 cm)的多餘體積造成溶劑梯度的延遲。將穿隧式擋板捕捉式管柱連續批次的操作結果與商業化的捕捉管柱相比較。結果如表1所示,由所選的峰來看,其峰強度及半高峰寬具有高度再現性。此外,穿隧式擋板管柱以約0.5 mm及3 mm的擋板長度對胜肽進行分析的結果發現無任何差異。穿隧式擋板管柱的管柱與管柱(column-to-column)之間分析,峰1的滯留時間(retention time)、峰強度及半高峰寬的相對標準偏差值(RSD,n=3)係分別為2.1%、4.75%及9.77%。捕捉式管柱製程的高再現性說明穿隧式擋板填充管柱對於奈米流速級UPLC-MS系統係相當具可行性的。
表1
針對商業化之捕捉式管柱及穿隧式擋板捕捉式管柱的批次與批次之間分析之滯留時間、強度及半高峰寬之相對標準偏差。
以先前預備好的粒徑1.7 μm之C18粒子作為固定相。以75 μm內徑大小的毛細管管柱作為分析式管柱。利用直徑15 μm的鎢線來製造具有內徑為15 μm通道的擋板。先以粒徑5 μm C18粒子填充管柱約達5 mm長度,再以粒徑1.7 μm的粒子填充25 mm長度的管柱。如圖6(a)及圖6(b)所示,對烯醇酶胜肽片段進行分離,穿隧式擋板分析式管柱之分析結果(如圖6(b))與購買使用BEH C18(1.7 μm,75 μm×250 mm,Waters)的商業化分析式管柱所獲得分析結果(如圖6(a))為相似(如表2所示)。使用長度介於1 mm至3 mm的穿隧式擋板對於分離效率並無顯著的影響。高再現性的分析結果說明穿隧式擋板分析式管柱的穩定及堅固特性。
表2
針對商業化之分析式管柱及穿隧式擋板分析式管柱的批次與批次之間分析之滯留時間、強度及半高峰寬之相對標準偏差。
因磷酸化胜肽上帶負電的磷酸基會與金屬吸附,此特性被用以開發出磷酸化胜肽的純化方法如二氧化鈦(TiO2
)及固定相金屬親和層析(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)等技術。因大多數商業化捕捉式管柱係使用不銹鋼擋板,但是否使用不鏽鋼擋板會吸收磷酸化胜肽並降低質譜訊號仍是個疑慮。四種合成的磷酸化胜肽混合烯醇酶胜肽片段(product No.186003286,Waters)被用於測試商業化之捕捉式管柱及穿隧式擋板捕捉式管柱。如圖7所示,將所得磷酸化胜肽訊號均整除於一內標物(非磷酸化胜肽,643.9m/z)。與商業化的捕捉式管柱相比,使用穿隧式擋板捕捉式管柱能增強磷酸化胜肽訊號約1.2(684.8m/z)~1.7倍(432.2m/z)。穿隧式擋板捕捉式管柱中使用非金屬擋板,避免了磷酸化胜肽被金屬製的擋板吸收的現象,因而增進磷酸化胜肽偵測的靈敏度。
藉由使用金屬線輔助(wire-assisted)及溶膠-凝膠方法,發展出一種簡單、低背壓及高再現性的穿隧式擋板方法。從穿隧式擋板捕捉式管柱的應用結果來看,穿隧式擋板捕捉式管柱經填充在以2 cm管柱長的粒徑5 μm的靜相顆粒之後,其可承受高達11,000 psi的壓力。在分析蛋白質水解產物中,穿隧式擋板捕捉式管柱及穿隧式擋板分析式管柱均具有與商業化系統相同的分析結果。據了解,本說明書係首先揭露關於管柱上擋板的製造方法、最終的穿隧式擋板及在UPLC的應用,並同時兼具了新穎性及進步性。穿隧式擋板成功地應用在奈米流速級UPLC-MS,實質上對於研究蛋白質體學的實驗室來說能減少在捕捉式管柱及分析式管柱上的花費成本,並同時增進偵測磷酸化胜肽的靈敏度。穿隧式擋板的方法及手段可廣泛地被應用於其他色層分析濃縮或分離領域中的填充管柱。
以上所述僅為舉例性,而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇,而對其進行之等效修改或變更,均應包含於後附之申請專利範圍中。
11...鎢線
12...毛細管管柱
13...溶膠-凝膠混合物
13’...擋板
14...通道
15...靜相粒子
461...毛細管柱連接套件
462...T形管
463...ZDV管套
47...捕捉式管柱
48...分析式管柱
MS...質譜儀入口
S1~S4...步驟
圖1為本發明穿隧式擋板製備的流程圖;
圖2為本發明之穿隧式擋板之顯微照相片:(a)鎢線(18 μm)係嵌入毛細管管柱(180 μm id,365 μm od)的溶膠-凝膠溶液中;(b)在溶膠-凝膠混合物反應後形成通道;以及(c)填充管柱的出口端;
圖3顯示本發明之捕捉式管柱的穿隧式擋板在幫浦超高壓力下長時間穩定度測試結果;
圖4為本發明用於一奈米流速級-UPLC-MS系統中具有穿隧式擋板的捕捉式管柱的示意圖;
圖5烯醇酶(enolase)胜肽片段(50 fmol)以奈米流速級-UPLC-MS分析所得到的液相層析圖之基峰的示意圖,其中圖5(a)及圖5(b)分別表示將商業化的捕捉式管柱或具有穿隧式擋板的捕捉式管柱設置在商業化的分析式管柱的上游處的分析結果;
圖6烯醇酶胜肽片段(50 fmol)以奈米流速級-UPLC-MS分析所得到的液相層析圖,其中圖6(a)及圖6(b)分別表示使用商業化分析式管柱與穿隧式擋板之分析式管柱的分析結果;以及
圖7為使用商業化捕捉式管柱及穿隧式擋板捕捉式管柱分析四種合成之磷酸化胜肽的分析結果,其中,每個磷酸化胜肽係與作為內標物的非磷酸化胜肽訊號(643.9 m/z)相除後求得一相對比值。
11...鎢線
12...毛細管管柱
13...溶膠-凝膠混合物
13’...擋板
14...通道
15...靜相粒子
S1~S4...步驟
Claims (18)
- 一種組合,係用於一液相層析系統及一毛細管電泳層析系統,包含:一毛細管管柱,用於容納靜相粒子;以及一穿隧式擋板,設置於該毛細管管柱一端,以便保留靜相粒子於該毛細管管柱中,其中,該液相層析系統係包含一超高壓液相層析系統,且該液相層析系統及該毛細管電泳層析系統係進行奈米流速及/或微米流速層析。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合,其中該穿隧式擋板包含一通道,連通該毛細管管柱之內部及外部。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合,其中該穿隧式擋板係形成並固化於該毛細管管柱中適當位置使形成一堅固鍵結以支撐一超高壓力。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合,其中該穿隧式擋板係包含石英玻璃材料及其他聚合材料。
- 如申請專利範圍第3項所述之組合,其中該超高壓力係高達11,000 psi。
- 如申請專利範圍第2項所述之組合,其中該通道對該擋板之內徑比例係介於0.07到0.3之間。
- 如申請專利範圍第1項所述之組合,其中該毛細管管柱含有一固定相填充物。
- 一種堅固的毛細管管柱之製造方法,該毛細管管柱係用於進行奈米流速與微米流速之超高效能液相層析系統,其步驟包含:提供一毛細管管柱;將一耐熱之金屬線插入該毛細管管柱一端一預設距離;以一未固化之材料與該毛細管管柱該端接觸,使該未固化之材料滲透至該毛細管管柱內但不超過該金屬線之深度;當該未固化之材料已設置好後移除該金屬線;以及固化該材料以形成一穿隧式擋板與該毛細管管柱產生一耐高壓之鍵結。
- 如申請專利範圍第8項所述之堅固的毛細管管柱之製造方法,其中該耐熱之金屬線係包含鎢。
- 如申請專利範圍第8項所述之堅固的毛細管管柱之製造方法,其中該未固化之材料係包含一溶膠-凝膠混合物、樹脂粒子、或其他可聚合之材料。
- 如申請專利範圍第8項所述之堅固的毛細管管柱之製造方法,其中該未固化之材料係先以介於50至90℃間之一溫度設置。
- 如申請專利範圍第8項所述之堅固的毛細管管柱之製造方法,其中該固化該材料係於一高溫下進行。
- 如申請專利範圍第12項所述之堅固的毛細管管柱之製造方法,其中該固化該材料係於一介於50℃及120℃之間之溫度下進行。
- 一種分離蛋白質物質用以進行分析之方法,包含:將含物質之一蛋白質在一高溫下通過一填充毛細管管柱,其中該毛細管管柱之一端係具有一穿隧式擋板。
- 如申請專利範圍第14項所述之方法,其中該毛細管管柱係包含一非金屬製之擋板。
- 一種用以分離物質以進行分析之一系統,包含:一捕捉式管柱以及一分析式管柱,其中該等管柱至少其中之一係具有一穿隧式擋板。
- 如申請專利範圍第16項所述之系統,係用於高達11,000 psi之超高壓力下操作及用於奈米流速或微米流速之液相層析之分離。
- 一種穿隧式擋板之製造方法,包含:於一金屬線周圍聚合或燒結一可聚合材料,使當該金屬線自一毛細管管柱中抽出時,於一擋板中形成一通道或一孔洞;其中,該通道或該孔洞的內徑係小於該毛細管管柱之內徑,以使粒子及填充物被保留在該毛細管管柱中。
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