TWI457149B - 具有抑制上方靶細胞黏附的表面之基板及其製備方法 - Google Patents

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Description

具有抑制上方靶細胞黏附的表面之基板及其製備方法
本發明係廣泛地關於具有抑制上方靶細胞黏附的表面之基板。本發明也關於製備一抑制於其上之靶細胞黏附之基板的表面。
當植入一醫療裝置於一人體中時，有被人體排斥的風險，其可能以纖維化(fibrosis)、栓塞症(thrombosis)與發炎的形式發生，且可併發細菌感染。特別是，含血液醫療材料的植入可引起於血液材料之介面的栓塞，伴隨著血栓性栓塞(thromboembolic event)的相關風險。
其廣泛地認為當一將外來材料置於人體與人體接觸時，其快速吸附一層蛋白質且經由這些蛋白質至特定細胞上所媒介之一系列事件(event)導致產生，例如栓塞、發炎或排斥。這些反應之程度根據生物材料之生物相容性。
至於與血液接觸之裝置，蛋白質，例如纖維素原(fibrinogen)吸附至材料可引起血漿血小板之黏附與活化及隨之發生之凝集連鎖反應(coagulation cascade)的活化，導致凝血酶(thrombin)的產生，凝血酶為引起纖維聚合串(fibrin polymer strands)的形成且為血小板之強而有力之活化子(activator)。附著之血小板變為被活化，分泌活化另外之血小板的受體素(agonist)，且提供普及凝集連鎖反應之受質。這些糾纏的事件導致於材料表面上一穩定的血栓(thrombus)的形成，血栓由經活化之血小板彼此黏附與黏附至其他材料所組成，且由纖維聚合串所鞏固。
降低血小板吸附與活化之材料可因此促進具有經改善之血液相容性(hemocompatibility)的醫療器材的發展。多樣的生物相容聚合材料被使用於與血液接觸之裝置中。為了提供它們的使用與此種應用中，這些材料可遭受表面保護(passivation)處理以增加其生物或血液相容性。表面保護處理的例子包括以一碳之無機塗層覆蓋、使用生物巨分子(biomacromolecule)之片段的生物活化(bioactive)塗層、藉由使用長鏈親水分子，如聚氧化乙烯(poly(ethylene oxide),PEO)刷狀物(brushes)之共價連結的塗層的形成、聚合物表面之化學組合物修飾、以可控制位置與大小之生物分子的固定(immobilization)、離子植入與接枝聚合。然而，於使用塗層中的限制之一為，其在血流中之剪應力(shear stress)的分層(delamination)，且因此導致下游併發症(complication downstream)。此外，這些塗層之成本與複雜度會使控制認可之製程更複雜化。仍然沒有發展至今之人工表面對於血液為完全惰性(inert)。為了避免栓塞症(thrombosis)與血栓性栓併發症，具有醫療植入物之病患必須遭受抗凝血治療(anticoagulant therapy)，其輪到導致不受歡迎的副作用。
使用表面化學修飾之替代方案係於血液接觸之醫療裝置之表面上產生地形的(topographic)結構。藉由使用膠體衍生地形(colloidal-derived topographies)與無法溶混之聚合物混合物之聚合物分層(demixing)可產生此種表面。然而，使用這些製程之所形成結構一般為隨機結構，於一批與一批裝置間具有不固定之高度與寬度，導致與血小板黏附之程度相關之再現性與不確定性問題。修飾醫療表面之表面的地形的另一方式為形成具有奈米與微米尺寸之雙級別(dual-scale)結構。然而，於經建造之表面上之血小板黏附的程度，雖然低於在原始表面上，但並非在所需要的範圍中。本技術領域中已教示一於基板表面上具有奈米級結構之另外已知的基板，然而隨著這些奈米結構的問題為它們並無顯著降低於經建構之表面之血小板黏附的程度，由於並無從頭至尾控制於基板表面上之結構的尺寸與位移。此外，為了達到血小板黏附之低程度，此已知基板為使用不會導致地形結構微型化(miniaturization)之製程來製造。雖然為了減少於醫療裝置上之血小板黏附程度已盡力降低地形結構之尺寸與參數至奈米級時，但是這些地形結構無法達到所需血小板黏附的低程度。
因此需要一經改善之基板，具有所需參數之地形結構以達到於其上之靶細胞黏附的低程度。
也需要提供依方法，其可產生一基板，其具有所需參數之地形結構，其克服或至少改善上述一或多個缺點。
根據本發明一第一態樣，提供一種基板，具有抑制上方靶細胞黏附的表面，該基板包括大致上縱向之凸出物(longitudinal projections)之一陣列，該縱向之凸出物具有自該基板之該表面延伸之一縱軸(longitudinal axis)與具有一至少2.5之圖像縱橫比(aspect ratio)，其中該陣列之相鄰的凸出物設置於該基板上以使該凸出物至少部分抑制於其上之靶細胞的黏附。
有益地，當凸出物之圖像縱橫比為2.5以上，該凸出物實質上抑制於其上之靶細胞的黏附。例如，相較於具有並無落於所定義之圖像縱橫比之此種凸出物的基板，血小板黏附至基板被實質上降低。在一實施例中，該凸出物之圖像縱橫比為於於3至20的範圍中。發明人也已發現此經選擇之圖像縱橫比的範圍為抑制細胞黏附之最理想範圍。在無受理論束縛，相信超過範圍之上限，可能發生凸出物串連以使一增加之表面區域為細胞接觸可得，反而增加細胞黏附至基板。
當圖像縱橫比低於2.5時，並無充分抑制靶細胞黏附於其上，由於凸出物並無有效避免靶細胞與其下之基板接觸。此外，凸出物變為相對不易曲折，當沒入於液體環境中時，液體環境增建立於靶細胞與凸出物或其下基板間之穩定接觸的可能。
在一實施例中，該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於靶細胞直徑的距離。有益地，當鄰接之凸出物的距離小於細胞直徑時，細胞可黏附於凸出物之間的間隔之表面的可能性大幅減低。此為由於凸出物之間的間隔之尺寸排除功效，那就是，細胞太大以致無法進入介於相鄰的凸出物間之間隔。
在一實施例中，該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於200nm或更小的距離且具有2.5與以上之圖像縱橫比。有益地，此大幅減低凸出物之間隔且圖像縱橫比不只排除整個細胞進入相鄰細胞間的空隙也減少來自細胞之偽足(pseudopod)或延伸以穩定接觸至凸出物表面與凸出物之間的間隔之表面的可能性。此幫助細胞，特別是遊走細胞(motile cell)黏附至基板之表面上的減少。發明人也驚訝地發現當凸出物被配置成彼此相隔一小於200nm或更小的距離時，與其他凸出物間距離相較，對於抑制細胞黏附，特別是血小板而言，基板為極度有效的。
在一實施例中，該基板與該凸出物之至少一個包括一生物相容聚合物。有益地，基板可被使用於要求與病患身體接觸而不引起來自病患之有害的免疫反應的應用中。例如，基板可為一植入物，其長時間被置於病患身體中，或為一導管(catheter)或管(tube)其可in vivo 或ex vivo 持續與病患體液接觸。
在一實施例中，該生物相容聚合物為熱可塑性塑膠(thermoplastic)。有益地，當生物相容材料為一熱可塑性塑膠，可輕易地利用技術，例如鑄造(casting)或奈米壓印(nanoimprinting)來形成於基板上之凸出物。更有益地，可輕易地將熱可塑性塑膠再成形(reshape)成具有高圖像縱橫比之奈米結構的凸出物，且因此當需要提升時，可將於基板上之凸出物再成形與客製化。在一實施例中，熱可塑性塑膠係擇自由聚(D,L-乳酸)(poly(D,L-lactic acid),PDLLA)、聚甘醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚(3-羥基丁酸酯)(poly(3-hydroxybutyrate),PHB)、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚(乳酸-甘醇酸)(poly(lactide-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙烯對苯二甲酸酯(poly(ethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚胺基甲酸乙酯(polyurethanes,PU)、聚氯乙烯(poly (vinyl chloride),PVC)、聚碸(polysulfones,PS)、聚醯胺(polyamides,PA)、聚縮醛(polyacetal,POM)、聚丙烯腈(polyacrylonitrile,PAN)、聚四氟乙烯(poly(tetrafluoroethylene),PTFE)、聚二甲基矽氧烷 (polydimethylsiloxane,PDMS)、環氧樹脂(epoxies)與其組合所組成之群組。
在一實施例中，該靶細胞係擇自由血栓細胞(thrombocytes)、巨噬細胞(macrophages)、樹突細胞(dendritic cells)、淋巴細胞(lymphocytes)、顆粒球(granulocytes)與細菌所組成之群組。有益地，當將基板使用於需要與血液接觸之應用中時，可抑制於病患身體中引起血液凝固(clotting)與免疫反應之在血液中出現的細胞，例如血栓細胞、巨噬細胞、樹突細胞、淋巴細胞與顆粒球黏附至基板。更有益地，此減少併發症，例如於病患中之外來體排斥(foreign body rejection)、血栓症、栓塞或感染的可能性。
在一實施例中，當受遭力時，凸出物為可曲折的，因為各凸出物之至少部分為具偏離其縱軸的能力。有益地，當將基板置於具有流體力學(fluid motion)之液體培養基中時，凸出物為可移動約它們之附著點至以偏離它們之縱軸的表面。更有益地，當置於一移動液體之途徑中時，此凸出物之彎曲移動幫助抑制細胞黏附至基板的表面上。在無受理論束縛時，相信此凸出物之彎曲移動避免細胞穩定地黏附至基板表面。此彎曲移動也有益地促進任何於基板上弱的貼附細胞的分開。因此，當將基板使用於需要與病患血流接觸之應用，例如導管或血管內管(intravascular tube)時，血流會起始凸出物之彎曲移動以藉此幫助抑制血小板黏附於基板上。更有益地，抑制於基板上之凝塊形成， 且因此避免基板功能之損傷與可發生之由於血液凝塊之可能醫學併發症。在一實施例中，該凸出物之縱軸設置在相對於該基板之平面之表面的一實質法線角(normal angle)。
在一實施例中，該凸出物具有於300nm至8000nm之範圍中的高度。在另一實施例中，該凸出物具有於80nm至800nm之範圍中的寬度。發明人驚訝地發現凸出物之高度與寬度的特定範圍保證最理想的細胞抑制。更有益地，高度與寬度的特定範圍允許凸出物具有有效機械強度(mechanical strength)以抵擋即將來臨之液體流動(fluid flow)而無破壞，但在同時也可維持所需之曲折度的量以抑制於其上之細胞黏附。
於一第二態樣中，提供一種用以植入病患身體之植入裝置，其中該裝置包括一表面，該表面具有自該裝置之一表面延伸之縱向之凸出物的一陣列且其中該凸出物具有一至少2.5之圖像縱橫比，其中該陣列之相鄰的凸出物設置於該裝置的該表面上以使該凸出物至少部分抑制於其上之一靶細胞的黏附。
於一第三態樣中，提供一種抑制靶細胞黏附於與體液接觸之裝置上的方法，該方法包括：提供一裝置，其包括一基板，該基板包括縱向之凸出物之一陣列，該縱向之凸出物自該基板之該表面延伸且具有一至少2.5之圖像縱橫比的，其中該陣列之相鄰的凸出物設置於該基板上以使該凸出物至少部分抑制於其上之靶 細胞的黏附；以及將該體液與該基板接觸。
於一第四態樣中，提供一種製備基板之一表面的方法，該方法包括形成縱向之凸出物之一陣列的步驟，該縱向之凸出物自該基板之該表面延伸且具有一至少2.5之圖像縱橫比的，其中該陣列之相鄰的凸出物設置於該基板上以至少部分抑制於其上之一靶細胞的黏附。在一實施例中，形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括奈米壓印(nanoimprinting)、毛細力壓印(capillary force imprinting)與鑄模(casting)。有益地，這些方法能產生尺寸至奈米範圍之基板上的凸出物，且因此可被用產生此處揭露之基板的較佳實施例。在一實施例中，形成縱向之凸出物之一陣列的步驟可視需要排除化學處理表面的步驟。
在一實施例中，形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括奈米壓印該凸出物於該基板的步驟。
在另一實施例中，該形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括：a)提供一模具，其具有經其延伸之縱向凹處；b)塗覆一熱可塑材料至該模具且在毛細力(capillary force)下允許該熱可塑材料進入該縱向凹處，以藉此產生該凸出物於該基板上。塗覆步驟中之該熱可塑材料塗的溫度可為在熱可塑材料之玻璃轉換溫度之上。
在另一實施例中，該形成縱向凹處之一陣列的步驟包 括：a)提供一模具，其具有經其延伸之縱向凹處；b)塗覆一可聚合溶液至該模具且允許該可聚合溶液進入該縱向凹處；c)在該塗覆步驟b)後，加熱該可聚合溶液，以藉此產生該凸出物於脫模(demolding)之時。
在另一實施例中，該形成縱向凹處之一陣列的步驟包括：a)提供一模具，其具有經其延伸之縱向凹處；b)塗覆一聚合溶液至該模具且允許該聚合溶液進入該縱向凹處；c)在該塗覆步驟b)後，蒸發於該聚合溶液中之溶劑，以藉此產生該凸出物於脫模之時。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
 定義
下列與此處使用之字與措辭應具有所指出的含義：於此處使用之措辭“靶細胞(target cell)”廣泛意指任何細胞其傾向被抑制黏附於一基板之表面。靶細胞可為真核細胞(eukaryotic cell)或原核細胞(prokaryotic cell)。示範的真核細胞包括但不限於血小板、紅血球 (erythrocyte)、白血球(leukocyte)、巨噬細胞、樹突細胞、纖維組織母細胞(fibroblast)、顆粒球與淋巴細胞。示範的原核細胞包括但不限於細菌。
於此處使用之措辭“圖像縱橫比(aspect ratio)”被解釋為廣泛意指最大尺寸比，通常為一結構之長度或高度比寬度。因此當措辭“圖像縱橫比”用來敘述延伸自表面的凸出物時，其應解釋為意指凸出物之高度比凸出物之寬度或凸出物之直徑，若凸出物之切面區於形狀中為圓形的話。
於此處使用之措辭“至少部分抑制黏附”或其文法上之變異意指廣泛解釋為包括避免黏附與阻擋或減少靶細胞於基板上之黏附。因此，當此處揭露之凸出物被敘述為可“至少部分抑制靶細胞於基板上之黏附”，其可解釋為凸出物能完全避免靶細胞於基板上之黏附或當與沒有包括凸出物之基板；那就是無凸出物之基板比較時，至少減少細胞黏附至基板的數目。
於此說明書內容之措辭“低黏附”意指於一樣本中之靶細胞的黏附那就是相似或低於黏附至具有奈米碳管之基板上的相同樣本中靶細胞的數目。
此處使用之措辭“柱狀物之間的間隔”、“結構之間的間隔”、“凸出物之間的間隔”解釋為意指距離、面積、體積或空隙，如同分別可為適當的介於鄰接之柱狀物、結構與凸出物之間。同樣地，此措辭之變體也因此以相同方式來解釋。例如，當為適合時，措辭“間隔之間”可交替與“柱狀物之間的間隔”、“結構之間的間隔”、“凸出物之間的間隔”使用。
此處使用之措辭“生物相容”意指當投予一合理的量時，不於動物或人類中導致嚴重毒性、嚴重有害生物反應、嚴重有害免疫反應或致死的材料。
詞“實質上(substantially)”並不排除“完全地(completely)”，例如“實質上”無Y之一組合物其為可為完全無Y。當需要時，詞“實質上”可被省略於本發明之定義中。
除非以別的方式詳細說明，措辭“包括”與其文法之變體，為打算代表“開放”或“包含”語言以使其包括所列元件但也准許額外的包含，未列出之元件。
如此處使用，措辭“約”於配方之成分之濃度的上下文中，典型意指+/-5%之所述值，更典型為+/-4%之所述值，更典型為+/-3%之所述值，更典型為+/-2%之所述值，甚至更典型為+/-1%之所述值，且甚至更典型為+/-0.5%之所述值。
遍及此揭露，各定實施例可被揭露於一範圍形式。需瞭解的是，於此範圍形式中之描述，僅為了方便與簡潔，且應不被解釋為所揭露範圍之範圍之不可更改的限制。因此，範圍之敘述應考慮具有所特別揭露所有可能之次範圍(sub-range)與於那範圍中之單獨數值。例如，範圍之敘述例如自1至6應被考慮具有所特別揭露之次範圍，例如自1至3、自1至4、自1至5、自2至4、自2至6、自3至6等，與於那範圍中單獨數值，例如1、2、3、4、5與6。
實施例之詳細揭露
一種基板，其包括大致上縱向之凸出物(longitudinal projections)之一陣列，該縱向之凸出物自該基板之該表面延伸以至少部分抑制於其上之靶細胞的黏附，而其示範的、非限制的實施例將於現在揭露。
基板具有抑制上方靶細胞黏附的表面，且該基板包括大致上縱向之凸出物(longitudinal projections)之一陣列，該縱向之凸出物自該基板之該表面延伸與具有一至少2.5之圖像縱橫比(aspect ratio)，其中該陣列之相鄰的凸出物設置於該基板上以使該凸出物至少部分抑制於其上之靶細胞的黏附。
凸出物之圖像縱橫比可為至少約3、至少約5、至少約8、至少約10、至少約12，與至少約14。在一實施例中，凸出物之圖像縱橫比為不大於約20、不大於約18與不大於約15。在一實施例中，凸出物之圖像縱橫比為於3至20的範圍中。較佳為，凸出物之圖像縱橫比為於8至15的範圍中。
凸出物可為奈米尺寸之結構或為微米尺寸之結構。較佳為，凸出物可為奈米尺寸之結構。當凸出物為奈米尺寸之結構時，奈米結構之高度可為於自約300nm至約8000nm、自約300nm至約7000nm、自約300nm至約6000nm、自約300nm至約5000nm、自約300nm至約4000nm、自約300nm至約3000nm、自約300nm至約2000nm、自約300nm至約1000nm、自約400nm至約1000nm、自約3500nm至約800nm、自約600nm至約800nm或自約700nm至約800nm的範圍中。在一實施例中，凸出物之高度可為於自約700nm至約900nm的範圍中。
奈米結構之寬度可為於自約50nm至約800nm、自約50nm至約200nm、自約50nm至約100nm、自約50nm至約80nm、自約100nm至約300nm、自約100nm至約250nm、自約100nm至約200nm或自約100nm至約150nm的範圍中。在一實施例中，凸出物之寬度可為於自約70nm至約130nm的範圍中。
在一實施例中，該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於靶細胞直徑的距離。此確保在兩相鄰的凸出物間之間隔小於細胞之直徑以避免細胞黏附於凸出物之間隔內。在另一實施例中，於陣列中凸出物之密度為至少每個細胞區2個結構。在一實施例中，介於相鄰的凸出物之間的間隔為於自約100nm至約500nm、自約100nm至約400nm自約100nm至約300nm與自約100nm至約200nm的範圍中。較佳為，介於相鄰的凸出物之間的間隔為小於約200nm、小於約180nm、小於約160nm、小於約150nm或小於約140nm。
在一實施例中，凸出物為可曲折的。凸出物可為可曲折以使凸出物之各個的至少一部份可偏離其縱軸當置於一移動液體之途徑中時。例如，當將凸出物置於在移動中之液態培養基的途徑中時，凸出物可自基礎移動它們貼附的點乙篇離其縱軸，以彎曲(sweeping)/搖動(swaying)之方式。當液體培養基不再於移動中時，凸出物也可回到其原來的位置且與它們縱軸重新排列(realign)。
凸出物可為任何切面，包括圓形、橢圓形、正方形、矩形多邊形等。在一實施例中，凸出物為延伸自基板表面之柱狀物。柱狀物之切面可實質上沿著大部分或實質上柱狀物之所有高度相同，或當柱狀物自表面之臺架延伸而出時可逐漸變得尖細。柱狀物之側壁對於周圍表面可為一般直角。柱狀物也可包括一一般平坦或圓形蓋(rounded cap)。
在一實施例中，凸出物出現於陣列中，其可於任何選擇之圖案中，例如正方形圖案、矩形圖案、圓形圖案、玫瑰花形圖案、任意圖案等。凸出物之陣列也可包括具有不同尺寸之凸出物，例如不同之寬度與高度，只要圖像縱橫比、高度與寬度與以上所定義之特定範圍中。
基板及/或凸出物可包括聚合物，例如合成之聚合物、聚合之生物材料、生物聚合物與其他聚合物。生物相容聚合物可，若需要，由一於特定時期中可被再吸收進活體組織之可吸收的材料所形成。例如，若基板為打算於治療過程中避免組織結構之吸附，基板與凸出物可包括一可吸收材料，其在完成其功能後被再吸收。此外，生物相容材料可為一熱可塑性塑膠(thermoplastic)。在一實施例中，熱可塑性塑膠係擇自由聚(D,L-乳酸)(poly(D,L-lactic acid),PDLLA)、聚甘醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚(3-羥基丁酸酯)(poly(3-hydroxybutyrate),PHB)、聚碳酸酯(polycarbonate,PC)、聚(乳酸-甘醇酸)(poly(lactide-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙烯對苯二甲酸酯(poly(ethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚胺基甲酸乙酯(polyurethanes,PU)、聚氯乙烯(poly(vinyl chloride),PVC)、聚碸(polysulfones,PS)、聚醯胺(polyamides,PA)、聚縮醛(polyacetal,POM)、聚丙烯腈(polyacrylonitrile,PAN)、聚四氟乙烯(poly(tetrafluoroethylene),PTFE)、聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、環氧樹脂(epoxies)與其組合所組成之群組。
此處揭露之靶細胞可擇自由血栓細胞(thrombocytes)、巨噬細胞(macrophages)、樹突細胞(dendritic cells)、淋巴細胞(lymphocytes)、顆粒球(granulocytes)、細菌或可黏附至沒有所揭露之凸出物的基板的任何細胞所組成之群組。
基板可為任何基板，其遭遇生物環境，不論是藉由植入血液或其他體液之體外處理(extracorporeal processing)，或使用於食物與飲料治療中且遭遇生物形成要素，例如細菌之工作表面之基板。例如，基板可為被引入血管系統、腸胃道、肺泡(lung alveolae)、滑液(synovia)、結締組織(connective tissue)與於眼或齒齦(gum)中與身體之任何部分中的一植入物、一移植物與一義體(prosthesis)。在一實施例中，基板為一導管，其與病患之血液接觸。在其他實施例中，基板為一植入裝置，例如一支架(stent)、心臟起搏器(heart pacer)、或人工心臟瓣膜(artificial heart valve)用以植入一病患之身體。
延伸自基板之表面的凸出物的陣列可被形成於奈米壓印(nanoimprinting)、毛細力壓印(capillary force imprinting)、濕模板法(template wetting)與鑄模(casting)之至少之一。在一實施例中，當使用熱塑奈米壓印時，奈米壓印執行於一溫度範圍於聚合物之玻璃轉換溫度之上且於一壓力範圍約自約10Bar至80Bar。
在一實施例中，當使用光奈米壓印(photo nanoimprinting)時，將一光(UV)硬化液體前-聚合物塗覆約於一基板。一模具，一般由透明材料所形成，可知後被一起加壓且前-聚合物於UV光中可被硬化以交聯與固化。於其之後，可將模具分開以釋放結構。在另一實施例中，當使用濕模板法時，濕模板法被執行於相當高於聚合物之玻璃轉換溫度的溫度範圍中，且於壓力範圍約自約100mBar至5000mBar。在另一實施例中，當使用鑄模時，鑄模之製程執行於室溫於真空中。
在一實施例中，在凸出物已被形成於基板上漏，凸出物及/或基板之表面可被更進一步化學增強或功能化以給予額外之抗黏附特性至基板。也可使凸出物及/或基板表面增加其疏水性，其可增強於上方之靶細胞黏附的抑制。
【實施例】 實施例1與2及比較例1至4
本發明之非限制性實施例與比較例將更進一步敘述更詳細，不應將其建構為以任何形式限制本發明之範圍。
使用之材料 樣本
自美國伊利諾州之Lincolnshire的PURAC Biochem獲得80/20聚(乳酸-甘醇酸)poly(lactic-co-glycolic acid)5.01(PLGA)。垂直排列碳多壁奈米管(vertically aligned carbon multi-walled nanotubes,MWNTs)為自美國麻薩諸塞州之Newton之Nanolab,Inc購得。高序熱解石墨(highly ordered pyrolytic gtaphite,HOPG)為獲得自美國賓夕法尼亞州之SPI Supplies and Structure Probe of West Chester。二氯甲烷(dichloromethane,DCM)為提供自美國俄亥俄州之Faitfield的Tedia Company Inc。
緩衝溶液、生物化學與抗體
藉由溶解8.0g NaCl、0.2g KH2 PO4 、2.9g Na2 HPO4 與0.2g KCl於1L去離子水中來製造磷酸鹽緩衝液(hosphate buffer saline,PBS)。使用為酵素連結免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)之停止溶液的清洗緩衝溶液由0.1% v/v Tween-20於PBS中與0.5M H2 SO4 所組成。乳酸去氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)細胞毒性分析套組獲得自美國密西根州之Ann Arbor of Michigan的Cayman Chemical Co(Cat # 1008882)。含2% v/v Triton X-100於PBS中之溶解緩衝溶液(lysis buffer)與於PBS中之1M HCl的停止溶液用於乳酸去氫酶分析。當需要時，以NaOH或HCl調整由4.0g NaCl、0.5g NaHCO3 、0.1g KCl、0.03g Na2 HPO4 、0.5g D-葡萄糖、0.1g MgCl2 於500mL去離子水中與2%甲醛所組成之無鈣之台氏緩衝溶液(tyrode buffer)至pH7.4。
CaCl2 、H3 PO4 、(3，3，3-三氟丙基)三甲氧基矽烷(3,3,3-trifluoropropyl-trimethoxysilane)、戊醛(glutaraldehyde)、丙酮與乙醇皆購自美國密蘇里州之Louis街的Sigma-aldrich。微量離心管與96-孔聚苯乙烯(polystyrene)微效價盤分別使用於培養研究與酵素分析。
來自人類之纖維素原(fibrinogen from human,Hfg)購自Sigma-Aldrich(~35-65%蛋白質,≧95%之蛋白質凝固(clottable))。用於ELISA測試之血小板豐富血漿(Platelet-rich plasma,PRP)、山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase,HRP)結合之山羊抗人類纖維素原與四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidene,TMB)為購自美國麻薩諸塞州之Swampscott的US Biological。用於流式細胞術分析之螢光標誌之IgM單株抗體與原硫胱氨酸蛋白酶活化化合物-1異硫氰酸酯螢光素(procaspase activating compound-1 fluorescein isothiocyanate,PAC-1 FITC)為購自美國加州之San Jose的BD Biosciences。
使用的方法 奈米多孔陽極氧化鋁(Nano Porous Anodized Alumina,NPAA)模板的製造
為了製造一整齊NPAA模板，使用一壓痕製程(indentation process)。這裡，將鋁箔(99.999%，獲自美國麻薩諸塞州之Ward Hill的Alfa Asear)之表面刻成鋸齒狀，使用壓力於4000psi，2分鐘，以於其中顆粒直徑約270nm之矽凝膠已被裝配之基板。接著於超音波水浴中清洗鋁箔以釋放於表面上之矽凝膠球的貼附。之後於3℃，在0.3M H3 PO4 水溶液中，在112V之電壓下，根據所需孔洞的深度以時間範圍1至20分鐘，將鋁箔陽極氧化。NPAA模板具有一相對固定之間隔與直徑，且藉由變化陽極氧化時間之持續期間來控制孔洞深度。一般地，以約20分鐘之陽極氧化時間達到約1μm之深度。
矽主要模板(silicon master template)的製造
使用標準微米/奈米製造技術，例如深紫外光微影(deep ultraviolet photolithography)或電子束微影(electron beam lithography)，接著感應耦合電漿-深相對離子蝕刻(inductively coupled plasma-deep reactive ion-etching,ICP-DRIE)BOSCH製程來製造矽主要模板。以結構範圍自奈米至微米大小來製造各種模板以產生具有如總括於表1中之尺寸的凸出物。
於一PLGA基板上製造凸出物的方法
將如上所製備的模板於丙酮中清洗以移除任何污染物的痕跡、沖洗(rinse)於去離子水中並接著烘乾。為了在乾燥後促進已鑄成(casted)之PLGA基板的移除，將模板以抗黏附試劑，例如(3，3，3-三氟丙基)三甲氧基矽烷於氣相(vapor-phase)中處理約1小時。
藉由於1:28w/v之比例溶解PLGA顆粒狀物(pellets)於二氯甲烷中來製備鑄造混合物。之後在自模板以柱狀物或凸出物之形式釋放三維結構前，將鑄造混合物倒至已包覆之模板與真空烘烤於70℃，4天。
溶劑鑄造(solvent casting)自主要模板再產生(reproduce)精確之三維凸出物，其為價格低廉且允許模板之重複利用。自藉由許多NPAA模板或矽模具之鑄造獲得PLGA之柱狀物。使用Smile View 2來分析所製造之柱狀物的尺寸並列表顯示於表1中，與對應之圖像縱橫比(其定義為高度比寬度之比)一起。
或者，可使用毛細力壓印以在PLGA基板上形成凸出物。在毛細力壓印中，將為一熱可塑聚合物具有0.5mm之厚度的PLGA與如上所製備之模板接觸。接著，提供500mBar之輕微接觸壓力至組合以使聚合物與模具間之緊密接觸為可能。在其之後，升高組合之溫度於聚合物之玻璃轉換溫度之上。使用之溫度為約120℃-150℃。將黏的聚合物填滿模板之凹處為藉由毛細作用來驅動。製程之時間持續取決於在模板中之孔洞的圖像縱橫比與在基板上所需的凸出物大小。在模板移除前將複製(replicated)之模板冷卻至近40℃。藉由脫掉模板或蝕刻模板可將模板移除。典型的製造參數顯示於表1中。
藉由ELISA測定纖維素原吸附
藉由一ELISA陣列來將於基板上之纖維素原吸附進行定量。在基板定量前首先建立一標準曲線(calibration curve)。步驟如下：首先於微量離心管中將3 x 3mm之基板樣本平衡於PBS中30分鐘。接著，將樣本置於具有0.05mg/ml之Hfg的96-孔微效價盤中1小時，於37℃。再將樣本轉換至於微效價盤上之新孔洞前，以清洗緩衝溶液(0.1% v/v Tween 20 in PBS)將樣本沖洗5次。之後將樣本培養於山葵過氧化酵素結合之山羊抗人類纖維素原1小時，於37℃在1:105的稀釋。之後在轉換進新的孔洞前沖洗樣本5次。最後，將100μl之呈色試劑，例如四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethyl-benzidene,TMB)加至各孔中且將培養盤培養於黑暗中20分鐘，其中溶液遭遇氧化且藉由與山葵過氧化酵素反應轉變為藍色。接著，將100μl之0.5M H2SO4加至孔中以停止酵素反應。使用多重吸移工具(multiple pipette tool)將溶液快速吸出且轉換至新孔洞中，其中在5分鐘內，於一微效價盤讀取機上在450nm測定溶液之吸收值。將吸收實驗執行於三重複(n=3)且分別重複3次。
首先獲得介於Hfg之塗覆濃度(0.001 to 0.05mg/ml)與藉由ELISA測量之吸收之間的線性相關(linear correlation)(r=0.951)。Hfg吸附之絕對量的標準曲線表示為：
吸附之Hfg(mg/mm2 )=4.31 x 10-3 OD-1.489 x 10-4
其中OD指當以微效價盤讀取機測量反應溶液之光學密度(optical density)或吸收。
藉由LDH分析測定血小板吸附
藉由測量已知血小板濃度(由血球計數器測定(hemocytometer))光學密度(OD)值來最初繪製標準曲線。介於懸浮黏附之血小板之所測量的光學密度與確實的量之間的線性相關(r=0.9882)顯示為：
黏附血小板數目/mm2 =370.37OD+21.26
當前吸收(pre-adsorbed)之Hf與LDH反應溶液之互相作用顯示一非顯著之吸收值(p>0.05)時，光學密度值首先被歸因於懸浮之血小板。
為了定量血小板黏附於測試基板上的量，首先將基板(3x3mm之寬度與長度)以PBS平衡30分鐘在37℃。之後，將200μl之Hfg(4mg/ml)加進微效價盤孔中且培養1小時於37℃。接著，孔洞以PBS沖洗3次以移除任何未固定之Hfg。之後將200μl之PRP加至孔洞中且將微效價盤培養於37℃，2小時。在培養後，將孔洞再次以PBS沖洗3次以移除任何沒有黏附之血小板，且將基板轉換至新的孔中。之後，加入25μl之溶解緩衝溶液且將微效價盤培養於37℃，1小時。之後，加入50μl之LDH反應溶液且將微效價盤培養20分鐘於室溫。然後，在轉換至新孔洞前將25μl之停止溶液加至各孔且吸出，其中使用微效價盤讀取機執行OD讀取於490nm。將實驗執行於三重複(n=3)且分別重複3次。
流式細胞研究
自如先前段落中所述之PRP培養後之血小板結合Hfg基板所萃取之PRP懸浮液被用於流式細胞研究中。將清洗溶液(無鈣台氏緩衝溶液)加至經萃取之PRP且將混合物離心於2000rpm，15分鐘。在離心後移除上清液且經活化之血小板藉由以使用PAC-1 FITC之直接免疫螢光(direct immunofluorescence)來染色，其中稀釋之PAC-1 FITC染劑對PRP之比為4:1。將經染色之樣本培養於室溫20分鐘於黑暗中。之後，加入等體積之2%甲醛以固定血小板。將固定之樣本保存於4℃於黑暗中且於18小時內進行分析。
血小板活化，當血小板反應或貼附至外來表面時執行且因此遭受一系列之複雜反應以促使凝血形成與血小板聚集，使用配備488nm雷射激發波長之BD FACSCaliburTM 流式細胞儀(Becton Dickinson of San Jose of California of the United States of America)來將血小板活化定量。自設置於前側散射光(forward side scatter,FSC)與側散射光(side scatter light,SSC)光通道中之點圖(dot plot)限制每個樣本總數10,000血小板以獲得血小板結合Hfg之螢光的平均值強度。經由530/30(FL1)波段濾光鏡(bandpass filter)收集螢光強度。使用對數放大(logarithmic amplification)由於小的血小板大小。將自流式細胞儀獲得之資料以WinMDI 2.9軟體套裝再分析。(http://en.bio-soft.net/other/WinMDI.html)。
藉由FESEM之於基板上黏附之血小板的觀察
以2.5%戊醛固定根據標題為“藉由LDH分析測定血小板吸附”之段落製備的基板2小時於4℃。必然地，在將基板冷凍乾燥於-80℃前將基板沖洗於PBS中且經由一系列之梯度酒精(0%,25%,50%,75%,100%)脫水且以鉑包覆以藉由場發射掃描式電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)(JEOL JSM-6340F)觀察血小板形態學中的變化。
統計分析
將所有實驗執行於三重複且分別重複至少3次。當不使用時將PRP與血漿儲存於-20℃且其穩定達12個月。將獲得自不同分析之資料呈現為具有標準差之平均值。介於兩基板間之統計學顯著之差異使用變數之單一因子分析(ANOVA)。
結果 PLGA基板之特性
使用前面討論之方法製備的PLGA基板呈現三維凸出物於柱狀物之形式中，其延伸自表面。實施例1與2及比較例1至4之這些柱狀物的尺寸與柱狀物間之間隔顯示於以下表1中。
基板標誌：例如，(1,1,2)指表現於102 nm中之柱狀物的(間隔，寬度，高度)。≠：由於碳奈米管之高密度無法測量。
於PLGA基板上之血小板黏附與活化
為了確認於具有地形凸出物之PLGA基板上之血小板黏附程度，使用一參考樣本，例如具有垂直排列多壁碳奈米管於表面上之一矽基板，以實驗地形凸出物的功效。也使用高序熱解石墨(highly ordered pyrolytic graphite,HOPG)片作為其他比較目的之樣本。此參考樣本之參數描述於上面表1中。使用此參考樣本以確認於測試聚合物基板上之黏附的程度。如第1b圖中所示，與參考樣本相較具有低程度之血小板黏附的任何聚合物基板會被呈現於表1中為具有一“低黏附”。就其本身而論，與參考樣本相較具有高程度之血小板黏附的任何聚合物基板會被呈現於表1中為具有一“高黏附”。
第1a圖與第1c圖分別顯示於PLGA基板、原始PLGA基板、HOPG基板與參考樣本上吸附之Hfg的程度與血小板活化的程度。可以看出實施例1與2之吸附之Hfg的程度與血小板活化的程度與參考樣本的那些相較為較低。
由ANONA所執行介於基板間之統計顯著相關自第1a圖至第1c圖被列表顯示於下方表2中。表2顯示(a)吸收之纖維素原的量，(b)黏附之血小板的數目與(c)血小板活化強度。將資料執行三重複(n=3)，且表現為三重複之獨立實驗的平均值±標準差。
如於第1a圖與第1b圖中所示，於具有不同尺寸與間隔之凸出物的PLGA基板上觀察到Hfg吸附之不同量，且此結果相對地充分的關連於隨後發生之基板上之血小板貼附的量。一血小板黏附的量對吸附之Hfg的相關圖顯示一強烈的相關性(r=0.88876)，如於第2圖中所示。此意指於相同之地形凸出物上之兩個測試的資料配合良好，其證明特定凸出物的有效性。結式(resultant)r2 =0.789指出血小板之黏附為大部分取決於纖維素原吸附(約79%)，但其他因子(約21%)，例如於表面化學中之變化(即，HOPG vs. PLGA)也參與一部份。
然而，若僅使用基於PLGA樣本之資料，看到一強烈的相關性(r2 =0.93)(資料未顯示)，指出一旦將表面化學固定，纖維素原吸附差異度支配隨後發生之於那些經建構之PLGA表面上的血小板黏附量。
也觀察到對於由LDH分析所測定之黏附血小板的數目對由流式細胞分析所測定之經活化之血小板的PAC-1表現的一強烈之相關性(r=0.84492)於第2b圖中。此意指於相同之地形凸出物上之兩個測試的資料配合良好，其證明特定凸出物的有效性。0.714之相關r2 值指出約71%之於血小板活化中的變化可被歸因至黏附之血小板的量，而約29%之於血小板活化量中的變化性為在此觀點無法說明。相似地，介於在所有PLGA基板上之黏附之血小板之數目對經活化之血小板的相同相關性的關聯性研究顯示一輕微強烈的相關性(r2 =0.72)(資料未顯示)。
如於第3圖中所示，藉由流式細胞區域(R1)，經活化之血小板族群被限制且定義，根據其大小與形態學特徵。於原始PLGA基板上觀察到一較高之血小板活化，相較於具有較低平均值強度之P(1,2.5,8)的那些。
如以上證明，血小板反應與Hfg吸附量於經建構之PLGA膜上為明顯不同，而在所有經建構之PLGA膜上觀察到顯著減低之吸附之Hfg與血小板反應的程度，當相較於原始表面的那些時。相應地，就於所有三個實驗研究中之凸出物大小、圖像縱橫比與密度而論，當將經建構之PLGA基板與原始表面之那些比較時，於Hfg吸附與血小板反應中觀察到統計上之顯著差異，其指出這些參數在影響表面之血液相容性中的重要性。
間隔影響(Interspacing Effect)
為了研究於血小板黏附上之間隔的影響，於此研究兩個PLGA基板。如於第4a圖與第4b圖中所示，這些圖清楚展現具有約150nm間隔之區域上之血小板黏附的一經減低程度與具有約1000nm間隔之區域上之黏附的血小板的一高程度。於第4b圖中，結構被劃分成三個區域，於其中，於基板左手邊上之區域中的結構的垂直間隔為150±10nm；於基板中間中之區域中的結構的垂直間隔為580±40nm；以及於基板右手邊上之區域中的結構的垂直間隔為9500±50nm。對於所有三個區域而言，結構之水平間隔維持於125±40nm。對於所有三個區域而言，結構之寬度維持於50±10nm。對於所有三個區域而言，結構之高度維持於450±150nm。
如於第4c圖中所示，當間隔變為小於約200nm時，黏附明顯地降低由於介於凸出物與血小板間的接觸區域減少。因此，此情況對於血小板建立與PLGA表面之穩定接觸與獲得導致活化之正確細胞形態表現型而言為不適合的。因此觀察到血小板活化之低程度，當柱狀物間之間隔減少而血小板形態變成被其無法接觸完整表面區域所限制時。因此，基於自第4c圖的結果，於這些經建構之表面上，小於或約200nm之間隔在將血小板黏附與由此之血小板活化最小化中顯露為有效的。
為了減少於凸出物間血小板誘捕(entrapment)之可能性及引起血小板活化之與表面穩定接觸的形成，間隔之尺寸應為遠小於血小板的大小。
圖像縱橫比的影響
第5圖顯示自第1b圖之每面積血小板黏附對測試之PLGA基板的圖像縱橫比的列表結果。於第5圖中，以標誌“高度影響”表示之PLGA基板為實施例1與比較例1；以標誌“寬度影響”表示之PLGA基板為實施例2與比較例2；以標誌“間隔影響”表示之PLGA基板為比較例3與4。其可看出血小板黏附顯著減少於具有增加之圖像縱橫比的基板上。3至5之圖像縱橫比(藉由箭號顯示於第5圖中)為適合實現一黏附之血小板的一足夠低量。然而，凸出物之圖像縱橫比可大於此範圍，只要凸出物不群集太多以使其彼此糾結以形成一糾結結構其提供一血小板黏附之較大接處表面。描繪於第5圖中之虛線指出於此研究中使用的控制組。
其顯示血小板可僅與高圖像縱橫比之凸出物頂端互相作用，當間隔變得夠小時(即，約或等於200nm)。如第6a圖中所示，具有高圖像縱橫比之凸出物，例如於基板P(1,1,8)中，為可能變形與彎曲，於液體培養基中，甚至在培養中之輕微震動下。此凸出物之可曲折性導致任何黏附之血小板的不穩定黏附與無法獲得正確之細胞形態表現型，因此血小板可被輕易逐出凸出物的表面。此效果說明於第7a圖與第7b圖中。第7a圖為示意圖顯示具有一低的圖像縱橫比的凸出物於一懸浮液會維持堅硬與筆直的，藉此允許更多血小板貼附以較容易與較大之頻率，相較於在第7b圖中之局面。第7b圖為一示意圖顯示具有高圖像縱橫比的凸出物於兩可能的局面中(i)可曲折之柱狀物由於其彎曲能力作用避免血小板成功接觸於凸出物上與(ii)任何不穩定黏附之血小板的可能分離。於第7a圖與第7b圖中出現之箭號指出形成於移動中之液體的摩擦力(frictional force)。
如於第6b圖與第8b圖中所示，如於在第6b圖中之P(1,1,8)上與在第8b圖中之P(1,1,2)所觀察到之於血小板黏附中之差異為明顯的，隨著列表之資料顯示高重要性(p<0.001)。當為了電子顯微鏡之觀察將樣本乾燥時，由於毛細力於第6b圖中觀察到柱狀物之群聚，其被推測為這些柱狀物於液相中在PRP中會存在為單獨分開之完整實體。發明人推測，於P(1,1,8)上之減弱的血小板反應，可能因為採用於這些基板上之所測量之吸附的Hfg的低程度或不充分的構造改變。兩個影響，即表面修飾與纖維素原結構改變可一起做用以降低血小板之黏附。因此，於2.5至5之範圍中的圖像縱橫比顯示為有效減少一顯著量之於表面上黏附的血小板。
寬度影響
具有自100nm至300nm之寬度的凸出物的範圍為適合於此研究中之血小板反應。在具有250nm寬度之凸出物的基板(P(1,2.5,8))上(第9a與9b圖)，相較於具有500nm寬度之凸出物的基板(P(1,5,8))上(第10a與10b圖)，觀察到吸附之Hfg的量與具有其隨後發生之活化的黏附血小板為顯著較低(p<0.001)。將P(1,2.5,8)與P(1,5,8)進行比較，纖維素原吸附差異為統計上顯著的，且因此這些差異為在P(1,5,8)表面上所觀察到之增加的吸附的原因。換句話說，在較寬之柱狀物上，纖維素原之吸附被增加，可能因為較大的接觸面積。接著，血小板黏附也被增加。同樣地，也於在P(1,1,8)中之100nm寬的柱狀物上觀察到相同之統計上之重要性，由於在P(1,1,8)上觀察到減低的Hfg與血小板反應，當與P(1,5,8)中之500nm寬的柱狀物的那些比較時。
此外，當比較介於基板P(1,1,2)與P(1,5,8)之間時，即使這些基板具有極度相似之約2的圖像縱橫比於第5圖中，其可觀察到於P(1,1,2)上黏附血小板之程度明顯較小。這些結果指出除了影像縱橫比之外，柱狀物之絕對尺寸在血小板活性減低中也為重要的。其可被設想為，具有擴大寬度的柱狀物作用增加表面接觸面積以增強纖維素原吸附，且因此藉由允許更容易發生之黏附增強血小板黏附/互相作用。
化學與起因於在基板上之凸出物的影響
在沒有任何凸出物於其上之原始表面上，例如PLGA與HOPG，顯著觀察到Hfg吸附與血小板反應的最高程度。此為明確地因為纖維素原或血小板吸附於此種表面上為構造上最理想且不受物理結構存在限制的事實。為了更進一步研究凸出物在血小板反應上的影響，將HOPG之平面碳表面對其於MWNTs上經建構之相等物(equivalent)，C(~,1.5,190)，進行評估。這些基板之表面化學為相似的。
此處，結果顯示介於HOPG與C(~,1.5,190)之間，在所有三方面(即，吸附之Hfg、黏附與活化之血小板)中之統計上顯著之差異，其意味著表面修飾之有影響的角色。然而，表面之或學也為重要的，如在C(~,1.5,190)與結構-修飾之PLGA膜之性能中的差異所看到。表面之化學需被考慮，由於蛋白質之起始黏附會因為蛋白質-表面結合親和力而相當不同。於原始PLGA上之血小板黏附與活化(第11a與11b圖)，在所有執行於原始PLGA上之測試中為明顯最高，接著為原始HOPG(第11c圖)。此以介於PLGA與HOPG間之在黏附上表面化學的影響為例子，其中，於Hfg吸附與黏附之血小板中觀察到統計上顯著之差異(p<0.05)。然而，需注意的是，於血小板活化中並無統計之差異，如於表2中所見。此結果指出表面之化學差異地影響，在起始吸附與結合階段但沒有在之後階段的血小板活化中。
相較於起始表面，在經建構之PLGA與碳基板上，於此例子中，C(~,1.5,190)，血小板反應顯然較低。然而，於C(~,1.5,190)上之黏附程度(第11d圖)比得上高圖像縱橫比建構之PLGA膜的黏附程度(第1b圖)。因此，這指出藉由適合之表面的結構修飾可克服在黏附上之化學影響。然而，其也可能為結構修飾與化學之兩者的影響可一起作用來確認於人工表面上之血小板影響。
因此，除了表面化學，具有特定結構之表面可導致經減低的凝血活性(thrombogenicity)。
經活化之血小板的形態學
經活化之血小板的形態學自最低至最高程度被分成5個種類，包括：圓形、樹突的、延伸-樹突的、延伸的與完全延伸的。
於具有高圖像縱橫比之基板P(1,1,8)上所觀察到之血小板活化的最少量具有圓形血小板形態(第6a圖)，接著具有經減低之樹突的形態的P(1,2.5,8)，如顯示於第9b圖中，相較於最大柱狀物寬度之具有延伸-樹突形態之P(1,5,8)(第10b圖)。此結果顯示，當柱狀物之寬度變大時，血小板活性會提升，由於於血小板上之多價黏附互相影響隨著擴大之接觸面積而增加。
相反地，具有低圖像縱橫比之基板P(1,1,2)顯示活化之高程度，因為血小板喪失其圓盤形狀且變為以尖的偽足來延伸，採納為延伸的形態(第12a圖與第12b圖)。
於原始PLGA上之活化程度為顯著最大(第11a圖)，其中，血小板完全延伸，當細胞質經由表面延伸導致血小板延伸變成一薄膜，伴隨血小板之不間斷的黏附(第11b圖)。相較下，於HOPG之血小板活化程度為相對較低，且採納為經減低之延伸形態，其強調此材料之低凝血活性。
於第11d圖中之在MWCN(C(~,1.5,190))上的活化程度與於第6a圖中之P(1,5,8)為可比較的，兩者顯示經減低之減低之延伸-樹突形態，相較於在第12a圖與第12b圖中之最大間隔基板，P(14,6,0.4)。結果顯示隨著介於結構間的間隔增加，血小板活化增加，特別歸因於當有效接觸表面面積增加時，血小板增加活性以與表面互相作用。
所呈現之結果強調，在指揮一所需之血小板反應中，經建構表面之適合尺寸的重要性。具有減低間隔(例如顯示於第4b圖中)、減低寬度(例如顯示於P(1,2.5,8)中)與增加之圖像縱橫比(例如顯示於P(1,1,8)中)之結構特徵，被發現產生吸附之Hfg與血小板反應的顯著減少。於減少凝結形成之風險中。不止減少纖維素原吸附至表面為重要的，且當測定之後之血小板黏附/活化時，影響表面上所採用之結構也為重要的。凸出物之幾何結構於此扮演一重要角色。此外，於MWNTs形式中之碳表面變為最低限度血栓的當與抗血栓材料，例如HOPG相較時。
結論
藉由上述實施例與比較例已顯示血小板黏附與活化被凸出物所影響，凸出物於奈米程度自基板表面延伸，與控制組相較，其具有顯著減少的血小板反應。
於結論中，其發現：
(a)於原始表面上，表面化學於黏附上扮演一支配角色，如相較於PLGA，其顯示於HOPG上減低的纖維素原與血小板黏附。
(b)當表面被建構時，這些結構可克服化學影響。例如一次微米經建構之PLGA表面可存在減低之血小板黏附，比起原始PLGA或HOPG。
(c)除了一特定表面化學作用，以適合之結構特徵修改表面以減少血小板反應。
(d)凸出物之特定尺寸具有顯著影響。已觀察到間隔、寬度與高度(即，圖像縱橫比)顯著影響血小板黏附與活化，於下列方式中：
‧於次微米凸出物中之增加的圖像縱橫比減少血小板黏附之數目，由於血小板無法與減少之表面面積形成穩定之接觸以貼附。
‧增加寬度增加了血小板黏附的可能，由於於表面接觸面積中的增加且可能經由經吸附之Hfg的結構。
‧增加間隔之尺寸大於200nm導致血小板捕獲與其接下來之活化，由於增加之表面接觸面積與捕獲。
於結論中，於表面上之結構特徵的存在可加控制組之另一程度以減少血小板-生物材料相作用且在用於血液接觸醫療裝置之低血栓表面的發展為有益的。僅藉由物理性修改表面，血小板黏附的程度可被降低至遠低於在“最低限度血栓”表面，例如HOPG上所觀察到的程度。
【應用】
所揭露之基板可使用於各種需要與體液接觸之醫療裝置。例如，這些裝置包括醫療或獸醫植入物，例如起搏器、耳植入物、鼻植入物、移植物或義肢；與血液接觸之裝置包括心臟辦膜、心血管移植物、流管(shunt)或支架；與裝置觸碰有與其他體液與組織接觸，例如導管或引流管(drainage tube)。
所揭露之基板可用以實質上抑制靶細胞的黏附，例如微生物，例如細菌或真菌，及生物細胞，如血液細胞、血小板或白血球。
所揭露之基板可不需為了修飾基板之表面的化學處理或塗覆一化學材料。因此，所揭露之基板的生物相容性與表面化學可不被顯著改變。此外，凸出物形成於所揭露之基板上為一不可缺之單元，凸出物不易自基板分離且抵抗當基板置於生物系統(例如，病患之血管中)中時可能出現之剪力。
自所揭露之基板表面延伸之凸出物可具有尺寸與凸出物間之間隔，而由於用以形成所揭露之基板的方法，其為可控制的，且在一批與一批基板間為固定的。因此，所揭露之基板為可再現的且血小板黏附程度為可根據一必然程度來預測。此外，為了減少把細胞於其上之黏附程度，揭露之方法可形成於奈米級範圍中之凸出物。
與一般基板相較，揭露之基板可實質上僅少靶細胞之黏附程度，由於上述之具有高度、寬度、圖像縱橫比與凸出物間之間隔的凸出物。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
第1a圖為一定量曲線圖，其顯示纖維素原吸附於一系列測試基板、控制組基板的量與參考樣本，隨著測定自藉根據ELISA之標準曲線。第1b一定量曲線圖，其顯示血小板黏附於在第1a圖之測試基板的數目隨著測定自根據LDH分析之標準曲線。第1c圖為一定量曲線圖，其顯示對於在第1a圖之測試基板上之血小板活化上的PAC-1表現，其來自流式細胞術分析(flow cytometric analysis)。
第2a圖為被列表顯示於第1a圖與第1b圖的散射圖，其顯示根據ELISA之吸附的纖維素原的量與根據LDH分析之黏附血小板的數目有強烈地相關係性。
第2b圖為被列表顯示於第1b圖與第1c圖的散射圖，其顯示根據LDH分析之黏附血小板的數目與根據流式細胞術分析之活化之血小板的PAC-1表現有強烈地相關係性。
第3a圖為一正向對側光散射點圖，具有經染色之血小板結合之纖維素原平均值強度，經染色之血小板結合之纖維素原係經由篩選僅表現血小板(正控制組)來獲得。第3b圖為一正向對側光散射點圖，具有經染色之血小板結合之纖維素原平均值強度，經染色之血小板結合之纖維素原係經由篩選原始PLGA上表現較高血小板活性來獲得。第3c圖為一正向對側光散射點圖，具有顯示經染色之血小板結合之纖維素原較低平均值強度，經染色之血小板結合之纖維素原係經由篩選P(1,2.5,8)樣本來獲得。
第4a圖為一SEM影像，其獲得於原始PLGA表面及以具有約150nm之間隔的柱狀物所建構之PLGA表面間之比較的500 x放大，其顯示與經建構之表面相較，一較高之血小板黏附於原始表面上。第4b圖為一SEM影像，其獲得於一PLGA表面的800 x放大，其已使用具有150nm、600nm與1μm之間隔的柱狀物，其顯示與150nm相較，一較高之血小板黏附於1μm之間隔上。第4c圖為曲線圖顯示自第4b圖列表顯示之資料，其藉由視覺計數血小板以6影像之平均(n=3)來獲得。
第5圖為於具有變化之圖像縱橫比的多個測試基板間的一圖解比較。
第6a圖為一SEM影像，其獲得於2000 x放大，顯示出在P(1,1,8)上之黏附血小板(圓形)之最低量，由於柱狀物之高圖像縱橫比。第6b圖為一SEM影像，其獲得於以虛線盒顯示於第6a圖中之區域的2000 x放大，顯示在乾燥後之柱狀物串。
第7a圖為血小板貼附於具有低圖像縱橫比之柱狀物上的示意圖。第7b圖為於具有高圖像縱橫比之柱狀物上之血小板抑制的示意圖。
第8a圖為一SEM影像，其獲得於2000 x放大，顯示於P(1,1,2)上之血小板黏附之高程度，顯示具有突出偽足之經活化血小板(圓形)。第8b圖為一SEM影像，其獲得於以正方盒顯示於第8a圖中之區域的15000 x放大，顯示一平面圓盤血小板。
第9a圖為一SEM影像，其獲得於2500 x放大，顯示具有柱狀物與上之區域相較(第9a圖右側)，於PLGA基板之原始表面上之血小板之優先的黏附(第9a圖左側)。第9b圖為為一SEM影像，其獲得於第9a圖右側之5000 x放大，顯示在乾燥後之於柱狀物上觀察到的群集影響。
第10a圖為一SEM影像，其獲得於2500 x放大，顯示於P(1,5,8)上之500nm(寬度)柱狀物上之黏附的血小板稍微提高。第10b圖為一經放大之SEM影像，其獲得於a圖之柱狀物的5000 x放大，顯示在乾燥後群集之柱狀物的減少影響。
第11a圖為一SEM影像，其獲得於原始PLGA基板之500 x放大，顯示血小板黏附之最高程度，其中，藉由使具有基礎表面之最大表面接觸區域為可能，使此形態學(morphology)增加多價黏附互相影響的潛力。第11b圖為一SEM影像，其獲得於原始PLGA基板之1000 x放大，顯示血小板分佈與其進階階段。第11c圖為一SEM影像，其獲得於HOPG基板之表面的1000 x放大，顯示血小板黏附之適度高程度。第11d圖為一SEM影像，其獲得於C(~,1.5,190)之表面的600 x放大，顯示當與第11c圖比較時，血小板黏附之經抑制的量，意味著於血小板活性之調控中之表面修飾的有影響的角色。
第12a圖為一SEM影像，其獲得於3000 x放大，顯示於P(14,6,0.4)上之經活化之血小板的形態學。第12b圖為一SEM影像，其獲得於10000 x放大，顯示於P(8,10,0.4)上之經活化之血小板的形態學。

Claims (23)

  1. 一種基板，具有抑制上方靶細胞黏附的表面，該基板包括大致上縱向之凸出物(longitudinal projections)之一陣列，該縱向之凸出物具有自該基板之該表面延伸之一縱軸(longitudinal axis)與具有一至少2.5之圖像縱橫比(aspect ratio)，其中該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於靶細胞直徑的距離以使該凸出物至少部分抑制於其上之靶細胞的黏附。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於200nm或更小的距離。
  3. 如申請專利範圍第1-2項之任一項所述之基板，其中該凸出物之該圖像縱橫比至少為3。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該凸出物之該圖像縱橫比為於3至20的範圍中。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該基板與該凸出物之至少一個包括一生物相容聚合物。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之基板，其中該生物相容聚合物為熱可塑性塑膠(thermoplastic)。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之基板，其中該熱可塑性塑膠係擇自由下列所組成之群組：聚(D,L-乳酸)(poly(D,L-lactic acid),PDLLA)、聚甘醇酸(polyglycolic acid,PGA)、聚(3-羥基丁酸酯)(poly(3-hydroxybutyrate),PHB)、聚碳酸酯 (polycarbonate,PC)、聚(乳酸-甘醇酸)(poly(lactide-co-glycolic acid),PLGA)、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙烯對苯二甲酸酯(poly(ethylene terephthalate,PET)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚胺基甲酸乙酯(polyurethanes,PU)、聚氯乙烯(poly(vinyl chloride),PVC)、聚碸(polysulfones,PS)、聚醯胺(polyamides,PA)、聚縮醛(polyacetal,POM)、聚丙烯腈(polyacrylonitrile,PAN)、聚四氟乙烯(poly(tetrafluoroethylene),PTFE)、聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、環氧樹脂(epoxies)與其組合。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該靶細胞係擇自由下列所組成之群組：血栓細胞(thrombocytes)、巨噬細胞(macrophages)、樹突細胞(dendritic cells)、淋巴細胞(lymphocytes)、顆粒球(granulocytes)與細菌。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該凸出物為可彎曲的。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該凸出物具有於300nm至8000nm之範圍中的高度。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之基板，其中該凸出物具有於300nm至800nm之範圍中的高度。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該凸出物具有於80nm至800nm之範圍中的寬度。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之基板，其中該凸出 物具有於100nm至200nm之範圍中的寬度。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之基板，其中該凸出物之縱軸設置在相對於該基板之平面之表面的一實質法線角(normal angle)。
  15. 一種用以植入病患身體之植入裝置，其中該裝置包括一表面，該表面具有自該裝置之一表面延伸之縱向之凸出物的一陣列且其中該凸出物具有一至少2.5之圖像縱橫比，其中該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於靶細胞直徑的距離以使該凸出物至少部分抑制於其上之一靶細胞的黏附。
  16. 一種製備基板之一表面的方法，該方法包括形成縱向之凸出物之一陣列的步驟，該縱向之凸出物自該基板之該表面延伸且具有一至少2.5之圖像縱橫比的，其中該陣列之相鄰的凸出物被配置成彼此相隔一小於靶細胞直徑的距離以至少部分抑制於其上之一靶細胞的黏附。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括奈米壓印(nanoimprinting)該凸出物於該基板的步驟。
  18. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括：a)提供一模具，其具有經其延伸之縱向凹處；以及b)塗覆一熱可塑材料至該模具且在毛細力(capillary force)下允許該熱可塑材料進入該縱向凹處，以藉此產生該凸出物於該基板上。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中於該塗覆步驟中之該熱可塑材料的溫度為在該熱可塑材料之玻璃轉換溫度之上。
  20. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括：a)提供一模具，其具有經其延伸之縱向凹處；b)塗覆一可聚合溶液至該模具且允許該可聚合溶液進入該縱向凹處；以及c)在該塗覆步驟b)後，加熱該可聚合溶液，以藉此產生該凸出物於該基板上。
  21. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該形成縱向之凸出物之一陣列的步驟包括：a)提供一模具，其具有經其延伸之縱向凹處；b)塗覆一聚合溶液至該模具且允許該聚合溶液進入該縱向凹處；以及c)在該塗覆步驟b)後，蒸發該聚合溶液之溶劑，以藉此產生該凸出物於該基板上。
  22. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該基板與該凸出物之至少一個包括一生物相容聚合物。
  23. 一種抑制靶細胞黏附於與體液接觸之裝置上的方法，該方法包括：提供一裝置，其包括一基板，該基板包括縱向之凸出物之一陣列，該縱向之凸出物自該基板之該表面延伸且具有一至少2.5之圖像縱橫比的，其中該陣列之相鄰的凸出 物被配置成彼此相隔一小於靶細胞直徑的距離以使該凸出物至少部分抑制於其上之靶細胞的黏附；以及將該體液與該基板接觸。
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