TWI454693B - 整合型生物感測晶片系統 - Google Patents

Description

整合型生物感測晶片系統

本發明係有關於一種生物感測晶片，尤指一種整合微流體電動力學以及電化學檢測之生物感測晶片系統。

生物親和性感測器係一種常見的生物檢測技術，其是利用接受器(receptor)/配體(ligand)、抗體(antibodys)/抗原(antigen)或核酸(nucleic acid)雜合(hybridization)等生物親和性結合(bioaffinity binding)發生時，以電極表面生物分子的形狀、電荷、阻抗特性、質量、熱量或空間障礙等變化，進行量測的感測器。相較於諸如結合紫外光或螢光法的高效液相層析法(high performance liquid chromatography,HPLC)以及酵素連結免疫吸附分析法(enzyme-linked immuneosorbent assay,ELISA)之其他感測方法，電化學式親和性感測器可在樣本的前處理程序與儀器需求上，節省不少成本與時間。但在探針與待測物間的親和反應步驟，仍受限於待測物粒子本身以布朗運動與濃度梯度擴散的方式進行，而顯得過於緩慢，此過程往往需要一小時甚至更長的時間方能達到飽和親和反應，若遇待測物種結構太小或因濃度太低，其結合量更是受限，以致檢測極限無法再降低。

電化學式親和性感測器之檢測原理，主要分成安培法與阻抗法。當專一性的親和性探針被固定在電極表面後，並與待測樣本中的抗原進行親和反應，其結合量可透過安培法對添加於測試液內的Fe(CN)₆ ^3-/4- 或Ru(NH₃ )₆ ³⁺ 等電活性物質(electroactive mediator)進行檢測。由於電活性物質在電極介面氧化還原的程序，受到電極介面上修飾物結構產生之障礙或因化學基團可能的靜電力排斥/吸引影響，導致響應電流變化，可用來評估電極表面狀態。

阻抗法則藉由電極表面電子轉移的電阻和電雙層(electric double layer,EDL)電容的改變，即可直接量測出樣本中待測物樣本的濃度(Wu,C.C.,Lin,C.H.,Wang,W.S.,Talanta 79(2009) 62-67)。此種不需二次抗體的螢光標定或酵素反應的檢測技術，被稱為免標定式(label free)檢測法，可大幅縮短檢測時間。一般阻抗式電化學親和性感測器分為兩大類，一是電阻式感測器，藉由量測氧化還原探針(如Fe(CN)₆ ^3-/4- )在電極表面進行電子轉移的電阻改變量，來量化待測抗原濃度；其二是電容式感測器，不需添加氧化還原探針，藉由檢測時因結構物(生物辨識層)極化所造成EDL厚度改變下的電容值變化進行量測，上述之技術皆適合當作親和性生物感測器[如抗體/抗原、DNA親和、抗生物素(avidin)/生物素(biotin)等]的傳感器(transducer)界面。

近幾年微流體晶片的發展廣受討論，利用電控技術例如交流電滲流(alternating current-electroosmotic flow,AC-EOF)、介電泳(dielectrophoresis,DEP)、電熱(electrothermal effect,ELE)與誘導電荷電滲流(induced-charge electroosmotic,ICEO)等對流體、生物樣本或膠體粒子等微小物質進行控制的研究備受注目(Morgan,H.,Green,N G.,Gonz′alez,Z A.,Ramos,A.,Castellanos,A.,Journal of Physics D: Applied Physics ,36(2003) 2584-2597)。

電動力學技術中，AC-EOF適用於低導電度溶液中進行液體擾動，其原理為施加一交流電於二電極間，電解質中與電極表面之異性電離子受靜電效應影響會產生電遷移，在電極表面形成EDL。累積於電極介面之異性電荷所受施加之交流電場梯度的作用，使電極表面產生由兩電極中心向外拉伸之庫倫力，再受流體本身黏滯力推動流體產生渦流擾動(如圖10所示)，此現象被稱為AC-EOF。其特性為粒子受流體推動而移動，不受粒子的大小而改變，AC-EOF驅動頻段範圍大，且流體流動方向受施予之電場控制，可依理論根據電極的設計求得理論操作頻率，更能藉三維渦流帶動離電極遠處的待測物分子接近電極表面與探針反應。由於AC-EOF可在低導電度液與適中的驅動頻率下操作，可防止因電驅動時大量電荷傳遞於溶液間所造成的焦耳熱效應，而影響生物樣本的活性之問題。此外AC-EOF流速與施加之交流電壓成平方關係，供給適合的交流電位便能產生強勁的渦流擾動，更可防止因過大的電場梯度造成水的電解而有損檢測電極；由於AC-EOF是控制流體的流動，愈小的分子愈易被推動，因此次微米等級之待測物其移動速度不同於DEP效應，不受檢測物種的大小而影響。AC-EOF理論之操作頻率與流速可由公式(1)求得(Morgan,H.,Green,N. G.,AC Electrokinetics: colloid and nanoparticles,Research Studies Press LTD., (2003) pp. 107-109)。

其中《u》：平均流速。Ω_d =(1/2)πκL(ε_d /σ)ω。式中V_o ：施作之電壓、σ：溶液導電度、ω：角頻率。L：電極特徵長度。ε_d ：擴散層之介電係數。η：黏滯度。κ：電雙層厚度之倒數。

由上述可見，AC-EOF主要可藉由電極的設計改變流體在管道中前進與渦流旋轉的方向，增加管道中分子碰撞的機會以縮短反應時間。關於AC-EOF的應用，例如Lei團隊則利用AC-EOF設計了一個DNA濃縮器(Lei,K.F.,Cheng,H.,Choy,K.Y.,Chow,L.M.C.,Sensors and Actuators ,A 156(2009)381-387)；我國有成功大學楊瑞珍教授在交流與直流電滲流於微管道中之應用(陳佳堃，交流與直流電滲流在微管道中之應用，國立成功大學工程科學系博士論文，2007)；清大曾繁根教授則著重在AC-EOF引起平面微渦流對靜止或連續流體混合情形的探討(Huang,S.H.,Wang,S.K.,Khoo,H.S.,Tseng,F.G.,Sensors and Actuators B：Chemical. 125(2007)326-336)。前述AC-EOF大多應用於微管道中樣本的混合與幫浦功能。

微流體電動力學技術輔助生物親和性感測器檢測是將微流體電動力學控制系統應用到生物與化學的分析檢測中，其只需少量的樣本即可進行檢測，進而減少檢測時間與成本。Meinhart團隊利用高離子強度溶液與交流振幅(10V_p-p, 200kHz)藉由ETE於電極界面產生渦流擾動流體，以增強標定螢光之生物素(biotin)與蛋白質(protein)反應的時間與結合量(Sigurdson,M.,Wang,D.,Meinhart,C.D.,Lab on a Chip ,5(2005)1366-1373)。晶宇科技擁有之專利係應用上下對稱式導電基板，將探針固定於下基板，透過施予DC電壓(60V) 產生平行電場，藉此吸引或排斥核酸，以加速雜交反應(中華民國專利公告第536553號)。Hart團隊將一抗吸附於交指狀電極後透過交流振幅(2V_p-p, 100Hz)產生AC-EOF擾動，以提升與標定異硫氰酸螢光素之兔免疫球蛋白(FITC-anti-rabbit IgG)的結合率，螢光強度為沒有AC-EOF擾動強度的6.7倍(Hart,R.,Lec,R.,Noh,H.M.,Sensors and Actuators B：Chemical 147(2010)366-375)；Hart團隊於2011年使用城垛電極整合於石英晶體微天秤(quartz crystal microbalance,QCM)檢測兔免疫球蛋白，透過交流振幅(2V_p-p, 100Hz)產生AC-EOF擾動，其探針修飾量為靜置吸附的6.1倍，親和效果為靜置反應的5.7倍(Hart,R.,Ergezen,E.,Lec,R.,Noh,H.M.,Biosensors and Bioelectronics ,26(2011)3391-3397)。Chen團隊的研究，應用設計之盤環電極，經由交流振幅(1V_p-p ,1MHz)對細胞產生nDEP，聚集細胞(CD34⁺ )來加速與增量阻抗檢測的靈敏度與極限(Chen,Y.,Reboud,J.,Wang,K.Y.P.,Tang,K.C.,Ng,S.Y.,Zhang,L.,Wong,P.,Moe,K.T.,Shim,W.,Biosensors and Bioelectronics ,25(2010)1095-1101)。

綜上所述，目前諸多交流/直流電動力學之電控技術已被嵌入親和性檢測系統中來降低檢測極限，同時改善藉布朗運動或濃度梯度擴散的方式所導致檢測時間緩慢的難題。然而，其檢測方式係透過光學、石英晶體微平衡法檢測，或需要使用經標定之探針，因而導致前處理程序與儀器需求之成本過高。或者以高離子強度或高的頻率與電場強度驅動DEP或ETE等，以此方式輔助的生物樣本操控程序會因電荷主要 傳遞於液相中，產生焦耳熱而造成溫度的提升，可能會影響到生物分子(抗體/抗原)的活性或DNA的變性(Tuukkanen,S.,Kuzyk,A.,Toppari,J.J.,Häkkinen,H.,Hytönen,V.P.,Niskanen,E.,Rinkiö,M.,Törmä,A.,Nanotechnology ,18(2007)295204)，進而造成檢測時的誤差，並降低其可信度。因此，如申請人所知，現有技術並未有任何人提供將AC-EOF混合系統電極與電化學感測電極整合成同一電極組或於同一基材上，並作成生物親合性感測器的技術。在檢測晶片操作時，以DNA雜合反應為例，液體的pH值與導電度將影響DNA雜合時氫鍵的鍵結能力，從而影響目標DNA與探針DNA的雜合比率與時間。再者，雜合時液體的特性也影響AC-EOF的電控制頻率與合適的電場強度，這將影響電極介面的EDL，使操作最佳AC-EOF的理論頻率與真實頻率有異，且過高的AC-EOF驅動電壓，會致使金屬薄膜電極損毀或是使原被固定於電極表面的DNA探針產生脫落，致使量測變異度增加。基於上述可見，可靠又快速的利用AC-EOF電控系統以及電化學檢測系統之整合技術，仍為親合性生物分子偵測領域中所缺乏的技術。

有鑒於目前應用AC-EOF電控技術於親和性感測晶片中，所搭配的檢測方法僅有光學法與石英晶體微平衡法二種，而無法快速且有效的檢測奈米等級之微小生物分子，因此本發明係藉由提供整合AC-EOF於電化學式親和性感測晶片的概念與電極設計的技術，藉由AC-EOF帶動目標物流往電化學電極表面，以縮短僅藉布朗運動與擴散運動 碰撞之親和反應程序，並提升檢測靈敏度與降低檢測極限；並藉由提供適合此整合AC-EOF之阻抗式生物親和性感測晶片量測的電極設計、溶液配方與AC-EOF操作條件，而達到有效、快速檢測生物分子之目的。

因此，本發明係提供一種整合型生物感測晶片系統，其包括：一電控流體混合晶片，其係包括一基材以及至少一電極組，其中各電極組係設於該基材上並且被用作為工作電極，藉以與一待測物接觸，而電極組係於一AC-EOF控制條件操控，藉以令待測物產生微渦流而增加該待測物中之一目標物與該電極組碰撞機率；以及一電化學感測器，其係與該電控流體混合晶片之電極組相連接，藉以偵測工作電極表面的電阻或電容變化。

另一方面，本發明亦提供一種整合型生物感測晶片，其包括一基材以及至少一電極組，其中各電極組係設於該基材上並且具有：一盤電極，其係呈盤狀；一環電極，其係呈弧形並且環繞該盤電極；其中該環電極與盤電極之間形成一盤環間距。

較佳的，前述的電化學感測器係以電化學阻抗頻譜(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)進行檢測。

較佳的，前述的盤電極半徑與盤環間距比例係小於8：1，且其比例越小越佳，例如，但不限於：0.1：1、0.01：1、4：1或8：1。

較佳的，所述的盤電極半徑：盤環間距：環電極寬度之比例為係介於200：50：100至400：50：100之間。

依據本發明，前述的交流電滲流控制條件包括交流振幅係介於0.5V_p-p 至3V_p-p 之間，而頻率係介於100赫茲(Hz)至1000Hz。

依據本發明，前述的待測物之導電度係介於1.24μS/cm至150μS/cm之間。

依據本發明，電極組的盤電極以及環電極之表面固定有探針，探針可為任何生物分子，包括但不限於核苷酸、抗體、抗原、酵素或受質等；而該待測物係為具有一目標物之溶液，該目標物係為與該生物分子具有親和性之分子，例如，但不限於核苷酸、抗原、抗體、受質或酵素。較佳的，所述探針係聚核苷酸，且目標物係為具有標的聚核苷酸之溶液。

基於上述可見，本發明係提供一種整合交流電滲流之阻抗式親和性感測晶片的技術，其主要利用適合親和反應且能兼具電控條件的溶液配方，透過適當的盤環電極設計，並依理論計算取得接近最佳的驅動條件與流場效果，經由不同驅動電壓振幅條件以求得電極穩定度，可達縮短反應時間與提升檢測靈敏度之目的。本發明並可利用EIS檢測方式，將AC-EOF驅動技術整合入生物親和性感測晶片中，將有利於微小化，大量化製作、檢測便利、縮短檢測時間、降低檢測極限、提高靈敏度與成本低廉及不對辨識分子產生破壞性等優點。

本發明係以免標定式的電化學阻抗親和性感測器為實例，將專一性的DNA探針固定在電極表面並與待測樣本中 的DNA目標物進行親和性反應，由電極表面電子轉移的電阻或EDL電容的改變，即可直接量測出樣本中目標物的濃度，相較於現有技術之檢測方式可以省去許多前處理步驟，而為一種快速又準確的檢測方式。

同時，本發明整合AC-EOF微流體混合技術於EIS親和性生物感測晶片，可以改善傳統靜置狀態下僅藉布朗運動進行親和反應導致時間過長的問題。本發明以檢測DNA雜合反應為例，檢視同時適合AC-EOF驅動與DNA雜合反應所需之液體環境。一般而言，AC-EOF於低離子強度液體內有較大的EDL厚度，使較多的電荷累積於EDL內以產生較大的庫倫力作用於EDL內離子，此現象可產生較大的流速，因此可加快渦流速度，有利於流場將待測物待導引至電極表面與固定之探針層進行碰撞，然而過低的離子強度不利帶負電之DNA彼此雜合，因此合適的液體配方將被探討。

在AC-EOF的驅動中，可先透過電極設計配合溶液條件求得理論驅動頻率，由於當施加頻率低於最佳頻率時，隨著EDL的遮蔽效應增強，使得EDL層外之電場切線分量(E_t )減弱，因而降低AC-EOF流速；當相對高頻時，弛豫時間無法跟上頻率變換，沒有足夠的時間誘導電荷累積於電極表面產生EDL，亦會使AC-EOF流速下降，故欲產生最大的AC-EOF必須選擇一適當之最佳頻率，以產生最佳流速的驅動。申請人將利用理論設計電極，並實驗找出具有最好流場效果之電極尺寸與相對應之最佳AC-EOF操作條件。AC-EOF平均流速與施加電壓平方成正比，然而過大的 壓降會導致水的電解與EIS感測電極損毀，因此合宜的操作電壓也會被界定。

最後，此整合AC-EOF驅動之EIS檢測晶片將會實際量測目標DNA(target DNA,tDNA)與探針DNA(probe DNA,pDNA)的雜合反應，以比較EIS電極在有無AC-EOF驅動下，其DNA雜合反應的阻抗響應值。

本發明藉由下列實施例證實，在6.1μS/cm液體中，在200Hz與1.5V_p-p 的AC-EOF電驅動下，可使飽和親和時間能縮短至3分鐘，為靜置親和反應時間的0.033倍，其親和反應後由EIS量得之電子轉移電阻可達21.7±1.1kΩ，為靜置親和電子轉移電阻的1.43倍。

本發明將進一步藉由下面的實施例來作說明，但應明瞭的是，該等實施例僅為說明之用，而不應被視為本發明的實施上的限制。

一般實驗材料與方法 1實驗試劑與設備 1.1 實驗試劑

(1)磷酸鹽緩衝液(Phosphate buffered solution,PBS)，取等比例之NaH₂ PO₄ ．2H₂ O與Na₂ HPO₄ 以二次水進行配置，分子量分別為156.01與141.96，購自Sigma。研究中選擇適合操控導電度與適合生物樣本保存反應之pH值(NaOH調整)，做為檢測時的緩衝溶液。

(2)三羥甲基氨基甲烷((hydroxymethyl)aminomethane,Tris)，分子式NH₂ C(CH₂ OH)₃ ，分子量為121.14，購自Sigma。研究中選擇適合操控導電度與適合生物樣本保存反應之pH 值(HCl或Glycine調整)，做為檢測時的緩衝溶液。

(3)硫酸(sulfuric acid)，分子式H₂ SO₄ ，分子量為98.08，用來配置piranha溶液，購自Sigma。

(4)鹽酸(hydrochloric acid)，分子式HCl，分子量為36.48，用來調整pH值，購自Showa。

(5)氫氧化鈉(sodium hydroxide)，分子式NaOH，分子量40.00，用來調整pH值，購自Showa。

(6)硝酸(nitric acid)，分子式HNO₃ ，分子量63.01，用來配置王水，購自Sigma。

(7)正光阻與正光阻顯影劑，型號為S1818，購自Microchem，與正光阻型號為AZ4620，購自Shipley。

於本研究中用於薄膜金屬Lift-off製程中之犧牲層。

(8)負光阻與負光阻顯影劑，型號為SU-8 3010，購自Microchem，研究作微電極絕緣層，定義電極面積。

(9)異丙醇(isopropanol,IPA)，分子式(CH₃ )₂ CHOH，分子量為60.1，用來清潔電極，購自Meledla,USA。

(10)丙酮(acetone)，分子式CH₃ COCH₃ ，分子量為58.08，用來清潔電極，購自Meledla,USA。

(11)Mercaptohexanol(MCH)，分子式HS(CH₂ )₆ OH，分子量為134.24，購自Sigma。研究中用為填補(blocking)電極未鍵結上修飾物的區域，以及轉置掉非特定吸附的單股DNA。

(12)N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethane sulfonic acid(TES)C₆ H₁₅ NO₆ S，分子量為229.25，購自Sigma。研究中以NaOH調整pH值為7，做為檢測時的緩衝 溶液。

(13)氯化鈉(Sodium chloride,NaCl)，分子量為58.5，購自Showa。

(14)乙二胺四乙酸 2-[2-(Bis(carboxymethyl)amino)ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid(EDTA)，分子量為292.24，購自Sigma。

(15)Potassium hexacyanoferrate(III)，CAS：13746-66-2，分子式為K₃ Fe(CN)₆ ，分子量為329.24，純度為99.0%，購自Showa。於本研究中使用濃度為5mM配製於10mM TES中。

(16)Potassium hexacyanoferrate(II)trihydrate，CAS：14459-95-1，分子式為K₄ Fe(CN)₆ ．3H₂ O，分子量為422.39，純度為99.0%，購自Showa。於本研究中使用濃度為5mM配製於10mM TES中。

(17)標定螢光之聚苯乙烯粒子(carboxylate-modified polystyrene)，聚苯乙烯粒(polystyrene,PS)，含螢光修飾羧基的微粒(carboxylate-modified latex beads,2.5% solids,0.9~1.5g/ml)粒徑為1.0μm(L1030,yellow-green)。微粒物理性質中，介電常數2.53~2.55(25℃)，折射率1.59(590nm)，初始濃度為10⁹ /ml使用去離子水保存於-4℃冰箱，購自Sigma，依實驗條件分配至各個不同導電度溶液，以進行AC-EOF的驅動量化實驗。

1.2 實驗設備

(1)觸控式桌上型旋轉塗佈機(spin coater)：擎邦國際科技工程公司。可設定轉速、時間以及加速 度，利用高速旋轉塗佈將光阻均勻塗佈於基材上並可藉由控制不同轉速得到所需之光阻厚度。

(2)曝光機(mask aligner)：可以調整曝光時間和曝光劑量，並將光罩與晶片對準的功能，與顯影蝕刻後微電極的檢查等步驟。由科毅科技有限公司出產之曝光機，型號為AG350-4N-S-S-S-H。

(3)氧氣電漿(oxygen plasma)：型號為Femto，購自德國Diener electronic公司。直徑及深度分別為10cm與27cm之艙體；真空度約0.2~1mbar。研究中用於改質PDMS於親水。

(4)微量天平：型號為AL104，購自Metter Toledo。研究中為準確量測藥品所需之重量。

(5)酸鹼度計(pH meter)：型號為6173pH+R，購自Jenco公司。研究中用為量測緩衝液與樣本之pH值。

(6)電化學阻抗分析儀：購自IM-6 impedance analyzer，檢測模式除EIS分析外也含有循環伏安法(cyclic voltammetry,CV)等功能。研究中用以評估電極表面狀態，並搭配有Thales模擬電路系統，可模擬出各電路組件相對應數值。

(7)原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)：物理系何孟書老師實驗室，型號為Dimensional 3100，購自Veeco(United States)。研究中用以計算電極表面粗糙度。

(8)表面輪廓儀(surface profiler)：購自Ambios technology(Santa Cruz)公司，型號為XP-1。在本研究中用於量測負光阻電極高度。

(9)溫控水浴槽：將進行電鍍或雜合實驗時所需電鍍液與DNA回溫用。由BRASON司出產。

(10)螢光式顯微鏡：Olympus，型號為IX71。配有落射(正立式)之鹵素光源、透射底座(倒立式)之鹵素光源以及螢光之汞燈光源，可供不同樣本設計之使用，做即時觀測懸浮膠體或DNA擾動情況。

(10)相機：型號Nikon E5000，拍攝微電極。

(11)信號產生器：Agilent 33220A函數產生器提供11種標準波形加上脈衝及任意波形，提供了同等級函數產生器中最穩定的頻率及最低的失真。在實驗中用來進行電控。

(12)高速離心機：Hettich公司出產，型號為EBA 21。於本研究中用於收集DNA。

(13)溫控水浴槽：凱欣有限公司出產。於本研究中用於回溫冷藏之DNA。

(14)無菌操作台：造鑫企業有限公司出產。於本研究中用於DNA分裝至適合濃度。

(15)導電度計： Eutech公司出產，型號為con510，本研究中用於量測電控與雜合溶液配方的導電度值。

(16)ITO透明導電玻璃：購自佳佑公司，型號code007，導電玻璃厚為7mm，為具研磨拋光之ITO鍍膜，厚度為260±20nm，片電阻(sheet resistance)為小於等於7Ωcm^-1 。本研究中製作盤環電極量化螢光粒子之流速。

2.核酸檢測流程

實施例中所使用核酸序列，委託Bio Basic Inc.公司代為合成，以HPLC方式純化，滴入105μL去離子水(D.I.water)到含有DNA粉末管內並離心脫附黏於管壁上的DNA，其濃度為100μM，再以配置溶液為Tris(NaCl)調配成1μM DNA。

金電極以piranha(2分鐘)、aqua regia(1分鐘)清潔後，再透過電化學清潔(electrochemical clean)於10mM PBS以循環伏安法往負電位掃引(0~-1.5V)直到波型穩定，以此電極做為後續DNA檢測電極。

實驗流程如下：

步驟1：在電極上滴上15μL的1μM探針(probe)-DNA(pDNA)配方(Tris(NaCl)或Tris(EDTA))溶液修飾2小時，此時硫醇分子藉由金硫鍵結，固定到金電極表面，以去離子水清洗後滴上20μL的Tris(NaCl)中10分鐘，讓未鍵結的DNA游離電極表面，再次經去離子水清洗後使用EIS與CV評估所修飾之探針多寡。

步驟2：滴上20μL的1mM MCH(製備於去離子水中)溶液中1小時，以去離子水潤濕後再滴上10μL去離子水10 分鐘，讓未鍵結之MCH游離於電極表面後，再以去離子水清洗後使用EIS與CV檢測作為與目標物雜合反應前的背景參數值。

步驟3：滴上20μL不同實驗所需濃度的目標物DNA(target-DNA,tDNA)製配於Tris(NaCl)或1mM Tris(pH 9.3)溶液進行無AC-EOF下的雜合反應，最後取出浸泡到250μL的10mM Tris-HCl(pH 7.0)中10分鐘，以脫附未雜合的tDNA，完成電極的雜合程序後使用EIS與CV進行量化評估。

步驟3’：滴上20μL的tDNA其緩衝液為1mM Tris，用信號產生器產生AC-EOF，120秒(因為使用電場約300V/cm，為防止電極連續使用而損毀，或造成法拉第反應產生氣泡，每電控30秒時停止10秒，進行電極過剩電荷放電以確保電極安全)。表1為實驗中所使用DNA序列。

3. 電化學量測 3.1 檢測溶液配方

實驗中選擇添加5mM Fe(CN)₆ ^3-/4- 的10mM TES緩衝溶液其pH值皆調整7，其導電度為4.08mS/cm。實驗流程為將靜置雜合與AC-EOF後雜合反應，其過程分別以該溶液進 行EIS量測，以1nM tDNA進行雜合反應。

3.2 CV與EIS檢測條件與分析

以三電極式電化學之檢測系統探討實施例中的親合性感測器的金工作電極表面狀態，分別以Ag/AgCl為參考電極以及白金(Pt)為輔助電極，掃描速率20mV/s，掃描範圍為-0.2~0.6V。

當待測物分子固定於電極表面時，由於待測物化學電性與結構改變原本的介面特性，隨著電極介面修飾物的不同，會因不同的物理化學特性反應出不同的電阻、電容或相角變化之響應，因此便可以利用阻抗頻譜分析來評估電極上修飾層的狀態。阻抗分析的量測也是三電極式方式進行，參考電極為Ag/AgCl、對極為白金(Pt)，掃描頻率範圍為1Hz~100kHz，在工作電極上施加+0.21V的直流準位與±5mV的AC訊號進行檢測。

3.3 EIS等效電路設計

EIS量測後可得由阻抗實部與虛部所組成之奈氏圖與相對應於頻譜之波得圖(如圖1)。隨後可建立等效電路模型對所測之EIS頻譜圖進行模擬。表面修飾層不緻密且在低頻範圍下，會有電活性物質的淨氧化還原發生致使擴散產生，實驗中等效電路須以Z_w 元件模擬擴散阻抗的部份，如圖2(a)所示。反之，當修飾物如DNA或MCH修飾後，使得反應沒有擴散部份出現時(如奈氏圖三角標示所示)，Z_w 元件就必須拿掉，以R_et 並聯CPE的方式進行模擬，如圖2(b)所示。

實施例

首先探討不同導電度溶液，於盤環電極模式之固定電極 間距(D_gap ：50μm)下，依電學理論計算取得之較佳驅動頻率與流速。為了能夠清楚量化流速，選擇利用標定螢光之膠體粒子於透明銦錫氧化(indium tin oxide,ITO)電極與光學法探討不同導電度液之AC-EOF流速。

盤環狀ITO電極製作如圖3所示，採用微機電製程製作電極，以微影蝕刻技術先定義正光阻(S1818,Microchem)犧牲層，再將非電極區的ITO蝕刻，隨後去除正光阻犧牲層，最後經由負光阻(SU-3010,Microchem)當作絕緣層定義工作電極面積，以得到ITO電極圖樣。

電極製作完成後，於振幅為3V_p-p 條件下探討不同導電度溶液(1.24μS/cm,6.1μS/cm與110μS/cm)下之AC-EOF最佳流速，並比較理論計算(公式(1))與實驗所相對應的最佳流速的頻率，其理論計算結果如圖4a所示。上述三種導電度液所得之數值計算的最佳驅動頻率分別為71、172和618Hz。而其實驗結果則藉由螢光式顯微鏡觀察標定螢光之聚苯乙烯粒子進入盤電極邊緣後0.5-1.0s時間區間內的移動速度，以定義AC-EOF流速(如圖4b所示)，實驗驗證最佳驅動頻率分別約為75、150~200和600~700Hz。說明經由理論計算求得所使用溶液(不同導電度)與電極設計之系統下，產生AC-EOF的最佳頻率與實驗值相差不遠，但由於理論公式無法正確描述在不同導電度溶液下AC-EOF流速的差異，此時須以電三層(electric triple layer)模型對理論公式(1)修正如公式(2)(Jiang,H.Li,S.,Ren,Y.,Jie,W.,Electric-triple-layer model based AC electroosmosis flow ,http：//arxiv.org/abs/1006.4061v1)。

λ_s ,λ_m 與λ_d 分別為Stern層(Stern layer)、中層(middle layer)與擴散層(diffuse layer)的厚度。通常λ _s ≒0.5nm，近似於漢姆茲層；λ _m 其厚度受其表面粗糙度影響，由原子力式顯微鏡實際量測ITO表面粗糙度為4nm，Λ為電黏效應之衰減因子。

依照圖4b實驗所得之最佳頻率產生最大流速下的粒子所相對應於電極邊緣之距離，定義公式(2)中的L，並且調整Λ值使其最大流速與實際值吻合，依此方式可得圖4c，並由電三層理論推得若導電度高於150μS/cm以及1kHz的驅動頻率下會使得流速下降至25μm/s以下，因此在實驗中不再探討超過其範圍之條件。

接著選擇上述導電度為6.1μS/cm的溶液，同樣外加電控3V_p-p 頻率200Hz下進行最佳AC-EOF的控制，並比較濃度為10^-17 mole/ml螢光粒子懸浮液(實驗材料(17))在盤-環電極之尺寸於固定盤環間距D_gap ：50μm與環電極寬W_ring ：100μm下，但盤電極半徑R_disk 分別為200μm、300μm與400μm的ITO電極(實驗設備(16))上，以螢光式顯微鏡(實驗設備(10))觀察AC-EOF驅動2分鐘後在盤電極上沈降的螢光粒子數目，藉由分析軟體為ImageJ軟體(Research Services Branch,National Institute of Mental Health,Bethesda,Maryland,USA.)量化在盤電極上的螢光亮度以進行螢光粒子收集之量化分析。

結果如圖5所示，單一電極不同半徑下所量化的螢光強度為R_{disk200 μm} ：R_{disk300 μm} ：R_{disk400 μm} =750.8±24.9：953.8±232.1：1422.8±301.9，其單位為任意單位(arbitrary unit)，若考量粒子總滴入量與總工作面積(R_{disk200 μm} ：R_{disk300 μm} ：R_{disk400 μm} 總電極數為16：7：4)則可得標準化後單一根電極的粒子收集量，為 2.11：1.73：1，此結果顯示盤電極半徑愈小，在相同的總工作電極面積下，可得愈多的粒子。膠體粒子皆能經由AC-EOF的作用被收集於盤電極中心，也由此說明待測物種能藉由AC-EOF渦流導引遠離電極表面之待測物種由盤電極邊緣往內移動集中，提升待測物與未來修飾於電極表面生物辨識層碰撞親和的機會。並由實驗提出，以盤-環電極為例，當盤電極半徑與盤環間距比率愈小時(如8：1以下)，具有較佳的收集效果。

以上述實驗盤環電極R_disk ：200 μm、D_gap ：50 μm與W_ring ：100 μm尺寸為例，製作薄膜金電極，其步驟如圖6所示。清潔好的玻片(76×26 mm)表面潔淨度提高，可使光阻塗佈的均勻性變好，也可使蒸鍍或濺鍍上的薄膜金屬與基材有較好的黏附性。

玻璃塗佈之前，為確保沒有殘留的油污和粉塵，對玻璃基材進行清潔，步驟如下：

(1)將玻片浸入去離子蒸餾水(D.D. water)中，用超音波震盪5分鐘，重複3次。取出吹乾後放入IPA中，超音波震盪30分鐘，再放入去離子蒸餾水超音波震盪5分鐘重複3~5次，移除殘留的IPA。取出吹乾後改放入piranha(3：1的H₂ SO₄ 與H₂ O₂ )溶液中，隔水加熱到80℃後超音波震盪30分鐘，之後同樣取出放入去離子蒸餾水中，超音波震盪5分鐘重複3~5次，移除殘餘piranha溶液。將清潔好的玻片取出於95℃下烘烤5分鐘，去除玻片上殘餘水分。

(2)以旋轉塗佈方式塗佈上正光阻(AZ4620,Shipley)，條件為第一轉500 rpm 10秒，第二轉3000 rpm 40 s，其厚度約為2 μm。塗佈好的玻片置於95℃加熱板上軟烤(soft bake)10分鐘，之後退火到室溫。軟烤的目的為將光阻中的溶劑蒸發，可增加光阻與玻片間的附著力。

(3)利用光微影蝕刻方式製作相對之電極圖樣的正光阻犧牲層，先將玻片放於波長365 nm的紫外光下，並以光罩隔絕其餘光線，光罩上為所設計的電極圖樣，曝光劑量為135 mJ/cm² 。

(4)將顯影原液與去離子蒸餾水以1：2稀釋，進行顯影約2分鐘，利用去離子蒸餾水去除殘餘顯影液後。

(5)以蒸鍍或濺鍍方式在晶片上逐步沉積20 nm Ti層作為黏著層，與200 nm Au層。蒸鍍好的電極浸入丙酮溶液(acetone solution)中可移除正光阻犧牲層，得到金薄膜電極圖樣。為了定義電極面積，需在電極上覆蓋一層負光阻作為絕緣層，製作程序如圖6所示。將清潔好的電極於95℃下烘烤5分鐘，去除殘餘水分。後續定義金薄膜電極面積。

(6)以旋轉塗佈方式塗佈上負光阻SU-3010，條件為第一轉500 rpm 10秒(s)，第二轉2500 rpm 40秒(s)，其厚度約為6~8 μm。置於加熱板上進行軟烤(soft bake)時間為65℃ 3秒後，以95℃ 10秒，之後退火到室溫。

(7)之後將電極放於波長365 nm的紫外光下，曝光劑量為320 mJ/cm² 。將曝光後晶片置於加熱板上進行曝後烤(post bake)，此時光線照射到的光阻會進行交聯，曝後烤可幫助交聯程度增加。

(8)之後直接利用負光阻顯影原液進行顯影約2分鐘，再以乾淨的負光阻顯影原液、IPA沖洗後，置於150℃加熱板上硬烤(Hard Bake)10分鐘，強化光阻對晶片表面的附著力。完成電極絕緣層30製作，定義電極工作區域(盤環微工作電極共16組，其中盤電極10之總面積為2 mm² ，環電極20之環寬為100 μm，盤環間距40為50 μm)，最終完成薄膜金電極製作，如圖7所示。

本實施例中，探討工作電極固定探針，比較靜置與電控後目標物進行親和反應之後的電子轉移電阻變化量。

以下進一步探討晶片在雜合前受電控驅動之穩定性。由於過大的AC-EOF驅動電壓可能會造成電極的損毀現象或金硫鍵的斷鍵而導致探針的脫落，甚者造成凡德瓦力的特異性吸附。因此申請人將嘗試使用不同振幅之電壓(1 V_p-p 、1.5 V_p-p 、2 V_p-p 、2.5 V_p-p 、3 V_p-p 、5 V_p-p 與8 V_p-p )，固定頻率為200 Hz於導電度為6.1 μS/cm溶液中，電控時間為每30秒停止10秒共計180秒以避免焦耳熱累積，以前述「核酸檢測流程」中所述之步驟1、2、3或3’，試驗適合盤環狀薄膜裸金電極與DNA探針(probe DNA,pDNA(Bio Basic Inc.)層對於後續目標DNA(target DNA,tDNA(Bio Basic Inc.)雜合反應於系統的驅動電壓條件。

圖8a顯示經AC-EOF電控前(R_et-bare )後(R_{et-bare-ACEOF} )盤環狀薄膜裸金電極電阻值變化(△R_et-AC-EOF =R_{et-bare-ACEOF} -R_et-bare )，隨著驅動電壓的增加，△R_et-AC-EOF 有些微的上升，主要是由於在施加電壓時可能產生金氧化膜的生成，但是於3 V_p-p 後，可由顯微鏡觀察到有嚴重的水電解氣泡產生。因此為了確保薄膜裸金電極之穩定為前提，將選用3 V_p-p 以下之振幅進行pDNA固定層穩定性評估。

圖8b顯示AC-EOF電控電極經前述「核酸檢測流程」中所述之步驟1與2後，已有pDNA與巰基己醇(mercaptohexanol)(MCH,Sigma)修飾之MCH/pDNA複合層對溶液中添加的Fe(CN)₆ ^3-/4- 的電子轉移電阻(R_et-MCH )的變化(△R_et-AC-EOF =R_{et-MCH-AC-EOF} -R_et-MCH )。當驅動電壓為1 V_p-p 與1.5 V_p-p 時，顯示△R_et-AC-EOF 並無顯著改變，可判斷於此二條件下並不會有顯著MCH/pDNA複合層結構脫落或損毀。當頻率電壓提升至2 V_p-p 與2.5 V_p-p 時△R_et-AC-EOF 開始有嚴重的增幅，推論可能是流體與電場使MCH/pDNA複合結構層產生非特異性吸附之傾倒。當電壓提升至3 V_p-p ，其△R_et-ACEOF 有很大的偏差量，亦有觀察到電解水反應的發生，可推論複合層損毀極為嚴重，因此阻抗變化的變異度甚大。

有鑑於此，由上述之結果，申請人利用硫醇與金進行共價性鍵結的方式固定DNA探針於上述盤環狀薄膜金電極上，所使用之盤環工作電極R_ring ：200 μm共16組，盤電極總面積為2 mm² ，環寬為100 μm，盤環電極間距為50 μm。

導電度以6.1 μS/cm為例，使用振幅為1.5 V_p-p 頻率為200 Hz之電控條件，來討論進行AC-EOF驅動下雜合時間對反應的影響，其雜合程序如前述「核酸檢測流程」中所述之步驟3’。結果顯示如圖9，能成功透過電驅動AC-EOF使飽和親和時間能縮短至3分鐘，為靜置親和反應時間的0.033倍，其親和反應後由EIS電化學量測程序與圖2b之EIS等效電路設計分析量得之電子轉移電阻可達21.7±1.1 kΩ，為靜置親和電子轉移電阻的1.43倍。

<110>　國立中興大學

吳，靖宙

楊，東潔

<120>　整合型生物感測晶片及其系統

<130>　P99638

<160>　2

<170>　PatentIn version 3.4

<210>　1

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　DNA探針，來源為Salmonella

typhmurium，全長20員(mer)，在5'端修飾上硫醇基，並設計6個碳鏈間距

<220>

<221>　modified_base

<222>　(1)..(1)

<400>　1

<210>　2

<211>　20

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>　

<223>　目標物-DNA,來源為Salmonella typhmurium，全長20員，與DNA探針完全互補

<400>　2

10．．．盤電極

20．．．環電極

30．．．絕緣層

40．．．盤環間距

圖1(a)係阻抗實部與虛部所組成之奈氏圖，圖1(b)之上圖為不同掃描頻率下總阻抗值(包含實部與虛部，其單位為歐姆)，右下為不同掃描頻率所對應阻抗元件之相角圖(矩形線表示有擴散效應影響之介面現象，三角則否)。

圖2(a)與圖2(b)係分別為電極介面有擴散現象(a)與無擴散效應時(b)所使用等效電路圖，其中R_s 為溶液等效阻抗，CPE常相位元件所表之電雙層等效電容，R_et 為電子轉移阻抗，Z_w 為擴散引起的阻抗。

圖3係盤環狀ITO檢測電極製作流程示意圖，其中最後取得ITO之盤環電極組(盤半徑(R_disk )：500 μm、盤環間距(D_gap )：50 μm與環寬(W_ring )：500 μm)。

圖4係以公式(1)模擬(a)、實驗(b)與以公式(2)模擬於盤環電極(R_disk ：500 μm、D_gap ：50 μm與W_ring ：500 μm)上施加驅動電壓3 V_p-p 條件下，比較評估不同導電度溶液(1.24 μS/cm,6.1 μS/cm與110 μS/cm)之平均流速-頻率之特性曲線圖。

圖5係於盤-環ITO電極(固定D_gap ：50 μm與W_ring ：100 μm。R_disk 分別為：200 μm、300 μm與400 μm)，施加3V_p-p ，200 Hz於6.1 μS/cm溶液2分鐘之螢光收集量化分析圖，其中信號值取之部分為電控後盤電極所對應之單一電極的螢光強度(n=3)。

圖6係盤環狀薄膜金電極製作流程圖。

圖7係完整盤環金電極外觀圖，其中盤電極10半徑R_disk ：200 μm、環電極20寬W_ring ：100 μm與盤環間距40D_gap ：50 μm。工作電極總面積為2 mm² 。

圖8係盤環裸金電極(a)與經MCH/pDNA修飾後之盤環金電極(b)隨不同AC-EOF驅動電壓(1 V_p-p 、1.5 V_p-p 、2 V_p-p 、2.5 V_p-p 、3 V_p-p )於頻率為200 Hz之導電度為6.1 μS/cm溶液中，以電控時間為每30 s停止10 s共180 s之EIS電阻變化量(△R_et-AC-EOF =R_{et-MCH-AC-EOF} -R_et-MCH )之曲線圖(n=3)。

圖9係經MCH/pDNA修飾後之盤環金電極隨在導電度為6.1 μS/cm溶液中親和反應時間與相對應EIS電阻變化量(△R_et =R_et-tDNA -R_et-MUA )。(n=3)之曲線圖，其中紅線為靜置方式親和反應，藍線為有AC-EOF電控親和反應。

圖10係AC-EOF驅動方式之理論示意圖，其中虛線所指為電場方向；綠球表示陽離子；紅球表示陰離子；藍色箭頭表示流體渦流方向；紅箭頭表示庫倫力方向。

Claims (5)

1. 一種整合型生物感測晶片系統，其包括：一電控流體混合晶片，其係包括一基材以及至少一電極組，其中各電極組係設於該基材上並且被用作為工作電極，藉以與一待測物接觸，而電極組係於一交流電滲流控制條件操控，藉以令待測物產生微渦流而增加該待測物中之一目標物與該電極組碰撞機率；其中各電極組具有一盤電極，其係呈盤狀；一環電極，其係呈弧形並且環繞該盤電極；其中該環電極與盤電極之間形成一盤環間距；其中該交流電滲流控制條件包括交流振幅係介於1.5V_p-p 至3V_p-p 之間，而頻率係介於100赫茲(Hz)至1kHz；其中各電極組表面固定有親和性探針；以及一電化學感測器，其係與該電控流體混合晶片之電極組相連接，藉以偵測工作電極表面的電阻或電容變化；其中電化學感測器係以電化學阻抗頻譜(electrochemical impedance spectroscopy,EIS)進行檢測。
2. 如申請專利範圍第1項所述之整合型生物感測晶片系統，其中該盤電極半徑與盤環間距比例係小於8：1。
3. 如申請專利範圍第2項所述之整合型生物感測晶片系統，其中盤電極半徑：盤環間距：環電極寬度之比例為係介於200：50：100至400：50：100之間。
4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之整合型生物感測晶片系統，其中該待測物溶液之導電度係介於1.24μS/cm至150μS/cm之間。
5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之整合型生 物感測晶片系統，其中該親和性探針係聚核苷酸，且該目標物係聚核苷酸。