TWI448251B - 諾麗果發酵液及其除臭及保存之製備方法 - Google Patents

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諾麗果發酵液及其除臭及保存之製備方法
本發明是有關於一種諾麗果發酵液，特別是有關於一種諾麗果發酵液及其除臭及保存之製備方法。
隨著時代的演進，現代人對於健康越來越重視，從舊時認為藥品可以有病治病無病強身的「藥補」觀念，轉變為利用健康飲食以預防疾病的養生概念。這些保健意識的抬頭也提供了保健食品市場大量的商機以及帶動食品科技產業的發展，而如何保持食物的營養價值且改善不良風味以提供消費者較佳的口味選擇便成為食品加工技術之一大重要課題。
諾麗(Noni,Morinda citrifolia)為一種盛產於南太平洋群島之熱帶植物，其根、莖、葉、果實、種子與樹皮皆含有多種有益身體健康之植物成分。經由許多生理活性的研究顯示，諾麗果具有抗氧化、抗病毒、抗細菌、抗真菌、抗癌症、抗腫瘤、抗發炎及降血壓等功效，因此目前市面上諾麗果相關產品也越來越多。而研究中也證實諾麗果肉中含有多種酵素，可促使成熟的果實進行自消化分解，進而增強有效成分的生理活性。因此，一般認為諾麗果發酵產品之生理活性較新鮮果汁為佳。
然而，傳統諾麗果汁之發酵時間需花費6至12個月，不僅費時且增加成本，而長時間發酵也會降低果汁之有效功能性。研究指出長時間發酵會降低諾麗果汁之二苯聯苦基(1,1-Diphenyl-2-picrylydrazyl，DPPH)自由基之清除能力，破壞不穩定之抗氧化物，且果汁中許多功能性化合物，如東茛菪素(scopoletin)與芸香素(rutin)亦會有減少之趨勢。另外，熟成之後的諾麗果實具有刺激性臭味，也成為相關產品開發上的一大障礙。
目前在諾麗果發酵方法中，台灣專利案(TW201109025)掲露一種諾麗果萃取液及其製法與應用產品，其製造方法係將乾燥後的諾麗乾果原料以醋液浸漬，並以鹼性溶液調整pH值以得到弱酸性至中性之諾麗果萃取液，並藉此萃取液搭配其他基底組份進一步製成方便塗抹或噴塗的護膚產品。而在諾麗果除臭方法中，台灣專利案(TW200822869)則掲露一種諾麗果除臭發酵法，其係將諾麗果乾燥後置於具有發酵活菌之醋液中發酵，利用發酵活菌去除諾麗果原有之刺鼻臭味，以獲得除臭之諾麗果萃取液。
由上述前案可知，在諾麗果的發酵方法中尚未有一較傳統發酵時間短且可確保發酵物生理功效之黃金發酵時間。而除臭方法部份，相關前案(TW200822869)係利用發酵活菌將易揮發性物質分解，然而這些易揮發性物質同時也扮演功能性化合物的角色，具有抗氧化、抗發炎等功效，故該前案之除臭方法恐會降低果汁的生理活性。因此，本發明為改善上述問題，提供一種諾麗果發酵液及其除臭及保存之製備方法，其發酵時間短，可保留諾麗果的生理活性，且利用螯合方法，於諾麗果發酵液中添加鹼性成分，不僅可除臭，也可保留原有之生理活性，更可進一步提供消費者更多的營養來源。
有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之目的就是在提供一種諾麗果發酵液及其除臭及保存之製備方法，以解決因長時間發酵而導致諾麗果發酵液之生理活性降低的問題，另外也可改善傳統諾麗果發酵液之刺激性臭味，並且也可添加額外的鹼性成分，提供消費者更多的營養來源。
根據本發明之目的，提出一種諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法，其步驟包含：將諾麗果洗乾淨後自然風乾一預定時間後，取得一熟化諾麗果實；接著將熟化諾麗果實進行兩階段發酵步驟，其包含將熟化諾麗果實去除種子後，置於曝氣式發酵桶內，於24℃~30℃溫度下發酵1~2天、接著置於密封式發酵槽內，於24℃~30℃溫度下發酵18~28天，再進行一第一離心步驟以取得第一溶液；將鹼性化合物以微電腦自動滴定裝置滴定計算其添加量後添加於第一溶液中以取得第二溶液，其中所添加之鹼性化合物包含氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鈉或其組合，且第二溶液之pH值係為6.5~7；接著於第二離心步驟後，置於水域槽內以60～70℃之溫度逐步加熱，進而的到諾麗果發酵液。
較佳地，諾麗果自然風乾之預定時間為1~4天。
較佳地，在兩階段發酵步驟前，更包含以攪碎機將熟化諾麗果實打碎，並藉由粗細分離機將該熟化諾麗果實之果肉與種子分離之步驟。
較佳地，在第二離心步驟前，更包含將第二溶液攪拌後置於0~10℃之溫度16~18小時之步驟。
根據本發明之另一目的，提出一種如上所述之製備方法所製造之諾麗果發酵液。
較佳地，本發明所揭露之諾麗果發酵液，其鈣含量為1~2.5 mg/ml。
呈上所述，依本發明之諾麗果發酵液及其除臭及保存之製備方法，可具有一或多個下述優點：
(1)　本發明之諾麗果發酵液之保存之製備方法可縮短傳統諾麗果發酵液之發酵時間，藉此可降低因長時間發酵而導致生理活性流失之問題。
(2)　本發明之諾麗果發酵液之除臭之製備方法可消除傳統諾麗果發酵液之刺激性臭味，藉此可使消費者廣泛接受其相關產品，並提升諾麗果發酵相關產品之利用性。
(3)　本發明之諾麗果發酵液添加額外的鹼性成分，可增加其營養價值，提供消費者更多營養來源。
本發明將藉由下述之較佳實施例及其配合之圖式，做進一步之詳細說明。需注意的是，以下各實施例所揭示之實驗數據，係為便於解釋本案技術特徵，並非用以限制其可實施之態樣。
實施例1：諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法
請參閱第1圖，其係為本發明之諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法之一實施例流程圖。此流程步驟說明可使本領域具有通常知識者能夠清楚了解，並可據以實施。
第1圖中，步驟S11，採取諾麗果實並以特製鋼刷毛之刷具清洗；步驟S12，將上述之諾麗果實自然風乾1-4天以除去水果表面的水分，進而取得熟化之諾麗果實，熟化諾麗果實以其果實顏色由綠色轉為米白色為基準判斷，且質地較未成熟之果實軟；步驟S13，將熟化之諾麗果實以攪碎機將熟化之諾麗果實打碎並以粗細分離機將熟化諾麗果實之種子去除；步驟S14，將上述之果肉實進行兩階段發酵步驟，先將其置於曝氣式發酵桶內，以排除發酵所產生的氣體方式於24℃~30℃溫度下發酵1~2天進行曝氣發酵；步驟S15，接著將已經過曝氣發酵的熟化諾麗果實置於密閉式發酵槽內，以非接觸空氣的方式於24℃~30℃溫度下發酵18~28天進行厭氧發酵後，接著利用離心機離心以進行第一離心步驟以取得第一溶液，此步驟係將果肉與發酵液體分離；步驟S16，以微電腦自動滴定裝置滴定計算鹼性化合物之添加量後添加於上述第一溶液中，並調整諾麗果發酵液之pH值至6.5~7，以取得第二溶液。其中，鹼性化合物可為氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鈉、或其組合，較佳為氫氧化鈣。加入鹼性化合物可與第二溶液中導致刺激性臭味來原之揮發性物質螯合，進而達到除臭的效果；步驟S17，將上述第二溶液於攪拌後置於0~10℃之溫度16~18小時，接著以離心機離心以進行第二離心步驟，再置於恆溫水浴槽內逐步加熱至60~70℃之溫度後，再逐步降溫至常溫，以取得活性穩定之諾麗果發酵液。此加熱步驟可使諾麗果發酵液之色澤、功能性成份含量、及生理活性較穩定，有利於產品長時間保存之品質維持。
實施例2：諾麗果發酵液之成分分析
將諾麗果實以上述實施例中之方法製備成諾麗果發酵液，接著分別以無添加鹼性化合物之諾麗果發酵液(後文以無添加-諾麗果發酵液表示)、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，測定其水分、灰分、粗蛋白、以及粗脂肪含量，以了解添加鹼性化合物後之諾麗果發酵液是否會影響基本組成分。
水分之測定係在秤到恆重的容器中分別加入待測品各10ml，並紀錄重量，放入烘箱中以100℃乾燥，秤至恆重為止，並以下列公式計算：
水分含量(%)=(W1-W2)/W3×100%
W1：乾燥前待測品與容器重(g)
W2：乾燥後待測品與容器重(g)
W3：乾燥前待測品重(g)
灰分之測定係將坩鍋以10%的鹽酸煮兩小時，以去離子水沖洗乾淨後置乾，再放入灰化爐以525℃之溫度加熱8小時後，置於乾燥箱回溫後秤重。接著在坩鍋中分別加入待測品各10ml，並在烘箱中以100℃乾燥8小時，再移至灰化爐中以525℃灰化18小時。灰化完成後將待測品置於乾燥箱中回溫並秤重，並以下列公式計算：
灰分含量(%)=(W1-W2)/W3×100%
W1：灰化後待測品與坩鍋重(g)
W2：坩鍋重(g)
W3：待測品重(g)
粗蛋白之測定係在玻璃消化管中分別加入待測品各10ml、一顆消化碇、3-5顆沸石及20ml濃硫酸，以凱式氮分解裝置加熱400-450℃消化2~3小時，等待測品從黑褐色變成澄清即可取出冷卻。接著加入40ml去離子水，於凱式氮蒸餾裝置上加入氫氧化鈉溶液後進行蒸餾，在錐形瓶中加入4%硼酸且添加2-3滴BG-MR指示劑(溴甲酚綠+甲基紅)用以接收蒸餾液的氨氣，收集到總體積160ml即可取出。最後以0.1N HCl滴定至與空白組相同顏色，紀錄所消耗HCl的量，以下列公式計算粗蛋白含量：
粗蛋白量(%)=[(V1-V2)×0.0014×N.F]/W×100%
V1：樣品消耗的HCl滴定量(ml)
V2：空白組消耗的HCl滴定量(ml)
N.F：氮係數(6.25)
0.0014：1mL 0.1N HCl(0.0001mole)×氮的分子量14，故滴定1mL 0.1N HCl之相對氮量為0.0014 g
W：樣品重(g)。
而粗脂肪之測定係分別取20ml待測品至烘箱中乾燥成粉末後刮下秤重，將乾燥好的粉末以秤量紙包覆好放置於頂針中，並於烘箱中以100℃乾燥2~3小時，接著在頂針中加入脫脂棉及在乾燥秤重後之萃取杯中加入40ml的石油醚後將兩者裝上萃取裝置開始萃取。萃取完成後將萃取杯於抽風櫃中以加熱板緩慢加熱至石油醚完全揮發，然後放在乾燥器中冷卻秤重。
粗脂肪含量(%)=(W3-W1)/W2×100%
W1：萃取杯乾重(g)
W2：乾燥待測品粉末重(g)
W3：經萃取後萃取杯加待測品萃取物重(g)
由表一可以得知，加入氫氧化鈣和碳酸鈣的諾麗果發酵液，其水分較無添加-諾麗果發酵液僅有些微的降低，且因礦物質增加導致其灰分增加。在粗蛋白及粗脂肪方面，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液與無添加-諾麗果發酵液之間沒有顯著的差別。整體而言，於諾麗果發酵液中添加鹼性化合物並不會影響其基本組成分。
表一
每一待測品之樣本數為3，且其結果均在統計上有顯著差異(p＜0.05)
實施例3：諾麗果發酵液之含鈣量分析
將諾麗果實以上述實施例中之方法製備成諾麗果發酵液，接著分別以無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，作為待測品，測定其含鈣量。
含鈣量之測定係分別取5ml之待測品置於以10%的鹽酸煮兩小時後以去離子水沖洗乾淨之坩鍋中以100℃乾燥至恆重，並置入灰化爐中以550℃灰化15小時。接著在坩鍋中加入5ml 10%鹽酸，在加熱板上加熱至冒煙後過濾至100ml定量瓶中，以去離水定量到100ml後從中取出2ml置於另一個100ml定量瓶，在定量瓶中加入1ml的LaCl3 並以去離子水定量到100ml，接著以原子吸收光譜儀(AAS)進行分析。
將1000ppm的鈣標準溶液(calcium standard solution)稀釋成2、4、6、8ppm，以AAS分析製成標準曲線。樣品經AAS分析後自動帶入標準曲線算出樣品中鈣含量。
其結果如表二所示，無添加-鈣諾麗果發酵液中鈣含量為0.07 mg/ml，而添加氫氧化鈣及碳酸鈣後，其鈣含量分別提高到1.77 mg/mL和1.56 mg/mL，因此以本發明之一實施例之方法所製備之含鈣諾麗果發酵液其鈣含量確實有明顯的提升。
表二
每一待測品之樣本數為3，且其結果均在統計上有顯著差異(p＜0.05)
實施例4：諾麗果發酵液之風味分析
以無添加諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，分別測定其風味變化。
風味變化之測定係分別取20ml之待測品加入7.14g的食鹽以達到飽和，使溶在發酵液中之揮發性物質釋放出來。接著在60℃水浴平衡15分鐘後，將注射針插入上方空間30分鐘以讓揮發性物質充份吸附於聚合物纖維中，並立即注入氣相層析儀(GC)中以分析其風味變化。
參閱第2圖至第4圖，其係分別為無添加諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液中之揮發性化合物氣相層析圖。藉由氣相層析儀之分析可分別偵測三種待測品中構成不良風味之主要揮發性化合物，如：3-甲基-3-丁烯-1-醇(3-methyl-buten-1-ol)、丁酸(butanoic acid)、2-甲基丁酸(DL-2-methyl-butyric acid)、己酸(hexanoic acid)、以及辛酸(octanoic acid)之含量。
第2圖至第4圖係為各待測品中之高密度及低密度揮發性化合物之氣相層析圖。
第2圖至第4圖之量化結果由表三所示，其係含氫氧化鈣-諾麗果發酵液及含碳酸鈣-諾麗果發酵液與無添加-諾麗果發酵液之揮發性化合物含量之比較結果，其揮發性化合物3-甲基-3-丁烯-1-醇(3-methyl-buten-1-ol)分別下降29.92%及23.53%、丁酸(butanoic acid)分別下降84.66%及77.36%、2-甲基丁酸(DL-2-methyl-butyric acid)分別下降81.82%及75.77%、己酸(hexanoic acid)分別下降78.02%與67.37%、以及辛酸(octanoic acid)分別下降52.79%與33.92%。
表三
每一待測品之樣本數為3，且以無添加-諾麗果發酵液之揮發性化合物含量為100%進行量化
由上述結果可知，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液其揮發性化合物含量具有明顯的下降，因而可能改善原有之刺激性臭味。然而上述實施例中所揭露之風味改變是否可為消費者所接受，則須進一步進行官能性評估。
實施例5：諾麗果發酵液之官能性評估
為了解以本發明之一實施例所揭露之方法所製備之添加鹼性化合物之諾麗果發酵液其風味改變是否可為消費者所接受，本實施例中係以喜好試驗法進行官能評估，以1~9分為評估分數，1分為極少、極低、最不喜歡，9分為極多、極高、最喜歡，5分為中等、普通、剛好。
以無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，並以14名受試者為評估對象，針對嗅覺(濃厚味、刺鼻味、並以酸味及整體評分)和味覺(酸味、澀味、苦味、鹹味及整體評分)兩部份進行官能評估。
其結果由表四所示，就嗅覺而言，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液之濃厚味、刺鼻味及酸味都較無添加諾麗果發酵液淡。而在味覺方面，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液之酸味相較於無添加-諾麗果發酵液有明顯下降，然而在澀味、苦味和鹹味方面並無明顯差異。
表四
由上述結果可知，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液改善了原有之刺激性臭味，其氣味較能為消費者所接受。
實施例6：諾麗果發酵液之物理性分析
本實施例分別以儲藏於暗室0、14、28、42及56天之無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，針對待測品之ph值及色澤度測定其物理特性，以供其於相關產品應用之參考。
其中，ph值係利用酸鹼度計，依據電位差之原理測定待測品之酸鹼值變化。
請參閱第5圖，其係為待測品於儲藏於暗室0、14、28、42及56天之pH值變化之柱狀圖。其中，每一待測品之樣本數為3，且其結果均在統計上有顯著差異(p＜0.05)。
在第5圖中，無添加-諾麗果發酵液及含碳酸鈣-諾麗果發酵液之pH值於不同儲藏時間下並沒有明顯變化。而含氫氧化鈣-諾麗果發酵液於儲藏52天後，其pH值由5.46些微下降至5.35。
而色澤度則係以色差儀來測定待測品之顏色變化，分別以*L、*a和*b值表示。其中*L=100時表示全白，而*L=0時表示全黑；+*a表示越傾向紅色，-*a表示越傾向綠色；+*b表示越傾向黃色，-*b表示越傾向藍色。
其結果如表五所示，在*L值的判斷中，在未儲藏的情況下，含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液之*L值明顯較無添加-諾麗果發酵液低。而在儲藏52天後，無添加-諾麗果發酵液及含碳酸鈣-諾麗果發酵液之*L值明顯下降。而在*a值的判斷中，在儲藏時間14天前，各待測品之*a值均有明顯上升。另，就*b值而言，無添加-諾麗果發酵液及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於儲藏期間皆無明顯變化，然而含氫氧化鈣-諾麗果發酵液之*b值隨儲藏時間增加而明顯上升。
表五
Non：無添加-諾麗果發酵液
Ca1：含氫氧化鈣-諾麗果發酵液
Ca2：含碳酸鈣-諾麗果發酵液
請參閱第6A至6C圖，其係為以色差儀來測定待測品顏色變化，根據表五之數據以繪示之柱狀圖。第6A圖為各待測品於不同儲藏時間所測定之L*值；第6B圖為各待測品於不同儲藏時間所測定之a*值；第6C圖為各待測品於不同儲藏時間所測定之b*值。
由上述可知，由於無添加-諾麗果發酵液及含碳酸鈣-諾麗果發酵液之L*值隨儲藏時間增加而下降，以及a*值隨儲藏時間增加而上升，其色澤傾向深色偏紅。而含碳酸鈣-諾麗果發酵液之b*值隨儲藏時間增加而上升，因此其色澤傾向偏黃。
藉由上述pH值與色澤之物理特性測定，可提供添加鹼性化合物之諾麗果發酵液於相關產品之口味及風味應用之參考。
實施例7：諾麗果發酵液之功能性化合物含量測定
本實施例係分別以儲藏於暗室0、14、28、42及56天之無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，測定其總酚類化合物、類黃酮化合物、縮合單寧、東莨菪素以及芸香素等功能性化合物之含量。
總酚類化合物是植物中廣泛存在的成分，其種類超過8000種，其酚型構造上帶有數個羥基，此羥基與體內的抗氧化有關。許多文獻指出人體內總酚類化合物的含量與抗氧化能力有高度正相關，不但可以抑制油脂自氧化，也具有清除自由基之抗氧化能力。
總酚類化合物之測定係以可與總酚類化合物之OH基反應之酚試劑(Folin-Ciocalteu’s phenol reagent)與各待測品反應，以分光光度計測量其在波長735 nm下的吸光值，並以不添加酚試劑之試驗當作空白對照組。而在本實施例中以沒食子酸(gallic acid)當作標準品，並製作標準曲線(圖未示)。沒食子酸(gallic acid)為一種常見於植物中之酚類化合物，常用以作為定量總酚類化合物之標準品。而各待測品之總酚類化合物之含量由沒食子酸之標準曲線算出相對沒食子酸的量，以沒食子酸當量(mg/ml)表示。
請參閱第7圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之總酚類化合物含量之柱狀圖。由第7圖所示，各待測品於不同儲藏時間之酚類化合物含量並無太大差異。
酚類化合物多以穩定之醣苷或酯鍵的鍵結型態存在，且由本發明之一實施例之方法所製備之諾麗果發酵液皆經過加熱步驟，此加熱步驟可將酚類化合物上醣苷或酯鍵之水解酵素失活，因此不會影響其酚類化合物之含量。
本實施例更利用類黃酮化合物在鹼性條件下可與硝酸鋁形成穩定的黃色錯合物並在415nm波長下有吸光值之特性，以測量待測品中類黃酮化合物之含量。其中以槲皮素(quercetin)作為標準品，並製作標準曲線(圖未示)。而各待測品中之類黃酮化合物含量由此標準曲線算出相對的槲皮素含量，並以槲皮素當量(μg/ml)表示。
類黃酮維多酚類化合物之一種，其具有多樣的結構與特性，多發現於水果、蔬菜、核果、種子、花、樹皮等地方。目前已有4000多種類黃酮被鑑定出，且研究指出類黃酮化合物具有廣泛的生理活性，包括抗氧化、抗細菌、抗病毒、抗發炎、抗過敏、血管舒張、螯合金屬離子、抑制脂質過氧化等功能。
請參閱第8圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之類黃酮化合物含量之柱狀圖。由第8圖所示，在經過52天儲藏時間後，各待測品之類黃酮化合物含量皆有些微增加，但各待測品之間之類黃酮化合物之含量並無太大差異。由此可知，於諾麗果發酵液中添加鹼性化合物並不會影響其中類黃酮化合物之含量。
本實施例之另一態樣係測量各待測品中縮合單寧之含量。單寧為一種複雜的酚類化合物，又稱為鞣質。單寧除具有酚類化合物之特性外，還能使蛋白質、生物鹼、明膠沉澱。其廣泛存在於植物中或植物來源的食物內，尤其在橡樹等樹皮中可發現高含量的單寧。根據其結構，單寧可被分為水解型單寧(hydrolysable tannins)和縮合型單寧(condensed tannins)。研究指出單寧具有良好的抗氧化及捕捉自由基能力，也有抗癌、抗突變、預防低密度脂蛋白氧化等功效，近年來受到廣泛的研究。
而縮合單寧之測定係利用其在與香草醛(vanillin)及濃鹽酸作用下會產生紫色之顏色，並在波長500 nm下有吸光之特性進行測定。其中以右旋兒茶素((+)-catechin)作為標準品，並製作標準曲線(圖未示)。而各待測品中之縮合單寧含量由此標準曲線算出相對的槲皮素含量，並以右旋兒茶素當量(mg/ml)表示。
請參閱第9圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之縮合單寧含量之柱狀圖。如第9圖所示，經52天之儲藏時間後，無添加-諾麗果發酵液及含碳酸鈣-諾麗果發酵液之縮合單寧含量有下降的趨勢，而含氫氧化鈣-諾麗果發酵液中之縮合單寧之下降則不具顯著差異。
而各待測品之間的縮合單寧含量起初沒有明顯的差異，但隨著儲藏時間的增加，無添加-諾麗果發酵液中之縮合單寧含量明顯比另外兩待測品低。由上述可知，添鹼性化合物之諾麗果發酵液較無添加鈣之諾麗果發酵液可保留較多縮合單寧的含量。
本實施例之再一態樣係檢測各待測品中之東莨菪素及芸香素含量，其係以高效能液相層析儀(HPLC)來測定東莨菪素及芸香素分別於各待測品中之含量。
芸香素係屬於類黃酮糖苷化合物，許多植物中都有芸香素的存在，包括柑橘類(橘子、葡萄柚、檸檬、萊姆等)的果實及其外皮、莓果(桑葚、小紅莓等)、蕎麥、蘆筍等，其中又以蕎麥的含量最多。芸香素具有很好的抗氧化及抗發炎的能力，且芸香素可以強化血管結構以改善血友病患的症狀及預防靜脈曲張，並對視網膜出血、微血管性中風、冠狀動脈阻塞等疾病有所助益。且有動物實驗證實，芸香素可以降低肝臟中總膽固醇和三酸甘油酯的含量。
東莨菪素則係屬於香豆素化合物(coumarin)之一的化合物，是一種重要的酚類化合物，於自然界中並不常見，但在諾麗果中含量豐富。東莨菪素具有許多生理活性，包括抗氧化、抗菌、抗發炎、鎮痛、保護肝臟、預防高血壓等。經研究證實其具有抑制小鼠肝癌細胞的增生之功效，並具有抗腫瘤的能力，係為研發癌症用藥的明日之星。
請參閱第10圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之東莨菪素含量之柱狀圖。如第10圖所示，各待測品於儲藏過程中並沒有明顯的變化，因此由上述可知，於諾麗果發酵液中添加鹼性化合物並不會影響其中東莨菪素之含量。
而有關於芸香素含量的測定，請參閱第11圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之芸香素含量之柱狀圖。如第11圖所示，各待測品在儲藏時間第14天前有明顯的下降，而在第15至56天仍有些微下降。其中，含氫氧化鈣-諾麗果發酵液之芸香素含量下降最多，其次為含碳酸鈣-諾麗果發酵液。
由於水解芸香素之芸香素降解酶(rutin-degrading enzyme)於pH 5.0實具有最佳活性，然而，添鹼性化合物之諾麗果發酵液之pH值趨近於5，因此可能使芸香素較易被降解。
由上述結果可得知，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液其大部分之功能性化合物皆與未添加鹼性化合物之諾麗果發酵液無明顯差異。換言之，於諾麗果發酵液中添加鹼性化合物並不會影響其中功能性化合物之含量。
本實施例之另一態樣則係分別以儲藏於暗室0、14、28、42及56天之熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理之諾麗果發酵液作為待測品。其中，熱處理-諾麗果發酵液係將利用實施例中所述之方法所製備之諾麗果發酵液於65℃下加熱48小時而取得。針對上述待測品測定其總酚類化合物、類黃酮化合物、縮合單寧、東莨菪素以及芸香素等功能性化合物之含量。其中，各個功能性化合物測定方法如上所述，在此不再贅述。
請參閱第12圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之總酚類化合物含量之柱狀圖。由第12圖所示，經過加熱後之諾麗果發酵液於不同儲藏時間下，其總酚類化合物之含量與未加熱之諾麗果發酵液無太大差異。
請參閱第13圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之類黃酮化合物含量之柱狀圖。由第13圖所示，未經熱處理之諾麗果發酵液的類黃酮含量隨著儲藏時間之增加而降低，且於儲藏第24天有顯著的下降。而熱處理-諾麗果發酵液之類黃酮含量則於各儲藏時間均無太大差異。
請參閱第14圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之縮合單寧含量之柱狀圖。如第14圖所示，經52天室溫儲藏後，熱處理-諾麗果發酵液中之縮合單寧含量並無顯著變化。然而，未經熱處理之諾麗果發酵液中之縮合單寧含量則隨著儲藏時間增加而降低，且於第36天後有顯著降低。
參閱第13與第14圖，類黃酮化合物可經聚合而轉變成縮合單寧化合物，而縮合單寧亦可能影響類黃酮化合物之聚合。由上述結果可得知，熱處理不僅不會影響發酵液中之類黃酮化合物及縮合單寧，更可於儲藏期間維持上述兩種功能性化合物之含量。
請參閱第15至第17圖，其分別係為各待測品於不同儲藏時間之東莨菪素衍生物、東莨菪素及芸香素含量之柱狀圖。其中，熱處理-諾麗果發酵液於各儲藏時間下，其東莨菪素衍生物、東莨菪素及芸香素含量皆無明顯差異。由第16圖可知，未經熱處理之諾麗果發酵液之東莨菪素含量亦沒有明顯的改變，然而由第15圖及第17圖所示，其東莨菪素衍生物及芸香素含量皆隨著儲藏時間增加而降低，且於第36天後有顯著減少之趨勢。由此結果顯示未經熱處理之諾麗果發酵液中之功能性化合物含量變化較大。
由上述結果可知，諾麗果發酵液經熱處理後不僅不會影響其中之功能性化合物，更可於室溫儲藏後維持其功能性化合物之含量，因此可使諾麗果發酵液於室溫下具有較穩定且良好之儲藏性。
實施例8：諾麗果發酵液之抗氧化能力測定
諾麗果發酵液具有良好的抗氧化功能，由上述可知本發明所揭示之添加鹼性化合物之諾麗果發酵液中之功能性化合物並不會因此而流失，然而鹼性化合物的添加對於諾麗果發酵液中該些功能性化合物之作用是否有影響，將於本實施例中之試驗詳細描述。
本實施例係分別以儲藏於暗室0、14、28、42及56天之無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液作為待測品，測定總抗氧化能力、二苯聯苦基(1,1-Diphenyl-2-picrylydrazyl，DPPH)自由基清除能力、血管收縮素轉化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)活性抑制能力之抗氧化功能。
在本實施例中，總抗氧化能力之測定係將各待測品與2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)、過氧化酵素(peroxidase)、與過氧化氫(H2 O2 )混合均勻。若待測品具有抗氧化能力，則會抑制過氧化酵素催化ABTS與H2 O2 反應所形成之ABTS‧+陽離子自由基反應物產生。ABTS‧+陽離子自由基反應物於波長734nm下具吸光值，可藉由偵測該反映物之產率以測定各待測品之總抗氧化能力。
請參閱第18圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之總抗氧化能力之柱狀圖。由第18圖所示，各待測品之ABTS‧+自由基清除能力於儲藏過程中有少許的下降但不具有顯著差異。然而各待測品之間的比較結果，則顯示添加鹼性化合物之諾麗果發酵液之ABTS‧+自由基清除能力明顯高於無添加-諾麗果發酵液。自由基的清除與pH值有密切關係，pH值可因添加鹼性化合物而提升，進而可使ABTS‧+自由基更容易被還原，因此而提高自由基清除能力。
而在DPPH自由基清除能力方面，DPPH自由基之甲醇溶液為深紫色，於波長517 nm下有最大吸光值。若待測品具有抗氧化能力，則能清除DPPH自由基，使其顏色變淡，吸光值下降。本實施例藉由偵測DPPH自由基的含量以檢測待測品之DPPH自由基清除能力。
請參閱第19圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之DPPH自由基清除能力之柱狀圖。如第19圖所示，在儲藏時間0天時，各待測品之DPPH自由基清除能力無明顯差異。而隨著儲藏時間增加，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液之DPPH自由基清除能力明顯較無添加-諾麗果發酵液低。由於添加鹼性化合物之諾麗果發酵液之pH值較高，其可提供氫離子給DPPH自由基的程度較低，可能造成DPPH自由基清除能力下降。
而ACE活性抑制能力則係利用Hippuryl-L-histidyl-L-leucine(HHL)作為ACE之受質之特性，具活性之ACE可將HHL分解為馬尿酸(hippuric acid，HA)，因此若待測品具有抗氧化能力，可抑制ACE之活性，而HA及HHL之生成量將會減少。而HA於波長228 nm下具有最大之吸光值，利用HPLC來偵測HA單位時間之生成量，即可偵測待測品對ACE之抑制活性。
請參閱第20圖，其係為各待測品於不同儲藏時間之ACE抑制活性之柱狀圖。如第20圖所示，隨著儲藏時間增加，各待測品之ACE抑制活性皆有明顯上升趨勢，而至儲藏時間第42~56天則呈現明顯下降。然而，添加鹼性化合物之諾麗果發酵液於儲藏期間內之ACE抑制活性皆高於無添加-諾麗果發酵液。由於二價鈣、鎂、鋇、銅及亞鐵離子皆可使ACE失活，因此於諾麗果發酵液中添加鹼性化合物確實具有抑制ACE活性之功效。
本實施例之另一態樣則係分別以儲藏於暗室0、14、28、42及56天之熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理之諾麗果發酵液作為待測品。其中，熱處理-諾麗果發酵液係將利用實施例中所述之方法所製備之諾麗果發酵液於65℃下加熱48小時而取得。針對上述待測品測定其總抗氧化能力、二苯聯苦基(1,1-Diphenyl-2-picrylydrazyl，DPPH)自由基清除能力、血管收縮素轉化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)活性抑制能力之抗氧化功能。其中，各個生理活性之測定方法如上所述，在此不再贅述。
請參閱第21A及第21B圖，其分別係為各待測品於未稀釋以及稀釋40倍後，於不同儲藏時間之總抗氧化能力之柱狀圖。由第21A圖所示，在未稀釋的情況下，諾麗果發酵液不論是否經過熱處理皆具有約100%的總抗氧化能力。然而在經40倍稀釋後(見第21B圖)，經熱處理之諾麗果發酵液之總抗氧化能力則較強。
第22A及第22B圖則係分別為各待測品於未稀釋以及稀釋80倍後，於不同儲藏時間之DPPH自由基清除能力之柱狀圖。由第22A圖所示，在未稀釋的情況下，諾麗果發酵液不論是否經過熱處理皆具有約97%的DPPH自由基清除能力，結果與總抗氧化能力相似。而在經過80倍稀釋後(見第22B圖)，經熱處理之諾麗果發酵液之DPPH自由基清除能力則較未經熱處理之諾麗果發酵液強。
由上述結果可知，諾麗果發酵液經熱處理後可保持諾麗果發酵液原有之生理功能(抗氧化能力)，因此可使諾麗果發酵液於室溫下具有較穩定且良好之儲藏性。
綜上所述，本發明之除臭方法確實可降低傳統諾麗果發酵液刺激性臭味，提高消費者的接受度。其中，所添加的鹼性化合物更可包含氫氧化鈣或碳酸鈣，除了除臭效果外更可額外增加諾麗果發酵液的含鈣之營養價值。而本發明之保存製備方法藉由低溫逐步加熱之方式，可使諾麗果發酵液之功能性化合物含量及生理活性(抗氧化能力)在經過室溫儲藏後較為穩定。因此，本發明所揭露之諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法可提供諾麗果發酵相關產品之利用價值。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
S11~S17．．．步驟
第1圖　係為本發明之諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法之一實施例之流程圖；
第2A圖係為本發明之無添加-諾麗果發酵液中之高密度揮發性化合物之氣相層析圖；
第2B圖係為本發明之無添加-諾麗果發酵液中之低密度揮發性化合物之氣相層析圖；
第3A圖係為本發明之含氫氧化鈣-諾麗果發酵液中之高密度揮發性化合物之氣相層析圖；
第3B圖係為本發明之含氫氧化鈣-諾麗果發酵液中之低密度揮發性化合物之氣相層析圖；
第4A圖係為本發明之含碳酸鈣-諾麗果發酵液中之高密度揮發性化合物之氣相層析圖；
第4B圖係為本發明之含碳酸鈣-諾麗果發酵液中之低密度揮發性化合物之氣相層析圖；
第5圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液儲藏於暗室0、14、28、42及56天之pH值變化之柱狀圖；
第6A圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間所測定之*L值之柱狀圖；
第6B圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間所測定之*a值之柱狀圖；
第6C圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間所測定之*b值之柱狀圖；
第7圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之總酚類化合物含量之柱狀圖；
第8圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之類黃酮化合物含量之柱狀圖；
第9圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之縮合單寧含量之柱狀圖；以及
第10圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之東莨菪素含量之柱狀圖；
第11圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之芸香素含量之柱狀圖；
第12圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之總酚類化合物含量之柱狀圖；
第13圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之類黃酮化合物含量之柱狀圖；
第14圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之縮合單寧含量之柱狀圖；
第15圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之東莨菪素衍生物含量之柱狀圖；
第16圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之東莨菪素含量之柱狀圖；
第17圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之芸香素含量之柱狀圖；
第18圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之總抗氧化能力柱狀圖；
第19圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之DPPH自由基清除能力柱狀圖；
第20圖　係為無添加-諾麗果發酵液、含氫氧化鈣-諾麗果發酵液、以及含碳酸鈣-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之ACE抑制活性柱狀圖；
第21A圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之總抗氧化能力柱狀圖；
第21B圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於稀釋40倍後，於不同儲藏時間之總抗氧化能力柱狀圖；
第22A圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於不同儲藏時間之DPPH自由基清除能力柱狀圖；
第22B圖　係為熱處理-諾麗果發酵液以及未經熱處理-諾麗果發酵液於稀釋80倍後，於不同儲藏時間之DPPH自由基清除能力柱狀圖。
S11~S17．．．步驟

Claims (6)

  1. 一種諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法，包含下列步驟：將一諾麗果實自然風乾一預定時間以取得一熟化諾麗果實；將該熟化諾麗果實進行兩階段發酵步驟，其包含於一曝氣式發酵桶內，於24℃~30℃溫度下發酵1~2天，接著於一密封式發酵槽內，於24℃~30℃溫度下發酵18~28天，再進行一第一離心步驟，取得一第一溶液；將一包含氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鈉或其組合的鹼性化合物，以一微電腦自動滴定裝置滴定計算添加量後，添加於該第一溶液中以取得一第二溶液，該鹼性化合物係可與該第二溶液中導致剌激性臭味來源的揮發性物質產生螯合作用，以去除該臭味，且該第二溶液之pH值係為6.5~7；以及將該第二溶液進行一第二離心步驟後，置於一水浴槽內以60~70℃之溫度逐步加熱，進而得到一諾麗果發酵液。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法，其中該預定時間係為1~4天。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之諾麗果發酵液之除臭 及保存之製備方法，其中在該兩階段發酵步驟前，更包含以一攪碎機將該熟化諾麗果實打碎，並藉由一粗細分離機將該熟化諾麗果實之果肉與種子分離之步驟。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之諾麗果發酵液之除臭及保存之製備方法，其中在該第二離心步驟前，更包含將該第二溶液攪拌後置於0~10℃之溫度16~18小時之步驟。
  5. 一種諾麗果發酵液，係如申請專利範圍第1項至第4項中之任一項所述之製備方法所製造而成。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之諾麗果發酵液，其中該諾麗果發酵液之鈣含量為1~2.5mg/ml。
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