TWI438430B - 用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記 - Google Patents

Description

用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記

本發明係有關於一種用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，尤指一種可檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，並利用該些蛋白生物標記製作成檢測套組運用在臨床測試上，藉篩選檢體中其蛋白生物標記之濃度差異而獲得確認是否罹患阿茲海默氏症。

阿茲海默氏症係一種由某種蛋白質在腦部沈積，造成腦神經細胞死亡之腦神經退化性疾病，好發於65歲以上之族群，並隨著年齡而增加其罹患率。此疾病會導致漸進式之認知功能失調，包括記憶、判斷力、決策能力、身體對週遭環境之適應性及語言能力等。在阿茲海默氏症患者之腦部中，一些對記憶很重要之區域亦受到影響，例如基底前腦(Basal Forebrain)以及海馬迴(Hippocampus)。美國在阿茲海默氏症治療花費上每年高達500～1000億美金，僅低於心血管疾病與癌症之花費，然而，目前藥物治療只能改善所產生之症狀，卻無法停止疾病之繼續惡化。因此，早期診斷才能有機會提供此疾病更有效之處理方式。

目前沒有一個檢測可以完全診斷出罹患阿茲海默氏症，亦沒有一種藥物可以治癒阿茲海默氏症以及停止腦細胞之死亡，唯其可以改善認知與行為異常問題。Cognex及Aricept兩種阿茲海默氏症之藥物係唯一獲得美國食品藥物管制局(FDA)之認可。該些藥物係乙醯膽鹼酯分解酵素抑制劑(Cholinesterase Inhibitors)，藉著阻斷乙醯膽鹼酯分解酵素之作用來抑制乙醯膽鹼之分解，進而提高腦中乙醯膽鹼之含量。上述兩種藥物皆可延緩記憶之喪失，並且有助於患者執行日常起居所需之動作。然而，如前所述，這些藥物並不能治癒阿茲海默氏症，它們僅能減輕症狀。

於顯微鏡中觀察阿茲海默氏症患者腦組織時，不僅發現其大腦皮質組織中之神經細胞及突觸有消失之情形，且組織切片亦發現神經細胞外有蛋白質堆積物，顯示與此疾病之產生有著密不可分之關聯。因此目前唯一能夠明確診斷出阿茲海默氏症之方法，就係搜尋大腦組織是否有瘢塊(Plaques)與糾結物(Tangles)之存在。在活體無法進行組織切片觀察之情況下，非侵襲性之血清生物標記可能係一個廣泛用來診斷阿茲海默氏症之絕佳選擇。

其中蛋白生物標記係目前蛋白質體學用來研究疾病相關之一個熱門課題，無論係文獻、儀器開發或技術改良，無非係想提供研究者對此門科學之研究可有所進步與發現。一般利用體液(包含血清、唾液或脊髓液等)來研究蛋白生物標記與疾病之關係，係多數學者們之檢體來源，不過，這些體液係流動於全身，與真正病灶發生處是否有關係，是個值得讓人深思之議題。此外，文獻上亦指出，某些癌症患者之血清有出現部份蛋白質表現量增加之情況，這也許說明癌細胞增生需要許多之因子來幫助，因此分布於全身血液之含量也因此增加，但這也是在末期時比較易發現，對於分析癌症初期檢體並非可有相同結果之出現。

基於目前藥物只能延緩病情之發展以及症狀之改善，並無法根治，因此事先之預防勝於治療，且準確之診斷即係一個須努力之目標。然而，腦部影像掃描只能診斷阿茲海默氏症末期患者，卻無法做到早期診斷目的，又目前唯有將腦部解剖後進行組織切片觀察才能做明確之診斷，故，一般習用者係無法符合使用者於實際使用時之所需。

本發明之主要目的係在於，克服習知技藝所遭遇之上述問題並提供一種可檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，並利用該些蛋白生物標記製作成檢測套組運用在臨床測試上，藉篩選檢體中其蛋白生物標記之存在濃度而獲得確認是否罹患阿茲海默氏症。

本發明之次要目的係在於，可用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，係選自人體血清中具多重特異性之蛋白生物標記，纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)、補體蛋白C3(Complement component 3)、α-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)、血紅素結合蛋白(Haptoglobin)、轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)者。

為達以上之目的，本發明係一種用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，係利用阿茲海默氏症患者血清檢體篩選其蛋白生物標記，藉由蛋白質體分析工具(2D-DIGE、ICPL)進行分析，找出差異性蛋白生物標記，並經由西方墨點法(western blotting)進行生物標記身分確認後；再利用該蛋白生物標記製作成檢測套組運用在臨床測試上，藉檢測人體血清中是否有其蛋白生物標記之存在而獲得確認是否罹患阿茲海默氏症，可有效提高準確度與靈敏度，進而達到早期診斷早期預防之目的。

請參閱『第1圖』所示，係本發明篩選蛋白生物標記之流程示意圖。如圖所示：本發明係一種用於檢測阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)之蛋白生物標記，該蛋白生物標記篩選方法係至少包含下列步驟：

(A)血清樣品收集11：分別收集一阿茲海默氏症患者及一健康者之血清樣品；

(B)二維微差電泳分析法(2D-DIGE)12：利用二維微差電泳分析法，以螢光染劑，直接在同一片膠片中對步驟(A)兩種血清樣品之蛋白質上標幟螢光染劑(CyDye)，並進行等電焦集電泳(Isoelectric Focusing,IEF)及SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分析使蛋白質分離，再由影像分析軟體(Decyder6.5)分析出可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記，經由質譜儀分析鑑定其蛋白質身分；以及

(C)同位素標記蛋白標籤法(Isotope-Coded Protein Labeling,ICPL)13：利用同位素標記蛋白標籤法，以同位素標定之方式，分別對步驟(A)兩種血清樣品之蛋白質上標定不同質量之標定物，且可直接經由質譜儀分析，以間接得到被標定之蛋白質間之含量差異，並依據設定，可自動選擇兩者差異程度大之胜肽片段(即可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記)作二次質譜分析(MSMS)而鑑定其蛋白質身分。

(D)西方墨點法(Western Blotting)14：利用西方墨點法對步驟(B)與步驟(C)所得出的蛋白生物標記進行身分確認實驗。

該檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，主要包含所挑選之蛋白生物標記係與症狀發生前阿茲海默氏症之造血功能、免疫反應、凋亡及神經元支持之系統失調程度具相關性之多重特異性之蛋白生物標記，而該些阿茲海默氏症可能之蛋白生物標記係為纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)、補體蛋白C3(Complement component 3)、α-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)、血紅素結合蛋白(Haptoglobin)、轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)者。上述蛋白生物標記係可作為用以預測罹患阿茲海默氏症之確認。

將人體阿茲海默氏症相關之蛋白分子利用上述方法進行蛋白質之分離與鑑別，由於該些蛋白質係利用病人血清中篩選出來，所以可利用該些蛋白質作為蛋白生物標記發展為檢測套組。該檢測套組係選自上述篩選出之蛋白生物標記，並進一步先行固定於蛋白生物晶片(Protein Microarray)上，直接對大量病人血清檢體進行篩選後，藉篩選檢體中其蛋白生物標記之存在量的差異而獲得確認是否罹患阿茲海默氏症。

請參閱『第2圖～第15圖』所示，係分別為本發明之2D-DIGE實驗之血清樣品排序示意圖、本發明之第一個可能之蛋白生物標記2D-DIGE膠體影像比對分析結果示意圖、本發明之第二個可能之蛋白生物標記2D-DIGE膠體影像比對分析結果示意圖、本發明之纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)蛋白身分鑑定示意圖、本發明之補體蛋白C3(Complement component 3)身分鑑定示意圖、本發明之2D-DIGE蛋白質鑑定結果示意圖、本發明第一次ICPL鑑定之阿茲海默氏症蛋白生物標記示意圖、本發明第二次ICPL鑑定之阿茲海默氏症蛋白生物標記示意圖、本發明之ICPL蛋白質鑑定結果示意圖、本發明之西方墨點法確認纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)蛋白身分示意圖、本發明之西方墨點法確認補體蛋白C3(Complement component 3)身分示意圖、本發明之西方墨點法確認α-1酸性醣蛋白(alpha-1 acid glycoprotein)身分示意圖、本發明之西方墨點法確認血紅素結合蛋白(Haptoglobin)身分示意圖、本發明之西方墨點法確認轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)身分示意圖。如圖所示：當本發明於篩選時，於一較佳實施例中，本發明所篩選之蛋白生物標記係為用以檢測阿茲海默氏症者之生物標記，為纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)、補體蛋白C3(Complement component 3)、α-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)、血紅素結合蛋白(Haptoglobin)、轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)，其篩選並包括下列各實施方式：

[實施方式一]血清樣品之收集

分別收集15位阿茲海默氏症患者之血清樣品，及20位健康受試者之血清樣品，共收集35個樣品血清，其中正常血清20個，阿茲海默氏症血清15個。

[實施方式二]二維微差電泳分析法

{2D-DIGE實驗流程}

將上述血清樣品分成兩組，每種血清樣品各取3個，共6個血清樣品，分成3片膠片進行實驗，並以Cy2螢光染劑標幟全部混合之血清樣品作為內標準(Internal Standard)，以Cy3及Cy5分別標幟此6個血清樣品，如第2圖所示。其中，同一種血清樣品係分開標幟Cy3及Cy5，以避免螢光之間強度之誤差影響分析結果，最後將分別標幟之血清樣品混合，於同一膠片中進行分析，共分析3片。

利用各蛋白質等電點及分子量之不同，同時進行等電焦集電泳(Isoelectric Focusing,IEF)及SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)，依據電荷及分子篩效應進行蛋白質分離。

{螢光標幟膠片影像擷取與分析}

利用一螢光掃描儀(Typhoon Scanner)掃描擷取上述經電泳後之膠片影像，並將Cy3及Cy5擷取之影像重疊在一起，利用軟體給予蛋白顏色之不同，Cy3影像設定綠色，Cy5影像設定紅色，如果蛋白表現量相當時，就會呈現黃色，藉此由顏色之變化判斷出各區域之蛋白質表現量之差異。

再以一DeCyder 6.5分析軟體之影像輸入(Image Loading)功能將此3片膠片，共9個影像傳送至軟體編輯區內，並將Cy2影像設定為內標準，其他影像依序排列成Normal與AD，每組3個影像。

將上述9個影像進行膠內分析(Differential In-gel Analysis,DIA)，設定圈選蛋白點10000點，讓軟體進行圈選動作，並於完成後，設定蛋白點強度大於60000才可顯示，其餘圈選區域刪除之。藉此不僅可讓背景值之雜訊號消失，並可使Cy3或Cy5之影像可與Cy2之內標準產生一比值，以方便膠片與膠片之間之比較與分析，進而降低膠片與膠片之間之實驗誤差因素而使結果能更為可信。

待上述蛋白點圈選完畢後，係接著進行膠間分析(Biological Variation Analysis,BVA)，先行比對膠片蛋白圈選位置之正確性，藉由膠間分析做人工校正，將圈選錯誤之蛋白質校正回來，使3片膠片之內標準中之蛋白點能相互對應。待完成人工校正後，便進行模組計算，由軟體內建之統計分析系統計算出一T檢驗值(T-test)與一單因子變異數分析(One-way ANOVA)數值，即P值(P value)。

{可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記}

從上述計算出之T檢驗值或單因子變異數分析數值中，挑選出可信度大於95%之蛋白點，意即數值小於0.05者。共計挑選出兩個可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記，分別為：第一個可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記，其在9個影像中可對應到9個，T檢驗值為2×10-5，屬於下調(Down Regulation)蛋白質；第二個可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記，其在9個影像中可對應到9個，T檢驗值為1.3×10^-4 ，屬於上調(Up Regulation)蛋白質。

在完成二維微差電泳分析法後，經軟體分析所挑選出兩個可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記位於膠片的位置，膠片經由螢光染色(SYPRO Ruby)後，在UV光的激發下，將蛋白質從其膠片上擷取下來，經由胰蛋白酵素(Trypsin)水解，與一基質輔助雷射脫附游離串聯飛行時間式質譜儀(MALDI-TOF/TOF)分析其蛋白質點，經數據分析軟體(FlexAnalysis)與生物工具分析(BioTool)選出胜肽分子量數據後，再將此數據送到一MASCOT蛋白質身分鑑定工作站進行分析，經NCBI生物資訊資料庫比對，完成其蛋白質鑑定工作，如第5圖~第6圖所示。

其中，並如第7圖所示，上述兩個可能之阿茲海默氏症蛋白生物標記中，經蛋白質鑑定在P值小於0.05之可信結果下，第一個得到可信度97分鑑定結果之蛋白生物標記，其蛋白質身分係為Fibrinogen γ’，具有46.3kDa之分子量，等電點為5.54，且與人體血清中之多重蛋白生物標記之序列重疊率係具有至少69%之相同性；第二個得到可信度79分鑑定結果之蛋白生物標記，其蛋白質身分係為Complement component 3，具有39.5kDa之分子量，等電點為4.79，且與人體血清中之多重蛋白質生物標記之序列重疊率係具有至少59%之相同性。

隨後將可利用酶聯免疫吸附劑測定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay ELISA)技術或蛋白質懸浮陣列(protein suspension array)技術，使用單株抗體之專一性來確認血清中這些蛋白生物標記，並以絕對定量方式得出差異值，以進一步於未來針對這些蛋白質發展出阿茲海默氏症之檢驗套組。

[實施方式三]同位素標記蛋白標籤法

{Hyper3.2分析結果}

以同位素[¹² C]及[¹³ C]作為標定物，分別標定上述血清樣品，其標定位置係在賴胺酸(Lysine)側鏈及胺基團(Free Amino Group)上，經由Hyper3.2分析軟體之設定經過各種蛋白質或胜態分離系統後，可直接使用MALDI-TOF/TOF質譜儀分析，如第8圖及第9圖所示，其上半部為所鑑定出來之蛋白質資訊，包括蛋白質名稱與種類、分子量、等電點及鑑定之胜肽數等，下半部則為對應該蛋白質所鑑定之胜肽片段訊息，包括分子量、色層分析時之流出時間、位在MALDI樣品盤上之位置及鑑定出來之胺基酸序列等，藉此間接得到被標定之蛋白質間之含量差異。

本實驗進行二重複分析，其結果發現兩次實驗所鑑定出來之蛋白質有部份係相同，分別為serum albumin precursor、Transthyretin precursor、α-1-acid glycoprotein 1 precursor、serotransferrin precursor以及Fibrinogen α chain precursor等五種蛋白，其餘有部分蛋白係與文獻所發現相同，如第10圖所示。此分析軟體係先將MALDI樣品上之樣品先用MS分析一次，找出每個經由高壓液相層析(HPLC)所分餾下來之樣品點中，波峰強度高於800以上之訊號，且這些訊號之分子量間距為6Da，之後再對這些訊號做第二次MS分析，所鑑定出來之蛋白即為正常血清樣品與阿茲海默症血清樣品中表現量具有差異之蛋白質。

[實施方式四]西方墨點法

{西方墨點法之實驗流程}

將上述之血清樣品分成兩組，每種血清樣品各取7個，共14個血清樣品，分別進行蛋白質定量後，每個樣品皆加入同體積的2倍樣品緩衝液混合，並於100℃下加熱10分鐘，使蛋白質變性(denaturation)。

利用蛋白質分子量不同的特性，進行SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)，依據分子篩的效應進行蛋白質分離。

完成電泳分析的膠片以西方墨點轉漬法將膠片中的蛋白質轉印於聚偏二氟乙烯樹脂(PVDF)轉印膜上，再以脫脂奶將轉印膜上的其他蛋白質吸附孔洞填滿後，再以欲確認身分的蛋白質，分別為：纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)、補體蛋白C3(Complement component 3)、α-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)、血紅素結合蛋白(Haptoglobin)、轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)共五種相對應之第一抗體(primary antibodies)與第二抗體(secondary antibodies)做反應。

{冷光分析系統偵測之結果及統計分析}

將上述完成抗體反應的聚偏二氟乙烯樹脂(PVDF)轉印膜以Enhanced ChemiLuciferase呈色試劑進行冷光顯影。並於冷光分析系統(LAS-4000mini)中進行偵測，其結果如第11A圖~第15A圖所示。

利用西方墨點法影像定量分析軟體(Multi Vauge V3.2)，將顯影的蛋白質訊號進行定量分析，並繪製成長條圖進行比較，如第11B圖~第15B圖所示。

將上述兩種蛋白質體分析工具(2D-DIGE、ICPL)所得出的蛋白生物標記，為纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)、補體蛋白C3(Complement component 3)、α-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)、血紅素結合蛋白(Haptoglobin)、轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)，分別利用西方墨點法進行身分確認後，並於蛋白質定量分析軟體的運算下，清楚顯示正常血清與疾病血清間的蛋白質表現差異，證實其身分，並與上述兩者蛋白質體分析工具所得結果相符。

藉此，利用阿茲海默氏症患者血清檢體篩選其蛋白生物標記，藉由蛋白質體分析工具(2D-DIGE、ICPL)進行分析，找出差異性蛋白生物標記，並利用西方墨點法確認蛋白生物標記之身分後；再利用該蛋白生物標記製作成檢測套組運用在臨床測試上，藉檢測人體血清中其蛋白生物標記之存在量差異而獲得確認是否罹患阿茲海默氏症，可有效提高準確度與靈敏度，進而達到早期診斷早期預防之目的。

綜上所述，本發明係一種用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，可有效改善習用之種種缺點，係利用阿茲海默氏症患者血清檢體篩選其蛋白生物標記，藉由蛋白質體分析工具進行分析，找出差異性蛋白生物標記；再利用該些蛋白生物標記製作成檢測套組運用在臨床測試上，藉檢測人體血清中是否有其蛋白生物標記之濃度差異而獲得確認是否罹患阿茲海默氏症，可有效提高準確度與靈敏度，以達到早期診斷早期預防之目的，進而使本發明之產生能更進步、更實用、更符合使用者之所須，確已符合發明專利申請之要件，爰依法提出專利申請。

惟以上所述者，僅為本發明之較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍；故，凡依本發明申請專利範圍及發明說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

11．．．步驟(A)血清樣品收集

12．．．步驟(B)二維微差電泳分析法

13．．．步驟(C)同位素標記蛋白標籤法

14．．．步驟(D)西方墨點法

第1圖，係本發明篩選蛋白生物標記之流程示意圖。

第2圖，係本發明之2D-DIDE實驗血清樣品排序示意圖。

第3圖，係本發明之第一個可能之蛋白生物標記2D-DIGE膠體影像比對分析結果示意圖。

第4圖，係本發明之第二個可能之蛋白生物標記2D-DIGE膠體影像比對分析結果示意圖。

第5圖，係本發明之Fibrinogen r’蛋白身分鑑定示意圖。

第6圖，係本發明之complement component 3蛋白身分鑑定示意圖。

第7圖，係本發明之2D-DIGE蛋白質鑑定結果示意圖。

第8圖，係本發明第一次ICPL鑑定之阿茲海默氏症蛋白生物標記示意圖。

第9圖，係本發明第二次ICPL鑑定之阿茲海默氏症蛋白生物標記示意圖。

第10圖，係本發明之ICPL蛋白質鑑定結果示意圖，

第11圖，係本發明之西方墨點法確認Fibrinogen r’身分示意圖。

第12圖，係本發明之西方墨點法確認complement component 3身分示意圖。

第13圖，係本發明之西方墨點法確認α 1 acid glycoprotein 身分示意圖。

第14圖，係本發明之西方墨點法確認haptoglobin身分示意圖。

第15圖，係本發明之西方墨點法確認Transthyretin身分示意圖。

11．．．步驟(A)血清樣品收集

12．．．步驟(B)二維微差電泳分析法

13．．．步驟(C)同位素標記蛋白標籤法

14．．．步驟(D)西方墨點法

Claims (4)

1. 一種用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，係選自人體血清中具多重特異性之蛋白生物標記而可作為檢測阿茲海默氏症者，該蛋白生物標記係包括：一蛋白生物標記其蛋白質身分為纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)者，係具有46.3kDa之分子量，等電點為5.54；一蛋白生物標記其蛋白質身分為補體蛋白C3(Complement component 3)者，係具有39.5kDa之分子量，等電點為4.79；一蛋白生物標記其蛋白質身分為alpha-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)者，係具有23.5kDa之分子量，等電點為4.79；一蛋白生物標記其蛋白質身分為血紅素結合蛋白(Haptoglobin)者，係具有45.2kDa之分子量，等電點為6.13；以及一蛋白生物標記其蛋白質身分為轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)者，係具有15.9kDa之分子量，等電點為5.43。
2. 依據申請專利範圍第1項所述之用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，其中，該蛋白生物標記係可製成檢測套組。
3. 依據申請專利範圍第2項所述之用於檢測阿茲海默氏症之蛋白生物標記，其中，該蛋白生物標記係可進一步先行固定於蛋白生物晶片(Protein Microarray)上。
4. 一種阿茲海默氏症之檢測套組，包含生物標記，其係選自人體血清中具多重特異性之蛋白生物標記而可作為檢測阿茲海 默氏症者，該蛋白生物標記係包括：一蛋白生物標記其蛋白質身分為纖維蛋白原γ’型(Fibrinogen γ’)者，係具有46.3kDa之分子量，等電點為5.54；一蛋白生物標記其蛋白質身分為補體蛋白C3(Complement component 3)者，係具有39.5kDa之分子量，等電點為4.79；一蛋白生物標記其蛋白質身分為alpha-1酸性糖蛋白(alpha 1 acid glycoprotein)者，係具有23.5kDa之分子量，等電點為4.79；一蛋白生物標記其蛋白質身分為血紅素結合蛋白(Haptoglobin)者，係具有45.2kDa之分子量，等電點為6.13；以及一蛋白生物標記其蛋白質身分為轉甲狀腺素蛋白(Transthyretin)者，係具有15.9kDa之分子量，等電點為5.43。