TWI433841B - 化學合成安卓幸的方法及其抑制非小細胞肺癌的應用 - Google Patents

Description

化學合成安卓幸的方法及其抑制非小細胞肺癌的應用

本發明關於化學合成安卓幸(Antrocin)的方法及其抑制非小細胞肺癌的應用。

全世界近二十餘年在牛樟芝所含天然化合物的研究，除多醣體等大分子外，總共發表了七十八個小分子化合物，其中包括三十一個三萜類化合物且大都有相關藥理活性研究報告，尤其著重在該等的抗癌活性，惟三萜類化合物各別分子仍須在較高使用量，才能達到癌症臨床化學治療藥物的效果(Geethangili and Tzeng,Evidence-based Complementary and Alternative Medicine(2011) doi: 10.1093/ecam/nep108)。但是，安卓幸(antrocin)自1995年首度報導在牛樟芝中被發現後(Chiang et al.,Phytochemistry(1995) 39,613-616)，迄今十六年間，除於2011年2月15日發表安卓幸具有抑制乳癌細胞增生的功效外(Rao et al.,Chemical Research Toxicology(2011) 24,238-245)，未再有任何相關報導，相關藥理活性報告亦付諸缺如。究其原因乃該安卓幸在一般牛樟芝子實體中含量很低而不易分離取得。

肺腺癌一般可以視為惡性腫瘤，是一種疾病。其特徵為惡性組織的不正常團塊，起因於過度地細胞分裂。癌症細胞不具有正常細胞生長的限制，會侵入與佔領正常留給其它細胞的範圍。癌症治療的種類包括化學治療、手術、放射線以及這些治療的結合。化學治療通常包括使用一個或多個抑制癌細胞生長的化合物。雖然目前已經發展了許多癌症化療藥劑，但仍然需要更有效的化學治療。

本發明提供一種化學全合成牛樟芝所含的天然化合物-安卓幸(antrocin)

的方法，包括：步驟(a).將化合物A

在鹼存在的條件下與硫化物及鹵烷反應生成中間物；和步驟(b).將中間物與自由基引發劑和自由基源反應，得到安卓幸，其中鹼較佳為雙(三甲基矽基)氨基鈉，硫化物較佳為二硫化碳，鹵烷較佳為碘甲烷，自由基引發劑較佳為偶氮二異丁腈，自由基源較佳為三正丁基錫烷。

化合物A是由化合物B

通過還原試劑與酸反應得到，其中還原試劑較佳為鹼金屬，酸較佳為鹽酸。

化合物B是由化合物C

通過金化合物和銀鹽的催化與醇在有機溶劑中反應得到，其中金化合物較佳為如下結構的金化合物(IPr)AuCl：，銀鹽較佳為AgSbF₆ ，有機溶劑較佳為二氯甲烷。

化合物C是由化合物D

與第一步氧化劑反應，再與第二步氧化劑在共溶劑中反應得到，其中第一步氧化劑較佳為2,2,6,6-四甲基-1-呱啶氧自由基和二乙酸碘苯，第二步氧化劑較佳為亞氯酸鈉，共溶劑較佳為三級丁醇和pH值為6.8的磷酸緩衝水溶液。

化合物D是由化合物E

在溶劑中與鹼反應得到，其中溶劑較佳為甲醇、四氫呋喃與水的混合溶劑，鹼較佳為氫氧化鉀。

化合物E是由化合物F

與還原試劑反應得到，其中還原試劑較佳為四氫鋁鋰。

化合物F是由化合物G

在氟源作用下，與高價碘化合物反應得到，其中高價碘化合物較佳為如下結構化合物：

，氟源較佳為四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液。

化合物G是由化合物H

在銅試劑作用下與格氏試劑反應得到，其中格氏試劑較佳由如下結構的溴化物制得：

，銅試劑較佳為溴化亞酮與二甲硫醚的錯合物。

本發明還提供一種組合物在製備用於抑制非小細胞肺癌細胞生長的藥物中的應用，該組合物包含有效劑量的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類與醫藥上可接受載體，其用於預防或治療非小細胞肺癌，對於人類正常支氣管上皮細胞不具細胞毒性。其中，安卓幸是以本發明化學合成安卓幸的方法製得。非小細胞肺癌的癌細胞包括CL1-0、CL1-5、A549、PC9、H1975或H441細胞株，較佳為H441細胞株。

本發明的藥物組合物主要經由活化半胱天冬酶-3(caspase-3)路徑及抑制XIAP、NF-kB及細胞週期素D1(cyclin D1)的表現抑制非小細胞肺癌細胞生長並且使非小細胞肺癌細胞的IFI44、IFIT1、MX1、NFkB1、IFIT2、CTNNBL1、SENP2、CEACAM1、POU5F2、ABCB5、ABCG2及XAF1基因表達降低。

本發明的藥物組合物中，安卓幸或其醫藥上可接受鹽類的有效劑量為1 mg/kg/天至50 mg/kg/天，較佳為5 mg/kg/天至10 mg/kg/天。

先前研究已證實自牛樟芝萃取的天然化合物安卓幸具有抑制乳癌細胞增生的功效(Rao et al.,2011)。本發明以化學全合成牛樟芝所含的天然化合物-安卓幸，並探討其對於人類非小細胞肺癌細胞株生長的影響。圖4A顯示，化學全合成的安卓幸對於數株非小細胞肺癌細胞(NSCLC)的生長具有不同程度的抑制效應，其中對H1975及H441兩株非小細胞肺癌細胞的抑制效果最佳。雖然化學全合成的安卓幸具有顯著的抑制癌細胞增生的能力，但更重要的是，在相同的處理劑量下，化學全合成的安卓幸對於人類正常支氣管上皮細胞則幾乎不具細胞毒性。

本發明進一步以H1975及H441為細胞模式探討化學全合成的安卓幸抑制細胞增生的功效是否與誘導細胞傾向凋亡有關。如圖4B所示，細胞以安卓幸處理48小時後顯著增加細胞凋亡早期及晚期細胞數的比例並呈現劑量效應。結果顯示化學全合成的安卓幸具有誘導NSCLC細胞凋亡的功效。

在確定了化學全合成的安卓幸的分子抗癌機制後，本發明進一步探討安卓幸對於癌細胞的基因層級的影響。預先以5 μM安卓幸培養H441細胞12小時後，再分析安卓幸對於基因轉錄反應的影響。以GeneSpring軟體分析經安卓幸處理後能呈現3.5倍以上的表現抑制效應的基因為主要的目標基因，並以樹狀圖呈現(圖5)，結果顯示具有100個以上的基因明顯因安卓幸的處理而影響其表現。這些基因對於細胞的增生、發炎反應、轉移、侵入、血管增生以及細胞週期的調控，皆扮演重要的角色。表1歸納出因安卓幸的處理而顯著降低表現的基因群。上述這些基因皆與轉錄因數NF-kB有關，如細胞激素(IFI44、IFIT1、MX1)、發炎反應(NFkB1及IFIT2)、幹細胞特性(CTNNBL1、SENP2、CEACAM1及POU5F2)以及抗藥性反應(ABCB5、ABCG2及XAF1)等。根據以上微陣列(microarray)的結果，本發明特別針對發炎相關因數、幹細胞特性以及抗藥性相關分子的表現作更深入的探討。

安卓幸具有抑制高度轉移能力的H441細胞的增生功效，隨著安卓幸的劑量升高能顯著誘發caspase-3的活化而走向細胞凋亡(圖6)。此外，安卓幸對於發炎反應相關分子，包括XIAP、NF-kB-p65及細胞週期素D1的表現方面，亦同樣呈現劑量的抑制效應。

本發明進一步探討安卓幸在活體是否同樣具有抗癌功效。以螢火蟲冷光及綠螢光蛋白雙重載體轉染標定的H441-L2G細胞，經由尾靜脈注射的方式(6×105/100 μl PBS)打入非肥胖型糖尿病/重度聯合免疫缺陷(NOD/SCID)的小鼠中，再以每日腹腔注射的方式施予安卓幸(共兩組，分別為低劑量5 mg/kg/天及高劑量10 mg/kg/天)，持續四周，並觀察腫瘤生長狀況。結果顯示，在投予低劑量5 mg/kg/天安卓幸達兩周後能抑制半數的實驗動物的腫瘤生長，而第三周時大多數的動物才被偵測到有腫瘤的存在(圖7A，7B)，另外安卓幸處理組與控制組間的體重並無顯著性的差異(圖7C)。

在存活率方面，控制組的存活時間中位數為28天，而安卓幸處理組則可達到50天以上。其中低劑量5 mg/kg/天安卓幸處理組有75%的動物生存超過50天，而且在實驗終止時(第50天)至少增加60%的存活時間中位數(圖7D)。

安卓幸可擁有一至三個對掌中心，因此具有各種立體異構物形式。本發明中提及的安卓幸包括所有此等異構物。安卓幸具有選擇性抑制肺腺癌細胞生長的功效。由於其分子量極小，因此，可使用較低劑量的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類，與醫藥上可接受載體的藥物組合物施用，即可得到渴望的治療效果。本發明的醫藥組合物可用於抑制癌細胞、或投予所需的病患(此病患具有癌症、癌症的症狀或傾向於癌症的體質)以治癒、恢復、減輕、緩和、改變、治療、改善、改進或影響疾病、疾病的症狀或傾向於疾病的體質為目的。此處使用的「有效劑量」指有效劑量的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類，具有抑制或治療功效的量。有效劑量可根據給藥的途徑、輔藥使用(excipient usage)以及與其它共同使用(co-usage)的活性藥劑而改變。

此處的「肺癌」意指肺細胞腫瘤。肺癌依組織細胞型態可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中以NSCLC為最常見的型態。在NSCLC中，可以細分成腺癌(adenocarcinoma)和鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)等，以肺腺癌最多。肺癌的另一特徵是早發轉移，早期肺癌症40%的病人會在術後5年內會發生轉移，且目前臨床TNM分期的方法無法準確預測病人預後。此處所指的癌症包括所有種類的細胞不當增生(cancerous growth)或致癌過程(oncogenic processes)、轉移性的組織或惡性轉換的細胞、組織或器官(與組織病理學型態無關)或侵入階段。

本發明的安卓幸是以化學全合成方法製備而得。安卓幸自1995年首度報導在牛樟芝中被發現後(Chiang et al.,1995)，迄今十六年間，除於2011年2月15日發表安卓幸具有抑制乳癌細胞增生的功效外(Rao et al.,2011)，未再有任何相關報導，相關藥理活性報告亦付諸缺如。究其原因乃該安卓幸在一般牛樟芝子實體中含量很低而不易分離取得，本發明以化學全合成安卓幸進而製備製得。

同時，本發明發現安卓幸有效抑制人類非小細胞肺癌的生長，但對正常細胞(正常肺腺上皮細胞-BEAS2B)則幾乎不具細胞毒性；再者，安卓幸抑制H441細胞的發炎相關基因的表現，並活化caspase-3及抑制XIAP、NF-kB-p65及細胞週期素D1的表現而抑制細胞增生，並顯著抑制活體的腫瘤生長。在此必須再強調的是：安卓幸乃是牛樟芝所含各種天然化合物中，惟一經化學全合成製備取得，並經實驗證實其在體外及活體內，有效抑制人類非小細胞肺癌細胞的生長。

本發明所使用的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類，可同時給藥或分開給藥，以口服、非口服、經由吸入噴霧(inhalation spray)或藉由植入貯存器(implanted reservoir)的方式。此處所使用的「非口服」指皮下(subcutaneous)、皮內(intracutaneous)、靜脈內(intravenous)、肌肉內(intramuscular)、關節內(intraarticular)、動脈內(intraarterial)、滑囊(腔)內(intrasynovial)、胸骨內(intrasternal)內蜘蛛膜下腔(intrathecal)、疾病部位內(intraleaional)與頭顱內(intracranial)注射以及灌注技術。

本發明所使用內安卓幸或其醫藥上可接受鹽類，可與至少一種固體、液體或半液體狀的賦形劑或輔助劑一同形成適當的藥劑形式。其形式包括，但不限定於，藥錠、膠囊、乳劑(emulsions)、水性懸浮液(aqueous suspensions)、分散液(dispersions)與溶液。藥錠一般所使用的載體(carrier)包括乳糖與玉米澱粉。一般也將潤滑劑(lubricating agent)，例如硬脂酸鎂(magnesium stearate)加至藥錠中。用於膠囊形式的稀釋劑(diluents)包括乳糖與經乾燥的玉米澱粉。當口服給藥為水性懸浮液或乳劑時，可懸浮或溶解有效成分(active ingredient)於與乳化或懸浮劑結合的油相(oily phase)。如果需要，可加入特定甜味、調味與著色劑。

本發明所使用的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類，亦可配製成無菌注射成分(例如，水或油的懸浮液)，例如利用本技術領域中已知的技術使用適合的分散或增濕劑(例如Tween 80)與懸浮劑。無菌注射調劑也可以將無菌注射溶液或懸浮液加入無毒性非口服的稀釋劑或溶劑，例如1,3丁二醇中。可使用的載體(vehicles)與溶劑包括甘露醣醇(mannitol)、水、林格氏液(Ringer’s solution)與等滲透壓氯化鈉溶液。此外，無菌、固定油常作為溶劑或懸浮媒介(例如合成的單-或雙-甘油酯(glycerides))。脂肪酸，例如油酸與其甘油酯衍生物亦可用在注射劑的調製，其為天然藥學上可接受的油，例如橄欄油、蓖麻油(castor oil)，特別是於其聚氧乙基化的(polyoxyethylated)變化形式。這些油溶液或懸浮液也可包含一長鏈醇類稀釋劑或分散劑，或者羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)或類似的分散劑。

本發明所使用的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類，亦可根據此技術領域中所熟知的技術來配製成吸入成分。例如可製成鹽類溶液，利用苯甲醇(benzyl alcohol)或其它適合的防腐劑、增強生物可利用性(bioavailability)的吸附促進劑、碳氟化合物(fluorocarbon)或其它本技術領域中熟知的助溶或分散劑來配製。

用於藥學組成物的載體必須是「可接受的」，其與配方的有效成分相容(以及較佳為具有穩定有效成分的能力)以及不對病患有害。例如，助溶劑(例如環狀糊精(cyclodextrins)(其與一個或多個萃取物的活性化合物形成特定更可溶解的複合物)，為了有效成分的傳送而作為藥理學上的輔藥。其它載體的例子包括膠狀二氧化矽(colloidal silicon dioxide)、硬脂酸鎂、纖維素與十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate)。

另外，由於抗癌劑如以高劑量投予病患易產生毒性。是以，本發明醫藥組合物為含有有效劑量的安卓幸，用於抑制肺癌細胞生長，其中該有效劑量為1 mg/kg/天至50 mg/kg/天，較佳為5 mg/kg/天至10 mg/kg/天。施予個別病人的特定劑量是依所有可能存在因素而定，例如：所使用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、進食狀況、施用時間與路徑、排泄率、醫藥物質的組合、以及所欲治療疾病的嚴重程度等。

以下實施實例將進一步說明本發明。它們僅用於說明本發明，並闡明本發明特定實施例的各種優點，但不表示本發明僅局限於此種方式。

實施例1

製備安卓幸

除非特別說明，所有反應均在N₂ 保護無水條件下進行，所有試劑都是從試劑公司購得後未經任何純化處理直接使用。試劑純化參照Purification of Laboratory Chemicals(Peerrin et al.,Pergamon Press: Oxford,1980)。四氫呋喃(THF)、甲苯採用金屬鈉回流純化；DCM使用CaH₂ 回流純化。產率除非特別指出均是柱層析分離產率。

反應檢測時使用的是0.25mm青島海洋化工廠生產的薄層色譜矽膠板(60F-254)。柱層析使用青島海洋化工產生產的200-300目矽膠，使用石油醚沸程為60-90℃。

所有紅外資料均是由以下儀器測得：Shimadzu IRPrestige21；所有核磁共振均由以下儀器測得：Brker Advance 500(¹ H:500 MHz，¹³ C:125 MHz)，使用TMS或氘代溶劑中殘留的未氘代溶劑做內標。

安卓幸的反應路徑如圖2、3所示，依下列步驟進行：化合物F的合成：

將含有鎂屑(0.49 g，20 mmol)以及一小塊碘的THF(3 mL)混合液加熱至沸騰。滴加(4-溴丁-1-炔基)三甲基矽烷(2.67 g，13 mmol)的THF(10 mL)溶液，加料完畢後繼續在室溫下攪拌0.5小時，製得如下結構的格氏試劑：

在-78℃下，將製備的格氏試劑加入到CuBr‧Me₂ S(0.32 g，1.56 mmol)的THF(40 mL)混合液中。之後，滴加化合物H(0.95 g，5.2 mmol)的THF(27 mL)溶液。攪拌2小時後用飽和的NH₄ Cl水溶液(50 mL)淬滅反應。EtOAc(40 mL×2)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/100)，得黃色油狀液體化合物G。

將化合物G的THF(60 mL)溶液冷卻至-78℃，加入高碘化物(2.5 g，7.3 mmol)以及TBAF溶液(1 M在THF中，7.3 mL，7.3 mmol)。反應溶液在-40℃攪拌4小時後用飽和的NH₄ Cl水溶液(50 mL)淬滅。EtOAc(40 mL×2)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/20)，得到無色油狀液體1.01 g，兩步產率為58%。

IR(純的，cm^-1 ): 3283,2960,2174,1750,1727,1434,1250,1220,1135,844,760,641;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ3.78(s,3H),2.85(td,J=14.2,5.9 Hz,1H),2.55(s,1H),2.52-2.41(m,4H),1.83(q,J=6.1,5.2 Hz,2H),1.74(ddd,J=13.8,6.0,4.1 Hz,1H),1.64(td,J=13.7,4.5 Hz,1H),1.06(s,3H),0.97(s,3H),0.14(s,9H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 201.6,168.8,106.9,85.2,80.0,75.9,60.2,55.3,53.2,40.2,36.5,34.4,31.1,27.5,22.1,20.3,0.3;HRMS-ESI C₁₉ H₂₉ O₃ Si[M+H⁺ ]計算值：333.1880；實測值：333.1883。

化合物E的合成：

在-40℃下，將LiAlH₄ (0.49 g，12.9 mmol)加入到化合物F(1.07 g，3.2 mmol)的THF(30 mL)溶液中。在室溫下攪拌4小時後用飽和的酒石酸鉀鈉水溶液(20 mL)淬滅反應。EtOAc(20 mL×3)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/3)，得到無色油狀液體0.86 g，產率為87%。

IR(純的，cm^-1 ): 2958,2920,2851,1261,1249,1034,841,796,668;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ 4.14(dd,J=11.4,5.8 Hz,1H),3.80(dt,J=11.4,4.5 Hz,1H),3.58(dd,J=11.3,7.0 Hz,1H),3.02(d,J=4.7 Hz,1H),2.70(t,J=6.7 Hz,1H),2.54(ddd,J=16.3,10.2,5.7 Hz,1H),2.39(ddd,J=16.7,10.4,6.0 Hz,1H),2.35(s,1H),1.93-1.83(m,1H),1.81(q,J=4.0 Hz,1H),1.75-1.65(m,1H),1.59(ddd,J=11.8,6.0,3.0 Hz,1H),1.48(dt,J=13.9,3.4 Hz,1H),1.39(t,J=4.3 Hz,1H),1.32(td,J=13.8,4.1 Hz,1H),0.93(s,3H),0.79(s,3H),0.16(s,9H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 107.3,87.0,84.8,79.2,72.7,61.5,52.4,49.0,39.4,34.1,32.6,27.5,26.8,22.9,22.3,0.3;HRMS-ESI C₁₈ H₃₀ NaO₂ Si[M+Na⁺ ]計算值：329.1907；實測值：329.1903。

化合物D的合成：

室溫下，將KOH(0.76 g，13.5 mmol)加入到化合物E(0.84 g，2.7 mmol)的THF/MeOH/H₂ O(20 mL/10 mL/2 mL)溶液中。反應體系回流6小時後冷卻至0℃，用飽和NH₄ Cl水溶液(20 mL)淬滅反應。EtOAc(15 mL×2)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/3)，得到無色油狀液體0.6 g，產率為95%。

IR(純的，cm^-1 ): 3299,2954,2878,2115,1631,1464,1434,1379,1056,998,634;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ 4.14(dd,J =11.5,5.9 Hz,1H),3.81(dt,J =11.3,4.4 Hz,1H),3.58(dd,J =11.4,7.0 Hz,1H),2.97(d,J =4.7 Hz,1H),2.66(t,J =6.7 Hz,1H),2.51(dddd,J =13.1,10.5,5.7,2.6 Hz,1H),2.41-2.31(m,1H),2.36(s,1H),1.99(t,J =2.6 Hz,1H),1.93-1.79(m,2H),1.76-1.60(m,2H),1.49(dt,J =13.8,3.5 Hz,1H),1.39(t,J =4.3 Hz,1H),1.33(td,J =13.7,4.0 Hz,1H),0.93(s,3H),0.80(s,3H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 87.0,84.5,79.2,72.7,68.6,61.5,52.5,49.0,39.4,34.1,32.5,27.6,26.8,22.2,21.5;HRMS-ESI C₁₅ H₂₃ O₂ [M+H⁺ ]計算值：235.1693；實測值：235.1695。

化合物C的合成：

室溫下，向化合物D(0.34 g，1.45 mmol)的DCM(14 mL)溶液中分別加入TEMPO(2,2,6,6-四甲基-1-呱啶氧自由基，0.16 g，1.03 mmol)和BAIB(二乙酸碘苯，0.56 g，1.74 mmol)。反應體系攪拌12小時後用飽和的Na₂ S₂ O₃ 水溶液(10 mL)淬滅。DCM(8 mL×2)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/8)，得到無色油狀液體。

將上述產物溶於t BuOH(8 mL)和磷酸緩衝溶液(pH=6.8，8 mL)中，室溫下加入NaClO₂ (1.05 g,11.6 mmol)和90%的異丁烯(4.3 mL，36.3 mmol)。反應體系攪拌15小時後用EtOAc(6 mL×3)萃取水相。有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/2)，得到黃色固體0.185 g，兩步總產率為51%。

IR(純的，cm^-1 ): 3297,2962,2870,2118,1709,1460,1392,1370,1264,1229,1071,932,640;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ 7.52(br.s,1H),3.70(dd,J=11.9,4.4 Hz,1H),2.49(br,1H),2.37(s,1H),2.43-2.30(m,2H),2.03-1.92(m,1H),1.97(t,J=2.7 Hz,1H),1.89-1.80(m,1H),1.76(ddt,J=14.9,9.8,5.4 Hz,1H),1.50(dt,J=13.7,3.7 Hz,1H),1.42(t,J=4.3 Hz,1H),1.34(td,J=13.6,4.0 Hz,1H),0.96(s,3H),0.81(s,3H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 174.6,84.5,83.9,77.3,72.3,68.6,53.8,51.1,39.3,34.6,31.6,27.6,27.6,21.3,20.7;HRMS-ESI C₁₅ H₂₁ O₃ [M+H⁺ ]計算值：249.1485；實測值：249.1488。

化合物B的合成：

室溫下，向化合物C(74.5 mg,0.3 mmol)的DCM(6 mL)溶液中分別加入加入(IPr)AuCl(18.6 mg,0.03 mmol)，苄醇(93 μL,0.9 mmol)和AgSbF₆ (10.3 mg,0.03 mmol)。反應體系室溫下攪拌1小時後旋蒸濃縮，經柱層析純化(EtOAc/己烷=1/10)，得到白色固體58 mg，產率為54%。

IR(純的，cm^-1 ): 3486,2949,2869,1778,1455,1357,1144,1086,967,740,698;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ 7.35(q,J=6.4,5.9 Hz,5H),5.19(s,1H),4.93(d,J=10.7 Hz,2H),4.88(d,J=2.2 Hz,1H),4.60(d,J=11.2 Hz,1H),3.79(d,J=1.7 Hz,1H),3.60-3.53(m,1H),2.95(s,1H),2.30(ddt,J=13.8,11.3,2.5 Hz,1H),2.19(td,J=14.9,13.3,6.4 Hz,1H),2.07(tdd,J=14.2,11.5,3.1 Hz,1H),1.85-1.73(m,1H),1.73-1.66(m,1H),1.63-1.52(m,2H),1.30(ddd,J=26.8,13.7,4.2 Hz,2H),1.17(s,3H),0.90(s,3H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 175.6,143.5,135.7,128.8,128.5,128.4,114.0,103.9,77.8,71.1,60.8,55.0,44.6,39.5,32.9,32.5,27.0,26.3,21.9,20.6;HRMS-ESI C₂₂ H₂₉ O₄ [M+H⁺ ]計算值：357.2060；實測值：357.2066。

化合物A的合成：

在-78℃下，將鈉(23 mg，1 mmol)加入到液氨(3 mL)中，並攪拌0.2小時。之後滴加入化合物B(18 mg，0.05 mmol)的THF(2.4 mL)溶液。反應體系攪拌0.6小時後用飽和的NH₄ Cl水溶液(2 mL)淬滅。EtOAc(2 mL×2)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後得到粗產物。

將上述粗產物溶於MeOH(2.5 mL)中，室溫下加入5 M的HCl水溶液至反應體系pH=2。反應液在50℃攪拌3小時後用飽和的NaHCO₃ 水溶液(2 mL)淬滅。用EtOAc(3 mL×3)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/6)，得到白色固體57 mg，兩步總產率為71%。

IR(純的，cm^-1 ): 3428,2958,2928,2854,1765,1746,1382,1261,1161,1055,802;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ 4.79(t,J =1.8 Hz,1H),4.77(t,J =1.9 Hz,1H),4.57(t,J =8.7 Hz,1H),4.00(dd,J =8.8,2.5 Hz,1H),3.62-3.55(m,1H),3.16(dt,J =8.7,2.3 Hz,1H),2.43-2.34(m,1H),2.30(ddt,J =14.5,11.4,2.7 Hz,1H),2.19(dtd,J =13.5,11.7,11.1,2.5 Hz,1H),1.77(ddt,J =16.5,11.3,5.6 Hz,1H),1.65-1.52(m,3H),1.34(dd,J =13.0,4.5 Hz,2H),1.16(s,3H),0.91(s,3H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 177.7,147.0,112.1,79.3,71.6,54.9,53.4,45.4,40.0,33.0,32.7,28.5,27.0,22.0,20.9；HRMS-ESI C₁₅ H₂₃ O₃ [M+H⁺ ]計算值：251.1642；實測值：251.1648。

天然產物安卓幸的合成：

在-78℃下，將NaHMDS(雙三甲矽基胺基鈉(Sodium bis(trimethylsilyl)amide)，2 M在THF中，33 μL，0.066 mmol)滴加到化合物A(11 mg，0.044 mmol)的THF(2 mL)中。在0℃攪拌0.5小時，加入二硫化碳(8 μL，0.132 mmol)。再在室溫下攪拌1小時後加入MeI(19 μL，0.308 mmol)。反應液攪拌2小時後用飽和的NH₄ Cl水溶液(2 mL)淬滅。用EtOAc(3 mL×2)萃取水相，有機相合併乾燥，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/30)，得到油狀物。

將上述油狀物溶於甲苯(2 mL)，室溫下加入n Bu₃ SnH(23 μL，0.088 mmol)。混合物加熱到110℃後加入AIBN(偶氮二異丁腈，Azobisisobutyronitrile)(2 mg)。反應體系攪拌1小時後冷卻至室溫，旋蒸濃縮後柱層析純化(EtOAc/己烷=1/30)，得到8 mg天然產物安卓幸(antrocin)，兩步產率為78%。

IR(純的，cm^-1 ): 2934,2854,1768,1457,1375,1368,1190,1121,1055,894;¹ H NMR(500 MHz,CDCl₃ ) δ 4.84(s,1H),4.81(s,1H),4.48(dd,J=9.5,6.8 Hz,1H),4.15(dd,J=9.5,1.5 Hz,1H),2.67(d,J=6.8 Hz,1H),2.42-2.31(m,1H),2.25(ddd,J=14.3,8.6,5.5 Hz,1H),2.20-2.11(m,1H),1.80(dddd,J=13.6,10.7,6.8,3.5 Hz,2H),1.61-1.50(m,2H),1.48(dq,J=14.0,3.3 Hz,1H),1.44-1.32(m,2H),1.23(dd,J=13.6,3.3 Hz,2H),1.19(s,3H),0.94(s,3H);¹³ C NMR(126 MHz,CDCl₃ ) δ 178.3,146.8,111.2,69.4,54.3,48.5,46.8,42.1,37.0,33.3,33.2,30.4,22.4,22.2,18.8;HRMS-ESI C₁₅ H₂₃ O₂ [M+H⁺ ]計算值：235.1693；實測值：235.1699。

實施例2

安卓幸生物活性分析

(A)　活化冷凍細胞

冷凍細胞的活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞死亡。細胞活化後，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)。冷凍的細胞快速解凍的方法為：將冷凍管由液氮或乾冰容器中取出，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在3分鐘內全部融化，以70%精擦拭保存管的外部，移入無菌操作臺內。取出解凍的細胞懸浮液，緩緩加入有培養基的培養容器內(稀釋比例為1:10-1:15)，混合均勻，放入CO₂ 培養箱培養。在解凍培養後隔日更換培養基。

(B)　人類肺癌細胞的培養

人類肺癌細胞株(CL1-0、CL1-5、H1975、H441、PC9、A549)及人類支氣管上皮細胞(BEAS-2B)皆來自臺北醫學大學臨床醫學研究所，以含有10%胎牛血清、2 mM麩醯胺酸(glutamine)，100 μg/ml鏈黴素(streptomycin)和100 U/ml盤尼西林(penicillin)的DMEM培養基Dulbecco's Modified Eagle's Medium中RPMI基礎培養基維持生長並培養於5% CO₂ 的濕式培養箱中。

(C)　肺癌細胞藥物處理

所有實驗的肺癌細胞皆培養於含10%胎牛血清的培養液中，待細胞長到約八成滿時，將舊培養液抽乾並以PBS緩衝液(磷酸鹽緩衝液)溶液清洗細胞後，加入10毫升不含血清的培養液。依實驗目的不同加入不同的藥物，於37℃恒溫培養箱中進行反應。

(D)　細胞毒性實驗(cytotoxicity)

將人類肺癌細胞株(CL1-0、CL1-5、H1975、H441、PC9、A549)及人類支氣管上皮細胞(BEAS-2B)放置於96孔培養盤(culture plate)(2000細胞/孔)，以及將其隔夜培養於100 μl的完全DMEM中。將50 μl包含安卓幸(0.5-10 μM)的完全DMEM等量樣品加入培養盤的不同孔中。另外，控制組則只加入100 μl的完全DMEM。培養2天之後，以磺醯羅丹明B(sulforhodamine B)(蛋白質結合染劑)分析測定每孔中的細胞數目。簡單地說，固定細胞於10%三氯醋酸(trichloroacetic acid)中，以0.4%磺醯羅丹明B將其染色。染色20分鐘後再以1%乙酸清洗，之後，將與細胞結合的磺醯羅丹明B溶解於10 mM的Tris鹼(Tris base)中。以微量滴定盤檢測器(microtiter plate reader)在562 nm下測定吸光值(optical density)。上述方法亦用來測試CL1-0、CL1-5、H1975、H441、PC9、A549及BEAS-2B細胞株等細胞對安卓幸的敏感性。

(E)　細胞凋亡檢測：

惡性肺癌細胞(H441)經安卓幸處理後，以胰蛋白-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)處理細胞，與培養液一起收集，離心後去掉上清液，並以4℃磷酸鹽緩衝液清洗後，加入1毫升冰冷的75%酒精，放入4℃冰箱過夜，以固定細胞。離心後，續以1毫升PBS懸浮，加入適量的核糖核酸A(RNase A)，於37℃作用30分鐘，最後加入40mg/ml的碘化丙啶(propidium iodide)(PI，Sigma Chemical Co.，cat. No P-4170)避光作用半小時，以35mm尼龍網(nylon mesh)過濾後，以495nm波長激發後，於637nm波長偵測細胞螢光含量，以流式細胞儀進行分析。

(F)　生物冷光造影(Bioluminescence imaging，BLI)

H441肺癌幹細胞將先利用基因轉殖方式加入螢火蟲冷光基因(firefly luciferase)，再利用FACS方法分離出肺癌細胞(這些肺癌細胞就具有螢火蟲冷光基因)然後植入免疫缺陷小鼠皮下或是由尾靜脈進入循環系統。本實施例利用IVIS造影系統(IVISImaging System 200 Series，Xenogen)進行生物冷光造影，首先老鼠以腹腔注射150 mg/kg D-luciferin，10分鐘後將老鼠固定於儀器暗箱中進行造影，由IVIS200系統高靈敏度的CCD照相機測試由具有螢火蟲冷光基因的肺癌細胞所釋放出的冷光，造影時間從120秒開始，並依據防止訊號強度飽和而縮短時間，本實驗中老鼠全程以氣體麻醉(2%異氟烷(Isoflurane)與98%氧)。冷光的訊號強度可以利用IVIS200分析軟體做腫瘤大小和訊號強弱的比較和分析。之後利用此生物冷光造影系統評估安卓幸對人類肺癌細胞的抑制效果。

安卓幸有效抑制人類非小細胞肺癌生長

先前研究已證實天然型態的安卓幸具有抑制乳癌細胞增生的功效(Rao et al.,2011)。本研究進一步以合成的安卓幸探討其對於非小細胞肺癌細胞株生長的影響。圖4A顯示，合成的安卓幸對於數株非小細胞肺癌細胞(NSCLC)的生長具有不同程度的抑制效應，其中更以H1975及H441的抑制效應最佳。雖然合成的安卓幸具有顯著的抑制癌細胞增生的能力，但更重要的是，在相同的處理劑量下，合成的安卓幸對於人類正常支氣管上皮細胞卻不具有顯著的毒性效應。

我們進一步以H1975及H441為目標探討合成的安卓幸抑制細胞增生的功效是否與誘導細胞傾向凋亡有關。如圖4B所示，細胞以安卓幸處理48小時後顯著增加早期及晚期細胞的比例並呈現劑量效應。結果顯示合成的安卓幸具有誘導NSCLC走向細胞凋亡的功效。

安卓幸抑制H441細胞發炎相關基因的表現

在確定了安卓幸的抗癌機制後，進一步探討安卓幸對於癌細胞的基因層級的影響。預先以5 μM安卓幸培養H441細胞12小時後，再分析安卓幸對於基因轉錄反應的影響。以GeneSpring軟體分析經安卓幸處理後能呈現3.5倍以上的表現抑制效應為主要的目標基因並以樹狀圖呈現，並利用STRING9.0分析軟體預測安卓幸影響H441細胞之訊息傳遞路徑及可能抑制標靶(圖5)，結果顯示具有100個以上的基因明顯因安卓幸的處理而影響其表現。這些基因對於細胞的增生、發炎反應、轉移、侵入、血管增生以及細胞週期的調控皆扮演重要的角色。表1歸納出因安卓幸的處理而顯著降低表現的基因群。有趣的是我們發現上述基因皆與轉錄因數NF-kB有關，如細胞激素(IFI44、IFIT1及MX1)、發炎反應(NFkB1及IFIT2)、幹細胞特性(CTNNBL1、SENP2、CEACAM1及POU5F2)以及抗藥性反應(ABCB5、ABCG2及XAF1)等。根據以上微陣列(microarray)的結果，本實施例將特別針對發炎相關因數、幹細胞特性以及抗藥性相關分子的表現作更深入的探討。

安卓幸經由活化caspase-3及抑制XIAP、NF-kB-p65及cyclin D1的表現而抑制細胞增生。

安卓幸具有抑制高度轉移能力的H441細胞的增生功效，隨著安卓幸的劑量升高能顯著誘發caspase-3的活化而凋亡(圖6)。此外，安卓幸對於發炎反應相關分子，包涵XIAP、NF-kB-p65及細胞週期素D1的表現方面亦同樣呈現劑量的抑制效應。

安卓幸顯著抑制腫瘤生長的活體試驗

本實施例進一步探討安卓幸在活體是否同樣具有抗癌功效。以螢火蟲冷光及綠螢光蛋白雙重載體轉染標定的H441-L2G細胞經由尾靜脈注射的方式(6×10⁵ /100 μl PBS)打入非肥胖型糖尿病/重度聯合免疫缺陷(NOD/SCID)的小鼠中，再以每日腹腔注射的方式施予安卓幸(共兩組，分別為低劑量5 mg/kg/天　及高劑量10 mg/kg/天)持續四周並觀察腫瘤生長狀況。結果顯示在投予低劑量5 mg/kg/天　安卓幸達兩周後能抑制半數的實驗動物的腫瘤的生長，而第三周時大多數的動物才被偵測到有腫瘤的存在(圖7A，7B)，另外安卓幸處理組與控制組間的體重並無顯著性的差異(圖7C)。

在存活率方面，控制組的存活時間中位數為28天，而安卓幸處理組則可達到50天以上。其中低劑量5 mg/kg/天安卓幸處理組有75%的動物生存超過50天，而且在實驗終止時(第50天)至少增加60%的存活時間中位數(圖7D)。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，但其並非用以限定本發明。本領域的普通技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍內，所作的改變或修飾，均屬本發明的保護範圍。

圖1是本發明的逆合成路線圖；

圖2是化合物C的合成路線圖；

圖3是安卓幸的合成路線圖；

圖4是合成的安卓幸抑制人類非小細胞肺癌的增生及誘導細胞凋亡的劑量效應：(A)合成的安卓幸抑制人類非小細胞肺癌及支氣管上皮細胞增生的劑量效應；(B)合成的安卓幸誘導H1975及H441細胞凋亡。

圖5(A)是以安卓幸處理的H441細胞的基因圖譜，紅色及綠色區塊分別表示具有爭議及排除的基因；(B)使用STRING9.0分析軟體預測安卓幸影響H441細胞之訊息傳遞路徑及可能抑制標靶。

圖6是安卓幸抑制H441細胞增生主要經由活化半胱天冬酶-3(caspase-3)路徑及抑制XIAP、NF-kB及細胞週期素D1的表現。以相對倍數呈現安卓幸對相關蛋白之抑制能力。β-肌動蛋白(β-actin)為對照組(loading control)。三次獨立試驗皆呈現類似的結果。

圖7是安卓幸抑制腫瘤增生的活體試驗：H441-L2G細胞(6×10⁵ /100 μl PBS)以尾靜脈注射方式施予免疫不全小鼠。安卓幸處理組(低劑量5 mg/kg/天及高劑量10 mg/kg/天)以腹腔注射的方式連續四周每日投予已注射腫瘤的小鼠。每週觀察(A) VIS影像、(B)腫瘤生長、(C)體重，並紀錄(D)生命曲線。

Claims (26)

1. 一種製備安卓幸的方法，包括：(a).將化合物A 在鹼存在的條件下與硫化物及鹵烷反應生成中間物；和(b).將該中間物與自由基引發劑和自由基源反應，得到安卓幸。
2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該鹼為雙(三甲基矽基)氨基鈉，該硫化物為二硫化碳，該鹵烷為碘甲烷，該自由基引發劑為偶氮二異丁腈，該自由基源為三正丁基錫烷。
3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該化合物A是由化合物B 經還原試劑與酸反應得到。
4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該還原試劑為鹼金屬，該酸為鹽酸。
5. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該化合物B是由化合物C 經金化合物和銀鹽的催化與苄醇在有機溶劑中反應得到。
6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該金化合物為如下結構的金化合物(IPr)AuCl：
7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該銀鹽為AgSbF₆ ，該有機溶劑為二氯甲烷。
8. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該化合物C是由化合物D 與第一步氧化劑反應，再與第二步氧化劑在共溶劑中反應得到。
9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該第一步氧化劑為2,2,6,6-四甲基-1-呱啶氧自由基和二乙酸碘苯，該第二步氧化劑為亞氯酸鈉，該共溶劑為三級丁醇和pH值為6.8的磷酸緩衝水溶液。
10. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該化合物D是由化合物E 在溶劑中與鹼反應得到。
11. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中該溶劑為甲醇、四氫呋喃與水的混合溶劑，該鹼為氫氧化鉀。
12. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中該化合物E是由化合物F 與還原試劑反應得到。
13. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中該還原試劑為四氫鋁鋰。
14. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中該化合物F是由化合物G 在氟源作用下，與高價碘化合物反應得到，其中該高價碘化合 物為如下結構化合物：
15. 如申請專利範圍第14項所述的方法，其中該氟源為四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液。
16. 如申請專利範圍第14項所述的方法，其中該化合物G是由化合物H 在銅試劑作用下與格氏試劑反應得到，其中該格氏試劑由如下結構的溴化物製得：
17. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中該銅試劑為溴化亞酮與二甲硫醚的錯合物。
18. 一種組合物在製備用於抑制非小細胞肺癌細胞生長的藥物中的應用，其中該組合物包含有效劑量的安卓幸或其醫藥上可接受鹽類與醫藥上可接受載體。
19. 如申請專利範圍第18項所述的應用，其中該組合物可預防或治療非小細胞肺癌。
20. 如申請專利範圍第18項所述的應用，其中該組合物對於人類正常支氣管上皮細胞不具細胞毒性。
21. 如申請專利範圍第18項所述的應用，其中該非小細胞肺癌的癌細胞包括CL1-0、CL1-5、PC9、H1975或H441細胞株。
22. 如申請專利範圍第21項所述的應用，其中該非小細胞肺癌的癌細胞為H441細胞株。
23. 如申請專利範圍第18項所述的應用，其特徵在於主要經由活化半胱天冬酶-3路徑及抑制XIAP、NF-kB及細胞週期素D1的表達抑制非小細胞肺癌細胞生長。
24. 如申請專利範圍第18項所述的應用，其中該組合物使該非小細胞肺癌細胞的IFI44、IFIT1、MX1、NFkB1、IFIT2、CTNNBL1、SENP2、CEACAM1、POU5F2、ABCB5、ABCG2及XAF1基因表達降低。
25. 如申請專利範圍第18項所述的應用，其中該有效劑量為1mg/kg/天至50mg/kg/天。
26. 如申請專利範圍第25項所述的應用，其中該有效劑量為5mg/kg/天至10mg/kg/天。