TWI432448B - 疫苗 - Google Patents

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TWI432448B
TWI432448B TW096134182A TW96134182A TWI432448B TW I432448 B TWI432448 B TW I432448B TW 096134182 A TW096134182 A TW 096134182A TW 96134182 A TW96134182 A TW 96134182A TW I432448 B TWI432448 B TW I432448B
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Description

疫苗 相關申請案之交互參照
本案請求美國臨時專利申請案第60/844,355號，申請日2006年9月14日及美國臨時專利申請案第60/907,272號，申請日2007年3月27日之優先權，二案全文內容以引用方式併入此處。
本發明大致上係有關人類免疫缺乏病毒(HIV)，特別係有關以碳水化合物為主之HIV疫苗及其製法及用法。
安全、實用且有效之HIV－1疫苗的發展為全球科學社群中占有最高優先順位之一(Klausner等人，科學5628：2036－2039(2003)，Esparza等人，科學策略性計劃，DOI：10.1371/journal.pmed.0020025，方針論壇，第2期，2005年2月)。雖然抗反錄病毒治療(ART)已經大為延長HIV－1感染病人的壽命，但於開發中國家尚未能常規進行抗反錄病毒治療，HIV－1的全球傳播速率仍然持續不衰。若至公元2010年仍未發展出有效的愛滋病(AIDS)疫苗，則全球感染HIV－1的病人數目將超過六千萬人(由全球愛滋病流行病摘要之統計數據推算，「最新AIDS流行病」UNAIDS世界衛生組織2005年12月)。
儘管研究已經超過20年，但尚未知保護接受免疫接種個體免於HIV－1感染所需要的免疫反應型別。已知於急性HIV－1感染(AHI)，CD8＋胞毒性T細胞反應可控制HIV－1的複製至不等程度(綜論於Letvin,Ann.Rev.Med.56：213－223(2005),Gandhi及Walker,Ann.Rev.Med.53：149－172(2002))，但當藉免疫原誘導免疫反應時，CD8＋胞毒T細胞反應可於非人靈長類動物控制於SIV或SHIV挑釁後之病毒設定點(Letvin,Ann.Rev.Med.56：213－223(2005))。業已顯示對HIV－1蛋白質之強力增生性CD4＋T細胞反應係與HIV－1病毒載荷量之免疫控制有良好交互關聯(Gandhi及Walker,Ann.Rev.Med.53：149－172(2002))。如此，高度期望HIV－1疫苗可誘導強勁的CD4＋及CD8＋ T細胞反應，來控制病毒增生，且降低隨後的傳染機率(Letvin,Ann.Rev.Med.56：213－223(2005)，Gandhi及Walker,Ann.Rev.Med.53：149－172(2002)，Mastro及Kitayaporn，AIDS Res.Hum.反錄病毒14 Suppl 3：S223－S227(1998)，Quinn等人，N.Engl.J.Med.342：921－929(2000))。
免除HIV－1感染之完全(「無菌」)免疫力的潛力可能仰賴既有之中和抗體的存在。已知於非人靈長類，於靜脈、陰道、直腸及口服病毒挑釁之後，中和抗體可防止AIDS病毒感染的獲得(Shibata等人，Nat.Med.5：204－210(1999),Mascola等人，J.Virol.73：4009－4018(1999),Mascola等人，Nat.Med.6：207－210(2000),Parren等人，J.Virol.75：8340－8347(2001),Ferrantelli等人，J.Infect.Dis.189：2167－2173(2004))。此項保護程度對於抗病毒(諸如HIV－1)疫苗具有高度吸引力，該種病毒與基因整合而於感染後迅速形成潛在的病毒存庫。但傳染HIV－1基因變異株之多樣性以及大部分HIV－1主要單離株對大部分可誘導中和抗體類型之相對抗藥性已經造成目前疫苗發展上的重大障礙。但由HIV－1感染病人體已經分離出少數罕見的寬廣反應性中和單株抗體(Mab)表示無法於動物體或未受感染的人體藉HIV－1 Env免疫原例行性誘導的抗體種類(綜論參考Burton等人，PNAS 102：14943－14948(2005),Haynes等人，人抗體，付梓中)。
成功地用於其它感染劑疫苗之中和抗體誘導策略至目前為止尚未能用於HIV－1疫苗的開發，包括使用外被膜蛋白質(gp120)免疫接種(rgp120 HIV疫苗研究小組,J.Infect.Dis.191：654－665(2005)，Gilbert等人，J.Infect.Dis.192：974－983(2005))以及使用死病毒或鈍化病毒免疫接種(Levine等人,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.11：351－364(1996)，Lifson等人，AIDS研究與人類反錄病毒，20：772－787(2004))。活減毒SIV確實可誘導對SIV挑釁的實質保護效果；但減毒SIV種系於活體內回復成野生型，已經證實用於新生猴不安全(Whitney等人，Curr.Opin.Infect.Dis.17：17－26(2004)，Koff等人，Nat.Immunol.7：19－23(2005))。
特別重要的疫苗研究領域包括瞭解於黏膜傳染部位對HIV－1粒子及HIV－1感染細胞之宿主免疫反應相關之疫苗研究領域，以及傳染病毒特徵化研究工作。晚近研究工作提示某些進化枝(A及C)(但非其它進化枝(B))之傳播HIV－1之可變回略可能較短，比較慢性HIV－1種系，傳播的病毒可能對中和較為敏感(Derdeyn等人，科學303：2019－2022(2004)，Frost等人，J.Virol.79：6523－6527(2005)，Chohan等人，J.Virol.79：6528－6531(2005))。此外，於血清陽性個體(Alfsen等人，J.Immunol.166：6257－6265(2001))以及高度暴露但未感染的個體(Devito等人，J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.30：413－420(2002))之生殖泌尿道已經報告有寬廣之中和IgA抗體。若此等觀察顯示對HIV－1之黏膜傳播的保護性免疫力有交互關係，則重要地必須將此等發現轉變為於人類誘導保護性IgA黏膜抗體的策略。此外，雖然IgG為子宮頸陰道分泌物中最常見的抗體類型，但極少注意黏膜IgG anti－HIV－1免疫反應之專一性與調節。
HIV－1疫苗發展者的重大難題在於，儘管HIV－1被膜上存在有抗原決定部位(該等抗原決定部位為廣效中和HIV－1人Mab之標靶)，但於使用抗原性Env蛋白質免疫接種後尚未能製作出此等抗體種類，於感染HIV－1後也未能例行性的製造出此等抗體種類(綜論於Burton等人，PNAS 102：14943－14948(2005),Haynes等人，人類抗體，付梓中)。此項失敗之兩大理由為缺乏目前免疫原其可映射誘導中和抗體所需的天然被膜結構，以及宿主對若干保留性HIV－1被膜抗原決定部位的可能忍受狀態。
罕見人廣效中和Mab(Burton等人，PNAS 102：14943－14948(2005))，HIV－1細胞反應可能短暫性(於某些情況下持久性)控制HIV－1(Letvin,Ann.Rev.Med.56：213－223(2005),Gandhi及Walker,Ann.Rev.Med.53：149－172(2002))，且高濃度被動投予的Mab可保護對抗嵌合猴－HIV免疫缺乏病毒(SHIV)挑釁(Shibata等人，Nat.Med.5：204－210(1999),Mascola等人，J.Virol.73：4009－4018(1999),Mascola等人，Nat.Med.6：207－210(2000),Parren等人，J.Virol.75：8340－8347(2001),Mascola，疫苗，20：1922－1925(2002),Mascola，目前生物醫藥3：209－216(2003))，全部皆提示製造成功的AIDS疫苗有望。
HIV－1已經利用多個機轉來調適Env之gp120部分來逃避免疫辨識，該等機轉包括糖蛋白屏蔽(Wei等人，自然422：307－312(2003))、可變區(66－69)突變及構型遮罩(Kwong等人，自然420：678－682(2002))。
gp120被膜蛋白質之外表面為免疫「沉默表面」，該外表面係由N－聯結糖蛋白所覆蓋；gp120高達50%重量比為碳水化合物(Wei等人，自然422：307－312(2003)，Scanlan等人，J.Virol.76：7306－21(2002)，Scanlan等人，Adv.Exp.Med.Biol.535：205－218(2003)，Calarese等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：13372－13377(2005))。JP120的多個糖化位置保持約略相同(約25個位置)，但隨著時間的經過，位置遷移或「釋放出」位置作為中和抗體，此種現象稱作為「釋放聚糖屏障」(Wei等人，自然422：307－312(2003))。罕見存在有人類Mab(2G12)，該人類Mab結合至於HIV－1三聚體上多種寡甘露糖碳水化合物之D1臂及D3臂終端，且廣效中和HIV－1(Scanlan等人，J.Virol.76：7306－21(2002)，Scanlan等人，Adv.Exp.Med.Biol.535：205－218(2003)，Calarese等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：13372－13377(2005))。為何HIV－1病毒粒子碳水化合物之免疫原性不佳，可能有兩大理由。第一理由，由於HIV－1不具有本身的糖化機器，類似其它病毒粒子碳水化合物，2G12所結合的糖類係類似宿主碳水化合物，因而可能被視為「自己的」抗原(Scanlan等人，J.Virol.76：7306－21(2002))。HIV－1碳水化合物之免疫原性不佳的第二個理由為微異質性，換言之單一蛋白質序列預期將表現出多種碳水化合物形式，結果導致免疫反應的稀釋(Scanlan等人，J.Virol.76：7306－21(2002))。
Yang等人驗證每個病毒粒子只有一個三聚體需要結合至宿主細胞來媒介感染(Yang等人，J.Virol.79：12132－12147(2005))。因此為了防止CD4＋、CCR5＋宿主細胞的感染，各個病毒粒子上的全部三聚體必須由至少一個中和抗體分子結合。為了誘導可中和HIV－1之抗體，重要地須瞭解如何誘導高度親和力、耐久且廣效反應性中和抗體，其係系統性存在且存在於黏膜表面。因此若HIV Env表面上的特定碳水化合物可製作成免疫原性，則HIV Env碳水化合物將變成中和抗體反應的可變標靶。同理，HIV Env碳水化合物將變成HIV疫苗之成分。
本發明大致上係有關人類免疫缺乏病毒(HIV)。更特別本發明係關於以碳水化合物為主之HIV疫苗及其製法及用法。
本發明之目的及優點由後文說明將更明瞭。
HIV Env V3環為HIV-1中和抗體之主要標靶(Palker等人，Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA 85：1932-1936(1988)，Haynes等人，疫苗之專家綜論5：347-363(2006))。但晚近資料提示V3環於多種主要HIV中係表面上可得(Bou-Habib等人，J Virol.68：6006-13(1994)，Haynes等人，病毒學345：44-55(2005))。晚近資料(Zolla Pazner等人，2006年愛滋病疫苗會議，2006年8月28日至9月1日，荷蘭阿姆斯特丹)顯示HIV Env之V1環及V2環當糖化時可遮蓋V3環，防止中和抗體結合V3環。不同HIV-1種系(準種)有可變糖化位置(Zhang等人，糖生物學14：1229-1246(2004))，如此Env「沉默面表面的」糖位置有準種改變成HIV準種。
本發明涉及識別於V1環及V2環之特定糖化位置之特定糖之策略，衍生此等碳水化合物來讓其具有免疫原性。對所衍生之碳水化合物產生抗體反應，將迫使病毒突變該特定糖化位置，如此去除該位置之碳水化合物，因而暴露出V3環，讓V3環變成可供抗V3抗體結合。
本發明係關於一種組成物(例如以碳水化合物為主之疫苗組成物)包含免疫原性(例如衍生結果變成免疫原性)碳水化合物及載劑。其它組成物成分包括能誘導產生抗V3抗體之V3胜肽(諸如胜肽62.19進化枝B V3，例如參考 PCT/US02/35625及PCT/US04/005497；及美國專利申請案10/373,592及10/431,596)、全共同序列(whole consensus)或野生型Env gp140(例如參考PCT/US2004/030397；美國專利申請案10/572,638)。此外也可識別HIV Env三聚體表面上得自其它區的特定碳水化合物，經過衍生且用作為組成物的額外其它成分。
本發明組成物之設備涉及V1、V2區碳水化合物之識別及該等碳水化合物之衍生因而讓其具有免疫原性。衍生例如可使用多種分子執行，該等分子諸如鎖孔蜞血藍質(keyhole limpet hemocyanin)、CRM197、或破傷風類毒素。另外HIV gag p24助手區諸如GTH1序列(YKRWIILGLNKIVRMYS)可用來衍生碳水化合物(參考後文實例)。
根據本發明，HIV Env表面上的全部碳水化合物可經衍生且用作為疫苗成分。例如，完好的HIV Env上的全部碳水化合物由於例如已經使用破傷風類毒素衍生而變成具有免疫原性。另外，HIV Env上的全部碳水化合物可經過裂解，然後，例如使用破傷風類毒素衍生(Wang等人，疫苗7：1112-1117(2003)；Amir-Kroll等人，J.Immunol.170：6165-6171(2003))，而用作為HIV疫苗成分。
根據又一實施例，碳水化合物可經識別結合至某些植物凝集素，植物凝集素經由結合至HIV Env三聚體表面碳水化合物而具有anti-HIV-1活性。此種植物凝集素之實例包括蕁麻(urtica diotica)(UDA)、雪地雪珠花(雪點)(glanthus nivalis)及刀豆球蛋白A(Hammar等人，AIDS Res.Hum.Retrovirol.11：87－95(1995)；Balzarini等人，J.Biol.Chemistry 280：41005－41014(2005))。要緊地，雖然HIV容易由2G12 Mab突變遠離，及由大部分植物凝集素突變遠離，但HIV由UDA植物凝集素之中和效應突變遠離較為困難(換言之較罕見脫序突變)。雪地雪珠花(雪點)植物凝集素及UDA植物凝集素之中和能力晚近已經對一組HIV主要單離株進行研究。於400微克/毫升，雪地雪珠花可於下列力價中和下列HIV主要單離株：TV－1(>43,740)、SF162(22410)、DU123(>43,740)、BG1168(<20,陰性)、DU422(>43,740)、6101(724)。相反地，UDA係以下列力價中和下列HIV主要單離株：TV－1(600)、SF162(467)、DU123(1576)、BG1168(190)、DU422(468)、6101(428)。如此，對某些單離株，此等植物凝集素中之一者或另一者可中和HIV主要單離株。此等資料指示當如前述衍生之碳水化合物結合至此等植物凝集素(可藉植物凝集素管柱親和層析術而單離自HIV Env，或單離自正常血漿蛋白)時，該等碳水化合物可用作為誘導對HIV之廣效反應性中和抗體之免疫原。HIV Env表面上或宿主蛋白表面上可由可中和HIV之植物凝集素(諸如雪地雪珠花或UDA)結合且因而變成具有免疫原性之碳水化合物，可用作為HIV疫苗成分。
經由研讀本揭示可知由HIV Env之V1、V2區或其它區所識別，或藉HIV Env上的碳水化合物之植物凝集素純化所識別之碳水化合物之模擬體可使用適體技術製備，或使用胜肽存庫以胜肽模擬體之技術製備(Agadjanyan等人，自然生物技術15：547－551(1997))。此等HIV之碳水化合物之模擬體也可用作為疫苗抗原。此外2G12 Mab可用來使用2G12親和層析術識別適體或胜肽之模擬體。
下列實例包括可用來識別於HIV被膜蛋白質之特定位置之糖化反應之方法之細節說明。本發明包括實例所述方法。
先前只有一個HIV－1 Env種系係以糖化位置專一性方式特徵化。該種系為表現於CHO細胞之gp120(Zhu等人，生物化學39：11194－11204(2000))。此型蛋白質於第III期臨床實驗中已經證實作為疫苗無效(rgp120 HIV疫苗研究小組，J.Infect.Dis.191：654－665(2005))。此種失敗的一項解釋為，CHO細胞所產生的糖化輪廓資料係與於人T－細胞所觀察得之糖化輪廓資料不同。因此於不合格疫苗中的聚糖屏蔽無法充分模擬於HIV－1病毒上之Env聚糖屏蔽。眾所周知於不同細胞系或不同種屬之糖化可產生不同的糖化樣式(Dalpathado等人，生物化學45：8665－8673(2006))，故後文實例所述研究目的係於細胞系統中表現HIV－1 Env，結果導致HIV－1之糖化作用，密切類似存在於病毒單離株上的糖化作用。
除了前述研究識別於HIV－1 Env的各個糖化位置之糖化之外，已經進行多項其它研究，注意力焦點集中在由單離自下列細胞：自HIV-1 Env釋放之聚糖之碳水化合物結構之特徵化：CHO細胞(Muzuochi等人，生物化學J.254：599-603(1988)、人類T細胞(Adachi等人，J.Exp.Med.167：323-331(1988))及人類樹狀細胞(Monzavi-Karbassi等人，Arch.Virol.149：75-91(2003))。結合廣效中和抗體2G12之HIV Env碳水化合物之結構已經經過徹底研究(Scanlan等人，J.Virol.76：7306-21(2002)，Scanlan等人，Adv.Exp.Med.Biol.535：205-218(2003)，Calarese等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：13372-13377(2005)，Wang等人，Chem and Biol.11：127-134(2004))。如此，已經識別HIV-1 Env之若干碳水化合物結構，但至今為止尚未識別V1、V2環或Env其它區之特定碳水化合物結構，其可製作成免疫原性，且誘導的抗碳水化合物抗體可中和HIV。但曾經報告，抗若干碳水化合物結構之單株抗體包括LeY、A1及sialy-Tn可中和HIV-1，如同mab 2G12，證實抗碳水化合物抗體若經誘導時可中和HIV的構想(Hansen等人，J.Virol.64：2833-2840(1990))。此外，HIV使用表面碳水化合物來結合樹狀細胞而進入樹狀細胞(Granelli-Piperno等人，流行生物學9：21-29(1999)；Turville等人，J.Virol.79：13519-13527(2005))。如此抗碳水化合物抗體可抑制涉及主要HIV感染之大部分細胞類型HIV感染力。
若干本發明之態樣可於下列非限制性實施例詳細說明。(也參考Burton等人，Nat.Immunol.5：233-236(2004)，Cutalo等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.15：1545-1555(2004)，Einfeld及Hunter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8588－8692(1988)，Evans及Desrosiers，Immunol.Rev.183：141－158(2001)，Fenouillet等人，生化科學趨勢19：65－70(1994)，Flynn等人，J.Infect.Dis.191：654－665(2005)，Gaschen等人，科學296：2354－2360(2002)，Geyer等人，Eur.J.biochem.193：855－862(1990)，Gilbert等人，J.Infect.Dis.191：666－677(2005)，Hartley等人，愛滋病研究及人類反錄病毒21：171－189(2005)，Haynes及Montefiori Expert.Rev.Vaccines，5：579－595(2006)，Hebert等人，J.Cell Biol.139：613－623(1997)，Hemming等人，Arch.Virol.134：335－344(1994)，Hemming等人，Arch.Virol.141：2139－2151(1996)，Humbert及Dietrich，AIDS Rev.8：51－59(2006)，Jeffs等人，J.Gen.Virol.77：1403－1410(1996)，Johnson等人，J.Virol.75：11426－1143692001)，Kothe等人，病毒學360：218－234(2007)，Kothe等人，病毒學352：438－449(2006)，Kwong，自然433：815－816(2005)，Kwong等人，自然393：648－659(1998)，Land及Braakman，生物化學83：783－790(2001)，Lee等人，Proc.Natol.Acad.Sci.USA 89：2213－2217(1992)，Letvin等人，Annu.Rev.Immunol.20：73－99(2002)，Li等人，J.Virol.67：584－588(1993)，Liedtke等人，糖生物學4：477－484(1994)，McMichael,Annu.Rev.Immunol.24：227－255(2006)，Mizuochi等人，J.Biol.Chem.265：8519－8524(1990)，Perrin等人，病毒學242：338－345(1998)，Poignard等人，Annu.Rev.Immunol.19：253－274(2001)，Preston等人，科學242：1168－1171(1988)，Reitter等人，Nat.Med.4：679－684(1998)，Saunders等人，J.Virol.79：9069－9080(2005)，Singh,Virol.J.3：60(2006)，Wolk及Schreiber,Med.Microbiol.Immunol.195：165－172(2006)，Wyatt等人，J.Virol.67：4557－4565(1993)，Yeh等人，生物化學32：11087－11099(1993)，Zolla－Pazner,Nat.Rev.Immunol.4：199－210(2004)。
實例I
實驗細節 糖蛋白消化糖蛋白消化有三個基本成分亦即將蛋白質變性、將半胱胺酸還原及烷化；及蛋白酶消化。各步驟說明如下。
變性條件可經由控制所添加之緩衝液數量或類型、所添加之賦形劑諸如EDTA、乙腈或尿素，或經由選擇沸騰蛋白質來調整至最佳化。所利用之變性條件之兩個實例為：(A)蛋白質溶液與水性碳酸氫銨緩衝液(pH 8.0)組合，沸騰20分鐘，進一步以乙腈稀釋，至乙腈終濃度為30%[此等條件為第2圖之條件]；以及(B)糖蛋白與6M尿素、2 mM EDTA及tris緩衝液(pH 7.5)組合(參考第4圖)。
於變性後，蛋白質可經還原及烷化。此項處理程序可經由改變試劑濃度或反應時間來調整至最佳化。還原及烷化條件之二實例包括：(A)於60℃以10 mM DTT(二硫赤蘚醇)還原半胱胺酸30分鐘，接著為烷化步驟，添加25 mM IAA(吲哚乙酸)，及於37℃於暗處反應30分鐘；以及(B)於60℃以10 mM DTT還原半胱胺酸60分鐘，接著為烷化步驟，添加25 mM IAA及於37℃於暗處反應60分鐘。
於還原及烷化後進行消化，消化可使用多種酶而達成。胰蛋白酶為用於此項目的之最常用之酶，但其它酶例如鏈霉蛋白酶(pronase)、蛋白酶K、Lys－C等也可個別使用或組合使用。典型胰蛋白酶消化條件包括於37℃使用胰蛋白酶以蛋白質：酶比＝50：1(w/w)消化蛋白質隔夜，或於37℃使用胰蛋白酶以蛋白質：酶比＝30：1(w/w)消化蛋白質隔夜，接著於相同條件下進行第二次消化。
MS分析之樣本製備於消化完成後，於MS分析前可進行額外樣本製備。例如樣本可以「離線」辦法藉HPLC分選，此處收集個別洗提分，於分析前進一步加工處理。另外，可使用「線上」HPLC－MS，此處MS分析直接接於分離步驟之後。於「離線」辦法中，條件包括使用具有尺寸4.6內徑x150毫米之C18管柱，於1毫升/分鐘之流速隨著時間之經過流過遞增乙腈(ACN)梯度(此處溶劑A為水含0.1%甲酸，溶劑B為ACN含0.1%甲酸)。於此等條件下，可注入小部分消化液(20－30微升)，每分鐘收集洗提分。對60分鐘之層析回合而言，收集60洗提分(參考Zhu等人，生物化學39：11194－11204(2000))。此等洗提分隨後經乾燥，於MS分析前於10微升水中重新調製。另外，經由乾燥各洗提分，再度收集第二回合洗提分於相同小瓶內，接著第二乾燥步驟，可提升各洗提分之終濃度。經由改變梯度、管柱類型、動相組成或分離溫度，可將糖肽之分離最佳化。
MS分析糖肽之質譜術分析可使用多種儀器完成，諸如MALDI TOF－TOF質譜儀(普提米克(Proteomics)4700，應用生物系統公司(Applied Biosystems)製造)及ESI－傅立葉轉換質譜儀(LTQ－FTMS，瑟莫公司(Thermo)製造)。總而言之，於獲得資料前可校準儀器。用於MALDI－MS分析，可使用離線樣本製備方法，水性樣本可打點於MALDI標靶上，連同適當基質，以反射模式獲得MS資料，獲得最佳質量準確度。第2、4、5及7圖含有使用「離線」辦法所收集之MALDI－MS資料實例。檢測得之可能為糖肽之任何尖峰可經由進行MS/MS分析來進一步特徵化。於本實驗中，前驅物離子經過選擇、分段，記錄銜接質譜術資料。由MS/MS實驗例所得資料顯示於第6圖。
MS資料也使用LTQ－FTMS，使用線上或離線樣本製備方法獲得。於離線情況下，樣本載入奈米－ESI－MS之奈米噴灑梢端。若屬可能獲得懷疑為糖肽之任何尖峰之MS/MS資料。於「線上」辦法中，MS分析係與HPLC分離同時進行。於此等實驗中，典型使用毛細HPLC管柱，HPLC條件可經最佳化來提供糖肽之最佳分離，可即時獲得高解析度MS資料。藉此方式所得之MS資料實例係於第8圖。此外，使用儀器之資料相依性掃描特徵，典型進行自動化MS/MS分析。
資料解譯於獲得質譜資料後，用來分辨附接至感興趣之糖蛋白上各個糖化位置之碳水化合物部分。分派尖峰予糖肽組成物之大致策略涉及：(1)識別最可能的糖肽尖峰，(2)使用此等尖峰之MS/MS資料(當可得時)來分派各個糖肽之肽組成，以及(3)藉助於GlycoPep DB(其為堪薩斯大學所設計及維持之以網路為基礎之演算法)來分派整個糖肽組成物。
由糖肽識別為最可能之質譜尖峰，可使用多項策略進行。大致上此等尖峰係大於2000 Da，一項策略係嘗試分派高於此質量臨界值之任何尖峰。另一辦法係尋找質譜中由一個共通單醣單位之質量所隔開之一對離子或一串離子。例如己糖為162 Da，故當存在有成對離子係分開162 Da時，此等離子可假設為糖肽，其質量差異達一個己糖單位之質量。此種辦法之實例顯示於第2、5、7及8圖。MS/MS資料也可用於驗證離子為糖肽。一種使用MS/MS資料來驗證離子之辦法為尋找隔開120 Da或266 Da之一對大型離子之糖肽。此二離子係與銜接質譜術期間常見產生之兩種易得分段產物相對應。此種辦法顯示於第6圖。另也可使用基於MS資料識別可能之糖肽之其它方法。
於給定之質譜峰經識別為可能之糖肽候選者後，MS/MS資料可用來分派糖肽之胜肽組成。MALDI TOF－TOF分析對此特別有利，原因在於需要兩種離子來分派糖肽，可識別為分隔120 Da或266 Da之一對離子，典型為光譜中之大型離子。一旦已經識別此對離子，被指定為糖肽之0,2 X離子及Y1,a 離子，基於該指定胜肽之質量被輕易計算(參考第6圖)。
於糖肽之胜肽部分分派後，最終分析步驟係使用有關胜肽資訊來簡化離子之碳水化合物部分之分派。GlycoPep DB可用於進行此項分派。GlycoPep DB使用輸入胜肽序列(或胜肽質量)，連同先前特徵化之碳水化合物資料庫來識別由質譜輸入各尖峰之質量匹配。
若無法取得MS/MS資料，仍然可使用高解析度MS資料，而由GlycoPep DB獲得胜肽組成。於此種情況下，以迭代方式，使用者輸入任何可能之胜肽質量或胜肽序列其可構成來自於所分析糖蛋白之糖肽之一部分。於此等情況下GlycoPep DB提供與所提供之高解析度MS資料符合一致之全部匹配的糖肽組成。由GlycoPep DB輸出之螢幕畫面顯示於第5圖。顯示第5圖之質譜中有數個峰為含有相同胜肽序列之糖肽。雖然理論上可使用其它工具來分派由HIV被膜蛋白質所產生之糖肽之質譜，但其它辦法導致不正確分派之發生率較高，要求顯著較多分析時間。
結果 HIV被膜糖蛋白經過重度糖化。例如JRFL gp140 CF序列(第1圖)有27個不同可能的N－鍵聯糖化位置(以紅色表示)。識別此等聚糖結構，表示數種疫苗發展策略中之一項重要成分。
因HIV Env糖化可由一個糖化位置改變為下一個糖化位置，聚糖靶定於疫苗發展之一項重要態樣係可識別於蛋白質之各個附接位置存在有哪些結構。由於蛋白質之複雜度，需要新穎分析策略來達成此項任務。此處所述方法可成功地用來於HIV被膜蛋白質之特定位置識別糖化。與先前其它糖蛋白之分析之差異在於：(1)消化條件特別調整來提供此種膜可溶性蛋白質消化所需之苛刻條件，同時提升不良游離糖肽之信號，(2)分析步驟係設計來確保尖峰不會錯誤分派，此點對HIV被膜蛋白為特別嚴重的考量，原因在於糖化位置的少數，導致幾乎為壓倒性數目之可能MS尖峰分派數目，因此重要地需有代理策略，來協助排除全部「錯誤」尖峰分派而其恰巧為正確質量。
第2－4圖驗證使用訂製設計消化條件之重要性。用來產生第2圖資料之條件為適用於寬廣糖蛋白範圍之標準消化條件。對HIV被膜蛋白，此等條件產生不良信號對雜訊譜，只有少數可識別之糖肽離子(第3圖驗證若此等量驗係於不同型質譜儀上進行，則光譜品質未見改良)。第4圖將此等「標準」條件與對HIV被膜蛋白質分析訂製設計的另一組條件作對比。第4圖中，「新穎消化條件」產生較為乾淨的質譜，有較多可識別之糖肽離子。
第5圖及第6圖驗證資料分析辦法。於獲得高品質後，識別與糖肽離子相對應之質譜尖峰之HIV被膜糖肽之高解析度MS資料。第5圖中，此等尖峰可識別，原因在於離子質量大於2000 Da，串列出現於光譜中，此處串列中各個離子之質量差異為一個單醣單位的質量。例如上方加星號之尖峰差異為一個己糖單醣單位的質量亦即162 Da。
於識別可能之糖肽尖峰後，可對各個離子獲得MS/MS資料。此資料實例顯示於第6圖。如前文說明，本資料係用於識別糖肽之胜肽部分。此驗證程序可大為降低不準確之尖峰指定之發生率。分派此胜肽部分之重要性可使用不相關之糖肽驗證(Irungu等人，Anal.Chem.78：1181－1190(2006))。於胜肽驗證完成後，可使用發明人小組所寫的以網路為介面之演算法GlycoPep DB來分派糖蛋白之碳水化合物部分。GlycoPep DB演算法之輸出實例顯示於第5圖之插圖。使用GlycoPep DB也可降低不準確之糖肽分派的發生率。雖然先前已經驗證此辦法之個別片段，但本辦法表示分派糖肽尖峰之新穎全球策略，此處該策略之各個步驟係設計來限制質量分派不準確的全部可能。
第7及8圖表示HIV被膜糖肽之糖胜肽離子質譜之額外實例。第7圖係使用用來產生第5及6圖之資料之相同條件獲得，第8圖係使用相同消化程序但使用另一種質譜檢測策略來獲得。於此種情況下，使用不同型質譜儀亦即FT－MS作為檢測方法，來完成線上HPLC－MS分析。檢測策略說明於此處，MALDI MS及線上HPLC－MS皆為廣為人使用之技術。兩項策略由於可提供互補資訊故目前皆實際實施。
前述方法與相關分析(例如Zhu等人，生物化學39：11194－11204(2000))之差異主要係來自於所使用之資料分析觀點(差異也存在於樣本製備方法，但此等改變為「增量」)。就資料分析而言，先前工作係仰賴胰蛋白酶消化、使用神經胺酶之糖苷外切酶反應、及使用PNGase F釋放聚糖來分派糖肽之組合；大部分結構式皆被分派質量準確度臨界值±0.5%(Zhu等人，生物化學39：11194－11204(2000))，以今日標準而言為相當不良。與此種辦法不同之主要元素包括：無需PNGase F及神經胺酶；質量準確度高100倍；藉MS/MS實驗驗證各糖肽；全部聚糖組成之生物優先順序皆使用例如GlycoPepDB之工具證實。此等變化為確保尖峰不會錯誤分派所需。晚近驗證(Irungu等人，Anal.Chem.78：1181－1190(2006))資料分析方法例如用於先前gp120分析之方法(此處胜肽組成物並未對各個分派尖峰個別驗證)可能導致錯誤分派或含糊分派。前述資料分析方法表示任何糖蛋白包括全部HIV被膜糖蛋白分析之第一實例，HIV被膜糖蛋白中，三種工具(低質量誤差、獨立胜肽驗證及GlycoPepDB)焦點集中在確保最佳可能糖肽分派的單一策略。
實例II
CON－S及JR－FL之糖化位置專一性分析資料呈現於表1－4。表中各行表示使用質譜分析所識別之一個獨特離子。表1及表2表示透過HPLC分選接著經MALDI－MS所得之資料；表3及4之資料係得自使用線性離子阱－傅立葉轉換質譜儀之線上HPLC－MS分析。
表中之各個離子於被考慮為「適當分派」之前必須符合某些標準。首先，所分派之離子之質量誤差必須為對感興趣之特定離子及所使用之儀器之合理數值。質量準確度係基於單一同位素尖峰之質量計算。「合理」質量誤差通常於MALDI TOF－TOF係小於160 ppm，於FT－MS係小於100 ppm(除非當同位素尖峰無法被解析，因而質量準確度係基於第一同位素尖峰計算時)。「典型」質量誤差遠低於最大臨界值。通常於MALDI係於20 ppm質量之範圍，而於FT－MS係於10 ppm之範圍。
第二標準為所分派之碳水化合物必須為生物相關性。通常達成此項標準，原因在於程式GlycoPep DB典型用來產生候選的分派，故能達成此項標準。於GlycoPep DB資料庫中之全部結構先前已經報告於參考文獻，故為生物相關性。於罕見的情況下，當光譜係以手動分派時，只考慮生物相關糖化分派。
確保分派尖峰之準確度之最終標準為各糖肽之胜肽部分必須獨立證實。此項驗證可以多種方式達成。對MALDI資料，胜肽典型係使用於糖肽離子之MS/MS實驗證實。本實驗期間，通常存在有兩個離子亦即[0,2 X]離子及[胜肽＋H]離子，證實胜肽之質量。對光譜中每個離子並不要求此項資訊，或不可能獲得此項資訊。原因在於含有相同胜肽序列之離子通常係於相同時段洗提出，驗證任何給定離子之分派標準為感興趣之糖肽之胜肽部分必須證實對與感興趣洗提分相對應之質譜中所存在之至少另一個離子而言為存在該感興趣糖肽之胜肽部分。
偶爾，離子信號過小而無法執行MS/MS分析，或若胜肽經過多重糖化，MS/MS資料提供非結論性結果。於此等情況下，可以另一辦法證實糖肽之胜肽部分，諸如使用PNGase於糖肽洗提分進行糖肽之去糖化反應。此種酶可裂解於糖肽上之碳水化合物，釋放出存在於該洗提分之未經糖化胜肽，質譜分析可用來證實所得胜肽之身分。
對於線上LC-MS資料，與糖肽之胜肽部分相對應之離子為[胜肽+HexNAc]；或若碳水化合物經過海藻糖化，則該離子典型為[胜肽+HexNAc+海藻糖]。此外，LC-MS實驗中糖肽之MS/MS資料典型提供有關糖肽之碳水化合物部分之額外資訊，若未能直接獲得有關胜肽質量之資訊，則也可用來證實離子之分派。
實例III
糖化樣式受蛋白質之三度空間結構的影響。比較於V1環前於共通糖化位置之CON-S及JR-FL之資料(第9圖)顯示即使該序列於二蛋白質間有高度保留性，但糖化改變。如此顯示糖化並非主要序列之直接結果。同理，糖化差異無法歸因於不同細胞系、不同純化法、或不同分析，原因在於兩種蛋白質進行相同條件。因此，糖化最可能係由於當蛋白質移動通過高爾基氏體(此處其糖化經過修改)(第9圖)時，因糖位位置周圍的三度空間環境差異所引起。請參見第9圖，CON-S與JRFL Pre V1之比較，CON-S：AYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEIVLENVTENFNMWK：糖化為高甘露糖和複合物(二族群)；JRFL：AYDTEVHNVWATHACVPTDPNPQEFVLENVTEHFNMWK：不含高甘露糖。糖化皆為全複合物，大部分為岩藻糖化結構。組成：兩種蛋白質中最靠近ENVT位置的70個胺基酸有95%相同，但糖化不同。如此驗證無法「假設」瞭解未經特徵化蛋白質之糖化樣式，即使極為類似的蛋白質序列之糖化為已知亦如此。
二蛋白質上之V1環含有高甘露糖碳水化合物之糖化位置。如此暗示於高爾基氏體中糖化重新塑型之酶無法接近此等糖類，而蛋白質係經過後轉譯修改。此乃整個蛋白質之最為重度糖化區之一，糖質量為胜肽質量之2倍至3倍(第10圖及第11圖)。請參見第10圖，CON-S：V1及V2；LTP：全部四個位置皆經利用。全部四個位置：高甘露糖，Man9、Man9、Man9、Man8至Man6、Man6、Man5、Man5酶無法接近此等位置來修改糖類。碳水化合物質量為胜肽質量的2-3倍。***分派之二次驗證懸而未決；NCS：利用兩個位置中之一者。觀察得寬廣多種糖型(約30)。「非一致結構」通過高爾基氏體碳水化合物質量為胜肽質量的一倍至1.5倍。LDV：利用兩個位置中之一者(約40結構)。碳水化合物質量約等於胜肽質量。HIV糖蛋白ID之「新穎」結構。請參見第11圖，JRFL：V1及V2，DVN：全部三個位置皆被利用。全部三個位置：高甘露糖。Man7、Man7、Man7、及Man7、Man7、Man9酶無法接近此等位置來修改糖類。碳水化合物質量為胜肽質量的2.5倍。與Con-S相同**二次驗證懸而未決。NCS及GEIKNCS：經利用一個位置(NCS)及兩個位置。觀察得寬廣多種糖型。GEIK...之經糖化保護之蛋白質分解。碳水化合物質量為胜肽質量的一倍至2.5倍。比Con-S更加多變(1個和2個位置)。LDV：利用兩個位置中之一者(多種結構)。碳水化合物質量約等於胜肽質量。HIV糖蛋白ID之「新穎」結構與Con-S相同。V2環顯示CON-S與JRFL間之變化。CON-S於各個V2胜肽只有一個位置由糖化所占據，表示於各個胜肽的一個位置維持未被占用(第10圖)(進行額外驗證試驗)。相反地，JRFL偶爾有於V2序列之第一胰蛋白酶胜肽上的兩個 糖化位置皆被占用(第11圖)。JRFL及CON-S顯示對V2區之第二糖化胜肽有類似的糖化樣式。此處，獲得多個結構。對於含HIV糖肽先前未曾報告若干此等聚糖。該等結構具有4HexNAc鄰接於三甘露糖核心，且係以經海藻糖化形式及非經海藻糖化形式存在(第10圖及第11圖及質量分派表)。由於於V2環末端區域存在有如此多種不同型聚糖，此項觀察係與此點於蛋白質中之單一保留三級結構的缺乏符合一致，原因在於有明確界定之三級結構之蛋白質通常可提供較為同質之糖化(參考Mir-Shekari等人，J.Biol.Chem.272：4027-4036(1997)及其中於實例中引用之參考文獻)。
於CON-S中之V2環之極為末端，檢測多種不同型之糖型，部分蛋白質未經糖化，驗證極為高度之結構異質性(第12圖)。請參見第12圖，CON-S：V2與V3間，LINCN：每種物質，包括得自V2位置(和未經糖化位置)之「新穎」結構。CNDKKFNGT：兩組：高甘露糖和小的「複合」型。NVSTV：兩個位置中之一者經使用：高甘露糖。SENIT：大部分為高甘露糖(小型)。(五個可能位置中，兩個位置至少偶爾為未經糖化)。如此係與CON-S上之V2與V3間該區中央之蛋白質序列鮮明成對比。於此部分之胰蛋白酶胜肽NVSTVQ...有一個未被利用的位置，第二個位置只有含高甘露糖之碳水化合物(第12圖)。如此表示此等糖化位置並未接近可能增加碳水化合物及修改碳水化合物之酶。如此可由碳水化合物作為內部守護者，蛋白質環繞碳水化合物摺疊來解釋(Jitsuhara等人，J.Biochem.132：803-811(2002))；或者或許蛋白質單純係以隱藏糖化位置之方式摺疊來作解釋。任一種情況下，糖化位置皆明顯被蛋白質所 阻隔，原因在於糖化位置未藉糖基轉移酶所徹底修改。此項理論確切被接受用來解釋於得自哺乳動物系統之糖蛋白上存在有含高甘露糖之碳水化合物(Mir-Shekari等人，J.Biol.Chem.272：4027-4036(1997))。V2與V3間之其它胰蛋白酶胜肽遵循如下趨勢：於該等胰蛋白酶胜肽上有高度含高甘露糖之碳水化合物(第12圖)。
組成V3環之胰蛋白酶胜肽上之糖化摘要示於第13圖(對CON-S)及第14圖(對JRFL)。請參見第13圖，接近V3之CON-S，V3區域為高度保留性位置。TIIVQ：3個位置中只利用一個。糖化有變化但變化小。糖化佔胜肽質量之二分之一。QAHC：大部分高甘露糖結構。請參見第14圖，接近V3之JRFL，ESV：兩個位置皆利用。至少一個位置為複合物。另一個位置偶爾為高甘露糖，而偶爾為複合物。糖質量為胜肽質量之1.5倍至2倍。QAHC：藉MALDI找到34個獨特結構(每種物質)(藉ESI-MS只找到三種結構)。有關此資料最重要的觀察係對CON-S，V3環起點含有開放糖化位置，通常小型糖型只存在於占用位置。相反地，JRFL含有糖化於V3環起點之糖化位置。結果，比較使用JRFL，似乎最可能使用CON-S更容易誘導V3導向抗體。對JRFL，糖質量為其相對應之胰蛋白酶胜肽質量之1.5倍至2倍(於V3起點)；對CON-S，糖質量為胜肽質量之半量。顯然胜肽更加可接近CON-S中之抗體。
於V3環末端，於二蛋白質觀察得多種糖型。大致上，CON-S含有較高比例之高甘露糖結構式，而JRFL含有超過30種糖型。本資料間接指示CON-S蛋白質之此一部分較為有序，當蛋白質行進通過高爾基氏體時，糖化位置通常被阻隔。相反地，JRFL之糖化含有高度變異，唯一的解釋為 此部分蛋白質由於經過後轉譯處理，故未具有一致之結構性抗原決定部位。
CON-S其餘部分之糖化摘述如下：
V3與V4間：WNK：高甘露糖(只於ESI-MS觀察得)，LREHFNK(T)：每種物質。
V4：V4起點有一個含三個位置之胜肽：需要其它方法來識別此等位置，KNNNNTNDTITLPCR：使用一個和兩個位置，當使用兩個位置時：大部分為高甘露糖，當使用一個位置時：混合物，部分帶有唾液酸。
V4與V5間：SNITGLLLTR：每種物質，但含大量高甘露糖。
V5：DGGNNNETEIFRPGGGDMR：使用一個位置：34種不同結構，包括「HIV之新穎者」和帶有唾液酸者。
V5之後：兩個可能位置：一個位置(EINNYTS...經識別為未經糖化)。於V3後之CON-S糖化，其八個特徵化位置中，三個位置至少於某些時間未經糖化。可變環間之區域有較高比例之含高甘露糖之碳水化合物，提示於高爾基氏體處理期間係被埋入蛋白質內部。於V4及V5外部的唾液酸可輔助減慢代謝清除率。此點為有意義，原因在於驗證當存在有一致序列N-X-T/S(此處X非為脯胺酸)時無法假設此等蛋白質上存在有糖化。此外，本資料顯示蛋白質之某些區，特別為可變環間區，含有高度含高甘露糖碳水化合物。如此指示此等位置並未埋設於蛋白質內，原因在於蛋白質係經過後轉譯修飾。
JRFL其餘部分之糖化摘述如下：
V3與V4間：AKWNDTLK：每種物質。LREHFNK(T)：每種物質(至少33結構)。
V4：胜肽為需要其它方法來將此特徵化。
V4與V5間：CSSNITGLLLTR：每種物質。
V5：DGGINENGTEIFRPGGGDMR：47種不同結構，包括「HIV之新穎者」和帶有唾液酸者。
V5之後：LICTTAVPWNASWSNKSLDR：使用一個位置；存在的每種物質。IWNNMTWMEWER：每種物質。
EIDNYTSEIYTLIEESQNQQEK：驗證未經糖化。八個經特徵化之位置中，有六個經糖化。於每個位置，發現糖化的高度變異性。如此指示蛋白質有高度結構異質性，原因在於蛋白質係經轉譯後處理。有關此資料之明顯觀察為未觀察得糖化之特定趨勢。取而代之，實質上每一型糖化係存在於實質上每個位置。如此強力提示於蛋白質之三級結構存在有高度變異性。否則，糖化遵循更「典型」樣式(先前已經說明)，此處阻隔位置典型含有高甘露糖糖類，而暴露位置含有完全經處理之複合碳水化合物。因此等糖化位置並未顯示偏好任何給定類型之碳水化合物，資料之最可能說明為存在有大量結構非同質性，原因在於蛋白質係通過高爾基氏體。於此蛋白質之此一部分之八個特徵化位置中，兩個位置不含糖化。
本資料直接驗證若干情況下，對兩種蛋白質，皆未利用可能之糖化位置。實際上，CON-S上的27個特徵化位置中的9個位置至少有某些時間係未經糖化。對JRFL，18個位置經過特徵化，18個位置中，4個位置至少有某些時間未經糖化。
此外，糖化趨勢顯示蛋白質環繞糖化位置的局部二級結構之差異。最值得注意，JRFL幾乎對全部位置皆未顯示一致的糖化趨勢。反而，於每個超過V3之特徵化位置含有 最少處理之高甘露糖型碳水化合物連同經過徹底處理之複合碳水化合物。相反地，CON-S顯示較為「傳統」糖化，類似V2與V3間、V3與V4間以及V4與V5間之區域，內部區域顯示至少處理聚糖之較高優勢。此等結構指示CON-S上之糖化位置於轉譯後修改經過阻隔。相反地，JRFL不具有相同保留結構部分阻隔此等糖化位置，如其糖之變異性高所指示。含有較為有展望之二級結構。
糖化類型與糖化位置的中間環境間之交互關係先前已經於參考文獻中建立，但此乃首次資訊流發生反向的時間。換言之，糖化資料係用來推斷有關糖化位置周圍二級結構之相關資訊。由此項處理所得資訊提供有關蛋白質之結構異質性之活體內資訊，以及當蛋白質行進通過高爾基氏體時，緊鄰於糖化位置周圍區的接近能力程度。由於有較為保守之結構部分，故可能CON-S為比JRFL更佳的免疫原。或許需要此等保留結構特徵來提供可有效提引出中和抗體之構型抗原決定部位。
實例IV
實驗細節
材料與試劑：除非另行註明，否則全部試劑皆係以高純度得自西革瑪亞利敘公司(Sigma-Aldrich)。碳酸氫銨(NH4 HCO3 )、崔瑪(trizma)鹽酸鹽、崔瑪鹼、伸乙基二胺四乙酸(EDTA)、磷酸鹽緩衝食鹽水溶液(PBS)、乙酸、HPLC及乙腈(CH3 CN)、及甲醇(CH3 OH)、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)尿素、α-氰基-4-羥基桂皮酸(CHCA)、碘乙醯胺(IAA)、西法羅斯(Sepharose®)CL-4B、丁醇、乙醇、二硫赤蘚醇(DTT)、三氟乙酸(TFA)、及甲酸係購自西革瑪公司(密蘇里州聖路易)。水係使用密里普公司(Millipore)直接-Q3水純化系統 (Direct-Q3 Water Purification System)(麻省貝瑞麗卡)純化。定序級胰蛋白酶(Tp)及得自腦膜伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningosepticum)之N-糖苷酶F(PNGase F)分別係得自普密嘉公司(Promega)(威斯康辛州麥迪遜)及卡爾生化公司(Calbiochem)(加州聖地牙哥)。
被膜糖蛋白(JR-FL及CON-S)之表現及純化：全部Env蛋白質皆係表現且純化自北卡羅萊那州杜漢，杜克大學人類疫苗研究院。Env蛋白質係使用參考文獻所述方法組成、表現及純化(Gao等人，J.Virol.79：1154-1163(2005)，Liao等人，病毒學353：268-282(2006))。
胰蛋白酶消化：含有每份300微克HIV-1Env蛋白質、JR-FL gp140△CF及CON-S gp140△CFI之樣本經6M尿素於含3mM EDTA之100mM tris緩衝液(pH 7.5)變性。蛋白質經還原，於室溫使用15mM DTT烷化1小時，及於室溫於暗處使用40mM IAA又烷化1小時。樣本調整至終濃度50mM DTT來中和過量IAA。然後蛋白質於37℃使用胰蛋白酶以蛋白質：酶比30：1(w/w)消化隔夜，接著為於相同條件下進行第二次胰蛋白酶消化。所得HIV Env蛋白質消化產物混合物接受離線反相高效液相層析術(RP-HPLC)分選進行MALDI分析或RP-HPLC ESI-FT MS分析。
離線RP-HPLC分選：將20微升整份HIV Env蛋白質消化產物混合物注入.C18管柱上(150毫米x 4.6毫米，5微米尺寸管柱粒子，艾爾科技公司(Alltech)，伊利諾州迪費爾)。用於分選之動相為99.9%去離子水+0.1%甲酸B：99.9% CH3 CN+0.1%甲酸。如下CH3 CN/H2 O多階梯度用來以1毫升/分鐘流速由管柱洗提糖蛋白：5%動相B 3分鐘，接著以15分鐘時間線性提高至40% B，於40% B維持15分鐘，然後 以20分鐘時間線性提高至85% B。然後管柱於85% B維持7分鐘隨後再度平衡。每分鐘收集洗提分歷60分鐘。HPLC洗提分於離心蒸發器(實驗室康那可公司(Labconco Corporation)，密蘇里州堪薩斯城)乾燥且以10微升水重新調製。共60個洗提分藉MALDI-MS進行分析。
N-去糖化：富含HIV糖肽之洗提分利用製造商所推薦之方案，使用N-糖苷酶F(卡爾生化公司)去糖化。簡言之，於小瓶內藉添加100微升去離子水至50單位凍乾酶來製備含500單位/毫升N-糖苷酶F之溶液。藉添加25微升20mM NH4 HCO3( pH=8)及4微升N-糖苷酶F溶液，釋放各個富含糖肽洗提分中之聚糖。反應於37℃培養隔夜，次日藉將樣本加熱至100℃來停止反應。隨後所得溶液藉MALDI-MS分析。
質譜術及液相層析術：於以正離子模式操作之應用生物系統公司(Applied Biosystems)4700普提米克分析儀(Proteomics Analyzer)質譜儀(加州福斯特城)上進行MALDI MS及MS/MS實驗。經由將等量被分析物及基質溶液於微離心管內混合，然後即刻沉積於MALDI板上，接著風乾，製備樣本。基質溶液之製法係經由混合等量CHCA於50% CH3 CN於水之飽和溶液與0.1% TFA及DHB於50% CH3 CN於水之飽和溶液製備基質溶液。樣本即刻以於200Hz操作之ND-YAG雷射(355奈米)照射。此儀器裝配有自動化多取樣能力來進行快速樣本分析。於反射模式及線性離子模式獲得質譜，經由將3200次發射雷射平均成一單一頻譜來產生質譜。各頻譜係得自於MALDI點中40個不同位置之80次雷射發射。雷射強度調整為最佳化，來對各樣本獲得適當信號對雜訊比(S/N)及解析度。使用1千伏特之碰撞能以 氮氣作為碰撞氣體，獲得MALDI MS/MS資料。
使用混成線性離子阱(LIT)傅立葉轉換離子迴旋加速器共振質譜儀(LTQ-FT，熱電公司(ThermoElectron)，加州聖荷西市)直接耦接裝配有FAMOS孔板自動採樣器之迪歐尼歐提麥特(Dionex UltiMate)毛細LC系統(加州桑尼維爾)進行LC/ESI-FTICR MS及MS/MS實驗。用於實驗之動相包含緩衝液A：99.9%去離子水+0.1%甲酸；緩衝液B：99.9% CH3 CN+0.1%甲酸，以5微升/分鐘速度泵送。樣本注入C18派麥普(PepMap)300管柱(300微米內徑x 15厘米，300埃，層析填充公司(LC Packings)，加州桑尼維爾)。於載入5微升樣本後，使用前述相同梯度，以5微升/分鐘流速洗提糖肽。對每個樣本進行短暫洗滌及空白組來確保無樣本殘留。混成LIT-FT-MS係以資料相依性掃描模式操作，掃描事件細節如下：於質量範圍m/z 800-2000內部完整FT-MS掃描，接著為三次資料相依性MS/MS掃描得自全MS掃描之三種最強力糖肽分子離子，循序進行，動態選用於隨後於LTQ線性離子阱中，使用35%規度化碰撞能及3分鐘動態排除窗進行碰撞誘導解離(CID)。若資料相依性MS/MS掃描檢測出與單醣單位(己糖或HexNAc)相對應之中性喪失，則對親代離子觸發MS3 掃描事件。離子來源之毛細溫度設定於200℃，ESI電壓設定於4.0千伏特，以陽離子模式掃描。
糖肽識別：由MALDI MS分析及ESI-MS分析產生之銜接質譜資料係使用GlycoPep DB分析(Go等人，Anal.Chem.79：1708-1713(2007))及使用GlycoPep ID分析(Irungu等人，Anal.Chem.79：3065-3074(2007))來顯示HIV Env蛋白質胰蛋白酶糖肽組成。先前已經說明糖肽組成之分析細 節。簡言之，胜肽部分係使用碰撞誘導解離(CID)資料測定。用於MALDI MS分析，得自富含糖肽部分之CID資料經人工檢測來識別十字環裂解之特徵性簽章部分離子亦即0,2 X離子。此離子用來證實糖肽之胜肽部分。一旦已經識別胜肽，由確定胜肽序列之部分所得MS資料之尖峰表單於GlycoPep DB資料庫中對全部碳水化合物登錄項目作搜尋。查詢結果產生全部可信糖肽組成，隨後經由評估MS資料及MS/MS資料來精製與證實。ESI FTICR-MS資料之組成分派係使用GlycoPep ID測定糖肽之胜肽部分，以及使用GlycoPep DB測定糖肽組成來達成。使用GlycoPep ID協助識別胜肽部分，其中胜肽預測表係由感興趣之糖蛋白理論消化產物產生，有其相對應之序列及m/z值、以及十字環裂解預測m/z表單亦即0,2 X離子或0 Y1 離子。
結果
CON-S及JR-FL被膜糖蛋白：合成Env免疫原之修飾形式，亦即CON-S，表示基團M及野生型殼B Env蛋白質，JR-FL用於本研究，係由於免疫原性顯著改良，蛋白質具有表現可溶性寡聚物蛋白質能力(Chakrabarti等人，J.Virol.76：5357-5368(2002)，Gao等人，J.Virol.79：1154-1163(2005)，Liao等人，病毒學353：268-282(2006))。基於參考HIV種系gp160之全長序列，HXB2亦即CON-S修改形式之基因構築體(gp140△CFI)係以三個內部刪失組成，包括gp120/gp41蛋白質分解裂解位置(C，殘基510-511)、gp41之融合領域(F，殘基512-527)，及於免疫主控區(I)中兩個七價重複本間之區域(殘基546-579，628-655)，及縮短的可變環，於該處JR-FL(gp140△CF)之修改形式缺gp120/gp41蛋白質分解裂解位置(C)及gp41之融合領域(F) (Chakrabarti等人，J.Virol.76：5357-5368(2002))。兩個Env免疫原皆經植物凝集素純化，於rVV傳播(Gao等人，J.Virol.79：1154-1163(2005)，Liao等人，病毒學353：268-282(2006))。CON-S gp140△CFI及JR-FL gp140△CF之全序列列比(alignment)顯示於第15圖，可能之糖化位置以紅色表示(參考「虛線」位置)。CON-S gp140△CFI及JR-FL gp140△CF之蛋白質序列為81%相同。由第15圖可知，Env蛋白質與九個可能的糖化位置不同。於JR-FL gp140△CF錯失可能的糖化位置，但係存在於CON-S gp140△CFI，反之亦然，顯示於框內。使用N-糖基位置之糖化分析(http：//www.hiv.lanl.gov/)分別顯示CON-S gp140△CFI及JR-FL gp140△CF之31個及27個可能的糖化位置。全文中CON-S gp140△CFI及JR-FL gp140△CF分別係稱作為CON-S及JR-FL。
藉質譜術之糖化拼圖：使用基於糖肽之MS分析作糖化之全面性拼圖及綜合識別或許為糖蛋白學中最具有挑戰性的工作之一。困難主要係來自於糖肽之游離效率低、各個糖化位置之徹底聚糖異質性、比較胜肽，糖肽濃度相對較低、及資料分析的複雜度。任何成功的MS分析中心在於樣本製備輔助之設計及選擇。晚近對數種用於基於糖肽之MS分析之層析方法及豐富方法進行徹底評估。該等方法經過最佳化可顯著改良糖肽覆蓋率(Zhang等人，遞交中(2007年))。如此，最佳化樣本製備方法經修改為良好適合用於徹底糖化重組HIV Env蛋白質、CON-S及JR-FL之分析。第16圖提供本研究所使用之實驗樣板之示意代表圖。該辦法係將MALDI-MS分析與LC/ESI FTICR-MS分析整合來獲得糖化之通用輪廓資料，區別兩種Env免疫原之糖化 輪廓資料間之差異。
CON-S及JR-FL皆具有約600胺基酸殘基。還原後之Env蛋白質有15個半胱胺酸殘基，經由半胱胺酸殘基與可產生IAA之胺基甲醯基甲基化Env蛋白質反應，於蛋白質層面被烷化。胺基甲醯基甲基化Env蛋白質接受溶液內胰蛋白酶消化之全部典型操作，當容許至多一個內部胰蛋白酶裂解位置(單一錯失裂解)時，產生約100個可能的胰蛋白酶片段。於使用胰蛋白酶消化後，兩個分開糖蛋白消化產物整份接受HPLC分選來進行MALDI-MS分析或LC/ESI FTICR-MS分析(第16圖)。對兩種MS實驗，糖肽係於80分鐘之梯度以內分離。對接受MALDI分析之各樣本所收集之60個HPLC洗提分中，有36個洗提分及38個洗提分對JR-FL含有糖肽及對CON-S含有糖肽。此等洗提分接受MS/MS分析來演繹出各個洗提分中所存在的糖肽組成。部分糖肽洗提分進一步使用PNGase F處理來驗證胜肽的分派，判定占用哪一個可能的糖化位置(第16圖)。以混成LTQ線性離子阱使用資料相依性獲得模式，進行使用LC/ESI-FTICR-MS及MS/MS分析之糖肽分析。糖肽係經由定位尖峰簇來識別，尖峰簇之特徵性質量差異係與ESI FTICR-MS資料中之單醣單位(己糖，HexNAc等)之質量相對應。由分析識別全部31個及27個用於CON-S及JR-FL之可能糖化位置(表5)。
CON-S及JR-FL之糖化輪廓資料：對CON-S及JR-FL識別共19個及16個胰蛋白酶糖肽，有單一糖化位置及多個糖化位置(參考第15圖)。對CON-S及JR-FL比較糖化輪廓資料，包括聚糖部分及位置占用狀況。糖肽組成之部分清單顯示於表6，完整表單顯示於表7及表8。第19圖所 示糖肽洗提分之代表性MALDI MS及LC/ESI-FTICR MS及相對應之銜接MS光譜，顯示對JR-FL(第19A圖)及CON-S(第19B圖)於V2區及V3區之胰蛋白酶糖肽。於由MS/MS資料(第19圖之插圖)識別糖肽之胜肽部分後，推定糖肽組成，使用得自各光譜之質量表單驗證聚糖部分。對每個所使用之MS技術每個免疫原進行組成分析產生約500個推定之識別。經由人工評估MS資料，進一步使用全部可得之MS/MS資料驗證分派，來精製查詢結果。總而言之，對每個免疫原識別約400種獨特糖肽組成，包含高甘露糖聚糖、混成聚糖及複合型N-鍵聯聚糖。此種糖化異質性之高度覆蓋率為前所未見。
為了區別合成型Env免疫原與野生型Env免疫原間之糖化部分與協助分析，糖型被廣義分類為兩組，亦即高甘露糖聚糖及加工聚糖。高甘露糖聚糖包含含甘露糖結構式有5-9個甘露糖糖類；而加工聚糖包括混成型結構式及複合型結構式。根據如下標準計算加工聚糖：己糖(Hex)≧3及N-乙醯基葡萄糖胺(HexNAc)≧4或Hex≧4及HexNAc≧3。第20A圖顯示各個位置普及糖化資料摘要。特寫指出CON-S及JR-FL之差異在於位置占用情況以及糖化樣式，特別為免疫主控V3環之糖化樣式。為了說明糖化輪廓資料之此二差異如何影響Env蛋白質之免疫原性，對Env蛋白質之糖化進行詳細比較，其對疫苗設計之意義討論如下。
A.於CON-S及JR-FL上之開放糖化
由CON-S及JR-FL之胰蛋白酶消化產物所分離之經過識別之糖肽分別占31個及27個可能的糖化位置。糖肽質量拼圖實驗允許識別糖肽，但無法直接預測位置占用情況。若干經識別之糖肽含有多於一個糖化位置(參考表5)。 為了識別此等糖肽上哪些位置被占用，糖肽藉酵素脫去糖化來測定位置占用情況(Morelle等人，蛋白學6：3993-4015(2006)，Morelle及Michalski,Nat.Protoc.2：1585-1602(2007)，Tarentino等人，生物化學24：4665-4671(1985)，Tarentino及Plummer，酶學方法.230：44-57(1994)。經過酵素作用釋放出聚糖，於NXT/S將天冬醯胺轉換成為天冬酸，結果導致每個位置1Da之質量遷移。第21A圖含有對CON-S之去糖化糖肽部分之代表性MS資料。檢測得四個去糖化糖肽，各自有1Da質量增量，指示各個糖肽含有一個被利用的糖化位置。進行此等胜肽之銜接MS分析，來驗證胜肽序列，以及測定有多個糖化位置之胜肽的利用情況。於V4環之胰蛋白酶胜肽NNN413 NTN416 DTITLPCR之MS/MS資料(第21B圖)顯示兩個可能的糖化位置中哪一個被占用。N413 NT位置被占用，如由此天冬醯胺已經被轉成天冬酸可證。第二個位置亦即N416 DT必須未經利用，原因在於MS/MS資料明白指出於PNGase F處理之後此一殘基仍然為天冬醯胺。分析含有此一胜肽之另一個糖肽洗提分，顯示N413 NT及N416 DT皆被利用。如此，N416 DT被可變地占用，原因在於藉MALDI MS由經PNGase F處理之糖肽洗提分識別糖化天冬醯胺及未經糖化天冬醯胺(N416 )。總而言之，結果顯示對CON-S所檢測的31個可能的糖化位置中(表5)，於C1-V1區之N141、於V1/V2區之N191、於穿膜區之N631及N643隨時皆未被利用；九個位置包括於C1-V1區之N135、於V1/V2區之N159及N201、於保留區2(C2)之N245及N293、於V3區之N305、於保留區3(C3)之N344、於V4環之N416、及於V5環之N466等位置可變地被利用(第20B圖，頂)。對JR-FL，於V1區之N138、V1/V2區之N192、 及於穿膜區之N617(或622)及N643兩個位置未被利用；而於N159之位置可變地被利用(第20B圖，底)。須注意對V4區之長胜肽部分，五個可能的糖化位置中有兩個位置被占用。藉MS/MS實驗無法測定哪些位置被占用，原因在於此種高質量物種特有之游離效率低之故。表5顯示經識別之胰蛋白酶糖肽表單，對CON-S及JR-FL有開放糖化位置及可變糖化位置。
兩種免疫原之糖化占用程度觀察得之變化係歸因於數種常見影響蛋白質糖化效率之因素。已知蛋白質糖化程度係受到下列因素的控管：於一致糖化位置(consensus glycosylation site)NXT/S中之X之一次結構；旁出於NXT/S之胺基酸殘基；NXT/S周圍局部環境之結構構型；及於聚糖生物合成/加工處理期間關鍵糖化酶陣列之利用率(Jones等人，Biochem.Biophys.Acta 1726：121-137(2005)，Kornfeld及Kornfeld,Annu.Rev.Biochem.54：631-664(1985)，Petrescu等人，糖生物學14：103-114(2004))。對表5中各個糖肽，密切檢驗NXT/S周圍的胺基酸殘基，指示位置占用的異質性可歸因於NXT/S周圍局部環境之構型以及X之胺基酸。例如，於CON-S V2區對糖肽LDVVPIDDNNN190 N191 SSNYR之第二天冬醯胺殘基不存在有糖化最可能原因係由於立體阻隔。同樣趨勢也於JR-FL對 類似之糖肽觀察得。於N-鍵聯聚糖轉移至N190(CON-S)或N191(JR-FL)後，由於立體封阻的緣故，不利於聚糖加成之N191或N192。對CON-S於N135、N141、N159、N245、N293、N305、N416、N466、及N631以及對JR-FL於N138及N159之無效糖化也可能係由於緊鄰附近被占用的糖化位置的立體封阻緣故。糖化效率也係藉於NXT/S一致之位置X存在有大型疏水殘基(W、L、F、及Y)及存在有帶負電荷之殘基(E及D)調節(Mellquist等人，生物化學37：6833-6837(1998)，Shakin-Eshleman等人，J.Biol.Chem.271：6363-6366(1996))。如此，對CON-S及JR-FL於位在穿膜區的N643缺糖化，最可能係受到於X位置存在有酪胺酸(Y)的影響。對CON-S，於V3區前方的N293及N5區中的N466之可變占用位置之無效糖化，最可能係受到X位置存在有麩胺酸(E)的影響。
除了一次序列影響糖化位置占用之外，也相當可能用來表現蛋白質之細胞系促成於CON-S及JR-FL之開放糖化位置數目。先前分析顯示Env上的全部可能的糖化位置皆被占用，先前分析係於CHO細胞中表現的蛋白質進行(Leonard等人，J.Biol.Chem.265：10373-10382(1990)，Zhu等人，生物化學39：11194-11204(2000))。相反地，JR-FL及CON-S皆係表現於293-T細胞。曾經描述其它糖蛋白於蛋白質得自不同哺乳動物種屬時，含有大為不同的糖化樣式(Dalpathado等人，生物化學45：8665-8673(2006)，Liedtke等人，Glycoconj.14：785-793(1997))。若所使用之細胞系之差異係歸因於Env之糖化位置占用情況的差異，則暗示對免疫原改變細胞系極為可能影響其糖化輪廓資料，結果影響其免疫原性。
開放糖化及可變糖化的存在直接影響Env蛋白之免疫原性。確實，病毒對抗體中和作用的敏感性係與未被利用的位置可有效暴露或無效暴露關鍵蛋白質抗原決定部位有關。當於V3區中接近受體結合區之糖化位置經去糖化時，觀察得抗體中和的增加(Koch等人，病毒學313：387-400(2003)，Kolchinsky等人，J.Virol.75：3435-3443(2001))。結果顯示比較較非有效之免疫原JR-FL，對CON-S於V1/V2、C2、V3區周圍有較多開放位置。
B.糖化與蛋白質結構
除了判定糖化位置是否被占用之外，糖化分析也提供對蛋白質之三度空間(3D)構型及於活體內之結構異質性提供若干深度瞭解。若旁出碳水化合物依據該位置是否可由關鍵糖化酶接近之性質而可經重度處理或否，則糖化處理之可變提供於糖化位置之蛋白質局部結構的探針。高甘露糖聚糖指出最少處理；較為經保護之局部3D結構而完全經處理之聚糖，指出糖化位置易接近高爾基氏體中之糖基轉移酶酵素。實際上，先前顯示高甘露糖聚糖可輔助穩定蛋白質的局部3D構型(Jitsuhara等人，J.Biochem.(東京)132：803-811(2002)，Nishimura等人，J.Biochem.(東京)123：516-520(1998)，Petrescu等人，糖生物學14：103-114(2004))。當然Env免疫原必須可調適穩定3D構型，故可提供保留性結構抗原決定部位，該等抗原決定部位提引出強力免疫反應。為了探測JR-FL(不良免疫原)與CON-S(較為有效免疫原)間之蛋白質結構差異，強調兩個關鍵區/節段，此處兩種蛋白質之糖化不同。
觀察得糖化差異的第一區為V1前方該區。糖化位置係位在於第一保留(C1)區。CON-S及JR-FL之糖化位置前方 及後方的60殘基節段之節段列比為95%相同性(第22A圖)。因兩個位置有相同序列，故可合理預期此等位置同等暴露且同等可接近糖化酶。但糖化資料明白顯示CON-S及JR-FL上的聚糖部分不同(第22B圖)。CON-S聚糖係由有5-9甘露糖(Man)糖類之高甘露糖結構式及經過處理之聚糖所組成，經處理之聚糖大部分為複合型結構式，由某些程度的唾液酸化及含最小量海藻糖化。相反地，JR-FL聚糖係由一個單一高甘露糖結構(Man5)及大量經處理之糖型所組成，大部分糖型被海藻糖化超過CON-S。須注意兩個免疫原皆為rVV經表現之蛋白質，於MS分析之前已經進行相同之樣本處理，故表現條件及分析條件無法用來解釋所檢測得的糖化差異，一次序列也無法解釋。結果提示糖化差異係由糖化位置周圍的局部環境之結構構型指示。某些構型用於處理較為有利，此種情況下，JR-FL的高度處理指示比較CON-S，JR-FL必須於此位置有不同的3D結構。由存在有較多高甘露糖結構證明對CON-S之相同糖化位置之接近程度相對較低，暗示此一位置被部分埋入於整疊的蛋白質中。如此，可能CON-S之此一特定區有較低蛋白質彈性，允許此區有較為安定之3D構型。此項假說由先例獲得證實，特定位置之糖化程度反映出該糖化位置周圍之蛋白質之特定局部構型(Rudd及Dwek,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.32：1-100(1997)，Scanlan等人，自然446：1038-1045(2007))。
CON-S及JR-FL之糖化不同的下一區為V3環周圍區(第20圖)。V3環跨據由雙硫鍵所連接的35殘基節段，此區已知為HIV趨向及受體結合之決定部位。此區於環前及環後經過糖化。如前一節討論，資料顯示對CON-S，於C2 區之N245、N266、N293及N299及於V3環之N305之位置可變地未被占據。當此等位置被糖化時，此等位置通常係由高甘露糖混成型聚糖及較小的複合型結構所占據(第23圖)。相反地，於JR-FL之相對應位置完全以較大的經處理的糖型所糖化。對CON-S gp140△CFI於此等位置單純存在有大量高甘露糖聚糖，提示蛋白質行進至高爾基氏體前，此等位置極少經加工處理(亦即葡萄糖修整)。此等位置完全或部分埋入摺疊後之蛋白質骨架內部，因而較少接近高爾基氏體中處理用之糖基轉移酶。於此等區有較多高甘露糖結構，也降低蛋白質彈性(Rudd及Dwek,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.32：1-100(1997)，Scanlan等人，自然446：1038-1045(2007))。雖然CON-S之V3區較不可接近糖基轉移酶酵素，但此種無法接近程度最終變成為何比較JR-FL，CON-S V3區提引出較多中和抗體的原因。因JR-FL較為可接近糖基轉移酶，故其糖化實質上比CON-S上的糖化更大。由於JR-FL的重度糖化(就占用的位置數目而言，及存在的聚糖大小而言)結果，此局部區的蛋白質序列被聚糖較為有效覆蓋，遮罩關鍵性抗原決定部位免於接近抗體。相反地，於CON-S V3環之蛋白質序列通常較少被屏蔽，關鍵抗原決定部位較為可接近抗體。
疫苗設計之暗示：瞭解糖化如何影響Env的免疫原性之第一步驟係界定其通用糖化輪廓資料。區別糖化差異提供洞察聚糖輪廓資料如何影響提引出強力免疫反應所需的蛋白質官能基構型。雖然於單離株內部及跨進化枝之間的總糖化程度經保留來維持聚糖屏蔽，但糖化持續進行，有效遮罩下方的抗原決定部位，或許去除由宿主細胞糖化機器所產生之非自我糖化樣式來迴避免疫的辨識(Pashov等 人，Curr.Pharm.Des.13：185-201(2007)，Scanlan等人，自然446：1038-1045(2007))。因此，設計作為疫苗成分之有效Env基於蛋白質之免疫原，須要求詳細分析二免疫原間之糖化輪廓資料間之差異來改良疫苗的開發。
致力於達成此目的，合成Env蛋白質CON-S之糖化表示M基，有衍生自進化枝C及野生型進化枝B JR-FL之縮短的可變環已經經過特徵化，進行其糖化輪廓資料之比較研究。此二Env蛋白質之胺基酸序列內文中，差異為9個可能的糖化位置。此種差異影響糖化效率，通常影響蛋白質如何摺疊。雖然Env間之胺基酸序列差異提供瞭解蛋白質結構及糖化之途徑，但界定於各個位置之特定糖化腳印提供額外洞察為何一種疫苗候選者比另一種疫苗候選者更有效。分析顯示就CON-S與JR-FL間之糖化程度及糖化樣式類型而言，糖化之實質差異。此項差異與蛋白質結構差異交互相關，最終與免疫原性交互相關。結果指出較高免疫原性之Env蛋白質於V1、V2、C2、V3區周圍有較多未被利用的位置及高甘露糖結構，以及於C2區及免疫主控V3區及V4區有小型經處理的糖型。
有效Env免疫原必須有低度結構異質性，來允許下方結構抗原決定部位的中和；CON-S糖化提示其結構式比JR-FL有更高保留性。特別，CON-S於C2領域及V4區有較高度高甘露糖聚糖，連同於V3環有最少經處理之糖型及高甘露糖結構。此項結果反映出C2、V3及V4區周圍有較為阻隔的糖化位置。因高甘露糖糖型已知降低蛋白質之彈性，此等聚糖可能促進蛋白質之穩定性，而保有此等區之特定蛋白質組態。此外，此等區周圍存在有較多未經利用的可能糖化位置，指示此區之關鍵蛋白質抗原決定部位較 為暴露，可協助提引出抗體反應。由至目前為止所得資料，顯然可增加CON-S免疫原性提升的糖化特徵包括開放糖化位置數目，於序列早期含高甘露糖聚糖區，係與更良好保留之蛋白質結構相關。關鍵性所見係與晚近之CON-S gp140△CFI免疫學資料符合一致，該資料於小型動物研究模型中當CON-S gp140△CFI用於DNA疫苗時，提引出高力價抗體(Liao等人，病毒學353：268-282(2006))。糖化與免疫原性間之交互關係的進一步研究及精製將提供允許識別Env蛋白質之某些糖化腳印之機會，將促進誘導對寬廣範圍之HIV-1單離株之抗體。此項研究為改良HIV疫苗設計/開發進展的一個步驟。其它合成免疫原及野生型免疫原經過特徵化，小型動物研究模型中糖化樣式係與免疫活性有交互關係。
結果，以糖肽為基礎之質量拼圖辦法用來以糖化位置專一性方式決定兩個Env蛋白質疫苗候選者之糖化特徵。結果顯示兩種Env蛋白質有不同的糖化位置占用及各個糖化位置普及的不同特徵性聚糖部分集合。CON-S及JR-FL為Env中含有未被占用的可能糖化位置之頭兩種蛋白質，CON-S有特高度未被占用位置：19/31，至少某些時間未被占用。開放位置部分存在於此等蛋白質，原因在於293-T細胞係用作為CON-S及JR-FL之表現系統。此外，比較JRFL，CON-S上高度未被占用的位置部分原因係由於具有獨特的一次序列。
闡明糖化差異，提供重要的生物學洞察為何CON-S比JR-FL有較高免疫原性。CON-S的特徵性結構包括較多未被占用的位置及以較小型糖型及/或高甘露糖結構占用的位置。此種糖化樣式將讓抗原性抗原決定部位更加可接近中 和抗體。糖化位置專一性分析連同免疫學資料，構成提供指示抗體反應資訊之研究途徑。
前文引述之全部參考文獻及資訊來源全文皆以引用方式併入此處。
第1圖，其係被膜蛋白質之蛋白質序列實例。糖化位置以紅色強調。該實例為JRFL 140CF序列：633胺基酸，其具有27個可能的糖化位置(N-X-T或N-X-S)，50%HIV被膜蛋白質質量為碳水化合物。
第2圖，使用「標準」消化條件之MALDI資料。該實例為JRFL gp140CF：選分29，其係藉由MALDI和ESI分析120個選分中之發明人的「最佳」資料3人×1週，其中可能問題在於未使用足量材料(150微克)，或蛋白質尚未完全消化。
第3圖，使用標準消化條件之奈米噴灑FT-MS資料。該實例為LTQ-FTICR(奈米噴灑)ESI-MS，圖中之糖胜肽質量遠大於此處檢測之任何物質。
第4圖，JRFL：選分29之標準消化條件與消化條件之比較。
第5圖，CON-S糖肽片段之一之MALDI-MS資料。插圖為由GlycoPep DB輸出之螢幕攝影。該實例為ConS gp140CFI：選分21之良好資料。
第6圖，於第5圖觀察得之糖肽離子之MALDI MS/MS資料。資料驗證糖肽之胜肽部分。該實例為MADLDI TOF/TOF CID資料：ConS gp140CFI：選分21。
第7圖，MALDI MS資料之額外實例。該實例為進行性分析：JRFL gp140CF選分5。
第8圖，於傅立葉轉換質譜儀上所收集之HPLC-MS資料。
第9圖，其係CON-S與JRFL Pre V1之比較。CON-S及JR-FL上於V1環前方之保留位置...LENVT...之糖化差異係歸因於活體內蛋白質之三度空間結構差異。
第10圖，V1環及V2環上之CON-S糖化摘要。V1以高甘露糖之糖類極為重度糖化。V2有兩個未被利用之可能的糖化位置。
第11圖，V1環及V2環上JRFL之糖化摘要。類似CON-S，V1係以高甘露糖糖類極為重度糖化。比較CON-S，V2使用較多糖化位置。
第12圖，V2與V3間之CON-S糖化。當通過高爾基氏體時，此序列部分通常並未暴露於糖基轉移酶。高甘露糖碳水化合物可作為「內部監護者(internal chaperones)」來輔助摺疊蛋白質。雖然碳水化合物可穩定蛋白質，但蛋白質也可代理穩定構型，來保護碳水化合物。
第13圖，接近V3環之CON-S糖化。
第14圖，接近V3環之JRFL糖化。JRFL於環起點較為重度糖化，於環終點較為結構異質性。
第15圖，CON-S gp 140△CFI與JR-FL gp140△CF序列列比(alignment)。虛線指示於胺基酸序列之間隙，顯示可變區(V1-V5)的所在位置。可能糖化位置以紅色表示，可能糖化位置中差異處則框出。經識別的胰蛋白酶片段下方劃線。
第16圖，糖化拼圖及輪廓資料之實驗手段之示意代表圖。
第17A及17B圖，由被膜蛋白質之蛋白質分解消化產物所產生之糖肽部分之代表性(第17A圖)ESI-FTICR MS及(第17B圖)MALDI MS光譜。插圖：經識別之胰蛋白酶糖肽之MS/MS光譜。由特徵性十字環裂解0,2 X離子(於MALDI MS)及0 Y1 離子(於ESI-FTICR MS)測定胜肽部分。
第18A及18B圖，第18A圖，存在於所識別之糖化位置上之聚糖組成物摘要(百分比)。聚糖組成物被廣義分成兩類(參考內文)。處理後之聚糖包括混成型結構及複合型結構。第18B圖，經利用及未經利用之CON-S gp 140△CFI(頂，藍色)及JR-FL gp140△CF(底，灰色)之可變糖化位置。注意第18A圖及第18B圖中條狀頂部或底部之號碼表示糖化位置。第18B圖之條狀底的多個號碼表示任一個糖化位置經利用。
第19A及19B圖，第19A圖，CON-S gp 140△CFI之去糖化糖蛋白部分之代表性MALDI MS光譜。識別載有可能之糖化位置之4個胰蛋白酶胜肽(參考圖說)。第19B圖，(第19A圖中)載有兩個可能之糖化位置之經識別之胜肽之一之去糖化胜肽之MALDI MS/MS光譜。如圖所示，只利用一個位置。
第20A及第20B圖，第20A圖，其係於被膜蛋白質之第一保留區所見60-殘基節段之序列列比。胺基酸殘基係根據其性質著色。序列為95%相同。胺基酸殘基之差異經框出。糖化位置以綠色強調。第20B圖，其係經過識別之糖型之圖解代表圖。注意所繪製的結構為生物相關，且存在有同基因型。
第21圖，JR-FL gp140△CF及CON-S gp 140△CFI於V3區起點之胰蛋白酶糖肽之糖化作用，顯示利用之位置及經過識別之聚糖組成物。
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<223> 人工序列之描述：合成胜肽
<400> 87

Claims (5)

  1. 一種組成物，包含含衍生而具有免疫原性之HIV Env之V1區或V2區之碳水化合物。
  2. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物進一步包含能誘導產生抗V3抗體之V3胜肽、全共同序列(whole consensus)或野生型Env gp140，或得自HIV Env之非-V1或V2環之經衍生之碳水化合物，可選擇地其中該胜肽包含62.19進化枝B V3。
  3. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該碳水化合物係以鎖孔蜞血藍質(keyhole limpet hemocyanin)、CRM197、破傷風類毒素、或HIV gag p24助手區衍生，可選擇地其中該助手區為GTH1序列(YKRWIILGLNKIVRMYS)。
  4. 如申請專利範圍第1項之組成物，其中該組成物包含HIV Env，其中於其表面上之全部碳水化合物經衍生因而具有免疫原性，可選擇地其中於該HIV Env表面上之該碳水化合物經由使用破傷風類毒素衍生而具有免疫原性。
  5. 如申請專利範圍第1項之組成物，其係用於誘導製造抗HIV之中和抗體之方法，該方法包含對一病人投予該組成物，可選擇地其中該病人為人類或非人之哺乳動物。
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