TWI421081B - 去氫羥化腎上腺皮質素（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）用於增加血漿中葉酸濃度及減低同半胱胺酸濃度之用途 - Google Patents

Description

去氫羥化腎上腺皮質素(prednisolone)用於增加血漿中葉酸濃度及減低同半胱胺酸濃度之用途

本發明係關於去氫羥化腎上腺皮質素(prednisolone)用於增加內源性葉酸之用途，更特別地係關於去氫羥化腎上腺皮質素增加哺乳動物血漿中葉酸濃度，以進一步做為須服用消炎劑或免疫抑制劑患者之葉酸補充劑的用途。本發明亦關於去氫羥化腎上腺皮質素降低哺乳動物血漿中同半胱胺酸濃度，以治療或預防與同半胱胺酸濃度上升相關的疾病。

葉酸對於許多身體功能而言是必須的，而在細胞快速分裂及生長期間尤其重要。葉酸參與單碳代謝作用(one-carbon metabolism)為嘌呤類與胸腺嘧啶之新(de novo )生合成作用所必須，並且在DNA複製、修復及甲基化作用；上述皆可能會影響癌症之易感性(susceptibility)並在疾病發生上扮演重要角色。缺乏葉酸會導致DNA受損及CpG島狀區之異常甲基化作用，其可能造成許多人類疾病或促進疾病惡化，包括癌症與免疫系統調節失常等(Jennings,1995;Jin et al.,2007;Luo et al.,2007)。再者，葉酸為同半胱胺酸(具有神經毒性的胺基酸)進行再甲基作用成為甲硫胺酸所需(Selhub,1999)，因此缺乏葉酸會導致同半胱胺酸血症(homocysteinemia)，並且增加包括動脈硬化性心血管疾病、血管內血栓產生等及多種辨識功能障礙(例如，與年齡有關的記憶喪失、老年癡呆、阿茲海默氏症與帕金森氏症)發生之危險率及風險(Arnesen et al.,1995;Malaguarnera et al.,2004;Sachdev et al.,2003;Graham et al.,1997;O'Suilleabhain et al.,2004)。

去氫羥化腎上腺皮質素為一種消炎劑或免疫抑制劑，主要使用於臨床治療人類全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)、氣喘及類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)等。去氫羥化腎上腺皮質素用於治療類風濕性關節炎之一般劑量為每日5-7.5毫克(Tengstrand et al.,2007)。

而本發明發現，去氫羥化腎上腺皮質素能夠增加受治療患者血漿中的葉酸濃度，並且降低同半胱胺酸濃度，因此去氫羥化腎上腺皮質素在臨床治療上除其抗發炎之使用亦可促進其血中葉酸濃度因而做為自體免疫疾病(尤其是全身性紅斑性狼瘡)補充患者之血中葉酸，從而亦具有防止自體免疫疾病患者發生同半胱胺酸血症及相關心血管疾病的功效。

於一方面，本發明係關於一種去氫羥化腎上腺皮質素(prednisolone)用於增加血漿中葉酸濃度之用途。於一項具體態樣，係提供一種用於增加哺乳動物血漿中葉酸濃度之組成物，其包含有效量之去氫羥化腎上腺皮質素及生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。

於另一方面，本發明係關於一種去氫羥化腎上腺皮質素(prednisolone)用於減低血漿中同半胱胺酸濃度之用途。於一項具體態樣，係提供一種用於減低哺乳動物血漿內同半胱胺酸濃度之組成物，其包含有效量之去氫羥化腎上腺皮質素及生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。

於又一方面，本發明係關於一種用於須服用消炎劑或免疫抑制劑患者之葉酸補充劑，其包含有效量之去氫羥化腎上腺皮質素及生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。於一項具體態樣，該患者為罹患全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)及類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)之人類患者。

於又另一方面，本發明係關於一種用於治療或預防須服用消炎劑或免疫抑制劑患者體內因葉酸缺乏所引起的疾病，其包含有效量之去氫羥化腎上腺皮質素及生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。於一項具體態樣，該疾病為同半胱胺酸血症(homocysteinemia)。於另一項具體態樣，該疾病為心血管疾病(cardiovascular diseases)。

在本發明所使用的特殊術語有其原本的意義，如下所用的某些特殊術語是提供熟悉該技藝者能更進一步了解本發明內容。除非另有規定，本發明所涉及的科學和技術所用詞彙和一般普通技能所使用的詞彙為相同的，若是有所衝突的情況下，本發明將會給予名詞新的定義。

本發明所使用的“哺乳動物”意指包括嚙齒類動物(例如鼠類與兔子)，及靈長類動物(例如人類)等。於本發明之具體實施態樣，所指之人類可包括須服用消炎劑或免疫抑制劑之患者，或是可因提升血漿內葉酸濃度，或降低血漿內同半胱胺酸濃度而獲得助益的個體。

於本發明之另一具體實施態樣，所指之人類可包括罹患自體免疫疾病及氣喘患者。於本發明之又一具體實施態樣，該自體免疫疾病包括全身性紅斑性狼瘡及類風濕性關節炎。

本發明所使用的“可因提升血漿中葉酸濃度或降低同半胱胺酸濃度而獲得助益”意指，因為體內(血漿中)葉酸濃度增高或體內(血漿中)同半胱胺酸濃度降低而能獲得改善、減輕或消除之生理狀況或病況。

全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus)是一種慢性自體破壞性疾病，疾病特徵是會產生多種不同的自體抗體，主要發生於年輕女性。在罹患全身性紅斑性狼瘡之患者體內同半胱胺酸含量會升高(Von Feldt et al.,2006)。而在罹患類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)之患者，已經有報導指出其同半胱胺酸代謝異常。而且最近研究發現同半胱胺酸為心血管疾病之危險因子(Von Feldt et al.,2006)。再著，心血管疾病為造成全身性紅斑性狼瘡患者死亡的主因之一(Ward et al.,1995)。血漿中足夠之葉酸濃度藉由防止同半胱胺酸升高，來維持全身健康的血液循環，而狼瘡腎炎(lupus nephritis)為全身性紅斑性狼瘡的主要病徵，且可能導致葉酸缺乏(Hoffbrand et al.,2001)。本發明的研究顯示，去氫羥化腎上腺皮質素可顯著增加小鼠血漿中葉酸濃度，並且減低同半胱胺酸之血漿濃度。因此，去氫羥化腎上腺皮質素可較其他用於治療全身性紅斑性狼瘡之糖質皮質素(glucocorticoid)，具有可預防或治療全身性紅斑性狼瘡患者體內葉酸缺乏，或與同半胱胺酸血症相關的心血管疾病。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

實施例 實施例一：投藥去氫羥化腎上腺皮質素對於小鼠活體內血漿葉酸濃度之影響

自國家實驗動物中心(台北，台灣)購得三週齡年輕成年的雄性C57BL/6J小鼠，並維持於有溫度(18~24℃)與濕度控制，設定在12h光照/12h黑暗週期的條件下生長。經7天適應期後，根據體重將小鼠分成三組(包括對照組與處理組，每組五隻動物)。將各組以自由攝食方式供給胺基酸-限定飼料(2.5g/Kg甲硫胺酸；2mg/Kg葉酸)(購自Dyets，Bethehem,PA)，其中含有1%琥珀醯基(succinylsulfathiazole)用以防止在實驗期間由小鼠腸道細菌產生內源性葉酸。對照組小鼠係經腹腔內注射載劑(0.01% DMSO之磷酸鹽緩衝食鹽水，5ml/kg體重/天)，而處理組小鼠則注射一定劑量之去氫羥化腎上腺皮質素(分別為0.1mg/kg體重/2天及1mg/kg體重/2天)。試驗期約28週，相當於人類長期以低至中劑量之去氫羥化腎上腺皮質素治療長達約22年。

而於本發明之研究中，所選用的去氫羥化腎上腺皮質素劑量，符合其用於治療許多類風濕性疾病及全身性紅斑性狼瘡做為維護療法之最初療程劑量。

於施予劑量處理後12小時，以肝素做為抗凝血劑，採集血液樣本。並將全血於4℃下800g離心20分鐘來分離血漿。採血係於經斷食12小時(期間飲水是採自由攝食方式)後之動物中進行。所有檢體在進行分析之前皆避光冷凍於-80℃下。測量血漿葉酸以及含硫胺基酸濃度。

血漿葉酸濃度係參照先前所描述之微生物法分析(O'Broin and Kelleher,1992)，以及如下所述之修改而進行測量得。於本實施例，用於葉酸分析中之微生物Lactobacillus rhamnosus (ATCC 7469，較早稱作L.casei )購自生物資源保存及研究中心(生物資源保存及研究中心，新竹，台灣)。L. rhamnosus 是一株須依賴葉酸方能生長之菌種。使用96孔盤，標準品或樣本孔中分別含有相等體積的培養基與標準品或樣本。空白孔中則含有培養基與予以取代標準品或樣本之無菌水，係做為空白值以扣除細菌與培養基原本之顏色。將經過混合之96孔盤緊密密封，並以錫箔覆蓋，然後靜置於37℃培養16小時後，使用ELISA reader測量吸光值595nm，以得知細菌生長量。使用葉酸標準品(20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625ng/ml)制定出標準曲線。藉由帶入標準曲線之公式計算出樣本中的葉酸濃度。結果列示於下表1。

¹ 小鼠係以去氫羥化腎上腺皮質素(低劑量：0.1mg/kg/2天；中劑量：1mg/kg/2天)以腹腔注射方式給藥24、48及72天。縮寫：Pred，去氫羥化腎上腺皮質素。

² 血漿葉酸濃度係藉由微生物學分析測定得。數據以(ng/ml)為單位表示。數據以平均值±標準差表示，並經由studentt -檢定進行分析。

結果發現，對照組與處理組之血漿葉酸濃度在統計學上有顯著差異。於藥物處理開始後三星期，對照組小鼠血漿中的葉酸濃度為34.3±7.1nmol/L，而處理組小鼠血漿中的葉酸濃度達到59.0±14.1nmol/L(%改變量：72.1±41.2；studentt -檢定，p =0.030)。於實驗期間，相較於對照組，處理組之葉酸濃度增加了1.58-3.05倍。

實施例二：投藥去氫羥化腎上腺皮質素對於小鼠活體內血漿整體同半胱胺酸狀態之影響

製備血漿樣本，並使用根據Araki等人所述之HPLC方法(Araki and Sako,1987)來分析同半胱胺酸濃度。簡述之，將樣本與還原劑(10%(v/v)三-n -丁基膦溶於二甲基甲醯胺)混合，然後於4℃下靜置反應30分鐘，將同半胱胺酸與其他硫醇類或白蛋白間之雙硫鍵打斷。於還原作用後，將0.6mol/L含有1mmol/L EDTA之過氯酸(PCA)加至混合物中，然後以16000g離心5分鐘去除蛋白(deproteinization)。接著將PCA上清液與衍生液(7-氟苯并-2-氧-1,3-二唑-4-磺酸酯,1mg/ml溶於2.0mol/L硼酸溶液，pH 9.5，含有4mmol/L EDTA)混和。完全衍生化作用係於60℃水浴進行60分鐘，並於冷卻後進行分析。

將由Hitachi L-2130幫浦所組成的HPLC系統與L-2480螢光偵測器連接。使用mightysil RP-18管柱(250×4.6mm;5μm)進行分離，並於激發波長385nm；發射波長=515或470nm之設定下操作偵測器。移動相包含0.1mol/L磷酸二氫鉀，6%(v/v)乙腈，以磷酸調整至pH 2.5，流速為1.2ml/min，進行8分鐘。藉由相互比對檢體與絕對標準品於相同條件下所得之波鋒面積，而定量得同半胱胺酸及半胱胺酸之血漿中含量。結果列示於下表2。

¹ 小鼠係以去氫羥化腎上腺皮質素(低劑量：0.1mg/kg/2天；中劑量：1mg/kg/2天)以腹腔注射方式給藥121天。縮寫：Pred，去氫羥化腎上腺皮質素。

² 血漿同半胱胺酸與半胱胺酸濃度係以高效能液相層析術(HPLC)進行測定得。數據以(μmol/L)為單位表示。縮寫：Hcy，同半胱胺酸；Cys，半胱胺酸。數據以平均值±標準差表示，並經由studentt -檢定進行分析。

結果發現，相較於對照組，中劑量處理會減少血漿同半胱胺酸濃度28%(p =0.05)，處理組(低+中劑量)相較於對照組其血漿同半胱胺酸濃度在統計學上有下降之趨勢(p =0.07)。於藥物處理開始後四個月，對照組小鼠血漿中的同半胱胺酸濃度為3.8±0.7μmol/L，而處理組小鼠血漿中的同半胱胺酸濃度為3.1±0.7μmol/L(%改變量：1.0±45.6；studentt 檢定，p =0.070)。於低劑量及中劑量組小鼠血漿中的同半胱胺酸濃度分別為3.4±0.3及2.7±0.8μmol/L。至於血漿中半胱胺酸濃度，在對照組與處理組之間並未觀察到有顯著差異(參見表2)。依據前述之實驗結果可結論，去氫羥化腎上腺皮質素確實減低空腹狀態之同半胱胺酸濃度，而不會影響斷食期之半胱胺酸濃度。

以上的描述已揭示本創作之較佳實施例，必須瞭解到各種增添、修改和取代可能使用於本創作較佳實施例，而不會脫離如所附申請專利範圍所界定的本創作原理之精神及範圍。因此，本文於此所揭示的實施例於所有觀點，應被視為用以說明本創作，而非用以限制本創作。本創作之範圍應由後附申請專利範圍所界定，並涵蓋其合法均等物，並不限於先前的描述。

圖1：為各組間之血漿葉酸濃度，以對照組(vehicle)與處理組(個別為：低劑量,0.1mg/kg body wt./2天；中劑量,0.1mg/kg body wt./2天；與低+中劑量)。血漿葉酸濃度以微生物法測得。數據以平均值±標準誤(ng/ml)表示。三個時間點分別為24天1(A),48天2(B)與72天3(C),(n=15)。統計上具有差異以(P value. *<0.1;**<0.05,***<0.01與對照組相比)表示。其中(A)為試驗24天，於各組間之血漿葉酸濃度；(B)為試驗48天，於各組間之血漿葉酸濃度；(C)試驗72天，於各組間之血漿葉酸濃度。

圖2.為試驗121天，於各組間之血漿同半胱胺酸濃度，其中對照組(vehicle)與處理組(個別為：低劑量,0.1mg/kg body wt./2天；中劑量,0.1mg/kg body wt./2天；與低+中劑量)。血漿同半胱胺酸濃度以高效能液相層析法測得。數據以平均值±標準誤(μmol/L)表示。時間點為121天(n=15)。以studentt -檢定進行統計分析，具有差異以(P value. *<0.1與對照組相比)表示。

Claims (9)

1. 一種去氫羥化腎上腺皮質素之組成物用於製備同時增加哺乳動物血漿內葉酸濃度及減低哺乳動物血漿內同半胱胺酸濃度之醫藥製劑的用途，其中該組成物包含有效量之去氫羥化腎上腺皮質素及生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
2. 根據申請專利範圍第1項之用途，其中該哺乳動物為人類。
3. 根據申請專利範圍第2項之用途，其中該人類為須服用消炎劑或免疫抑制劑之患者。
4. 根據申請專利範圍第3項之用途，其中該患者為罹患自體免疫疾病或氣喘者。
5. 根據申請專利範圍第3或4項之用途，其中該患者為具有葉酸缺乏症的個體。
6. 根據申請專利範圍第5項之用途，其中該患者為罹患全身性紅斑性狼瘡者。
7. 一種去氫羥化腎上腺皮質素之組成物用於製備治療或預防須服用消炎劑或免疫抑制劑患者體內因葉酸缺乏所引起的疾病之醫藥製劑的用途，其中該組成物包含有效量之去氫羥化腎上腺皮質素及生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
8. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中該疾病為同半胱胺酸血症(homocysteinemia)。
9. 根據申請專利範圍第7項之用途，其中該疾病為心血管疾病(CVD)。