TWI415859B - 核酸切割複合物及其使用方法 - Google Patents

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Description

核酸切割複合物及其使用方法
本發明係關於一種核酸切割複合物及其使用方法，尤指一種對標的核酸具有高度專一性辨識的核酸切割複合物及其使用方法。
在核酸切割技術發展的初期，化學合成的切割試劑在核酸上作用的切割位置是隨機發生而無法操控的，但是藉由技術的提升，近年來出現具序列專一性之核酸切割工具如限制酶，故已經可以部份解決上述問題，進而能夠在如質體重組、基因轉殖、基因圖譜分析等醫學、生物基因工程技術中大幅應用，以提升相關技術的良率。
然而，前述的限制酶對於序列的辨識長度大部分約為4至8個鹼基對，但此長度的序列辨識，在一長片斷DNA序列中往往出現在多個位置，而無法專一的在特定位置進行切割，因此已經難以負荷日趨提升的醫學、生物基因工程技術之需求。因此，目前相當需要能夠發展出一種核酸切割工具，得以針對細胞內或外的核酸進行切割，而不會隨意攻擊非特定之序列，最好可以同時針對多個標的核酸或基因進行專一性切割，且能克服限制酶易受序列、長度限制的缺點，以及需要不同的緩衝液環境等困擾，將更能提升醫學、生物基因工程技術。
本發明之主要目的係在提供一種核酸切割複合物，其透過活化複合物中的核酸切割試劑，可針對標的核酸序列進行專一性的切割，不會攻擊標的核酸序列之外的核酸，故不會損害其他非標的核酸。
為達成上述目的，本發明之核酸切割複合物，包括：一奈米粒；一核酸切割試劑；以及一多核苷酸鏈(polynucleotide chain)，係專一性辨識一標的核酸之序列，其具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，該第二端連接該核酸切割試劑，且該第一端與該第二端的部份序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式。
本發明上述核酸切割複合物中，該多核苷酸鏈的長度沒有特殊限制，可接近10至30個核苷酸的範圍，具體例如15、20、25、35個核苷酸等。此外，多核苷酸鏈主要包含三個區段，其中第一區段的一端即是連接該奈米粒之第一端，另一端則連接第二區段；第三區段的一端即是連接該核酸切割試劑之第二端，其另一端則連接第二區段，因此連接順序依次是奈米粒-第一區段-第二區段-第三區段-核酸切割試劑，其中第三區段的序列會與第一區段的部份序列互相配對，故使此多核苷酸鏈呈髮夾式。此外，由於第一區段與第三區段配對的序列長度會影響該多核苷酸鏈展開進而專一性辨識標的核酸的動作，因此第一區段與第三區段配對的序列長度需要適中，例如3至10對鹼基對的配對。舉例而言，第一區段的序列長度大致上可為1至25個核苷酸，第二區段的序列長度大致上可為5至80個核苷酸，第三區段的序列長度大致上可為1至25個核苷酸。較佳而言，第一區段的序列長度大致上為6至20個核苷酸，第二區段的序列長度大致上可為15至70個核苷酸，第三區段的序列長度大致上可為6至20個核苷酸。
於此所述之「專一性辨識」一詞，意指根據華森-克立克鹼基配對(Watson-Crick base pairing)規則、非華森-克立克鹼基配對(non-Watson-Crick base pairing)規則(如虎格斯汀鹼基配對(Hoogsteen base pairing)、搖擺式鹼基配對(wobble base pairing))等規則。本發明的多核苷酸鏈各個核苷酸中的鹼基，是依據虎格斯汀鹼基配對(Hoogsteen base pairing)規則或非虎格斯汀鹼基配對(Non-Hoogsteen base pairing)規則，與標的核酸相對應位置之各個核苷酸中的鹼基配對而生成氫鍵。舉例而言，若本發明的多核苷酸鏈中具有嘌呤(purines)與嘧啶(pyrimidines)此種鹼基時，於標的雙股脫氧核醣核酸上與其對應的鹼基可為嘌呤如腺嘌呤(adenine)、鳥嘌呤(guanine)及其經修飾後之衍生物等。若本發明的多核苷酸鏈中只有嘧啶(pyrimidines)此種鹼基時，於標的雙股脫氧核醣核酸上與其對應的鹼基可為嘌呤如腺嘌呤(adenine)與質子化的鳥嘌呤(guanine)。由此可知，若本發明的多核苷酸鏈無法與某一核酸配對產生氫鍵，則無法完成此辨識過程，故稱為專一性辨識。
此外，由於本發明的多核苷酸鏈可根據前述配對規則與標的核酸互相配對，因此標的核酸可為單股核酸或雙股核酸、核糖核酸或去氧核糖核酸、天然核酸或人工合成核酸等。具體例如由天然物中純化、聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)、化學合成或其他習知方式所獲得的單股核醣核酸或雙股脫氧核糖核酸皆可為標的核酸。因此，經過本發明多核苷酸鏈專一性辨識後之標的核酸，可形成出雙股螺旋核酸或三股螺旋核酸，若為三股螺旋核酸，多核苷酸鏈的配對結合主要發生在雙股螺旋標的核酸的主溝槽(major groove)，且亦表示本發明的多核苷酸鏈的作用同於具有三股形成能力之寡核苷酸鏈(triplex-forming oligonucleotide，TFO)。
另一方面，標的核酸的序列長度亦沒有特別限制，一般其中被多核苷酸專一性辨識的區域大致的序列長度約可為10至30個核苷酸，較佳約可為11至25個核苷酸。由於本發明的多核苷酸鏈必須要能專一性辨識標的核酸，因此兩者的序列中必須要有部份是互補，即是必須要能更互相配對，如此方能達到辨識之功能。另外，假使多核苷酸鏈上專一性辨識標的核酸的區塊在第一端與第二端之第二區段，由於核酸切割試劑連接在多核苷酸鏈的第二端之第三區段，因此核酸切割試劑作用的位置則會距離辨識區塊數個核苷酸遠。藉由此點特色，可預定切割在標的核酸的位置。
另外，於此所述之「切割」、「截斷」等詞，意指利用外力或作用使得連續連結之核酸分子上兩相鄰核苷酸之間產生間隙(gap)或股裂(nick)，致使被切割或截斷之核酸序列無法達到其原有功能。
本發明的核酸切割複合物中，單一奈米粒上一般可連接30至100條多核苷酸鏈，且不限於只連接一種多核苷酸鏈，亦可同時連接其他種多核苷酸鏈，達到專一性辨識標的核酸其他位置或其他對應的標的核酸之目地。因此，倘若核酸切割複合物中之奈米粒上有多種不同的多核苷酸鏈時，即可針對單一或多種不同之標的核酸進行專一性辨識，而在核酸切割試劑經過活化後可執行切割標的核酸之動作。
此外，該奈米粒的種類、形狀、粒徑及材質等沒有特別限定，可依應用所需或核酸切割複合物之製備方法而為選擇適合的奈米粒。對於奈米粒的材質，舉例可為金屬，如銦、鈦、銅、金、銀、鐵、鈷、鋁、鈀、鉑、鋅、錫、鉻、鎳等；磁性物質，具有順磁性之物質，如氧化鐵、氧化鎳等，可經由外加磁場達到吸引或排斥的效果，以利操控或回收本發明的核酸切割複合物；半導體，如硫化鎘、硒化鎘、經過硫化鋅包覆的硒化鎘或硫化鎘等；無機物質，如矽、二氧化矽等；有機聚合物，如乳酸-甘醇酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)等；或前述材料的組合。對於奈米粒的種類，舉例可為奈米棒；等向性奈米粒(isotropic nanoparticle)，如實心球體奈米粒或中空球體奈米粒；非等向性奈米粒(anti-isotropic nanoparticle)，如非等向性錐形、四邊形或菱形奈米粒；高樹枝狀分子(dendrimer)；以及複合型奈米粒，如內核-外殼奈米粒(core-shell nanoparticle，如SiO2 ＠Au)。對於奈米粒的平均粒徑，一般可接近1至100奈米的範圍，較佳約為10至30奈米的範圍。
上述核酸切割複合物中，該多核苷酸鏈與該奈米粒的連接方式沒有特別限制。舉例而言，該多核苷酸鏈之該第一端與該奈米粒可藉由官能基(如硫醚基(thioether))、單體(乙二醇)、聚合物(如聚乙二醇)等連接。另一方面，該核酸切割試劑與該多核苷酸鏈的連接方式亦沒有特別限制。舉例而言，可透過修飾該多核苷酸鏈之該第二端形成胺基，並藉由此胺基與該核酸切割試劑共價連接。
此外，對於該核酸切割試劑而言，其種類也沒有特別限制，舉例可為光激發型核酸切割試劑，具體如苯甲醛(hydrazone)、氮基原黃素(azidoproflavine)、疊氮基苯乙酮(azidophenacyl)、疊氮基(azido)衍生物、玫瑰樹鹼(ellipticine)衍生物、靛花青(Indocyanine Green,ICG)衍生物等，其激發光舉例可為可見光(Visible spectrum)、紫外光(UV)或近紅外光(Near-IR)。本發明所使用之核酸切割試劑是屬於對稱型靛花青(carbocyanine)一族之靛花青(ICG)的衍生物-近紅外多次甲基菁染料(NIR cyanine dyes,cypate)，其激發光源是近紅外光。研究指出，生物體內的水、紅血球或血色素在800 nm附近的吸收相對最小，對生物體有較深的穿透性，可作為熱療法的光源及深部組織非侵入性的監測(Ralph Weissleder. A clearer vision forin vivo imaging.Nature biotechnology 19;316-317(2001))。由此可知，在核酸切割試劑尚未活化時，由於髮夾式多核苷酸鏈的結構使得核酸切割試劑的激發能量被奈米棒表面電漿共振光學所吸收而產生衰減現象(quenching effect)，因此無法進行核酸切割動作，只有在髮夾式多核苷酸鏈辨識到特定的序列，展開成直線狀時，該核酸切割試劑遠離奈米棒表面電漿共振吸收作用而被激發，經過激發後，才可針對標的核酸進行切割動作。此外，本發明的核酸切割試劑需要與搭配標的核酸的種類來挑選，例如欲切割之標的核酸為去氧核醣核酸時，則須選擇能夠切割去氧核醣核酸的核酸切割試劑。
本發明的另一目的在於提供一種上述核酸切割複合物之使用方法，核酸切割複合物在缺乏標的核酸時，即使核酸切割試劑經過光照或其他方式活化，但因多核苷酸鏈依舊維持在髮夾式，此時核酸切割試劑與奈米粒的距離相當接近，因此核酸切割試劑的活化能量會被奈米粒的表面電漿共振光學所吸收而被衰減(quenching)，該核酸切割試劑不會外露而隨意被激發，故該核酸切割試劑可以安全地暴露在非標的核酸序列中而呈現不活化狀態。唯有在髮夾式多核苷酸鏈遇到標的核酸時，由於會與標的核酸進行專一性辨識，因此原本呈髮夾式的多核苷酸鏈會解開而與標的核酸配對，此時核酸切割試劑才會外露，當適合波長之光源激發時，便可執行切割動作達到永久性地抑制標的核酸表現。除此，髮夾式多核苷酸鏈的結構能有效保護光激發之核酸切割試劑在生物體中被降解，強化其專一性與切割效能。
本發明的核酸切割複合物之使用方法，包括以下步驟：提供一核酸切割組成物及一標的核酸，該核酸切割組成物包括一奈米粒、一核酸切割試劑以及一多核苷酸鏈，其中該多 核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，該第二端連接該核酸切割試劑，且該第一端與該第二端的部份序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式；將該核酸切割組成物與該標的核酸接觸，使該核酸切割組成物之該多核苷酸鏈專一性辨識該標的核酸之序列；以及活化該核酸切割組成物之該核酸切割試劑，使其截斷該標的核酸之序列。
舉例而言，當本發明的使用方法於試管溶液中進行時，該核酸切割複合物則如同限制酶的功能，可以辨識分佈於溶液中的特定序列並達到切割的目的，後續可以結合使用接合酶(ligase)，達到基因或質體重組建構。另外，若本發明的使用方法同樣於試管細胞中進行時，將該核酸切割複合物分散於培養基中，其自然(此指可無需電場或高壓氣體壓力等外力)會進入細胞中針對特定辨識序列進行切割。若細胞不含有此特定辨識序列，核酸切割複合物便無法達到細胞特定基因序列標定的作用，如此可以達到如篩選並處理具有特定基因序列突變的癌細胞的目的。由上述可知，本發明之核酸切割複合物及其使用方法，在應用上並無特別之限制，只要有需要進行核酸切割的相關應用則可使用，例如基因圖譜分析、體外核酸切割、體外核酸檢測、基因或質體重組、親源鑑定等。此即表示本發明之核酸切割複合物及其使用方法，可以在標的核酸被切割前或切割後與本領域通常技術來搭配、組合、置換使用。
另一方面，本發明的核酸切割複合物也可與醫藥上可接受之受體組合使用而形成醫藥組成物。若成為醫藥組成物，核酸切割組成物的劑量則須為有效量，即對標的核酸具高專一性切割作用所需之劑量，亦即需考量藥物動力學等藥學原理與核酸切割複合物在穿過細胞膜時所造成的劑量損失。另外，醫藥上可接受之受體例如為甘露糖醇(mannitol)、葡萄糖、微晶質纖維素(microcrystalline cellulose)、脫脂奶粉、聚乙烯(polyvinylprrolidone)、澱粉或其組合。醫藥組成物的投藥方式可依情況而定，舉例如經噴劑吸入、局部(topically)給予、鼻腔吸收、口服、腸胃外(parentally)投予、藥物儲槽之殖入、顯微注射(microinjection)、基因槍(gene gun)轉殖或其組合，其中，腸胃外投予可包括經皮下、皮內、靜脈內、肌肉內、關節內、動脈內、滑液內或胸骨內之注射或注入方式。
由上述可知，本發明可依照不同標的核酸來進行設計並置換核酸切割複合物中的髮夾式多核苷酸鏈，能符合客製化(customize)的需求，即針對不同的標的核酸製出相對應的核酸切割複合物。而更可藉由光學方式集中特殊波長之光子於特定部位以局限基因切割之範圍。
綜上所述，本發明的核酸切割複合物及其使用方法得以突破以往因為限制酶在較長核酸序列中識別能力不足的問題，提高核酸切割技術應用的實用性，且各種切割序列僅需單一種緩衝液，並且其激發切割能使用光學設計控制同步性、作用位置、進行動態等。並且在使用時可以搭配顯影技術追蹤核酸切割複合物所在之位置，其應用性相當廣泛，本發明的核酸切割複合物及其使用方法具備以下的優點：(1)可同時針對多個目標基因進行專一性的切割作用；(2)相對於限制酶酵素比較不易受序列限制；(3)較小的球體體積使其容易進入細胞及其細胞核進行切割調控；(4)對於標的核酸可產生永久性的破壞；(5)可整合影像追蹤及光調控切割的機制；(6)可透過光學系統進行切割位置及切割動能等之精確控制；(7)經由髮夾式設計可大幅提升其專一性及切割效能並減少切割化學物質被降解；(8)激發光源為生物體較不吸收之近紅外光。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地瞭解本發明之其他優點與功效。本發明亦可藉由其他不同的具體實施例加以施行或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
本發明之實施例中該等圖式均為簡化之示意圖。惟該等圖示僅顯示與本發明有關之元件，其所顯示之元件非為實際實施時之態樣，其實際實施時之元件數目、形狀等比例為一選擇性之設計，且其元件佈局型態可能更複雜。
實施例一　核酸切割複合物的製備
參考圖1A至1C，其為本發明核酸切割複合物的製作流程。首先，如圖1A所示，提供一奈米粒10及髮夾式多核苷酸鏈20。在本實施例中，奈米粒10為金奈米棒，此金奈米棒的準備方法可依種子間接成長法(又稱為植晶法)。0.5 mM四氯金酸(HAuCl4 )水溶液中加入1.822 g溴化十六烷三甲基銨(CTAB)及60 μL 100 mM硝酸銀(AgNO3 )，充分混合攪拌。在劇烈攪拌中，加入300 μL 100 mM維他命C(Ascorbic acid)，此時Au3+ 被還原成Au+ 。保持劇烈攪拌，經過五秒後，立即加入20 μL 100 mM氫硼酸鈉(NaBH4 )，此時Au+ 被還原成零價的金原子，成核與長晶開始進行；於兩小時後反應完成。硝酸銀的銀離子(Ag+ )與CTAB的溴離子(Br- )形成溴化銀(AgBr)固體選擇性地沈積吸附在{110}晶格面上並使其長晶速度緩慢，所以產物為奈米金棒而非金球，其長寬比(aspect ratio)為3.5到4(J. P. Justeet al .,Electric-field-directed growth of gold nanorods in aqueous surfactant solutions.Adv.Funct. Mater 14;571-579(2004))最後將製備好的金奈米棒用連續波長400至1100 nm掃瞄。
接著，準備髮夾式多核苷酸鏈20，其核酸序列舉例可為序列表之SEQ ID NO. 1及SEQ ID NO. 2，但序列不限於此，可根據需要來加以設計，其中SEQ ID NO. 1之5’端及3’端有5個鹼基配對，SEQ ID NO. 2之5’端及3’端有6個鹼基配對，此部份的鹼基配對屬於整體多髮夾式多核酸鏈的主幹部(Stem)，其餘未配對的部份則屬於主幹間的環部(Loop)，在髮夾式多核苷酸鏈20之5’端及3’端分別修飾成硫醇基(SH，thiol)及胺基(NH2 ，amino)，且前述官能基與核苷酸之間則以6個碳原子做連接，並由MDbio,Inc.(Taiwan,Taipei)合成。序列的設計可以參考以下文獻：Philippe Simonet al .,Targeting DNA with triplex-forming oligonucleotides to modify gene sequence.Biochimie 90: 1109-1116(2008)。
由於使用金奈米棒作為本發明的奈米粒10，故可採用本領域已知方法結合金奈米棒及髮夾式多核苷酸鏈20。舉例而言，將金奈米棒及髮夾式多核苷酸鏈20以莫耳數比1：100混合，且將混合液均勻混合16小時，使髮夾式多核苷酸鏈20得藉由其上之硫醇基氧化成硫醚基後而可與金奈米棒以共價鍵結連結。以10000 rcf的轉速離心去掉上清液，去除沒結合上金奈米棒的髮夾式多核苷酸鏈再利用1 ml的二次去離子重複此步驟，最後以相同的轉速離心去除廢液，並回溶至0.5 ml二次去離子水中。
其後，參考圖1B，提供核酸切割試劑30，以便與髮夾式多核苷酸鏈20之另一端3’端連結。對於核酸切割試劑30及多核苷酸鏈20的的連結方式，可根據本領域已知方法。舉例而言，在本實驗例中使用Cypate作為核酸切割試劑30，並以125 μM的濃度，將Cypate及已與金奈米棒10連接的髮夾式多核苷酸鏈20，以1：100的反應莫耳數比均勻混合作用16小時，之後以10000 rcf的轉速離心並去除上清液，以二次去離子水重複此步驟，最後回溶於50ul的二次去離子水中。
最後製得的核酸切割複合物1的結構可如圖1C所示，其中Cypate與髮夾式多核苷酸鏈20的連結如圖2所示。
實施例二　核酸切割複合物的使用方法
參考圖3A至3D，其為本發明核酸切割複合物的使用方法。
首先，如圖3A所示，提供一核酸切割組成物1及一標的核酸40。此標的核酸40可於試管溶液、細胞中，此核酸切割組成物1包括一奈米粒10、一核酸切割試劑30以及一多核苷酸鏈30，其中該多核苷酸鏈20具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒10，該第二端連接該核酸切割試劑30，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈20呈髮夾式。
如圖3B所示，均勻混合核酸切割組成物1及標的核酸40，使核酸切割組成物1與標的核酸40在溶液或細胞中接觸，因此核酸切割組成物1之多核苷酸鏈20便會專一性辨識標的核酸40之部份序列(如圖上之黑色圓點)。由於標的核酸40為雙股螺旋結構，故專一性辨識進行時，多核苷酸鏈20會展開並與標的核酸40上受辨識區域形成三股螺旋結構。
如圖3C所示，若使用光激發型核酸切割試劑作為核酸切割試劑30時，則可以選擇適合波長的光源活化核酸切割組成物1之核酸切割試劑30，例如本實施例使用近紅外光進行活化，此時受到活化的核酸切割試劑30則會呈現激發狀態，對標的核酸40之鹼基對或鄰近的鹼基對進行切割作用。
最後，如圖3D所示，切割完標的核酸40的切割試劑失去活性而呈現未激發狀態，並使標的核酸40失去功能。
另一方面，如圖3E所示，其餘未與標的核酸40辨識的多核苷酸鏈30，其所連接的核酸切割試劑30，經過光照後則會自我分解而失去活性。
試驗例一　試管中之專一性辨識試驗
首先，建構出試驗載體。以全長的-T Easy載體，建構出含有髮夾式多核苷酸鏈可辨識之位置，其命名為pST3試驗載體。另一方面，設計兩組(a,b)可辨識pST3試驗載體之髮夾式多核苷酸鏈與兩組(c,d)組成相同順序不同的爭奪序列(scramble sequence)之髮夾式多核苷酸鏈。
而後，將前述載體與這四組髮夾式多核苷酸鏈，以1：1000(圖4的欄3,5,7,9)與1:10000(圖4的欄4,6,8,10)的莫爾數比相混合，置於37℃的培養箱反應，，最後利用12%非變性之聚丙烯醯胺膠體(polyacrylamide gel)，利用電泳移動測定法(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)來觀察髮夾式多核苷酸鏈是否可以專一性的辨識載體上相對應的位置。
實驗結果如圖4所示，其中欄1為分子量標記(marker)，欄2為載體，欄3,4與5,6為質體與爭奪的髮夾式多核苷酸鏈(c,d)形成的複合物，圖4的欄7,8與9,10為質體與可辨識pST3試驗載體的髮夾式多核苷酸鏈(a,b)形成的複合物。由圖4之欄3,4與5,6可知，因為爭奪的髮夾式多核苷酸鏈序列無法辨識質體上的辨識序列，因此不會形成三股。而圖4的欄7,8與9,10可知，因為可辨識pST3試驗載體的髮夾式多核苷酸鏈可以辨試質體上的辨識序列而形成三股。此實驗驗證我們設計的序列是可以專一性的辨識到目標基因的序列。
試驗例二　試管中核酸切割試劑之DNA切割試驗
首先，準備試驗例一之pST3試驗載體。將前述載體與核酸切割試劑(Cypate)，以1：1000的莫爾數比相混合，圖5的欄2表示質體與限制酶酵素作用後，形成的直鏈質體(Form III plasmid)。圖5的欄3,4,7表示質體本身在經過照光(欄3)與不照光(欄4,7) 10分鐘後都不會因光而被切，所以維持超螺旋的結構(Form I plasmid)。圖5的欄5,6表示核酸切割試劑(Cypate)在膠體中的位置。圖5的欄8,9表示載體與核酸切割試劑形成混合物後在經過照光(欄8)與不照光(欄9)5分鐘後，有照光的質體「部分」被切割，形成缺口圓的質體(Form II plasmid)。圖5的欄10,11表示載體與核酸切割試劑形成混合物後在經過照光(欄10)與不照光(欄11) 10分鐘後，有照光的質體「全部」被切割，均形成缺口圓的質體(Form II plasmid)。由此實驗得知，我們合成的核酸切割試劑(Cypate)是可以達到DNA切割的效果。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
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<120>　核酸切割複合物及其使用方法/NUCLEIC ACID CLEAVAGE
COMPLEX AMD METHOD FOR USING THE SAME
<130>　S3462/0781TW
<160>　2
<170>　PatentIn version 3.3
<210>　1
<211>　32
<212>　DNA
<213>　Artificial
<220>
<223>　人工合成之單股DNA
<220>
<221>　stem_loop
<222>　(1)..(32)
<400>　1
<210>　2
<211>　33
<212>　DNA
<213>　Artificial
<220>
<223>　人工合成之單股DNA
<220>
<221>　stem_loop
<222>　(1)..(33)
<400>　2
1．．．核酸切割複合物
10．．．奈米粒
20．．．多核苷酸鏈
30．．．核酸切割試劑
40．．．標的核酸
圖1A至1C係本發明實施例一之核酸切割複合物的製作流程示意圖。
圖2係圖1C的局部放大圖。
圖3A至3E係本發明實施例二之核酸切割複合物的使用方法之流程示意圖。
圖4係本發明試驗例一中專一性辨識試驗所得結果之電泳圖。
圖5係本發明試驗例二中試管中核酸切割試劑的DNA切割試驗所得結果之電泳圖。
10．．．奈米粒
20．．．多核苷酸鏈
30．．．核酸切割試劑

Claims (14)

  1. 一種核酸切割複合物，包括：一奈米粒；一核酸切割試劑，其中，該核酸切割試劑係一光激發型核酸切割試劑，且該光激發型核酸切割試劑之激發光為可見光、紫外光或近紅外光；以及一多核苷酸鏈，係專一性辨識一標的核酸之序列，其具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，該第二端連接該核酸切割試劑，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之核酸切割複合物，其中，該奈米粒的平均粒徑係介於1至100奈米的範圍。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之核酸切割複合物，其中，該多核苷酸鏈的長度係介於10至30個核苷酸的範圍。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之核酸切割複合物，其中，該多核苷酸鏈中該第一端與該第二端的序列配對長度為3至10對鹼基對。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之核酸切割複合物，其中，該多核苷酸鏈之該第一端與該奈米粒以一硫醚基(thioether)連接。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之核酸切割複合物，其中，該標的核酸係一單股核醣核酸或一雙股脫氧核糖核酸。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之核酸切割複合物，其中，該奈米粒係一金奈米棒或內核-外殼奈米粒(core-shell nanoparticle)。
  8. 一種核酸切割複合物之使用方法，包括以下步驟：提供一核酸切割組成物及一標的核酸，該核酸切割組成物包括一奈米粒、一核酸切割試劑以及一多核苷酸鏈，其中，該核酸切割試劑係一光激發型核酸切割試劑，且活化該光激發型核酸切割試劑之方式，係提供可見光、紫外光或近紅外光，該多核苷酸鏈具有一第一端及一相對之第二端，該第一端連接該奈米粒，該第二端連接該核酸切割試劑，且該第一端與該第二端的部分序列配對使該多核苷酸鏈呈髮夾式；將該核酸切割組成物與該標的核酸接觸，使該核酸切割組成物之該多核苷酸鏈專一性辨識該標的核酸之序列；以及活化該核酸切割組成物之該核酸切割試劑，使其截斷該標的核酸之序列。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之使用方法，其中，該奈米粒的平均粒徑係介於1至100奈米的範圍。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之使用方法，其中，該多核苷酸鏈的長度係介於10至30個核苷酸的範圍。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之使用方法，其中，該多核苷酸鏈中該第一端與該第二端的序列配對長度為3至10對鹼基對。
  12. 如申請專利範圍第8項所述之使用方法，其中，該多核苷酸鏈之該第一端與該奈米粒以一硫醚基(thioether)連接。
  13. 如申請專利範圍第8項所述之使用方法，其中，該標的核酸係一單股核醣核酸或一雙股脫氧核糖核酸。
  14. 如申請專利範圍第8項所述之使用方法，其中，該奈米粒係一金奈米棒或內核-外殼奈米粒(core-shell nanoparticle)。
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