TWI411681B - 桿狀病毒表現載體與其應用 - Google Patents

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Description

桿狀病毒表現載體與其應用
本發明係關於一種桿狀病毒表現載體與藉此在主體之中產生免疫反應之方法，尤係關於一種可同時展示及表現流感病毒表面蛋白之桿狀病毒表現載體與藉此在主體之中產生免疫反應之方法。
流感病毒為正黏液病毒科(orthomyxoviridae)家族的A型成員，具有編碼10個蛋白質的8個負股RNA區段。在這些基因中，紅血球凝集素(hemagglutinin,HA)及神經胺酸酶(neuraminidase,NA)基因編碼與病毒毒性(virulence)相關的表面糖蛋白，負責病毒與宿主細胞受體之終端唾液酸殘基之附著，且媒介病毒與細胞膜之融合，以及病毒從感染細胞脫離的功能。目前，已經分別出16個紅血球凝集素及9個神經胺酸酶亞型的病毒。其中，於16個紅血球凝集素亞型中，高度病原性(high pathogenic,HP)的表現型與H5及H7亞型的某些病毒株有關，因此兩者具相關性。
去活化死疫苗(Inactivated vaccine)
新型H5N1家禽流行性感冒病毒其廣泛流行性及高致死率使得我們必須迫切發展疫苗來控制及防止其感染。現今所使用的標準流感疫苗是三價的去活化流感疫苗(trivalent inactivated vaccine)，此三價流感疫苗包含了目前所流行的流感病毒株的HA及NA蛋白(通常為兩種A型病毒及一種B型病毒)，製造方式是採用化學藥劑將從雞胚胎蛋生產的流感病毒進行去活化及萃取其中所需的抗原蛋白，免疫方式採用肌肉注射。此法已施行了五十年以上，尚為流感疫苗生產的主力方式。但是利用雞胚蛋生產疫苗，卻有以下的缺點，首先它不能生產高感染性的病毒株(H5N1)，因為會造成雞胚胎蛋的死亡，而且對於會對雞蛋過敏的人並不適用。並且去活化死疫苗一般被認為有以下的缺點，1.只能產生有效的中和性抗體，對於T細胞等細胞免疫反應 的刺激較弱，T細胞的免疫反對弱，意味著缺少可殺死被感染細胞的殺手T細胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)，所以對於病毒或在體內寄生的細菌和寄生蟲的免疫保護力較弱。2.難以提高記憶型免疫細胞的生成，通常需要多次接種才能達到免疫效果。
減毒活疫苗(Attenuated vaccine)
減毒活疫苗顧名思義即為減弱病毒毒力，使其失去致病性，但仍能在體內作短暫生長及繁殖。減毒活疫苗由於可以延長抗原在宿主內存在的時間，理論上可以增加抗原被免疫系統識別的機會，有利於提高免疫能力和記憶型的免疫細胞生成。而在宿主內生長並表現抗原也被認為可以有效激發殺手T細胞的產生。
但是減毒活疫苗也有不少缺點：1.由於是活病毒，所以有毒力回復的機會，對於安全性有重大的威脅。2.對某些免疫系統的缺陷者，可能會造成感染的危險。3.生產的作業需在生物安全性較高的場所，作業也較為複雜，生產的成本也較高。
為改良上述問題，美國專利公開號20080003203揭示一種假型(pseudo-typed)桿狀病毒載體，其使紅血球凝集素展示(display)於細胞膜，藉以增加宿主對紅血球凝集素之免疫反應，因此可作為疫苗以誘發對流感病毒的抗體反應。
然而，目前需要發展另一種疫苗，以進一步增加流感病毒在主體中所引發的免疫反應，以增加主體對流感病毒之保護效果。
本發明之目的之一為提供一種桿狀病毒表現載體與藉此在主體之中產生免疫反應之方法，此載體可展示流感病毒表面蛋白，因此具有次單元疫苗功效，並且可在轉導入主體後表現流感表面蛋白，因此亦具有核酸疫苗之功效，以藉此達到更佳的抗體反應以及血球凝集抑制作用，更重要的是可引發更好的細胞性免疫反應，因此可對施打主體具有更佳的保護效果。
根據本發明之一實施例，一種桿狀病毒表現載體包括第一基因卡匣及第二基因卡匣。第一基因卡匣包括：第一流感表面蛋白序列，其編碼第一流感表面蛋白，第一流感表面蛋白包含一紅血球凝集素；桿狀病毒蛋白質訊號序列連結至第一流感表面蛋白序列之5’端，並編碼桿狀病毒訊號胜肽，桿狀病毒訊號胜肽具有膜定位的功能並連結至第一流感表面蛋白之N-終端區域，藉以展現第一流感表面蛋白於桿狀病毒之一外套膜；以及桿狀病毒啟動子，連結至第一流感表面蛋白序列及一桿狀病毒啟動子，桿狀病毒啟動子可使桿狀病毒在昆蟲細胞中複製時，驅使第一流感表面蛋白的表現。第二基因卡匣，包括：第二流感表面蛋白序列，其編碼第二流感表面蛋白，其中第一及第二流感表面蛋白為相同；以及主體啟動子，其可操作地連結至第二流感表面蛋白序列及用以驅使第二流感表面蛋白於一主體中表現，以使桿狀病毒表現載體轉導該主體之後，達到產生內源性表現第二流感表面蛋白之作用。
根據本發明之另一實施例，一種疫苗，其用以在主體之中產生免疫反應，包括：桿狀病毒包含一第一基因卡匣，包括第一流感表面蛋白序列，其編碼第一流感表面蛋白，第一流感表面蛋白包含一紅血球凝集素或一神經胺酸酶；桿狀病毒蛋白質訊號序列，其可操作地連結至第一流感表面蛋白序列之5’端，並編碼桿狀病毒訊號胜肽，其中桿狀病毒訊號胜肽包含膜定位序列並連結至第一流感表面蛋白之N-終端區域，藉以展現該第一流感表面蛋白於該桿狀病毒之一外套膜；以及桿狀病毒啟動子，其可操作地連結至第一流感表面蛋白序列及一桿狀病毒啟動子，桿狀病毒啟動子可使桿狀病毒在昆蟲細胞中複製時，驅使第一流感表面蛋白的表現；一第二基因卡匣，包括：一第二流感表面蛋白序列，其編碼一第二流感表面蛋白，其中第一及第二流感表面蛋白為相同；以及，一主體啟動子，其可操作地連結至第二流感表面蛋白序列，驅使第二流感表面蛋白在主體內的表現。
 桿狀病毒表現載體之建構
請參照圖1a，一種桿狀病毒表現載體包括第一基因卡匣(gene cassette)1及第二基因卡匣2。第一基因卡匣1包括：第一流感表面蛋白序列11，其編碼第一流感表面蛋白；桿狀病毒蛋白質訊號序列12，其可操作地連結至第一流感表面蛋白序列11之5’端，並編碼桿狀病毒訊號胜肽，其中桿狀病毒訊號胜肽包含膜定位的功能，並連結至第一流感表面蛋白之N-終端區域；以及桿狀病毒啟動子13，其可操作地連結至第一流感表面蛋白序列11及一桿狀病毒蛋白質訊號序列12。第二基因卡匣2包括：第二流感表面蛋白序列21，其編碼第二流感表面蛋白，其中第一流感表面蛋白序列11及第二流感表面蛋白序列21係分別包含一紅血球凝集素或一神經胺酸酶；以及主體啟動子22，其可操作地連結至第二流感表面蛋白序列21，並在桿狀病毒進入主體後，驅使流感表面蛋白序列21在細胞內表現第二流感表面蛋白。
此外，在一實施例之中，可將上述的桿狀病毒表現載體施用於主體之中產生免疫反應，其步驟包括：以桿狀病毒感染昆蟲宿主，其中桿狀病毒包含第一流感表面蛋白序列11，其編碼第一流感表面蛋白；桿狀病毒蛋白質訊號序列12，其可操作地連結至第一流感表面蛋白序列之5’端，並編碼桿狀病毒訊號胜肽，其中桿狀病毒訊號胜肽包含膜定位的功能並連結至第一流感表面蛋白之N-終端區域；以及桿狀病毒啟動子13，其可操作地連結至第一流感表面蛋白序列11及一桿狀病毒蛋白質訊號序列12，以使桿狀病毒在昆蟲宿主中複製時，驅使第一流感表面蛋白的表現。收獲桿狀病毒以及將所收獲的桿狀病毒傳入主體，其中桿狀病毒更包含：一第二流感表面蛋白序列21，其編碼一第二流感表面蛋白，其中第一流感表面蛋白序列11及第二流感表面蛋白序列21係分別包含一紅血球凝集素或一神經胺酸酶；以及，一主體啟動子22，其可操作地連結至第二流感表面蛋白序列21，並在桿狀病毒進入主體後，驅使流感表面蛋白序列21在細胞內表現第二流感表面蛋 白。
請參照圖1b，在一實施例中，本發明建構了重組桿狀病毒Bac-CHA/HA64，其可由Gibco市售之pFastBac DualTM 雙重載體進行基因工程而得。可進行展現(display)及表現(express)紅血球凝集素，以達到更佳的免疫保護效果。此外，圖1c所示之Bac-HA64則為習知技術僅具展現血球凝集素之重組桿狀病毒。
請參照圖1b及1c，在Bac-CHA/HA64及Bac-HA64之中，包含了嵌合的紅血球凝集素序列(HA)，其由p10啟動子(Pp10 )所驅動。其他HA基因的5’端由桿狀病毒之gp64(glycoprotein 64)蛋白質所衍生之訊號序列(SS64 )所取代。編碼紅血球凝集素之紅血球凝集素序列的3’端可由源自gp64之胞質終端區域(Cytoplasmic Domain)序列(CTD64 )所取代，以藉此增加紅血球凝集素在桿狀病毒之中的表現量以及展現在桿狀病毒表面的效率。
Bac-CHA/HA64及Bac-HA64皆為可展示紅血球凝集素之重組桿狀病毒，其具有可編碼gp64蛋白質之訊號序列(SS64 )、紅血球凝集素序列(HA)及gp64蛋白質之胞質終端區域序列(CTD64 )之重組序列。SS64 訊號胜肽具有使融合蛋白質在表現後轉位(translocate)至昆蟲細胞細胞膜的能力，而CTD64 所編碼之gp64蛋白質之胞質終端區域具有使gp64蛋白質併入出芽桿狀病毒顆粒的能力，使得融合蛋白質可展現於病毒外套膜。當gp64蛋白質之特定訊號胜肽與胞質終端區域與外源性紅血球凝集素以融合蛋白質(fusion protein)形式利用桿狀病毒載體表現時，此融合蛋白質會轉位至細胞膜，而於病毒出芽時併入病毒外套膜，因此達成展現蛋白質之作用。因此，本發明之Bac-CHA/HA64及Bac-HA64藉由上述機制，達到展現流感病毒紅血球凝集素之成效。
此設計可以融合之紅血球凝集素序列於昆蟲細胞中有效地表現紅血球凝集素，並後續結合進入桿狀病毒套膜。由於紅血球凝集素是在桿狀病毒表面表現，因此桿狀病毒基因載體Bac-HA64及 Bac-CHA/HA64皆可引發抗HA蛋白的抗體反應，以達到血球凝集抑制作用(hemagglutination inhibition,HI)之效果，因此，此形式類似於次單元疫苗。
不同於Bac-HA64，Bac-CHA/HA64除了展現外源性紅血球凝集素，更可在哺乳動物細胞之中，在巨細胞病毒早期表現啟動子(cytomegalovirus immediate-early promoter,PCMV-IE )的調控下，以內源性方式表現紅血球凝集素。如圖1b所示，Bac-CHA/HA64更包含另一紅血球凝集素序列，其具有紅血球凝集素之訊號序列SSHA 及胞質終端區域序列CTDHA ，以期在啟動子PCMV-IE 之調控下，在Bac-CHA/HA64轉導哺乳動物細胞之後，達到產生內源性表現紅血球凝集素之作用，藉此達到抗HA的細胞性免疫反應，因此，此形式類似核酸疫苗。
因此，Bac-CHA/HA64包含了兩種基因卡匣，使得Bac-CHA/HA64為具紅血球凝集素展現之假型桿狀病毒，並且可以於哺乳動物細胞之中進行轉導作用而表現紅血球凝集素蛋白質，故具有次單元疫苗及核酸疫苗之功效。此外Bac-CHA/HA64可感染昆蟲宿主細胞以進行桿狀病毒之放大，接著再收獲桿狀病毒，並將所收獲的桿狀病毒傳入主體，因此減少放大及純化之成本。
此外，熟知此項技術者可選擇運用於本發明之啟動子。舉例而言，桿狀病毒之啟動子可包含但不限於p10啟動子、多角體蛋白質(polyhedrin)啟動子等。哺乳動物啟動子可包含但不限於PCMV-IE 、或猴病毒40(Simian virus 40,SV40)啟動子、人類延伸因子1α(EF-1α)、或巨細胞病毒早期啟動子/雞肌動蛋白融合啟動子(CMV early enhancer/chicken β actin；CAG)。
在一實施例中，本發明之桿狀病毒表現載體亦可於禽類動物(Avian)之中表現，因此，可選用適當的禽類啟動子，例如PCMV-IE 。
此外，在此實施例中，在建構Bac-HA64及Bac-CHA/HA64之過程中，為將野生型gp64基因藉由聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)加以擴增且次選殖至pBac-CEH質體，可於訊號胜肽與紅血球凝集素序列之間插入6織胺酸殘基序列(His6 )的延伸，但本發明並未以此為限。
桿狀病毒表現載體之展現及表現
Bac-CHA/HA64包含與Bac-HA64相同的基因組，因此可以展現HA，並且Bac-HA64/CHA感染昆蟲細胞之後，誘導合胞體(syncytia)形成。合胞體的形成是由紅血球凝集素所導致，而在Bac-HA64感染之後亦觀察到相同現象，因此可顯示紅血球凝集素亦展示於Bac-CHA/HA64之表面(資料未顯示)。
哺乳動物中之紅血球凝集素表現可藉由以Bac-CE(以加強型綠色螢光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Proteins,EGFP)取代紅血球凝集素)、Bac-HA64、Bac-CHA/HA64以病毒感染劑量(Multiplicity of infection,MOI)100轉導幼倉鼠腎(baby hamster kidney,BHK)細胞，並進一步以西方點墨法分析及抗紅血球凝集素抗體確認。其中，Bac-CHA/HA64所轉導之細胞可以表現HA0(未切割之紅血球凝集素)，而Bac-CE及Bac-HA64則未表現HA0(如圖1d所示)。
在一實施例中，可加入丁酸酯(butyrate)以增加蛋白質表現，如圖1d所示。
體液免疫反應(humoral immune response)之量測
為評估載體設計對疫苗效價的影響，接下來比較重組病毒Bac-CHA/HA64與Bac-HA64對主體之免疫反應。
為了比較兩種病毒載體引發體液免疫反應的效果，我們以每五隻小鼠為一組，分別以不同的免疫途徑(肌肉注射(i.m.)、皮下注射(s.c.)及鼻腔注射(i.n))，注射PBS(作為陰性對照組)、Bac-HA64或Bac-CHA/HA64重組桿狀病毒載體(劑量為1×109 PFU/mouse)，進行免疫效果實驗。
在首次注射之後，母鼠在第2週及第4週時，再接受相同劑量的加強注射。在第3,6,8,10,12及16週收集血清，並以酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)分析抗紅血球凝集素的免疫球蛋白G2a(IgG2a)及免疫球蛋白G1(IgG1)力價，其可與第一助手T細胞(Th1)及第二助手T細胞(Th2)反應的強度相對應。如同預期，PBS的注射不會引起IgG2a及IgG1的力價。鼻腔注射造成相當少的IgG2a及IgG1力價(<210 )，因此不顯示數據。
另一方面，Bac-HA64及Bac-CHA/HA64之肌肉注射及皮下注射都引發了IgG2a及IgG1抗體，其力價在第6週達到最高峰，在此之後逐漸下降，但至少在第16週仍保持穩定(圖2a-2d)。在經由肌肉注射(i.m.)之途徑部分，Bac-CHA/HA64相同地在第6週達到高峰的IgG2a力價，其顯著地超過Bac-HA64之力價(圖2a)。而在IgG1力價部分，Bac-CHA/HA64與Bac-HA64之力價則為相似。在經由皮下注射(s.c.)路徑時，Bac-HA64自第3週至第16週都可得到三組當中(Bac-CHA/HA64,Bac-HA64及PBS)最高的IgG2a力價(圖2c)及IgG1力價(圖2d)。因此，相較於皮下注射路徑，Bac-CHA/HA64以肌肉注射可以得到較高的IgG2a力價高峰值，但較低的IgG1力價高峰值。
接著繼續量測血球凝集抑制作用力價以檢視上述產生的抗體是否可以具有血球凝集抑制的效果。與IgG力價分佈相同，肌肉注射(圖3a)及皮下注射(圖3b)接種引發在第6週達到高峰及至少維持到第16週的血球凝集抑制作用力價。其中值得一提的是，肌肉注射相較於皮下注射可達到較高的血球凝集抑制作用力價。此外，在經由肌肉注射時，Bac-CHA/HA64在第3-10週高於Bac-HA64的力價。在經由皮下注射部分，Bac-CHA/HA64與Bac-HA64則達到相似的血球凝集抑制作用力價。
黏膜免疫反應之量測
如前所述，鼻腔注射引發較差的抗紅血球凝集素之IgG反應。然 而，因為黏膜免疫反應在預防感冒病毒進入鼻黏膜部分扮演重要角色，因此接下來探討桿狀病毒載體經由鼻腔注射所引發的黏膜免疫反應。老鼠經由鼻腔注射PBS，Bac-HA64(1×109 PFU/mouse之劑量)或Bac-CHA/HA64(1×109 PFU/mouse之劑量)，然後我們取出支氣管肺泡沖洗液(bronchoalveolar lavage,BAL)，並以ELISA量測其中的IgA力價。
圖4顯示PBS群組未誘發IgA產生，而Bac-HA64及Bac-CHA/HA64則可誘發相當高的IgA力價，但其差異在統計上並不明顯(p >0.05)，因此代表Bac-HA64及Bac-CHA/HA64在鼻腔注射時雖然不會引發明顯的體液或細胞免疫反應，但可誘發類似強度的黏膜免疫反應。
評估桿狀病毒劑量對於免疫效果的影響
為了了解桿狀病毒的劑量對免疫效果的影響，分別以5隻小鼠為一組，經由肌肉注射免疫途徑，注射不同劑量(1×108 ,1×109 或1×1010 PFU/mouse)的桿狀病毒載體。加強注射的方法及時程與圖2的實驗相同，並在第六週時以IgG2a、IgG1及HI效價等實驗來評估免疫效果。圖5a顯示，IgG1效價在病毒劑量從1×108 增加到1×109 PFU/mouse後並無顯著增加，然而當病毒劑量增加到1×1010 PFU/mouse時候，IgG1效價可明顯提升到16.3。但此二種病毒載體，無論在那種病毒劑量之下，激發IgG1效價的能力並沒有顯著差異。至於IgG2a效價的結果，由圖5b所示，可以很清楚觀測到隨著桿狀病毒Bac-CHA/HA64的劑量增加，IgG2a效價也會顯著提升。當病毒劑量增加到1×1010 PFU/mouse時，Bac-CHA/HA64可達到21.8的IgG2a抗體效價。Bac-HA64則在1×108 及1×109 PFU/mouse的病毒劑量時，激發相似的IgG2a效價，直到病毒劑量提高到1×1010 PFU/mouse時，IgG2a效價則提升至20.4。由圖5a及圖5b可計算得到表1結果，如表1所示，當病毒劑量由1×108 PFU/mouse提高到1×1010 PFU/mouse時，Bac-CHA/HA64之IgG2a/IgG1比例由6.5提升到44，高於Bac-HA64 由6.2提升至18，顯示Bac-CHA/HA64可較Bac-HA64引發較高的Th1反應。
如圖5c所示，HI效價則明顯隨著病毒劑量增加而增加，在1×109 與1×1010 PFU/mouse的病毒劑量時，Bac-CHA/HA64可較產生較Bac-CHA高的HI效價(p <0.05)。
為了進一步了解桿狀病毒載體疫苗引發細胞性免疫反應的能力，我們以肌肉注射方式及1×1010 PFU/mouse的病毒劑量對小鼠進行免疫，在第二週及第四週時進行加強注射。在第五週時，取得小鼠脾臟細胞，再以酶聯免疫斑點法(Enzyme-linked Immunospot Assay,ELISPOT)，分析脾臟細胞產生干擾素γ(interferon gamma,IFN-γ，代表Th1反應)及介白質-4(interleukin-4,IL-4，代表Th2反應)的量。根據圖6a結果顯示，在IFN-γ部分，Bac-CHA/HA64之斑點形成單位(spot forming unit,SFU)高於Bac-HA64(p <0.01)；而根據圖6b結果顯示，在IL-4部分，Bac-CHA/HA64之SFU與Bac-HA64相似(p >0.05)。這結果顯示經由肌肉注射之Bac-CHA/HA64，相較於Bac-HA64可產生更多的IFN-γ，亦即更強的Th1反應，但並不會產生較強的Th2反應。
我們進一步對脾臟細胞中分泌之CD8+ T細胞比例加以分析，作為功能性殺手T細胞(負責清除被病毒感染的細胞)之指標。如圖7所示，Bac-CHA/HA64所誘導的IFN-γ+/CD8+脾臟細胞相較於Bac-HA64所誘導的部分高出許多，且其差異具統計上意義(p <0.05)。這些數據證實了，同時展現與表現紅血球凝集素可誘發產生較多量的功能性殺手 T細胞。
上述實施例可延伸用以構築其他桿狀病毒表現載體。例如，本發明可將神經胺酸酶(NA)取代紅血球凝集素(HA)，以展示或表現神經胺酸酶以誘發主體之免疫反應，進而製備具保護力之疫苗。
綜合上述，本發明之桿狀病毒表現載體可展現流感表面蛋白，刺激產生中和抗體的體液免疫反應，以達到次單元疫苗功效；並且藉由表現流感表面蛋白，可以達到核酸疫苗之功效，進而引發較佳的細胞免疫反應。相較於先前技術，本發明之桿狀病毒表現載體在以肌肉注射時，對施打主體會產生更佳的IgG2a抗體激發效果、血球凝集抑制作用及細胞免疫反應。
以上所述之實施例僅係為說明本創作之技術思想及特點，其目的在使熟習此項技藝之人士能夠瞭解本創作之內容並據以實施，當不能以之限定本創作之專利範圍，即大凡依本創作所揭示之精神所作之均等變化或修飾，仍應涵蓋在本創作之專利範圍內。
1‧‧‧第一基因卡匣
11‧‧‧第一流感表面蛋白序列
12‧‧‧桿狀病毒蛋白質訊號序列
13‧‧‧桿狀病毒啟動子
2‧‧‧第二基因卡匣
21‧‧‧第二流感表面蛋白序列
22‧‧‧哺乳動物啟動子
CTD64 ‧‧‧gp64之胞質終端區域序列
CTDHA ‧‧‧血球凝集素之胞質終端區域序列
HA‧‧‧紅血球凝集素序列
His6 ‧‧‧6組胺酸殘基序列
Pp10 ‧‧‧p10啟動子
PCMV-IE ‧‧‧巨細胞病毒早期表現啟動子
SS64 ‧‧‧gp64訊號序列
SSHA ‧‧‧血球凝集素訊號序列
圖1a為示意圖顯示依據本發明一實施例之桿狀病毒表現載體。
圖1b為示意圖顯示依據本發明另一實施例之桿狀病毒表現載體。
圖1c為示意圖顯示習知技術之桿狀病毒表現載體。
圖1d為圖式顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
圖2a-2d為折線圖顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
圖3a-3b為折線圖顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
圖4為長條圖顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
圖5a-5c為長條圖顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
圖6a-6b為長條圖顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
圖7為長條圖顯示依據本發明一實施例之實驗結果。
1‧‧‧第一基因卡匣
11‧‧‧第一流感表面蛋白序列
12‧‧‧桿狀病毒蛋白質訊號序列
13‧‧‧桿狀病毒調控序列啟動子
2‧‧‧第二基因卡匣
21‧‧‧第二流感表面蛋白序列
22‧‧‧主體調控序列啟動子

Claims (15)

  1. 一種桿狀病毒表現載體，包含：一第一基因卡匣，包括：一第一流感表面蛋白序列，其編碼一第一流感表面蛋白，該第一流感表面蛋白包含一紅血球凝集素；一桿狀病毒蛋白質訊號序列，其可操作地連結至該第一流感表面蛋白序列之一5’端，並編碼一桿狀病毒訊號胜肽，其中該桿狀病毒訊號胜肽包含一膜定位序列並連結至該第一流感表面蛋白之一N-終端區域，藉以展現該第一流感表面蛋白於該桿狀病毒之一外套膜；以及一桿狀病毒啟動子，其可操作地連結至該第一流感表面蛋白序列及該桿狀病毒蛋白質訊號序列；以及一第二基因卡匣，包括：一第二流感表面蛋白序列，其編碼一第二流感表面蛋白，其中該第一流感表面蛋白及該第二流感表面蛋白序列為相同；以及一主體啟動子，其可操作地連結至該第二流感表面蛋白序列及用以驅使第二流感表面蛋白於一主體中表現，以使該桿狀病毒表現載體轉導該主體之後，達到產生內源性表現第二流感表面蛋白之作用。
  2. 如請求項1所述之桿狀病毒表現載體，其中該桿狀病毒蛋白質訊號序列為一gp64蛋白質之一訊號序列，並編碼該gp64蛋白質之一N-終端區域訊號胜肽。
  3. 如請求項2所述之桿狀病毒表現載體，其中該第一基因卡匣更包含 一gp64之胞質終端區域序列，其可操作地取代第一流感表面蛋白序列之一胞質終端區域序列，並編碼與該第一流感表面蛋白主要區域連結之gp64之一胞質終端區域。
  4. 如請求項1所述之桿狀病毒表現載體，其中該桿狀病毒啟動子為一p10啟動子或一多角體蛋白質啟動子。
  5. 如請求項1所述之桿狀病毒表現載體，其中該主體啟動子包含一哺乳動物啟動子或一禽類(avian)啟動子。
  6. 如請求項5所述之桿狀病毒表現載體，其中該哺乳動物啟動子為一巨細胞病毒早期啟動子、一猴病毒40啟動子、一人類延伸因子1α啟動子、或一巨細胞病毒早期啟動子/雞肌動蛋白融合啟動子。
  7. 如請求項5所述之桿狀病毒表現載體，其中該禽類啟動子為一巨細胞早期啟動子。
  8. 一種疫苗，其用以在主體之中產生免疫反應，包含：一桿狀病毒，其中該桿狀病毒包含：一第一基因卡匣，包括：一第一流感表面蛋白序列，其編碼一第一流感表面蛋白，該第一流感表面蛋白包含一紅血球凝集素；一桿狀病毒蛋白質訊號序列，其可操作地連結至該第一流感表面蛋白序列之一5’端，並編碼一桿狀病毒訊號胜肽，其中該桿狀病毒訊號胜肽包含一膜定位序列並連結至該第一流感表面蛋白之一N-終端區域，藉以展現該第一流感表面蛋白於該桿狀病毒之一外套膜；以及 一桿狀病毒啟動子，其可操作地連結至該第一流感表面蛋白序列及該桿狀病毒蛋白質訊號序列；以及一第二基因卡匣，包括：一第二流感表面蛋白序列，其編碼一第二流感表面蛋白，其中該第一流感表面蛋白及該第二流感表面蛋白為相同；以及一主體啟動子，其可操作地連結至該第二流感表面蛋白序列及用以驅使該第二流感表面蛋白在該主體內表現。
  9. 如請求項8所述之疫苗，其中該桿狀病毒蛋白質訊號序列為一gp64蛋白質之一訊號序列，並編碼該gp64蛋白質之一N-終端區域訊號胜肽。
  10. 如請求項9所述之疫苗，其中該桿狀病毒更包含一gp64之胞質終端區域序列，其可操作地取代該第一流感表面蛋白序列之一3’端，並編碼與該第一流感表面蛋白之主要區域連結之gp64之一胞質終端區域。
  11. 如請求項8所述之疫苗，其中該桿狀病毒啟動子為一p10啟動子、或一多角體蛋白質啟動子。
  12. 如請求項8所述之疫苗，其中該主體啟動子包含一哺乳動物啟動子，而該主體為一哺乳類動物。
  13. 如請求項12所述之疫苗，其中該哺乳動物啟動子為一巨細胞病毒早期啟動子、或一猴病毒40啟動子、人類延伸因子1α、啟動子、或巨細胞病毒早期啟動子/雞肌動蛋白融合啟動子。
  14. 如請求項8所述之疫苗，其中該主體啟動子包含一禽類啟動子，而 該主體為一禽類。
  15. 如請求項14所述之疫苗，其中該禽類啟動子為一巨細胞病毒早期啟動子。
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