TWI395589B - 用於治療皮膚傷口之醫藥組合物 - Google Patents

Description

用於治療皮膚傷口之醫藥組合物

本發明係關於皮膚創傷治療之技術領域。具體而言，本發明係提供一種治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括臍帶間質幹細胞。

皮膚是身體在面對外在威脅性傷害、微生物等，的第一道防禦關卡。在生理上具有重要功能。創傷、燒燙傷、慢性潰瘍等，可能會造成皮膚構造嚴重損害，影響其皮膜屏障的初級免疫功能，進而可能伴隨全身性難以估計之危險。

皮膚創傷的癒合主要必須歷經發炎反應、表皮再生、肉芽組織(granulation tissue)生成、血管增生，創傷收縮以及細胞外基質重新建構等過程，才能幫助創傷後再生的皮膚組織。近年來隨著幹細胞研究的興起，研究人員使用不同來源的幹細胞給予創傷皮膚治療，期望幹細胞能夠在各方面幫助整個皮膚創傷的再生與重建，且已達不錯成效(Yaojiong et al.,Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis.Stem Cells ,25(10)：2648-59,2007)。惟大部分幹細胞來源不易取得，有些甚至有道德或安全上的疑慮，仍有許多問題待解決。

人類臍帶是一種生產後的廢物，來源取得容易，沒有道德顧慮，處理方式簡單，而且人類臍帶幹細胞數量極多、繁殖快速，是很好的幹細胞來源。過去研究出移植人類臍帶間質幹細胞於大白鼠紋狀體中，植入的細胞可以存活在大白鼠腦中四個月，表示人類臍帶間質幹細胞，不會引起宿主的免疫及排斥反應。因此，人類臍帶間質幹細胞為一株適合用於進行異體移植的良好幹細胞來源。

在一方面，本發明提供一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括臍帶間質幹細胞(umbilical mesenchymal stem cells)。特定而言，所述醫藥組合物可促進創傷癒合。

再另一方面，本發明是針對臍帶間質幹細胞之用途，其係用以製備供治療治療皮膚創傷之醫藥。在一具體實例中，所述臍帶間質幹細胞係來自人類。

除非另外定義，本文中所用之所有技術及科學辭彙具有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。

在本文中，冠詞「一」係指一個或一個以上(亦即，至少一個)之該冠詞之文法客體。舉例而言，「一元件」意謂一個元件或一個以上之元件。

在一方面，本發明提供一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括臍帶間質幹細胞(umbilical mesenchymal stem cells)。另一方面，本發明提供臍帶間質幹細胞之用途，其係用以製備供治療皮膚創傷之醫藥。

本文所使用的「臍帶間質幹細胞」乙詞係指位於哺乳類動物臍帶，較佳為人類臍帶間質組織中之幹細胞，可為未經純化的細胞培養物或純化後的細胞。以下實例說明從個體組織取得臍帶間質幹細胞之流程。臍帶為生產後廢棄物，來源取得容易，沒有道德顧慮，處理方式簡單，數量極多、繁殖快速。且本實驗室先前發現，移植人類臍帶間質幹細胞，不會引起宿主產生免疫排斥反應。所以人類臍帶間質幹細胞為一種適合用來進行異體移植的良好幹細胞來源。

本文所使用的「醫藥組合物」是指一種作為醫藥之混合物，其通常含有載體，諸如，醫藥可接受之載體或賦形劑，其係技藝中所習知且適合投藥至對象中，以作為治療性、診斷性或預防性之目的，其亦可包括細胞培養物或細胞。醫藥組合物之形式可為溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊或粉末，其給藥方式較佳為注射。

本文所使用的「醫藥可接受之載體」係指任何習知類型之無毒固體、半固體或液體之填充劑、稀釋劑、包膠囊材料、調配物輔助劑或賦形劑。醫藥可接受之載體係在所用之劑量及濃度下，對接受者無毒性，且可與該調配物之其他成分相容。醫藥可接受之載體一般均可由公眾輕易取得。此外，醫藥可接受之輔助物質，諸如，pH調節及緩衝劑、滲透壓調節劑、安定劑、溼潤劑及類似物，亦皆可由公眾取得。

適當之載體包括，但不限於，水、葡萄糖、甘油、鹽水、乙醇及其組合。載體可含有額外之試劑，諸如，溼潤及乳化劑、pH緩衝劑或是佐劑，其可增強該調配物之有效性。局部性載體包括液體石油、棕櫚酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、溶於水中的聚氧乙烯單月桂酸酯(5%)或是溶於水中的十二烷基硫酸鈉(5%)。可視需要加入其他材料，諸如，抗氧化劑、保濕劑、黏度穩定劑及類似試劑。

本發明之醫藥組合物可用於治療皮膚創傷，個體較佳為哺乳動物，更佳為人類。在一具體實例中，所述醫藥組合物可植入皮膚創傷，或置於皮膚創傷周圍，或皮膚創傷上。或施加於敷料在置於皮膚創傷上。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。此一領域具通常知識者可瞭解本發明具有各種態樣，下述具體實例僅用以說明而非作為本發明之限制。

除非另外定義，本文中所用之所有技術及科學辭彙具有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。此一領域具通常知識者可瞭解本發明具有各種態樣，下述具體實例僅用以說明而非作為本發明之限制。

實例1：人類臍帶間葉細胞之製備

人類臍帶以無菌操作方式收集並在4℃下儲存於HBSS(Biochrom L201-10)不超過24小時。

臍帶先泡在75%之乙醇中30秒以消毒。在無菌操作台中將消毒過之臍帶置於無鈣及無鎂離子之緩衝溶液(CMF,Gibco 14185-052)，以消毒過之器具將臍帶縱切，並將其中之血管及間葉組織(瓦頓氏凝膠)去除。將間葉組織切成0.5立方公分之小塊，以250×g離心5分鐘。去除上清液，並以適量之無血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉澱物二次，再以250×g離心5分鐘。間葉組織在37℃下以膠原酶(collagnase)處理14至18小時，清洗後，再以2.5%之胰蛋白酶(trypsin)於37℃及震盪下處理30分鐘。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至間葉組織以終止胰蛋白反應。此時間葉組織已變成間葉細胞。間葉細胞以10% FBS-DMEM使其分散並計算其數量後，便可直接用於培養及進行後續實驗。

實例2：大白鼠真皮纖維母細胞(Rat dermal fibroblasts)之體外培養

初生3~5天的大白鼠，取其皮膚，加入胰蛋白酶(trypsin)以剔除表皮，再以膠原酶處理真皮組織，此時真皮組織內的纖維母細胞便可分離出來，再以10%FBS DMEM進行培養。

利用blue tip尖端，將培養單層(monolayer)的真皮纖維母細胞刮出一道等距離的缺口，同時與人類臍帶間質幹細胞共同培養。於時間點0小時、24小時、48小時、72小時，由光學顯微鏡觀察其爬行，補回缺口的情形，可以發現與人類臍帶間質幹細胞共同培養的大鼠真皮纖維母細胞爬行能力較好(圖1A)。統計後，發現在24小時和48小時有顯著差異(P<0.05，圖1B)。

實例3：皮膚創傷的大白鼠模式建立

取7週大，250g重之雄性大白鼠，剔除其背部毛，於兩耳連線下1.5cm，利用組織切割器(biopsy punch)移除直徑8mm的皮膚，蓋上防水透氣貼布，以防止抓傷。

本研究將實驗動物分成兩組，第一組為控制組，皮膚創傷建立後，立即於創傷周圍四個點分別給予20λ生理食鹽水(saline)。第二組為實驗組，皮膚創傷建，立後立即於創傷周圍四點分別移植5*10⁵ /20λ人類臍帶間質幹細胞(HUMSCs)。

實例4：HUMSCs對創傷皮膚產生膠原蛋白之影響

將實驗動物分成兩組，第一組為控制組，皮膚創傷建立後，立即於創傷周圍四個點分別給予20λ之生理食鹽水。第二組為實驗組，分為大鼠真皮纖維母細胞單獨培養，與纖維母細胞與幹細胞共同培養兩組，培養三天後收集細胞培養液，以可溶性膠原纖維測量套組(Sircol^TM Soluble Collagen Assay kit)測量大白鼠皮膚組織內或細胞培養液中可溶性膠原纖維的含量。

檢測控制組及實驗組之細胞培養液中之膠原蛋白含量結果顯示，與幹細胞共同培養之纖維母細胞的培養液中，每毫升含有(1263.73±52.24)μg，較單獨培養纖維母細胞組，每毫升(724.83±78.91)μg的膠原蛋白相比，明顯高出許多(p<0.05，圖1C)。證實在體外培養系統中，與HUMSC共同培養後，纖維母細胞分泌到培養液中的膠原蛋白量明顯較多。

實例5：HUMSCs對皮膚創傷癒合之影響

利用抗原抗體結合的原理，標定細胞內蛋白質所在位置的方法。本實驗所用的初級抗體為兔抗-MPO抗體(Rabbit anti-MPO antibody)，小鼠抗-MPO抗體(Mouse anti-ED1 antibody)，小鼠抗-人類專一性細胞核抗原抗體(Mouse anti-human specific nuclei antigen antibody)。作用後連接適當二級抗體，接著以DAB進行成色。

由巨觀型態定義其出血或濕潤乃至形成血栓纖維蛋白(blood clotting fibrin)是為創傷傷口，持續關注創傷變化情形，測量面積且持續記錄其數值到第十四天為止。第四天，在移植HUMSCs之實驗組(移植組)，觀察到創傷有收縮現象，創傷面積較僅給予生理食鹽水的控制組小，顯示移植組的癒合速度較快(圖2A)。經由統計發現自第四天起，移植組創傷面積的百分比和控制組相比顯著較低(p<0.05，圖2B)。另外，組內前後每兩天進統計分析，移植組第二天到第四天的癒合面積比例有顯著差異(p<0.05，圖2B)，而控制組在此階段並無差異，因此，我們推測此時間點為HUMSCs影響創傷癒合最劇的時機，後續便於此時觀察創傷癒合微觀變化與可能機制。

實例6：HUMSCs對皮膚創傷體積縮小及皮膚組織重建之效果

連續切片後HE染色的結果顯示，第四天，已經有細胞浸潤(藍紫色)於皮膚創傷處。控制組被移除的皮膚仍有許多空洞，幫助創傷修復的細胞仍未完全進入創部(圖3A，第4天控制組)。移植組已經有許多細胞進入創傷幫助修復，且創傷體積較小(圖3A，第4天移植組)。第八天，控制組的細胞浸潤數量已將創傷部位填滿HE染色呈現藍紫色(圖3A，第8天控制組)。移植組浸潤創傷部位的細胞已經開始釋放細胞外基質，使HE染色紅色部分明顯(圖3A，第8天移植組)。第十四天，創傷已經明顯縮小，且毛囊等組織明顯復原或再生，移植組的創傷後再生的皮膚厚度較接近周邊正常皮膚構造，殘餘創傷兩側的毛囊距離也較控制組為近(圖3A，第14天)。統計結果顯示第四天、第八天以及第十四天癒合過程中，給予HUMSCs治療的創傷剩於體積較控制組小(p<0.05，圖3B)。同時統計分析創傷兩側毛囊間距離，移植組較近(P<0.05，圖3C)，第十四天，移植組的毛囊再生或是創傷收縮的能力較控制組為強。

實例7：HUMSCs對創傷皮膚聚集嗜中性球與巨噬細胞之效果

皮膚創傷癒合的過程中，嗜中性球(neutrophil)會自血管浸潤到創傷部位，MPO用以標識嗜中性球。結果顯示，控制組皮膚組織中，第二天和第四天有MPO反應之細胞(MPO-positive cells)表現極低(圖4A、圖4C)。移植組皮膚組織中，第二天和第四天有MPO反應之細胞表現，從低倍到高倍的染色圖觀察到明顯有增多的趨勢(圖4B、圖4D)。嗜中性球會吸引巨噬細胞的聚集，而巨噬細胞所分泌的細胞激素在皮膚創傷癒合過程中扮演關鍵角色。

ED1用以標識嗜中性球與巨噬細胞。結果顯示，控制組在第二、第四天已有ED1反應之細胞(ED1-positive cells)進入創傷部位(圖5A、圖5C)。移植組在第二、第四天有較多的有ED1反應之細胞浸潤(圖5B、圖5D)。在第十四天時，有ED1反應之細胞分布情形(圖5E、圖5F)，可由兩部分觀察。第一，在皮膚構造已經建構完成的區域，控制組和移植組皆沒有其分部(圖5E1、圖5F1)。第二，在皮膚構造上未建構完成區域仍有有ED1反應之細胞分布於內(圖5E2)，在浸潤現象已減緩的情況下，移植組仍留有較多有ED1反應之細胞在其中(圖5F2)，可持續改善其最後階段的組織再生。

實例8：HUMSCs對創傷皮膚膠原蛋白之建構

以sirius red標定壁層腹膜組織中的膠原蛋白，即紅色區域，用以定量真皮膠原蛋白堆疊建構在創傷皮膚部位的比例。結果顯示，第二天和第四天，控制組和移植組的皮膚組織中，膠原纖維的表現量都跟周圍正常構造皮膚相比都較低，且在生皮膚的膠原纖維與下層筋膜的界線難以分辨，故無法確實判定膠原蛋白堆疊情形(圖6A、B、C、D)。第八天，控制組在創傷部位仍無法累積建構真皮所必須之膠原蛋白(圖6E)。移植組則明顯堆疊許多膠原蛋白(圖6F)。在第十四天時移植組的膠原蛋白在創傷處的分部比例(80.27±5.19)%，明顯高於控制組(33.22±1.18)%，其創傷皮膚組織內的膠原蛋白分部，明顯優於控制組(p<0.05，圖6I)。

實例9：HUMSCs於創傷皮膚之再建構

移植後第二週，以抗人類專一性細胞核抗原(anti-human specific nuclei antigen)標定的人類臍帶間質幹細胞之細胞核，仍然存在於皮膚組織(圖7D、圖7E)。在創傷癒合的過程中，其也具有爬行能力，可移動到皮膚創傷處(圖7B、圖7C)，持續幫助皮膚組織的再建構。顯示HUMSCs對於治療皮膚創傷有極佳之效果。

統計分析

所有數據以Mean±SEM表示。各組之平均值以One-Way ANOVA或Two-Way ANOVA分析，再以LSD test進行多重比較。實驗數據p<0.05判定為具有顯著差異。

熟知技藝之人士將可在不背離本發明精神之下，根據實施例進行改變和修改。要注意的是，本發明並不受限於說明書中實施例所揭露之範圍，而涵蓋於其他根據申請範圍內揭露之所有變化之形式。

前文之所述以及實施方式可藉由附加之圖式達到更好的說明效果。為了加強本發明之說明，將適當的實施例之圖式列舉於此。

圖1係HUMSCs與真皮纖維母細胞共同培養，於時間點0小時、24小時、48小時、72小時觀察其爬行補回缺口的情形，發現與HUMSCs共同培養的大鼠真皮纖維母細胞爬行能力較好(圖1A)，發現在24小時和48小時有顯著差異(p<0.05，圖1B)。

圖2係為HUMSCs處理創傷皮膚之創傷變化情形紀錄，顯示移植組的癒合速度較快(圖2A)，移植組創傷面積的百分比和控制組相比顯著較低(p<0.05，圖2B)。

圖3係為HUMSCs處理創傷皮膚後第4、8及14天控制組及HUMSCs治療組連續切片HE染色的結果(圖3A)，給予HUMSCs治療的創傷剩於體積較控制組小(p<0.05，圖3B)，移植組之創傷兩側毛囊間距離較近(P<0.05，圖3C)。

圖4係為HUMSCs處理創傷皮膚在皮膚創傷癒合的過程中觀察嗜中性球吸引巨噬細胞聚集的結果，控制組皮膚組織第二天和第四天有MPO反應之細胞表現極低(圖4A、圖4C)，而移植組皮膚組織第二天和第四天有MPO反應之細胞表現有增多的趨勢(圖4B、圖4D)。

圖5係為HUMSCs處理創傷皮膚後，ED1用以標識嗜中性球與巨噬細胞之結果，控制組在第二、第四天已有有ED1反應之細胞進入創傷部位(圖5A、圖5C)；移植組在第二、第四天有較多的有ED1反應之細胞浸潤(圖5B、圖5D)；。在第十四天時，有ED1反應之細胞分布情形(圖5E、圖5F)，在皮膚構造已經建構完成的區域，控制組和移植組皆沒有其分部(圖5E1、圖5F1)，而在皮膚構造上未建構完成區域仍有ED1反應之細胞分布於內(圖5E2)；在浸潤現象已減緩的情況下，移植組仍留有較多有ED1反應之細胞在其中(圖5F2)。

圖6係為HUMSCs處理創傷皮膚後，膠原蛋白堆疊情形(圖6A、B、C、D)，第八天控制組在創傷部位仍無法累積建構真皮所必須之膠原蛋白(圖6E)。

圖7係為HUMSCs處理創傷皮膚後與控制組織比較(圖7A)，HUMSCs仍然存在於皮膚組織(圖7D、圖7E)，。在創傷癒合的過程中也具有爬行能力，可移動到皮膚創傷處(圖7B、圖7C)。

Claims (10)

1. 一種用於治療皮膚創傷之醫藥組合物，其包括分離自瓦頓氏凝膠之臍帶間質幹細胞(umbilical mesenchymal stem cells)。
2. 根據申請專利範圍第1項之醫藥組合物，其可促進創傷癒合。
3. 根據申請專利範圍第1或2之醫藥組合物，其中臍帶間質幹細胞為植入皮膚創傷。
4. 根據申請專利範圍第1或2之醫藥組合物，其中臍帶間質幹細胞為置於皮膚創傷周圍。
5. 根據申請專利範圍第1或2之醫藥組合物，其中臍帶間質幹細胞為置於皮膚創傷上。
6. 根據申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其中臍帶間質幹細胞係來自人類。
7. 根據申請專利範圍第1或2項之醫藥組合物，其中該醫藥組合物係置於一敷料上。
8. 一種分離自瓦頓氏凝膠之臍帶間質幹細胞之用途，其係用於製備供治療皮膚創傷之醫藥。
9. 根據申請專利範圍第8項之用途，其中該醫藥可促進創傷癒合。
10. 根據申請專利範圍第8項之用途，其中該臍帶間質幹細胞係來自人類。