TWI391091B - Method for promoting transgenic plants to promote the efficiency of plant bacillus - Google Patents

Description

藉由共轉殖表現促轉基因以增進穠桿菌媒介之植物轉殖效率的方法

本發明係關於一種增進穠桿菌(Agrobacterium)所媒介之植物轉殖技術之效率的方法，係可應用於生命科學的技術領域。

欲將目標基因導入植物細胞以創造基因轉殖植物(transgenic plant)通常可使用穠桿菌媒介轉殖法、基因槍法、電擊原生質體法、微針穿刺法等轉殖技術，其中以穠桿菌媒介轉殖法最為便宜，操作簡易，且可使目標基因單一而完整的插入染色體，較少發生多次重複插入的現象，相對不易引發基因靜默(gene silencing)反應，因此被廣泛使用。

穠桿菌轉殖技術自被發明以來，已有種種衍生策略嘗試提升其轉殖植物的效率，在穠桿菌菌株本身遺傳性狀或培養方式的改良上包括(1)篩選天然強毒性(virulent)菌株(Jin et al.,1987)；(2)篩選人造突變產生強毒性的菌株(Paxour et al.,1992)；(3)人為設計突變染色體之定點位置創造強毒性的菌株(van der Fits,2000)；(4)改變菌體的培養或誘導方式，提昇其毒性(Hiei,et al.,1994)；上述(1)~(4)項目所稱之強毒性指穠桿菌感染植物使之產生腫瘤的能力(tumorigenesis)，亦代表穠桿菌移轉其T-DNA至植物基因組的效率；(5)改造穠桿菌使之具有營養需求的依賴性，以便在感染植物組織時控制穠桿菌之數量，避免搶走植物之生長資源而使致死(U.S. Pat. No. 6,323,396)；(6)與(5)目的相似，但以重金屬或抗生素控制穠桿菌之生長(WO 01/09302A2)。

而在植物方面，亦有種種增進轉殖效率的方法，主要分為兩大類型，分別針對(一)植物的培養方式，或(二)植物本身之遺傳性狀進行改良：

(一)植物培養方式的改良，亦即調整植物組織培養的步驟或其組成份，包括(1)以熱溫處理培植體(explant)，使植物參與氧化反應產生酚類物質(phenolic compound)的酵素失活；(2)調配“necrosis-inhibiting medium”，例如加入乙烯生成抑制劑、還原劑(reducing agent)、金屬螯合劑(metal chelator)、降低培養基之酸鹼值等，以緩解穠桿菌所誘發的植物過敏性褐化死亡(necrosis)反應；(3)降低培養基之溼度，減少培植體的重量，以加速T-DNA之傳送，並使培植體容易以體胚發育(embryogenesis)的方式再生成植株，減少嵌合體植物(chimeric plant)的現象(U.S. Pub. No. 20010054186A1)；(4)以超音波(sonication)震盪處理培植體，使穠桿菌較易進入植物細胞而轉殖之(U.S. Pat. No. 5,693,512)。

該些方法雖然極為多元，惟其效果常因不同種植物而差異極大，甚至同一植物物種但栽培品系不同即效果迴異，並無統一且有效的標準作法，更無法以邏輯推測預判是否有效，每種植物、甚至每個植物品種均須經過繁瑣耗時的測試，方能建立、或部分建立其轉殖操作流程，嚴重阻礙將有用基因導入植物的轉殖工作。

近年來，有大量文獻報告探討發現T-DNA傳送至植物細胞後，仍需要許多種穠桿菌或植物輔助性蛋白(accessory protein)參與，T-DNA方能成功傳送至終點、插入染色體並形成轉殖基因，此些輔助性蛋白包括有：提供穠桿菌附著之植物受體蛋白BTI1、BTI2、BTI3、AtRAB8、vitonectin、CSLA9、rhicadhesin receptor等；T-DNA進入細胞後與之結合形成T-complex的VirE2蛋白；幫助T-complex自細胞膜沿著microtubule構造移向細胞核的動力蛋白dynein-like protein DLC3等；與帶有入核訊號之VirD2結合之chaperon蛋白cyclophilins Rocl~5等；使VirD2蛋白活化入核之激酶(kinase)CAK2Ms或不活化之phosphotase DIG3等；與VirD2蛋白入核訊號結合之importin/karyopherin α蛋白AtKAPα等；與VirE2及importin α蛋白結合並導引其穿過核孔(nuclear pore complex)進入細胞核中之VirE2-interacting protein VIP1、VirE3等；在植物細胞核中，則包括可與染色體逢機斷裂處結合之Ku80，脫除T-complex蛋白外套的VirF等(參考回顧文獻McCullen et al.,2006;Citovsky et al.,2007)。

(二)植物本身之遺傳性狀的改良，如同前文所述，由於習知T-DNA傳送過程需要多種穠桿菌或植物輔助性蛋白參與，倘若其中某些輔助性蛋白的含量不足，則勢必影響T-DNA的傳送效率，相反的，大量表達某些輔助性蛋白時，則應可增進T-DNA的傳送效率，此觀點已有不少文獻報導，將參與T-DNA傳送過程的特定基因導入植物，產生T1轉殖株以提高或降低特定蛋白的表現量，結果發現T1轉殖株再度被穠桿菌T-DNA轉殖(或產生腫瘤)的效率亦伴隨其上升或下降，成功的例子包括有：(1)阿拉伯芥之BTI基因，其蛋白可與穠桿菌之T纖毛(T-pilus)作用，以提高T-DNA進入植物細胞的機率(Hwangand Gelvin,2004)；(2)阿拉伯芥之VIP1基因，其蛋白可辨識T複合體(T-complex)上的VirE2蛋白而導引其進入細胞核，進而與核小體(nucleosome)蛋白作用而幫助T-DNA插入染色體(Tzfira et al.,2002)；(3)穠桿菌之VirE3基因，其蛋白功能與VIP1相似(Lacroix et al.,2005)；(4)阿拉伯芥之Ku80基因，其蛋白可與染色體之斷裂位置結合並使之穩定存在，進而增加目標基因插入染色體的機率(Li et al.,2005)；(5)阿拉伯芥之H2A基因，其蛋白本身為組蛋白(histone protein)之一員，可鬆開染色體之結構，增加目標基因插入染色體的機率(Yi et al.,2002)。

然而上述報告之實施必須先建立T1轉殖株，使轉殖株大量表現輔助性蛋白後，方轉入目標基因(target gene)，作法上極為費時，大幅增加基轉植物的不確定性及困難性，且許多植物本身極難產生初步的T1轉殖株，故此策略多僅能用於學術研究，難以具有實際應用的價值。

現今植物種類中，能夠依循簡易操作步驟而穩定獲得轉殖株者仍屬少數，事實上，包括許多主要糧食作物目前仍舊難以進行轉殖(recalcitrant plant)，即便能夠轉殖，亦經常局限於特定品種，包括秈稻(Indica rice)、大豆、玉米(除Hi-II之外的品系)等許多栽培品系其轉殖效率仍極低落，需耗費大量的人力、物力、與時間方能獲得轉殖株，甚至只有少數實驗室可成功執行，可見不論是學術研究或是生物技術開發研究，如何提高植物轉殖效率仍舊是極為迫切的課題。

鑑於上述事實，本發明擬在植物細胞中暫時性大量表達參與T-DNA傳送過程的輔助性蛋白，以提昇穠桿菌媒介之植物轉殖效率，但與先前技術不同之處，在於本發明使用共同轉殖策略(co-transformation)，將雙T-DNA同時送入植物細胞，其中一個T-DNA可短暫大量表現輔助T-DNA傳送的蛋白，以提高另一個帶有目標基因的T-DNA於該植物細胞內被傳送、入核、或插入染色體之機率，最終提高轉殖植物的成功率。本發明尤其強調在執行轉殖的當代(如：T0世代)即有提升轉殖效率的效果；輔助T-DNA傳送的基因於本發明中稱之為促轉基因(enhance transformation gene，簡稱ETgene)。。

本案發明人鑑於植物轉殖技術於產業上的重要性，乃亟思加以改良創新，並經多年研究測試，終於成功研發完成本件藉由共轉殖表現促轉蛋白以增進穠桿菌媒介之植物轉殖效率的方法的發明。

本發明之目的即在於提供一種快速提昇穠桿菌所媒介植物轉殖效率的方法，特別係指於轉殖操作之當代細胞或組織(如：T0世代)，即可提昇T-DNA區域內之基因的轉殖效率。

本發明之次一目的係在於提供一種操作極為簡易的共轉殖方式(co-transformation)，將兩種穠桿菌液混合，共同感染植物細胞或組織，即可達成提昇轉殖效率的效果。

本發明之另一目的係在於提供促轉基因的篩選與鑑定方式。

本發明之再一目的係在於提供促進轉殖效率的促轉基因之選擇。

本發明之主要特徵在於：促轉基因在細胞內被轉譯為促轉蛋白後，促轉蛋白可提高T-DNA區域內之基因於植物細胞中的傳送效率，於進行植物轉殖之當代細胞或組織即提昇T-DNA區域內之基因的轉殖效率，該轉殖效率係包括暫時性轉殖(指T-DNA區域內之基因進入細胞核中，產生轉錄作用表現蛋白，但不一定插入染色體)及永久性轉殖(指T-DNA區域內之基因插入染色體)作用。

可達成上述發明目的之藉由共轉殖表現促轉基因以增進穠桿菌媒介之植物轉殖效率的方法，係包含下列步驟：步驟一：將至少一促轉基因構築於載體上，以形成促轉基因重組質體，其中該載體至少包含一T-DNA區域，且該促轉基因係構築於載體之T-DNA區域內；將促轉基因重組質體送入穠桿菌中，以取得帶有促轉基因重組質體之轉型後穠桿菌；步驟二：將至少一目標基因構築於載體上，以形成目標基因重組質體，其中該載體至少包含一T-DNA區域，且該目標基因係構築於載體之T-DNA區域內；將目標基因重組質體送入穠桿菌中，以取得帶有目標基因重組質體之轉型後穠桿菌；步驟三：將步驟一及步驟二所得兩種穠桿菌混合後，與植物細胞或組織共同培養，以進行穠桿菌所媒介之轉殖作用，使促轉基因與目標基因共同存在於同一植物細胞或組織中，當促轉基因於轉殖當代之植物細胞或組織表現其mRNA及其蛋白質，該促轉蛋白質即可促進其他T-DNA區域內之目標基因被傳送進入植物細胞或組織中，促使T-DNA區域內之目標基因被傳送入細胞核產生暫時性轉錄作用及轉譯作用(即暫時性轉殖)的機率增加，或T-DNA區域內之目標基因被插入染色體(即永久性轉殖)的機率增加，上述之轉殖效率的增加均相較於僅轉殖空載體之植物細胞或組織(即未轉殖促轉基因之植物細胞或組織)而言。

其中步驟一所述之促轉基因於本發明中係包括但不限於：T-DNA自接觸植物細胞表面、穿過胞膜進入植物細胞中、沿著微管(microtubule)移向細胞核、穿過核孔(nuclear pore complex)進入細胞核中、靠近染色體、至插入染色體，一連串過程中所需之各種穠桿菌或是植物蛋白之基因。

其中步驟三所述之共轉殖(co-transformation)的操作上至少包含另外三種可行之方式，分述如下：(1)將促轉基因與目標基因置於同一載體的同一個T-DNA區域內，形成一個重組質體，操作上可如Lin(2003)所描述之作法，其理論上所有位於同一個T-DNA之內的基因有100%的機率被送入同一植物細胞中。然而採此方式必需克服構築大型質體的技術障礙，或是僅能使用特殊設計的載體；(2)將促轉基因與目標基因置於同一載體的兩個T-DNA區域內，形成一個重組質體，操作上可如Komari(1996)或McCormac(2001)所描述之作法，其報告已証實兩個T-DNA送入同一植物細胞的機率分別高達47%與100%。惟其技術上之困難與方式(1)相似；(3)將促轉基因與目標基因置於兩載體的兩個T-DNA上，以形成兩種重組質體，兩種重組質體係送入同一穠桿菌中，操作上可如Sripriya(2008)所描述之作法，其報告已証實兩個T-DNA送入同一植物細胞的機率高於20%。惟此做法之載體種類略有限制，兩種重組質體於穠桿菌中的篩選標誌需相異。

本發明所使用之方式係為一最簡易之執行方式，優點為免除繁瑣的質體構築與菌種篩選程序，亦即(4)將促轉基因與目標基因置於兩載體的兩個T-DNA區域內，以形成兩種重組質體，兩載體係送入兩穠桿菌中，僅須混合菌液即可共感染植物細胞或組織(共轉殖)，Komari(1996)曾測試此方式證實可行，惟兩個T-DNA送入同一植物細胞的機率相當低。本發明之實施例係採用(4)之方式進行，理論上可將促轉基因與目標基因同時傳送至同一個植物細胞的機率最低，然而所有實施例均證實本發明之策略有效，統計分析結果均呈現顯著差異，因此可以合理預期，倘若採用(1)~(3)之執行方式進行共轉殖，促轉基因應有更高的機率輔助目標基因之傳送，效果應更加明顯。引此，本發明共轉殖之操作係包含但不限於上述(1)至(4)之操作方式，惟適用本發明之構築、共轉殖方式亦應包含於本發明之可實施範圍。

其中步驟一與步驟二之載體包括但不限於：pBI121、pBIN19(ClonTech)、pPZP series、pCAMBIA series、pGREEN(GenBank Accession No:AJ007829)、pGREEN II(GenBank Accession No:EF590266)(www.pGreen.ac.uk)、pGreen0029(John Innes Centre)、pHP10525、BIBAC system。

其中步驟一與步驟二之穠桿菌菌株(Agrobacterium tumefaciens )常用且易於取得者包含但不限於：GV3101、GV3850、ABI、C58、C58C1、LBA4404、A281、A348、AGL1、EHA101或EHA105。

本發明之方法可施用之植物種類係不受限制，包含單子葉植物或雙子葉植物。其中單子葉植物包含但不限於玉米(maize)、小麥(wheat)、水稻(rice)、蘭花(orchid)，較佳者為水稻；其中雙子葉植物包含但不限於蕃茄(tomato)、煙草(tobacco)、棉花(cotton)、芸苔(oilseedrape)、大豆(soybean)、阿拉伯芥(Arabidopsis)。

術語“重組質體”意指藉由基因重組技術將外源基因構築於載體上；而於本發明特別係指藉由基因重組技術將基因構築於載體之T-DNA區域內得者稱之。

術語“T-DNA”係指轉移DNA(Transferred DNA，T-DNA)。T-DNA係為穠桿腫瘤菌之Ti質體(Ti plasmid)上一段會轉移之DNA，當穠桿菌感染植物細胞或組織，該T-DNA會傳送至植物細胞、進入細胞核內，並嵌入(插入)植物細胞之染色體中。該T-DNA區域之兩端，分別為左邊緣DNA(left border，LB)、及右邊緣DNA(right border，RB)，任何一段目標基因置於T-DNA區域內皆有機會被嵌入(插入)植物染色體中，以形成一轉殖植物。

術語“共轉殖”係指將至少一穠桿菌與植物細胞或組織共同培養，以利穠桿菌感染植物細胞或組織，藉此將穠桿菌之T-DNA區域內之基因，傳送進入植物細胞、傳送進入細胞核，進而嵌入(插入)植物之染色體中；於本發明之實施例係以兩株轉型後穠桿菌(其中之一穠桿菌包含促轉基因重組質體、另外一穠桿菌包含目標基因重組質體)，與植物細胞或組織共同培養，以進行共轉殖。

術語“植物細胞或組織”係包含但不限於植物細胞群、毛狀根(hairy root)、癒傷組織(callus)、植物培植體(explant)或其他適用穠桿菌進行轉殖者。

術語“暫時性轉殖(transient transformation)”係指藉由轉殖技術，將目標基因轉殖入植物細胞或組織後(轉殖當代，如T0世代)，該目標基因係被傳送進入細胞核，僅於植物細胞之轉殖當代表現該目標基因，則稱為暫時性轉殖。

術語“永久性轉殖(permanent transformation)”係指藉由轉殖技術，將目標基因轉殖入植物細胞或組織後(轉殖當代，如T0世代)，該目標基因被傳送進入細胞核、或嵌入(插入)植物之染色體中，且其子代(轉殖次代)之染色體皆具有該目標基因，則稱為永久性轉殖。

術語“轉殖當代”係指一植物細胞、組織或適用之轉殖對象，於本發明中以穠桿菌進行初次感染轉殖者，即稱做轉殖當代，如T0世代、或其他適用轉殖對象進行初次感染轉殖者。而T0世代經過有性生殖產生之下一世代則稱為轉殖次代，如T1世代、T2世代等適用之名詞。

術語“轉殖效率的增加”在本發明係指於植物細胞中表現促轉基因，當該促轉基因於細胞核內被轉錄成mRNA，進而轉譯成蛋白質(促轉蛋白)，該促轉蛋白可增加其他T-DNA區域內之基因(目標基因)被傳送進入植物細胞之機會(機率)、增加T-DNA區域內之基因被傳送入細胞核產生暫時性轉錄作用及轉譯作用(即暫時性轉殖)之機會(機率)、或增加T-DNA區域內之基因被插入植物染色體之機會(機率)(即永久性轉殖)，依上述於本發明中統稱轉殖效率的增加；其中傳送進入植物細胞係指T-DNA區域內之基因從穠桿菌傳送進入植物細胞之過程、其中被傳送入細胞核係指T-DNA區域內之基因進入細胞核之過程。

術語“目標基因”係包含但不限於各種所欲之核酸(基因)、抗性基因(如：hygromycin抗性基因)、報導基因、或欲於植物中表現其mRNA、或其蛋白質之基因等。

術語“報導基因”係包含但不限於GUS報導基因、GFP螢光蛋白基因等。

術語“基因表現”意旨mRNA或蛋白質之表現。

本發明亦提供增進穠桿菌媒介之植物轉殖效率的促轉組成物，係包含至少一促轉基因、一載體及藥學上可接受的載劑，且該促轉基因係構築於載體之T-DNA區域內；其中該促轉基因係選自下列基因：ET4(具有SEQ ID No:11之核苷酸序列)、ET6(具有SEQ ID No:10之核苷酸序列)、ET7(具有SEQ ID No:9之核苷酸序列)、ET9(具有SEQ ID No:12之核苷酸序列)所組成群組中至少一員。

其中該載劑可為水、或各類適用之緩衝液，可使該促轉基因或其載體易於操作、易於保存及較為穩定不易降解。

上述之核苷酸序列，亦包含但不限於將SEQ ID No:9-12 所記載之序列，經突變(mutation)、刪除(deletion)、插入(insertion)、或取代(replacement)1至複數個核苷酸，且仍具有促進轉殖效率活性者。

本發明之實施方式中所使用之材料及方法闡明如下，然所用之材料或方法非用以侷限本發明之實施方式、或申請專利範圍之實施：

材料與方法 植物細胞或組織(又稱為培植體，explant) ：

本發明所使用的植物培植體為水稻癒傷組織(水稻品種為台農67號)。係採用Toki(1997)所述之方法。簡述如下，將水稻未成熟胚消毒後培養於誘導癒傷組織生成之N6D培養基，放置於30℃、全光照的環境下培養14天。將生成之癒傷組織切割成約2mm大小，放置於誘導癒傷組織生成之培養基，以30℃、全光照的環境培養2天，即可作為培植體(explant)進行轉殖。

促轉基因（Enhance Transformation gene,ET gene) ：

本發明中除ET6促轉基因係參考Lacroix(2005)文獻資訊，選殖自穠桿菌之外，ET4、ET7與ET9促轉基因係來自水稻，由於水稻基因組已被完整解序並且可被公開查詢，故可根據文獻中其它種植物的資訊，選出可能參與T-DNA傳送的輔助性蛋白基因，查詢資料庫獲知水稻基因組的完整序列資訊(http://rice.plantbiology.msu.eduLocusNameSearch.shtml )，並據以設計引子。正向引子(forward primer)係參考促轉基因之基因體序列(genomic sequence)設計，該正向引子位於基因之5'-UTR區域；反向引子(reverse primer)係參考促轉基因之編碼序列(CDS sequence)設計，該反向引子位於基因轉譯終點，進行實際操作時係以水稻葉片之cDNA為模板(template)，使用聚合酵素鏈鎖反應(PCR)獲得基因片段，選殖該基因片段構築於p35ST載體上。本發明所使用的促轉基因之GenBank登錄編號(GenBank accession number)或水稻基因座名稱(locus name)、被預測之蛋白特性、所用的引子及引入之限制酵素切位如表一所示，其中ET6、ET7、ET9基因片段係使用BamHI與XbaI酵素截切，截切後正向嵌入p35ST載體之BamHI與XbaI酵素切位；ET4基因係使用BamHI與SmaI酵素截切，截切後正向嵌入p35ST載體之BamHI與StuI酵素切位(SmaI與StuI酵素切位均為平口，產物可互相接合)。

表一本發明所用之ET基因的序列編號(SEQ ID No)，引子對序列與選殖所用限制酵素之切位

註：

1. ET4可預測之蛋白活性：Ku80，雙股T-DNA結合蛋白(ds T-DNA binding protein)；ET4之水稻基因座名稱(locus name)：LOC_Os03g63920；正向引子位置：於ATG上游35個核苷酸(nt)處。

2. ET6可預測之蛋白活性：VirE3，為VirE2及karyopherinα之銜接蛋白(adapter)；ET6之GenBank登錄編號(GenBank accession no.)：AF242881；正向引子位置：含跨ATG位置。

3. ET7可預測之蛋白活性：BTI，與VirB2交互作用之蛋白(VirB2-interacting protein)；ET7之水稻基因座名稱(locus name)：LOC_Os01g53520；正向引子位置：於ATG上游64個核苷酸(nt)處。

4. ET9可預測之蛋白活性：VIP1，與T-DNA入核(nuclear-import)有關；ET9之水稻基因座名稱(locus name)：LOC_Os09g34060；正向引子位置：於ATG上游72個核苷酸(nt)處。

5.水稻基因座名稱(rice locus name)係參考下列網址之序列資訊：http://rice.plantbiology.msu.edu/LocusNameSearch.shtml。6. GenBank accession no.係參考網址http://ncbi.nlm.nih.gov/之序列資訊。

促轉基因載體p35ST ：

p35ST表現載體之構築方式如下，將涵蓋"35SC4PPDK啟動子-SGFP蛋白基因-NosT停止子"的DNA片段以兩端限制酵素XhoI與EcoRI自HBT-SGFP(S65T)-NOS質體切下(Chiu et al.,1996，GenBank accession no. EF090408)，插入pCAMBIA1300載體(http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)之SalI與EcoRI限制酵素位置(SalI與XhoI酵素乃產生相同的接合序列)，隨後再以人工合成"BamHI-XbaI-StuI-KpnI-BglII-NotI"adaptor DNA取代_s GFP基因區塊，成為p35ST質體的multiple cloning site(MCS)，如圖一所示，其中左邊緣DNA(Left border，LB)與右邊緣DNA(Right border，RB)係用以界定T-DNA之邊界，位在LB及RB中間之基因片段(即T-DNA區域內之基因片段)可被穠桿菌傳送入植物細胞並嵌入(插入)植物細胞之染色體中；其中35SC4PPDK與2X35SP均為啟動子(promoter)，可啟動下游蛋白表現；其中NosT與35S polyA均為停止子(terminator)，可停止基因之轉錄作用；其中hyg^r 即代表hygromycin抗性基因，可提供轉殖後的培植體生長於含有hygromycin的培養基上。

空載體 ：

使用pCAMBIA1300空載體做為無促轉基因的對照組，其T-DNA上僅帶有hygromycin抗性基因。

目標基因載體 ：

本發明係以GUS報導基因作為目標基因，以方便偵測，GUS報導基因全名為GUSPlus報導基因，與hygromycin抗性基因均位於pCAMBIA1305.1載體(http://www.cambia.org/daisy/cambia/home.html)的T-DNA區域內，被傳送入植物細胞後，GUS報導基因可被轉譯產生β-glucuronidase(簡稱GUS酵素)，可催化4-methylumbelliferyl glucuronide(簡稱MUG)受質，產生螢光產物4-methylumbelliferone(簡稱4-MU)。

穠桿菌菌株 ：

係使用EHA105菌株(Hellens et al.,2000)，將前述三種載體分別以轉型(transformation)作用送入菌株中。

永久性基因轉殖效率之分析 ：

依照Toki(1997)所述之方法，製備穠桿菌菌液，首先將帶有促轉基因之菌株，置於AB培養液中，於28℃培養箱生長至O.D.600約為0.4，之後加入8.3ml 20% glucose及13.2μl 250mM acetosyringone繼續培養4小時。將培養好之菌液以6000g離心10分鐘，倒去上清液，以4ml AAM、1ml 20% glucose及2μl 250mM acetosyringone混合之溶液回溶後，感染水稻培植體，並紀錄所用培植體數目，每次感染使用約100個培植體。再依照Toki(1997)所述之方法，培養並篩選水稻永久性轉殖植株，亦即感染後將培植體放入2N6-AS培養基中，以22℃黑暗培養3天，之後以AA2溶液(AAM加上2ppm 2,4-D,pH5.7)進行洗滌洗除穠桿菌，將洗過的培植體放置於含有500ppm cetaxima之N6D medium，以全光照30℃培養四天，之後，將培植體移至RS-CH再生培養基(MS salts,vitamins,30g/L sucrose,30g/L sorbitol,2g/L casamino acids,2mg/L kinetin,0.02mg/L NAA,50mg/L hygromycin,4g/L gelrite,pH 5.7)進行再生，約二星期更換一次，直至產生再生小苗的綠點。感染70天後，計數可再生小苗之培植體數/原培植體數x100%，作為轉殖效率(transformation frequency)。每次實驗均以空載體等量並同步進行實驗，作為控制對照組。

暫時性基因轉殖效率之分析 ：

依照永久性基因轉殖效率之分析所敘述分別培養並製備帶有促轉基因或目標基因之穠桿菌菌液，之後以等比例混合兩菌液，並與培植體共培養，每次感染使用約60個培植體，感染後將培植體放入2N6-AS培養基中，以22。C黑暗培養3天，之後以AA2溶液進行洗滌，清除多餘穠桿菌，將洗滌過的培植體置於N6D培養基，以全光照30℃培養3天，共計感染6天即收集樣品。隨機取30個培植體，分別放入微量離心管中，以液態氮急速冷凍，之後萃取植物蛋白並分析蛋白濃度與GUS酵素活性。計算時以蛋白含量為分母，GUS酵素活性為分子，獲得GUS酵素之比活性(specific activity)。由於GUS報導基因係為本發明實施例所採用之目標基因，倘若目標基因之傳送效率可受到促轉蛋白所提升，則與促轉基因共轉殖之GUS酵素活性應高於與空載體共轉殖者。

植物蛋白之萃取與定量 ：

以Tissuelyser(Qiagen Co.)與4mm鋼珠分別研磨每一個2mm大小的培植體樣品，磨碎後加入0.1ml預冷的萃取液(50mM Na₂ HPO₄ ,pH7.0,10mM EDTA,0.1% Sarcosyl,0.1% Triton X-100)回溶，以13000rpm於4°C離心15分鐘後，取上清液為總蛋白萃取液，使用BCA Protein Assay Kit(Pierce Chemical Company,Rockford,Illinois.)依循指示步驟分析蛋白濃度。

GUS酵素活性之定量分析 ：

依照Gallagher(1992)所述之方法，依序加入20μl 5mM MUG溶液，50μl緩衝溶液(50mM Na₂ HPO₄ ，pH 7.0;10mM EDTA；0.1% sarcosyl；0.1% Triton-X100；5% glycerol)，與30μl之總蛋白萃取液，共計100μl，混合均勻後置於37°C培養，於15及45分鐘時間點以365nm激發光與455nm放射光測得螢光量。計算螢光增加量/(樣品濃度x樣品體積x反應時間)為GUS酵素活性，單位為pmole/mg protein/min。

螢光偵測 ：

以Infinite F200(Tecan Group Ltd.)進行。

統計分析 ：

所得數據均以SPSS軟體(Statistics Package for Social Science)之「T檢定」程式分析，以比較兩群體之間平均數的差異是否顯著。

有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之較佳實施例的詳細說明中將清楚陳明，但本發明不受下述實施例所限制。

實施例一以ET7為促轉基因增進T-DNA之傳送效率

ET7促轉蛋白相似於阿拉伯芥之BTI蛋白，阿拉伯芥之BTI蛋白位在細胞周緣，可與穠桿菌T pilus的主成份VirB2產生交互作用，文獻曾報導大量表達BTI的阿拉伯芥T1轉殖植物對於穠桿菌的感受性增加(Hwang and Gelvin,2004)，因此為本發明採用測試。

在共計三次的轉殖分析實驗中，每次各使用至少100個的水稻培植體轉殖ET7促轉基因(具有SEQ ID No:9 之核苷酸)，並同步進行空載體轉殖作為控制組，轉殖70天後，計算轉殖效率，結果如圖二A所示，三次實驗結果顯示ET7促轉基因之轉殖效率均高於控制組，以t-test檢驗確實具有顯著差異(圖二B，p=0.017)，平均轉殖率由轉殖空載體的6.1±1.6%提升為轉殖ET7促轉基因的18.6±3.2%，效果約為3倍，顯示選自水稻的ET7促轉基因確實可提高T-DNA區域內之目標基因插入染色體的機率，且在轉殖當代(如：T0世代)即具有效果。

再者，為測試ET7促轉基因可否輔助目標基因的傳送，將分別帶有ET7與GUS報導基因的穠桿菌菌液以等比例混合，共同感染水稻培植體，並同步進行控制組實驗，控制組中僅以空載體取代ET7促轉基因，其他條件完全相同，六天後測量水稻培植體GUS活性。由於帶有GUS之T-DNA被傳送入核後，可被轉錄產生mRNA，mRNA被轉譯出蛋白，而產生酵素活性，酵素活性愈高者代表T-DNA的傳送效率愈佳。兩組實驗各檢查26~30個培植體之GUS酵素比活性(specific activity)，結果如圖三A所示，與ET7促轉基因共轉殖之培植體GUS酵素活性大多高於與空載體共轉殖者，t-test檢驗顯示具有明顯差異，且三次重複試驗均如此(p=0.005；0.017；0.046)。本實施例顯示將ET7促轉基因與目標基因共同轉殖時，可提高T-DNA區域內之目標基因的傳送效率，因而提高目標基因的轉錄與蛋白表現量，使GUS酵素比活性由1.9±0.4unit提高為2.9±0.6unit(圖三B，p=0.048)，提高為1.5倍。

實施例二以ET6為促轉基因增進T-DNA之傳送效率

ET6促轉蛋白即穠桿菌之VirE3，自然狀態下，VirE3可利用T pilus為通道，自穠桿菌傳送進入植物細胞，並可進入細胞核中，研究報告指出VirE3可能擔任類似VIP1的角色，作為VirE2與karyopherin α蛋白間的橋樑，具有引領T-complex進入植物細胞核的角色(Lacroix et al.,2005)’由於VirE3並非來自水稻，而屬於細菌蛋白，故可用以測試本發明之方法是否適用非植物本身的促轉蛋白。

如同實施例一之方法操作，觀察結果如圖四A所示，四次實驗結果顯示ET6促轉基因(具有SEQ ID No:10 之核苷酸)之轉殖效率均高於空載體(控制組)，具有顯著差異(圖四B，p=0.04)，平均轉殖率由轉殖空載體的9.5±0.3%提升為轉殖ET6促轉基因的17.3±2.2%，效果約為1.8倍，顯示選自穠桿菌的ET6促轉基因確實可提高T-DNA插入染色體的機率，且在轉殖當代(如：TO世代)即具有效果。

再者，為測試ET6基因可否輔助目標基因的傳送，如同實施例一之方法操作，結果如圖五所示，與ET6基因共轉殖之培植體GUS酵素活性大多高於與空載體共轉殖者，t-test檢驗顯示具有明顯差異，且兩次重複試驗均如此(p=0.09；<0.001)。本實施例顯示將ET6促轉基因與目標基因共同轉殖時，可提高T-DNA區域內之目標基因的傳送效率，因而提高目標基因的轉錄與蛋白表現量，造成GUS的酵素活性高於未轉殖促轉基因者。

實施例三以ET4為促轉基因增進T-DNA之傳送效率

ET4促轉蛋白相似於阿拉伯芥之Ku80蛋白，Ku80為一核蛋白，可作為雙股T-DNA與雙股染色體斷點之間的媒介，使兩者交互產生連結反應，故可提升T- DNA插入染色體產生轉殖株的頻率(Lietal.,2005)，Ku80為一核蛋白，可用以測試植物之核蛋白是否適用於本發明之方法。

為測試ET4基因可否輔助目標基因的傳送，如同實施例一之方法操作，結果如圖六A所示，與ET4基因(具有SEQ ID No:11 之核苷酸)共轉殖之培植體GUS酵素活性大多高於與空載體共轉殖者，t-test檢驗顯示具有明顯差異，且三次重複試驗均然(p=0.01；0.008；<0.001)。本實施例顯示將ET4促轉基因與目標基因共同轉殖時，可提高T-DNA區域內之目標基因的傳送效率，因而提高目標基因的轉錄與蛋白表現量，使GUS酵素比活性由1.9±0.4unit提高為2.8±0.4unit(圖六B，p=0.003)，效果約為1.5倍。

實施例四以ET9為促轉基因增進T-DNA之傳送效率

ET9促轉蛋白相似於阿拉伯芥之VIP1蛋白，VIP1蛋白於T-DNA之傳送過程扮演多重角色，不論在細胞質或是細胞核內均具重要功能，可能是T-DNA傳送途徑的限制因子之一，部分功能並與VirE3(ET6)的角色重疊，故本實施例可用以重複印証實施例二的結果。

為測試ET9基因可否藉由本發明所提供之方法以輔助目標基因的傳送，如同實施例一之方法操作，結果如圖七所示，與ET9基因(具有SEQ ID No:12 之核苷酸)共轉殖之培植體GUS酵素活性大多高於與空載體共轉殖者，t-test檢驗顯示具有明顯差異，且三次重複試驗均然(p=0.031；<0.001；0.005)。本實施例顯示將ET9促轉基因與目標基因共同轉殖時，可提高T-DNA區域內之目標基因的傳送效率，因而提高目標基因的轉錄與蛋白表現量，造成GUS的酵素活性高於未轉殖促轉基因者。。

綜上所述，包括來自細菌或植物的基因，不論位在細胞核外或是核內，均可利用本發明之方法增進T-DNA區域內之基因的傳送效率，使T-DNA區域內之基因被傳送進入細胞、運送入細胞核或是插入染色體的機率增高。本發明之方法可改造植物之性狀，但與習知方式不同的是，本發明不需事先製成特定的轉殖株，可直接在轉殖目標基因的轉殖當代操作(如：TO世代)。

再者，本發明之方法操作方式十分簡易，不需要將促轉基因與目標基因構築在同一個T-DNA中或同一個載體上，不僅簡化繁瑣的質體構築動作，縮短實驗時間，且避免T-DNA過長反而減損其被傳送效率的可能性；本發明之方法亦不需要將分別帶有促轉基因與目標基因的兩個載體置入同一株穠桿菌中，操作更形簡易，且避免兩種T-DNA在同一菌體中組裝會彼此競爭組裝資源的可能性。本發明之方法僅須將分別帶有促轉基因與目標基因的載體的穠桿菌混合共同感染植物(co-transformation)，即可產生效果。

上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案不但在提高穠桿菌媒介之轉殖效率之方法上確屬創新，並藉此技藝可更易取得轉殖基因植物，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明，至感德便。

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請參閱以下有關本發明較佳實施例之詳細說明及其附圖，將可進一步瞭解本發明之技術內容及其目的功效；有關該實施例之附圖為：

圖一係為p35ST植物載體，用以驅動促轉基因蛋白表現。35SC4PPDK係轉錄啟動子，NosT係轉錄停止子，2X35SP-hygr-35S polyA則為hygromycin抗性基因卡匣。

圖二A係為三次獨立實驗均顯示ET7促轉基因產生轉殖株之效率高於空載體之控制組；圖二B係將圖二A之結果以SPSS軟體「成對樣本T檢定」程式分析，評估確認具有顯著性差異(P=0.017)，ET7促轉基因產生轉殖株的平均效率約為空載體之3倍。

圖三A係為三次獨立實驗結果均顯示與ET7共轉殖之GUS報導基因表現量高於與空載體共轉殖者，分別以SPSS軟體之「獨立樣品T檢定」程式分析，結果均具顯著性差異(P=0.005；0.017；0.046)；圖三B係將圖三A三次獨立實驗之結果以SPSS軟體「成對樣本T檢定」程式分析，評估確認具有顯著性差異(P=0.048)，共轉殖ET7促轉基因可提升GUS報導基因表現量約為空載體之1.5倍。

圖四A係為四次獨立實驗均顯示ET6促轉基因產生轉殖株之效率高於空載體之控制組；圖四B係將圖四A之結果以SPSS軟體「成對樣本T檢定」程式分析，評估確認具有顯著性差異(P=0.04)，ET6促轉基因產生轉殖株的平均效率約為空載體之1.8倍。

圖五係為兩次獨立實驗結果均顯示與ET6共轉殖之GUS報導基因表現量高於與空載體共轉殖者，分別以SPSS軟體之「獨立樣品T檢定」程式分析，結果均具顯著性差異(p=0.09；<0.001)。

圖六A係為三次獨立實驗結果均顯示與ET4共轉殖之GUS報導基因表現量高於與空載體共轉殖者，分別以SPSS軟體之「獨立樣品T檢定」程式分析，結果均具顯著性差異(p=0.01；0.008；<0.001)；圖六B係將圖六A三次獨立實驗之結果以SPSS軟體「成對樣本T檢定」程式分析，評估確認具有顯著性差異(p=0.003)，共轉殖ET4促轉基因可提升GUS報導基因表現量約為空載體之1.5倍。

圖七係為三次獨立實驗結果均顯示與ET9共轉殖之GUS報導基因表現量高於與空載體共轉殖者，分別以SPSS軟體之「獨立樣品T檢定」程式分析，結果均具顯著性差異(p=0.031；<0.001；0.005)。

Claims (5)

1. 一種藉由共轉殖表現促轉基因以增進穠桿菌媒介之水稻植物轉殖效率的方法，包含下列步驟：步驟一：將至少一種促轉基因之核苷酸構築於載體上，以形成促轉基因重組質體，其中該載體至少包含一T-DNA區域，且該促轉基因係構築於載體之T-DNA區域內；將促轉基因重組質體送入穠桿菌中，以取得帶有促轉基因重組質體之穠桿菌，其中該促轉基因係選自下列所組成之群組：ET6(具有SEQ ID No：10之核苷酸序列)，ET7(具有SEQ ID No：9之核苷酸序列)，以及ET9(具有SEQ ID No：12之核苷酸序列)；步驟二：將至少一種目標基因之核苷酸構築於載體上，以形成目標基因重組質體，其中該載體至少包含一T-DNA區域，且該目標基因係構築於載體之T-DNA區域內；將目標基因重組質體送入穠桿菌中，以取得帶有目標基因重組質體之穠桿菌；步驟三：將步驟一、二所得之穠桿菌，與植物細胞或組織共同培養，以進行穠桿菌媒介之共轉殖；其特徵在於當轉殖當代之植物細胞或組織經步驟一及步驟二所得之穠桿菌共轉殖後，促轉基因可於轉殖當代之植物細胞或組織內表現其mRNA及其蛋白質，以增加T-DNA區域內之目標基因被傳送入植物細胞、進入細胞核或被嵌入(插入)染色體之機率，相較於未轉殖促轉基因之植物細胞或組織。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中目標基因包含但不限於各種所欲 之核酸、報導基因、或欲於植物中表現其mRNA、或其蛋白質之基因。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟一及步驟二之促轉基因及目標基因之核苷酸序列分別構築於不同載體之T-DNA區域內，以形成至少兩種重組質體。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟一及步驟二所得之重組質體送入不同一株穠桿菌株。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中植物細胞或組織包含但不限於植物細胞群、毛狀根(hairy root)、癒傷組織(callus)、植物培植體(explant)或其他適用穠桿菌進行轉殖者。