TWI390041B - Biological wafer - Google Patents

Description

生物晶片

本發明是有關於一種生物晶片，特別是指一種用於快速純化DNA與進行聚合酶連鎖反應之微流體生物晶片。

傳統遺傳醫學應用檢測中，臨床檢體之前處理、去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)以及核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)的萃取與純化尤其複雜，往往耗費許多的處理時間與人力成本，且其繁複的操作與步驟更容易增加檢體之損耗與檢測之準確性。例如使用酚－氯仿(phenol and chloroform)法，除了需要花數十小時處理的時間且過程相當繁瑣外，更會使用到有機化學毒性試劑，而會增加實驗過程中的危險性，且會產生有毒廢液，而生物樣品之大量耗損，也都造成潛在成本與資源之浪費。

目前的DNA萃取試劑盒使用的方法，包括使用固相吸附(solid－phase adsorption)，蛋白質和DNA相繼沉澱(sequential protein and DNA precipitation)，微磁珠吸附(magnetic bead adsorption)。其中使用DNA沉澱(precipitation)法，常會受限於時間的浪費，且整體過程中需要繁瑣之人為操作程序與離心步驟，而不易自動化；若選用管柱親合性(column affinity)法雖然相對於沉澱法較易自動化，但對於體積小的檢體萃取效果不佳。此外，將DNA萃取完後，其後段的遺傳性疾病檢測，諸如聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)，更是耗時費力。

隨著近年來微機電製程技術之成熟，在許多不同的生物領域中有顯著的發展，尤其以微小化流體快速生物醫學分析晶片，更具發展潛力與市場價值。藉由微機電製程技術所生產之微流體生醫檢測晶片，其具有高檢測靈敏度、可拋棄式、可攜帶性、低樣品及檢體消耗量、低耗能、體積小以及成本低等優點，相較傳統分析檢測技術下，有著突破性的發展價值，有利於發展用以純化DNA與快速利用DNA進行PCR反應，而可應用於遺傳性疾病檢測的晶片。

因此，本發明之目的，即在提供一種可用於快速純化DNA與進行聚合酶連鎖反應之生物晶片。

於是，本發明生物晶片，適用於搭配微磁珠使用，而可用於快速純化DNA等生物分子與進行聚合酶連鎖反應，該生物晶片包含一晶片本體，及分別設置於晶片本體上之一電磁吸附器、一電磁溫控器與一溫度感測器。該晶片本體包括由下往上依序疊接之一第一板層、一第二板層、一第三板層與一第四板層，且該等板層相配合界定出一混合槽、一第一反應槽、一第二反應槽與一廢液槽，及一介於其中二相接合板層間之微流道，該微流道具有一連通混合槽與第一反應槽之第一流道段、一連通第二反應槽與廢液槽之第二流道段，及一連通該等反應槽之第三流道段，該晶片本體還包括一可被充氣驅動而在第三流道段中產生可雙向控制液體流動方向之幫浦作用的雙向幫浦機構、一可被充氣驅動而驅使混合槽內之液體產生擾動的震盪機構，及二可分別被充氣驅動而分別用以塞封第一流道段與第二流道段之閥門機構。

該電磁吸附器是安裝固定於第一反應槽下方，並可被通電驅動而於第一反應槽中產生將微磁珠吸附固定之磁力。該電磁溫控器是設置於第二反應槽下方，並可被通電驅動而於第二反應槽中產生將微磁珠吸附固定之磁力及改變第二反應槽內之液體溫度。溫度感測器是設置於晶片本體上且可對應第二反應槽之溫度變化而輸出一電訊號。

有關本發明之前述及其他技術內容、特點與功效，在以下配合參考圖式之一個較佳實施例的詳細說明中，將可清楚的呈現。

如圖1~3所示，本發明生物晶片的較佳實施例，適用於搭配多數第一種微磁珠(粒徑4.5 μm，圖未示)來對生物檢體中之特定生物細胞進行萃取純化，並以多數第二種微磁珠(粒徑2.8 μm，圖未示)來萃取純化上述細胞之DNA，並可搭配DNA聚合酶(DNA polymerase)以及高專一性之引子(primer)，來進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)，而可以快速進行遺傳性疾病之檢測。其中，該等第一種微磁珠表面接種有可與白血球結合之CD15/CD45抗體，而第二種微磁珠會因所處溶液的pH值不同，而改變其表面之電性，當溶液pH<6.0時，第二種微磁珠表面會帶正電荷，而可吸附溶液中之DNA，當溶液pH>8.5時，第二種微磁珠表面會帶負電荷，進而會排斥釋放所吸附之DNA。但實施時，第一種微磁珠表面接種的抗體種類與檢體之細胞種類皆不以此為限。

該生物晶片包含一晶片本體2，及分別設置於晶片本體2上之一薄膜狀微型電磁吸附器6、一薄膜狀微型電磁溫控器7與一薄膜狀微型溫度感測器8。在本實施例中，由於晶片本體2上的結構都相當微小，且該等薄膜狀微型電磁吸附器6、電磁溫控器7與溫度感測器8的結構亦非常小，為方便了解，在以下各圖式中之各構件比例皆為原結構之放大示意圖，所以實施時，該等構件大小比例不以圖式所示比例為限。

該晶片本體2包括由下往上依序疊接之一第一板層21、一第二板層22、一第三板層23與一第四板層24，該等板層21~24相配合界定出由右往左依序排列且開口分別朝上之一混合槽200、一第一反應槽201、一第二反應槽202與一廢液槽203、一介於第二板層22與第三板層23間之微流道204、一介於第三板層23與第四板層24間之雙向幫浦機構3、一介於第一板層21與第二板層22間之震盪機構4，及一介於第三板層23與第四板層24間之閥門機構5。

在本實施例中，第一板層21為玻璃材質，第二~第四板層22~24材質為PDMS，但實施時，該等板層21~24之材質不以此為限。

該混合槽200、第一反應槽201與第二反應槽202，是分別由第三板層23與第四板層24上之貫孔230、240和該第二板層22相配合所構成。該微流道204是左右延伸地凹設於第三板層23底面，並具有一連通混合槽200與第一反應槽201之第一流道段205、一連通第二反應槽202與廢液槽203之第二流道段206，及一連通該等反應槽201、202之第三流道段207，該第三流道段207具有二分別與該等反應槽201、202連通之連通部208，及一連通於該等連通部208間之圓環狀幫浦部209。

該雙向幫浦機構3包括一位於第三板層23上且界定出第三流道段207之幫浦部209頂緣的彈性幫浦膜31、四個凹設於第四板層24底面並沿該幫浦膜31對稱排列成環狀之幫浦氣室32、四分別連通於相鄰兩幫浦氣室32間且孔徑較小而可延遲氣體於兩幫浦氣室32間流動的延遲溝槽33，及二分別與左右間隔對稱之兩幫浦氣室32連通之進氣孔34，且該等幫浦氣室32分別涵蓋局部幫浦膜31頂面。

為方便區別，以下將該等幫浦氣室32由右往左依序區分為第一幫浦氣室32、上下對稱且分別透過延遲溝槽33與第一幫浦氣室32連通之第二幫浦氣室32，及一與該等第二幫浦氣室32連通之第三幫浦氣室32，而該等進氣孔34是分別和第一與第三幫浦氣室32連通。

如圖1、2、4所示，該震盪機構4包括一成型於第二板層22上且界定出該混合槽200底緣之彈性震盪膜41、一凹設於第二板層22底面且局部涵蓋該震盪膜41底面之震盪氣室42，及二分別連通於該震盪氣室42兩相反端之充氣孔43，該震盪氣室42具有多數相間隔且分別局部涵蓋該震盪膜41之氣室部421，及多數分別連通於相鄰兩氣室部421間且孔徑較小的延遲部422，該等延遲部422可延遲氣體於兩氣室部421間之流動，該等充氣孔43是成型於第二~第四板層22~24上，且分別與最兩端之氣室部421連通。

該閥門機構5包括二分別位於第三板層23上且分別界定出第一與第二流道段205、206頂緣之彈性閥門膜51、二凹設於第四板層24底面且分別涵蓋該等閥門膜51頂面之閥門氣室52，及二分別與該等閥門氣室52連通之閥門氣孔53。為方便區別，以下將設置於第一流道段205處之閥門膜51與閥門氣室52分別定義為第一閥門膜51與第一閥門氣室52，而將設置於第二流道段206處之閥門膜51與閥門氣室52分別定義為第二閥門膜51與第二閥門氣室52。

如圖1、2、5所示，該微型電磁吸附器6、電磁溫控器7與溫度感測器8是分別電鍍成型於第一板層21頂面，其中，該電磁吸附器6具有一對應位於第一反應槽201下方之線圈部61，及二分別與該線圈部61兩相反端電連接之電極部62，該線圈部61是由一條往復彎折延伸之薄膜狀金屬線所構成。該電磁溫控器7具有二間隔位於第二反應槽202下方並分別由一往復彎折延伸之金屬線所構成之線圈部71，及四分別電連接於該等線圈部71兩相反端的電極部72。該溫度感測器8是設置於該等線圈部71間，並具有一前後延伸且間隔位於該等線圈部71相向側間的細長感測部81。

在本實施例中，該等線圈部61、71可分別被通電驅動而分別於該等反應槽201、202中產生往下吸附固定微磁珠的磁力，其中，電磁溫控器7之該等線圈部71還會對第二反應槽202內之液體加熱，而改變液體溫度，該溫度感測器8之感測部81則可對應第二反應槽202之溫度變化，而產生輸出一電訊號。

該生物晶片使用時，會將該等進氣孔34、充氣孔43與閥門氣孔53分別連通組接一空壓機(圖未示)，而可經由該等氣孔34、43、53對該等氣室32、42、52灌注高壓氣體。且會將該電磁吸附器6與電磁溫控器7之該等電極部62、72，及該溫度感測器8分別電連接至一控制裝置(圖未示)。該晶片進行DNA之萃取純化與遺傳疾病檢測的步驟如下：步驟(一)混合微磁珠與臨床檢體。先經由該等閥門氣孔53對該等閥門氣室52灌注高壓氣體，迫使該等閥門膜51往下彈性突伸入第一與第二流道段205、206中，而分別塞封第一與第二流道段205、206。接著，將修飾有CD15/CD45抗體的微磁珠與臨床血液檢體一起置入該混合槽200中。

然後，啟動該震盪機構4，經由其中一充氣孔43對該震盪氣室42灌注高壓，使高壓氣體經由該等延遲部422而依序充滿各氣室部421，當氣室部421內被充滿高壓氣體時，會迫使其所涵蓋之震盪膜41部位往上彈性突伸入該混合槽200中，而造成混合槽200內之液體產生擾動，因此，可藉由該等氣室部421依序地被充填高壓氣體的方式，驅使震盪膜41之各部位分別往上突伸入混合槽200中，而可在混合槽200中產生使微磁珠和血液檢體充分混合之擾流，使血液檢體中之白血球與微磁珠上之CD15/CD45抗體結合。實施時，並可透過控制由任一充氣孔43進行充氣的方式，來改變擾流形式。

待微磁珠與血液檢體充分混合後，停止驅動震盪機構4，並釋放第一閥門氣室52之氣體，使第一閥門膜51彈性復位而開啟第一流道段205。然後，再啟動該雙向幫浦機構3，經由進氣孔34間歇地對第一幫浦氣室32灌注高壓氣體，並藉由該等孔徑較小之延遲溝槽33設計，延遲氣體進入並填滿相鄰幫浦氣室32的時間，使第一幫浦氣室32、第二幫浦氣室32與第三幫浦氣室32依序被灌注高壓氣體，依序將所涵蓋之幫浦膜31部位往下彈性擠推突伸入第三流道段207之幫浦部209中，而在該幫浦部209中產生由右往左輸送液體之蠕動式幫浦作用，進而逐漸將混合槽200內之液體經由第一流道段205而吸引輸送至第一反應槽201中。然後再次驅使第一閥門膜51塞封第一流道段205，並停止驅動雙向幫浦機構3。

步驟(二)萃取純化白血球。對該電磁吸附器6施加一預定電流，使該線圈部61於第一反應槽201內產生之磁力，將結合有白血球之微磁珠往下吸附固定於第二板層22頂面。然後，於該混合槽200中注入細胞洗滌緩衝液，並開啟第一流道段205與第二流道段206，且驅使雙向幫浦機構3產生往左輸送液體之蠕動式幫浦作用，驅使細胞洗滌緩衝液流經第一反應槽201，而將檢體中未被吸附之其他血球沖洗至廢液槽203中。最後再封閉第一與第二流道段205、206，並停止驅動雙向蠕動式幫浦機構3，便完成白血球之萃取與純化。

步驟(三)萃取純化DNA。將用以進行DNA萃取純化之第二種微磁珠與細胞裂解液(lysis buffer)混合注入該混合槽200中，並開啟第一流道段205，且停止驅動電磁吸附器6，再經由進氣孔34開始對第三幫浦氣室32灌注高壓氣體，使第三、第二與第一幫浦氣室32依序被充氣，而使該幫浦膜31在該幫浦部209中產生往右輸送液體之蠕動式幫浦作用，而將結合有白血球之第一種微磁珠溶液自第一反應槽201輸送回混合槽200中，然後關閉第一流道段205。

接著，再次驅動震盪機構4，驅使白血球、細胞裂解液與第二種微磁珠充分混合，使白血球裂解而釋出DNA，藉由控制第二種微磁珠所處之液體的pH值，使DNA被吸附於第二種微磁珠表面。然後，再開啟第一與第二流道段205、206，並啟動雙向幫浦機構3，將混合槽200中之液體全部輸送至第二反應槽202中，且對該電磁溫控器6施加預定電流，使吸附有DNA之第二種微磁珠被電磁溫控器6產生之磁力往下吸附固定於第二板層22頂面。再將洗滌緩衝液注入混合槽200中，並驅使雙向幫浦機構3作動而將洗滌緩衝液輸送經過該第二反應槽202，而將白血球碎片與其他雜質沖洗至廢液槽203中，此時，便完成高品質DNA的萃取與純化。

若只需做大量的DNA萃取與純化，只需再以充提液(elution buffer)將DNA自第二種微磁珠表面溶解出來。但如要進行遺傳性疾病之偵測，則需透過PCR反應，來將某一特定遺傳性基因片段進行訊號放大處理。進行PCR反應時，可於第二反應槽202中加入DNA聚合酶(DNA polymerase)及高專一性之引子(primer)，並對該電磁溫控器7施加預定電流，驅使該電磁溫控器7之該等線圈部71調變第二反應槽202內之溫度，同時藉由該溫度感測器8對應第二反應槽202溫度變化所產生之訊號，控制施加於電磁溫控器7之電流大小，進而可精確控制第二反應槽202內之溫度。由於PCR反應過程並非本發明之創作重點，因此不再詳述。

在本實施例中，是以200 μ l的全血檢體進行DNA之萃取與純化，同時將所純化之DNA量和傳統DNA萃取試劑盒與手動操作式微磁珠萃取法進行比較，並針對methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)C677T之基因片段進行PCR反應，且與傳統DNA試劑法所萃取之DNA經大型PCR儀器分析的結果進行比較。

由表1可知，本發明晶片所萃取純化之DNA量可達15.18 ng/μ l，明顯優於傳統DNA萃取法。

如圖6所示，lane L為100－bp DNA Maker，lane 1－2為傳統DNA試劑法萃取並經大型PCR儀器分析之結果，lane3－4為於本發明晶片上進行萃取與PCR反應分析之結果，由實驗結果顯示，於本發明晶片進行DNA萃取與PCR反應分析之結果相同於傳統PCR儀器。因此，本發明晶片可用以取代傳統DNA萃取方法與傳統PCR儀器。

歸納上述，透過該晶片本體2所構成之微流道204、可雙向控制流體流動方向之雙向幫浦機構3，及可有效促使混合槽200內之液體擾動而進行混合的震盪機構4等結構設計，並配合設置於晶片本體2上之微型電磁吸附器6、微型電磁溫控器7與微型溫度感測器8等結構設計，使得該生物晶片可用以快速萃取與純化生物檢體中之特定生物分子與DNA，並可用以進行PCR反應分析，而可用以快速檢測遺傳性疾病。整個萃取純化與PCR反應過程中，都是在晶片本體2上進行，且不需使用危險的有機化學試劑，僅需利用極少量之成本與樣品損耗，便能達到優於傳統萃取技術的萃取純化效果，再加上簡便操作程序，可大幅縮短傳統技術上之操作時間，並降低生物檢體被污染之風險，更可減少人為操作的不穩定性。因此，確實可達到本發明之目的。

惟以上所述者，僅為本發明之一較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及發明說明內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

2．．．晶片本體

33．．．延遲溝槽

21．．．第一板層

34．．．進氣孔

22．．．第二板層

4．．．震盪機構

23．．．第三板層

41．．．震盪膜

230．．．貫孔

42．．．震盪氣室

24．．．第四板層

421．．．氣室部

240．．．貫孔

422．．．延遲部

200．．．混合槽

43．．．充氣孔

201．．．第一反應槽

5．．．閥門機構

202．．．第二反應槽

51．．．閥門膜

203．．．廢液槽

52．．．閥門氣室

204．．．微流道

53．．．閥門氣孔

205．．．第一流道段

6．．．電磁吸附器

206．．．第二流道段

61．．．線圈部

207．．．第三流道段

62．．．電極部

208．．．連通部

7．．．電磁溫控器

209．．．幫浦部

71．．．線圈部

3．．．雙向幫浦機構

72．．．電極部

31．．．幫浦膜

8．．．溫度感測器

32．．．幫浦氣室

81．．．感測部

圖1是本發明生物晶片之立體分解圖；圖2是該較佳實施例之組合俯視示意圖，說明四板層相疊接所界定出之各構件之相對位置；圖3是該較佳實施例的第四板層之局部俯視放大圖；圖4是該較佳實施例之第二板層的局部俯視放大圖；圖5是該較佳實施例之第一板層之俯視放大圖；及圖6是該較佳實施例之萃取之DNA進行PCR反應之平板膠電泳之測試結果。

2．．．晶片本體

4．．．震盪機構

21．．．第一板層

41．．．震盪膜

22．．．第二板層

42．．．震盪氣室

23．．．第三板層

421．．．氣室部

230．．．貫孔

422．．．延遲部

24．．．第四板層

43．．．充氣孔

240．．．貫孔

5．．．閥門機構

204．．．微流道

51．．．閥門膜

205．．．第一流道段

52．．．閥門氣室

206．．．第二流道段

53．．．閥門氣孔

207．．．第三流道段

6．．．電磁吸附器

208．．．連通部

61．．．線圈部

209．．．幫浦部

62．．．電極部

3．．．雙向幫浦機構

7．．．電磁溫控器

31．．．幫浦膜

71．．．線圈部

32．．．幫浦氣室

72．．．電極部

34．．．進氣孔

8．．．溫度感測器

Claims (16)

1. 一種生物晶片，適用於搭配微磁珠使用，而可用於快速純化DNA等生物分子與進行聚合酶連鎖反應，包含：一晶片本體，包括由下往上依序疊接之一第一板層、一第二板層、一第三板層與一第四板層、由該第二板層~第四板層相配合界定出且開口皆朝上的一混合槽、一第一反應槽、一第二反應槽與一廢液槽，及一介於該第二板層與該第三板層間之微流道，該微流道具有一連通混合槽與第一反應槽之第一流道段、一連通第二反應槽與廢液槽之第二流道段，及一連通該等反應槽之第三流道段，該晶片本體還包括一介於該第三板層與第四板層間且可被充氣驅動而在第三流道段中產生可雙向控制液體流動方向之幫浦作用的雙向幫浦機構、一介於該第一板層與該第二板層間且可被充氣驅動而驅使混合槽內之液體產生擾動的震盪機構，及一介於該第三板層與第四板層間且可被充氣驅動而用以塞封第一流道段與第二流道段之閥門機構，該第三流道段具有一環狀幫浦部，該雙向幫浦機構包括一界定出該幫浦部頂緣並可被彈性擠推突伸入該幫浦部中之環狀幫浦膜，該環狀幫浦膜係位於該第三板層且該幫浦部係位於該第四板層，該震盪機構包括一界定出該混合槽底緣並可被彈性擠推入混合槽中之震盪膜，該震盪膜係位於該第二板層且該混合槽係位於該第三板層，該閥門機構包括三分別界定出第一、第二與第三流道段頂緣並可被彈性擠推而分別塞封相 對應流道之閥門膜，該閥門膜係位於該第三板層且該等流道係介於該第二板層與該第三板層間；一電磁吸附器，是設置在該第一板層與該第二板層之間，且安裝固定於第一反應槽下方，並可被通電驅動而於第一反應槽中產生將微磁珠吸附固定之磁力；一電磁溫控器，是設置在該第一板層與該第二板層之間，且設置於第二反應槽下方，並可被通電驅動而於第二反應槽中產生將微磁珠吸附固定之磁力及改變第二反應槽內之液體溫度；及一溫度感測器，是設置在該第一板層與該第二板層之間，且可對應第二反應槽之溫度變化而輸出一電訊號。
2. 依據申請專利範圍第1項所述之生物晶片，其中，該第三流道段更具有二分別與該等反應槽連通之連通部，且該環狀幫浦部連通於該等連通部間，該雙向幫浦機構更包括四分別沿幫浦膜間隔排列且可被充氣而分別驅使幫浦膜之局部部位突伸入幫浦部內的幫浦氣室、四分別連通於相鄰兩幫浦氣室間且孔徑較窄而可延遲氣體於兩幫浦氣室間流動之延遲溝槽，及二分別與其中二幫浦氣室連通之進氣孔。
3. 依據申請專利範圍第2項所述之生物晶片，其中，該等幫浦氣室是沿該幫浦部對稱排列成環狀，該等進氣孔是分別與間隔相向之兩幫浦氣室連通。
4. 依據申請專利範圍第2或3項所述之生物晶片，其中， 該震盪機構更包括一局部涵蓋震盪膜並可被充氣而驅使所涵蓋震盪膜部位往上彈性突伸之震盪氣室，及至少一與該震盪氣室連通之充氣孔。
5. 依據申請專利範圍第4項所述之生物晶片，其中，該震盪氣室包括多數相間隔且分別局部涵蓋該震盪膜之氣室部，及多數分別連通於相鄰兩氣室部間且孔徑較窄而可延遲氣體於兩氣室部間流動之延遲部。
6. 依據申請專利範圍第5項所述之生物晶片，其中，該震盪機構包括二充氣孔，且該等充氣孔是分別連通於震盪氣室之兩相反端側的氣室部。
7. 依據申請專利範圍第5項所述之生物晶片，其中，該閥門機構更包括三分別涵蓋該等閥門膜並可被灌注高壓氣體而分別驅使該等閥門膜突伸塞封相對應流道段之閥門氣室，及三分別與該等閥門氣室連通之閥門氣孔。
8. 依據申請專利範圍第7項所述之生物晶片，其中，該電磁吸附器具有一設置於該第一板層與該第二板層間且位於第一反應槽下方，並由一條連續彎折延伸之導線構成的線圈部。
9. 依據申請專利範圍第7項所述之生物晶片，其中，該電磁溫控器包括二間隔設置於該第一板層與該第二板層間且位於第二反應槽下方，並分別由一條連續彎折延伸之導線所構成之線圈部，該溫度感測器是設置於該等線圈部間。
10. 依據申請專利範圍第9項所述之生物晶片，其中，該溫 度感測器是由一條細長白金線構成。
11. 依據申請專利範圍第7項所述之生物晶片，其中，該雙向幫浦機構之幫浦膜是位於第三板層上，該等幫浦氣室與延遲溝槽則是分別成型於第三與第四板層間。
12. 依據申請專利範圍第11項所述之生物晶片，其中，該微流道是凹設於第三板層底面，而該等幫浦氣室與延遲溝槽則是分別凹設於第四板層底面。
13. 依據申請專利範圍第11項所述之生物晶片，其中，該震盪機構之震盪膜是位於第二板層上，而該等震盪氣室與延遲溝槽是分別成型於第一與第二板層間。
14. 依據申請專利範圍第13項所述之生物晶片，其中，該等震盪氣室與延遲溝槽是分別凹設於第二板層底面。
15. 依據申請專利範圍第13項所述之生物晶片，其中，該閥門機構之該等閥門部是分別位於第三板層上，該等閥門氣室是分別成型於第三與第四板層間。
16. 依據申請專利範圍第15項所述之生物晶片，其中，該等閥門氣室是分別凹設於第四板層底面。