TWI387649B - 多醣蛋白結合模組及澱粉吸附區上奈米原纖維之形成 - Google Patents

多醣蛋白結合模組及澱粉吸附區上奈米原纖維之形成 Download PDF

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Description

多醣蛋白結合模組及澱粉吸附區上奈米原纖維之形成
本發明關於一種澱粉吸附區(starch-binding domain,SBD)，一種多醣及蛋白質結合模組，以及一種可形成澱粉樣原纖維(amyloid-like fibril)的原纖維形成胜肽(fibril forming peptide)。本發明更進一步關於一種包含原纖維形成胜肽的奈米管。
澱粉為植物儲存能量的主要來源，係由直鏈澱粉及支鏈澱粉組成。直鏈澱粉幾乎全由α-(1,4)-D-葡萄呱喃糖(α-(1,4)-D-glucopyranose)單位組成，也包括少量以α-1,6鍵結形成的分支和連接的磷酸基團；支鏈澱粉則是由α-(1,4)-D-葡萄糖片段所組成，連接約5%的α-1,6分支。直鏈澱粉及支鏈澱粉可捲成螺旋結構，並進一步形成特定的結晶形態。
葡萄糖澱粉酶(Glucoamylase,GA)，亦稱為澱粉葡萄糖苷酶或γ-澱粉酶(EC 3.2.1.3)，是一種能水解生澱粉或其相關寡醣中α-1,4和α-1,6醣苷鍵聯結，以產生β-D-葡萄糖的生物催化劑(Sauer J,Sigurskjold BW,Christensen U,Frandsen TP,Mirgorodskaya E,Harrison M,Roepstorff P,Svensson B:Glucoamylase:structure/function relationships,and protein engineehng. Biochim. Biophys. Acta.,1543(2000)275-293;Norouzian D,Akbarzadeh A,Scharer JM,Moo Young M:Fungal glucoamylases. Biotechnol Adv,24(2006)80-85)。米根黴菌(Rhizopus oryzae )的葡萄糖澱粉酶(1,4-α-D-glucan glucohydrolase,Ro GA)包含兩個功能區,分別為位於胺基端(N端)的澱粉吸附區(starch-binding domain,SBD)與羧基端(C端)的催化區，中間則以糖基化的區間連接肽(O -glycosylated interdomain linker)相連。根據CAZY資料庫(http://www.cazy.org/)的定義，Ro GA的C端催化區歸類屬於糖苷水解酶家族15(glycoside hydrolase family 15(GH15))，其N端的SBD則隸屬於醣類吸附模組(carbohydrate-binding module,CBM)家族21(CBM21，Ro SBD)。
SBD不需依賴催化區即具備獨立的功能，已有報告指出其能破壞澱粉結構並將酵素催化區集中到澱粉表面，以提升顆粒澱粉水解效率。Ro SBD和澱粉及可溶性寡醣間的配體結合模式已由張大慈教授研究團隊測定(W.I. Chou,T.W. Pai,S.H. Liu,B.K. Hsiung,M.D. Chang,The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase fromRhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding,Biochem. J. 396(2006)469-477)。其Kd 值與CBM20(來自黑麴菌(Aspergillus niger )的葡萄糖澱粉酶(An GA))的Kd 值相近，但Ro SBD結合澱粉的最大容量(Bmax )比An SBD高40到70倍。Ro SBD與可溶性配體、β-環糊精(βCD)及麥芽七糖(maltoheptaose，G7)間的結合親和力約為5μM。
Ro GA的SBD具有108個胺基酸殘基，係由8個β-股(β-strands)組成的功能區域，具有2個糖配體結合位置(W.I. Chou,T.W. Pai,S.H. Liu,B.K. Hsiung,M.D. Chang,The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase fromRhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding,Biochem. J. 396(2006)469-477;Y.N. Liu,Y.T. Lai,W.I. Chou,M.D. Chang,P.C. Lyu, Solution structure of family 21 carbohydrate-binding module fromRhizopus oryzae glucoamylase,Biochem. J. 403(2007)21-30;J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)。研究發現重組SBD經加熱變性後會產生較強的β結構訊號，與雞蛋清溶菌酶及酸性纖維母細胞生長因子經加熱處理後會形成整齊的β-澱粉樣原纖維的現象十分相似(Srisailam,S.,Wang,H. M.,Kumar,T. K.,Rajalingam,D.,Sivaraja,V.,Sheu,H. S.,Chang,Y. C. and Yu,C.(2002)Amyloid-like fibril formation in an all beta-barrel protein involves the formation of partially structured intermediate(s). J. Biol. Chem. 277,19027-19036)。因為天然的SBD和酸性纖維母細胞生長因子都含有全為β-股組成的β-桶狀結構(β-barrel)，因此SBD遇熱產生的化學及生物物理機制與酸性纖維母細胞生長因子的機制可能相關。
至今CBM家族已分為53類，其中8個家族(CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM45和CBM48)具有澱粉吸附活性，其中只有CBM20和CBM21兩個家族包含與葡萄糖澱粉酶關聯的SBD。SBD與澱粉結合的解離常數Kd 約為微莫耳濃度等級。根據之前Ro SBD以結構為基礎的分子模擬和核磁共振(NMR)光譜的報告(Y.N. Liu,Y.T. Lai,W.I. Chou,M.D. Chang,P.C. Lyu,Solution structure of family 21‘carbohydrate-binding module fromRhizopus oryzae glucoamylase,Biochem.J.403(2007)21-30)，顯示雖然此二蛋白質家族的序列相似度極低(約13.5%)，但卻具備非常相似的生物功能和立體折疊結構。因此，最近的演化研究建議將CBM20和CBM21這兩個SBD家族合併成一個新的CBM家族(Machovic,M. & Janecek,S. The evolution of putative starch-binding domains. FEBS Lett 580,(2006)6349-56;Machovic,M. & Janecek,S. Starch-binding domains in the post-genome era. Cell Mol Life Sci 63,(2006)2710-24)。然而，CBM21與澱粉及肝醣的詳細結合機制仍舊未明。
CBM 45
CBM45家族起源於植物界的真核蛋白質，如質體(plastidial)的α-澱粉酶及α-葡聚糖水二激酶的N端模組。馬鈴薯的α-葡聚糖水二激酶(GWD,EC 2.7.9.4)的N端單元已證實能專一性地分解質體的α-葡聚糖，且在澱粉代謝中扮演重要的角色(Mikkelsen,R.,Suszkiewicz,K. & Blennow,A. Anovel type carbohydrate-binding module identified in alpha-glucan,water dikinases is specific for regulated plastidial starch metabolism. Biochemistry 45,(2006)4674-82)。CBM45家族含保留性色胺酸的SBD通常可形成重複串聯的模組(tandem repeats)，使SBD能與碳水化合物結合，CBM45單元的3D結構至今尚未解析。
CBM 48
CBM48家族具有約100個胺基酸殘基且與GH13模組相關聯。此蛋白質家族涵蓋古生菌的澱粉酶(archaeal amylase)和肝醣去分支酶(glycogen debranching enzymes)、細菌的澱粉酶和普魯藍酶分支酶(pullulanases branching-enzymes)、及真核生物的AMP活化蛋白激酶(AMPK)(Parker,G. J.,Koay,A.,Gilbert-Wilson,R.,Waddington,L. J. & Stapleton,D. AMP-activated protein kinase does not associate with glycogen alpha-particles from rat liver. Biochem Biophys Res Commun 362,(2007)811-5)，其中AMPK已證實可與肝醣結合。
目前有幾個CBM大家族的3D結構已經解析：包括An GA的CBM20、Ro GA的CBM21、嗜鹼芽孢桿菌(Bacillus halodurans )之麥芽六糖形成澱粉酶(maltohexaose-forming amylase)的CBM25和CBM26、普通高溫放線菌(Thermoactinomyces vulgaris )之α-澱粉酶(Tv AI)的CBM34、產氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes )之魯藍酶的CBM41、及溝鼠(Rattus norvegicus )之AMP活化蛋白激酶的CBM48。
一般而言，在高於熱穩定性的溫度，變性蛋白可能會部份組織成核狀態(nucleated state)，接著彼此間互相作用而形成排列整齊的澱粉樣原纖維，產生核聚合機制(S. Srisailam,H.M. Wang,T.K. Kumar,D. Rajalingam,V. Sivaraja,H.S. Sheu,Y. C. Chang,C. Yu, Amyloid-like fibril formation in an allbeta-barrel protein involves the formation of partially structured intermediate(s),J. Biol. Chem. 277(2002)19027-19036)。許多能夠轉換成不可溶性澱粉樣原纖維的可溶性蛋白具有共同的特性，目前已發現相鄰芳香環之間的π鍵及電荷配對之間的鹽橋，對特定蛋白質或多肽之澱粉樣原纖維的形成及穩定扮演重要的角色(A.T. Petkova,Y. Ishii,J.J. Balbach,O.N. Antzutkin,R.D. Leapman,F. Delaglio,R. Tycko,A structural model for Alzheimer's beta-amyloid fibhls based on experimental constraints from solid state NMR,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99(2002)16742-16747;L. Tjernberg,W. Hosia,N. Bark,J. Thyberg,J. Johansson,Charge attraction and beta propensity are necessary for amyloid fibril formation from tetrapeptides,J. Biol. Chem. 277(2002)43243-43246;O.S. Makin,E. Atkins,P. Sikorski,J. Johansson,L.C. Serpell,Molecular basis for amyloid fibril formation and stability,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102(2005)315-320)。除此之外，高蛋白質濃度、離子強度、pH值和溫度也會影響纖維的形成。
最近奈米技術令很多人感到興趣，例如奈米結構可用於製作分子層級的儀器，使分子探針技術變成可行；原纖維則可用於製造連接器，電線，和致動器。除此之外，奈米管也可形成將小蛋白質導入生物系統(或其他系統)的微型吸管。值得注意的是多肽奈米管的結構比脂質奈米管更強更穩定。
本發明提供一種用於降解多醣的混合物，其包含以螺旋型結合的至少兩個澱粉吸附區(starch-binding domain)及一個多醣。在較佳實施例中，該多醣係直鏈澱粉聚集體或支鏈澱粉聚集體，且澱粉吸附區的數量為三到四個，其中該澱粉吸附區來自醣類吸附模組(carbohydrate-binding module)家族20、21、25、26、34、41、45、48。在更佳實施例中，該澱粉吸附區來自米根黴菌(Rhizopus oryzae )的葡萄糖澱粉酶，並藉由區間連接肽(linker)與催化區相連。在另一實施例中，該澱粉吸附區另外與螢光物質相連接，並可應用於多醣的定量檢測。
本發明也提供一種產生寡醣的方法，其包含步驟如下：(a)提供一個組成物，其包含一個藉由區間連接肽與催化區相連的澱粉吸附區，其中該區間連接肽由至少兩個胺基酸殘基所組成；及(b)將步驟(a)中的組成物與多醣在能使酵素催化區具有活性的緩衝液中混合。
此處使用的術語『寡醣』表示一種具有3到15個葡萄糖單位長度的寡醣；較佳者為含有5到12個單位長度的寡醣；最佳者為含有7到10個單位長度的寡醣。
此處使用的術語『區間連接肽』表示在澱粉吸附區與酵素催化區之間連接片段的至少兩個胺基酸殘基；較佳的區間連接肽由2到60個胺基酸殘基組成。
在較佳實施例中，該酵素催化區係包含α-澱粉酶(α-amylase)、β-澱粉酶(β-amylase)、環糊精葡萄糖基轉移酶(cyclodextrin glycosyltransferase)、環糊精聚葡萄糖轉移酶(cyclodextrin glucanotransferase)、環麥芽糊精酶(cyclomaltodextrinase)、ATase酵素(acarviosyl transferase)、6-α-葡萄糖基轉移酶(6-α-glucosyltransferase)、4-α-聚葡萄糖轉移酶(4-α-glucanotransferase)、α-1,6-環麥芽五糖形成聚葡萄糖轉移酶(α-1,6-cyclomaltopentaose-forming glucanotransferase)、普魯藍酶(pullulanase)、麥芽六糖形成α-澱粉酶(maltohexaose-forming α-amylase)、麥芽五糖形成澱粉酶(maltopentaose-forming amylase)、麥芽三糖形成α-澱粉酶(maltotriose-forming α-amylase)、麥芽四糖形成澱粉酶(maltotetraose-forming amylase)、葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)、產麥芽糖α-澱粉酶(maltogenic α-amylase)、新普魯藍酶(neopullulanase)、α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、麥芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalose trehalohydrolase)、異澱粉酶(isoamylase)、1,4-α-聚葡萄糖分支酶(1,4-α-glucan branching enzyme)、肝醣去分支酶(glycogen-debranching enzyme)或澱粉分支酶(starch branching enzyme)。
在另一實施例中，該澱粉吸附區與螢光物質相連接，偵測螢光強度便可應用於定量多醣。
本發明更進一步提供一種會形成原纖維的14殘基胜肽，其胺基酸序列為X1 NNNX2 X3 NYQX4 X5 X6 X7 X8 ，其中X1 和X8 代表一對具有相反電荷的胺基酸殘基，X2 、X3 、X4 、X5 、X6 或X7 則代表一個胺基酸殘基。在較佳實施例中，該對具有相反電荷的胺基酸殘基由帶正電荷的殘基K、R或H，及帶負電荷的殘基D或E組成。在更佳實施例中，當X8 為K時，X1 為D；當X8 為D時，X1 為K；X2 為S或A；X3 為A；X4 為V或A；X5 為S或A；X6 為T或A；X7 為S或A。在最佳實施例中，該14殘基胜肽的胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
本發明更進一步提供一種製造澱粉樣原纖維(amyloid-like fibril)的方法，包含將遇熱會形成原纖維的14殘基胜肽溶解在pH值4.0到7.0的溶液中，加熱產生原纖維。在較佳實施例中，該溶液係10mM的檸檬酸鈉緩衝液或磷酸-檸檬酸緩衝液，且熱處理的溫度為至少37℃。該原纖維可應用於碳水化合物分離、藥物投遞、建造生物可降解的3D支架、奈米線生產或奈米管的形成等等。
該原纖維更進一步形成一種具有如下分子式的奈米管：Xn -[(P14 )m -Lq ]r -Ys ，其中P14 代表胺基酸序列如SEQ ID NO:7所示的14殘基胜肽；L、X和Y代表胜肽或金屬；m、n、q、r和s則為常數。在較佳實施例中，分子式中的X和Y可再與其他胜肽或金屬連接。
奈米管可被應用於過濾系統，或形成微型吸管將小蛋白質導入生物系統或其他系統中。
本發明可能以不同的形式實施，並不僅限於下列文中提及的實例。下列實施例僅作為本發明不同面向及特點中的代表。
實施例1 蛋白質表現與純化
Ro SBD重組蛋白質的表現、純化及功能檢測已有相關研究報導(W.I. Chou,T.W. Pai,S.H. Liu,B.K. Hsiung,M.D. Chang,The family 21 carbohydrate-binding module of glucoamylase fromRhizopus oryzae consists of two sites playing distinct roles in ligand binding,Biochem. J. 396(2006)469-477)。簡言之，先將掌控Ro SBD的DNA片段選殖(clone)到pET23a(+)表現載體，並在大腸桿菌(E. coli BL21-Gold(DE3)(Novagen))中大量表現(overexpress)。重組SBD樣本以組氨酸親和層析法(affinity column chromatography(Novagen))依標準程序純化。將純化的SBD(11.65kDa)樣本以醋酸鈉緩衝液(50mM,pH 5.5)透析得到最終產物。每公升細胞約可產出5mg的純化蛋白質。
定點突變
所有的Ro SBD突變體都經由QuikChange PCR定點突變法(PCR-based QuikChange site-directed mutagenesis method(Stratagene))產生，其以pET-Ro SBD為模板，使用兩段含有突變標的之互補引子，並加入特定的DNA聚合酶(Pfu Turbo DNA polymerase(Stratagene))。之後再將所有產物轉形至勝任細胞(E. coli BL21-Gold(DE3))中以表現出蛋白質。
Ro SBD與澱粉結合的定量測量
以飽和結合實驗(saturation binding assay)分析澱粉的等溫結合反應曲線(binding isotherm)。將野生型Ro SBD和突變的Ro SBD衍生物(100μL，保存在50mM，pH值5.5的醋酸鈉中)和0.1mg的不可溶性澱粉(事先清洗過)混和，並於25℃輕柔攪拌16小時。之後於4℃以16,000×g 離心10分鐘，使用蛋白質濃度分析法(BCA assay)測定上清液(即未與澱粉結合的蛋白質)之蛋白質濃度。由初始蛋白質濃度與未結合蛋白質濃度的差值，即可計算出結合蛋白質的數量。使用標準單點結合模型分析等溫結合反應曲線的非線性回歸，以求出Kd 值和Bmax 值。
Ro SBD與可溶性碳水化合物結合的定量測量
測量內在蛋白質螢光強度的變化，以記錄野生型Ro SBD和突變型Ro SBD與βCD結合的螢光分光光譜。實驗使用LS-55分光光度計(PerkinElmer)，於25℃的50mM醋酸鈉(pH 5.5)中進行。將環形及線性的碳水化合物(2到20mM)滴定到Ro SBD(1μM，2mL)中，接著監測350nm波長的螢光發射光譜(激發波長固定為280nm)。繪製螢光強度變化與配體濃度間的相對關係，再以適用於單一結合位點的方程式將數據轉換成模擬曲線。
Ro SBD結晶
使用懸滴蒸氣擴散法(hanging-drop vapor-diffusion method)進行結晶試驗。將蛋白質溶液(1μL)及結晶溶液(reservoir solution，1μL)與在養晶盤(Linbro plate)中的結晶溶液(500μL)混合並達到平衡。使用漢普頓研究晶體濾篩套組(Hampton Research Crystal Screen kit)得到初始結晶，再進一步優化以獲得具有良好衍射品質的晶體。蛋白質結晶實驗使用的Ro SBD濃度約10mg/mL。以【蛋白質：碳水化合物】為【1：2】的莫耳比，將環形碳水化合物(βCD)及線性碳水化合物(麥芽七糖、G7)分別形成SBD-βCD及SBD-G7複合體。於溫度293K，使用含18% PEG 8000及0.2M醋酸鋅的0.1M二甲胂酸鈉緩衝液(sodium cacodylate buffer，pH 6.5)，可使SBD-βCD複合體結晶在3天內長成，最大尺寸可達到0.1×0.1×0.3mm。同樣在溫度293K使用30% PEG 8000及0.6M硫酸銨，則可使SBD-G7複合體結晶在4天內長成，最大尺寸達到0.1×0.1×0.2mm。
收集X光數據
在台灣的國家同步輻射研究中心(NSRRC)內，以光束線BL13C1(beamline BL13C1)收集SBD-βCD及SBD-G7複合體結晶的X光衍射數據。使用HKL2000軟體處理數據並描繪出比例尺。SBD-βCD複合體結晶繞射可達到1.8的解析度，屬於正交晶系的P21 21 21 空間群(orthorhombic P21 21 21 space group)(如表1所示)；
計算後可得知其VM 值為2.44 3 Da-1 ，且每1個不對稱單位有1個分子。SBD-G7複合體結晶繞射可達到2.3的解析度，屬於單斜晶系(monoclinic)的P21 空間群(如表1所示)；計算後可得知其VM 值為2.46 3 Da-1 ，且每1個不對稱單位有4個分子。
結構測定和優化
使用未與配體結合的Ro SBD溶液結構(PDB:2djm)為分子置換的研究模型，以測定SBD-βCD複合體的結構。使用分子置換軟體MOLREP以決定結構相態。使用在8.0到4.0間的數據及20的帕特森半徑(Patterson radius)以計算旋轉(rotation)及轉移(translation)函數，並求出SBD-βCD複合體重要的旋轉函數解及轉移函數解。剛體(rigid body)優化後的相關係數及R-因子分別為31.7%及54.7%。採用相似的步驟但使用SBD-βCD的結構作為研究模型，以測定SBD-G7複合體的結構。使用XTAL VIEW建立結構模型，並用CNS優化結構。表1為SBD-βCD及SBD-G7複合體結構優化後的統計資料彙整。圖1到5係以PYMOL(http://pymol.sourceforge.net/)繪製。
PDB存取碼
Ro SBD複合體的資料已存進PDB資料庫，如SBD-βCD及SBD-G7複合體的PDB存取碼分別為2v8l及2v8m。
碳水化合物結合模組折疊拓樸學
某些CBM超級家族，包括CBM20、CBM21、CBM25、CBM26、CBM34、CBM41、CBM48、及CBM53在N端或C端含有SBD。這些SBD的序列彼此相似度低，卻具備相似的類免疫球蛋白(immunoglobin-like)折疊拓樸結構。Ro SBD與An SBD及其他含SBD之CBM家族的相似度都很低(與An SBD的相似度小於15%)。以結構為基礎進行SBD多重序列比對SBD中8股(strand)的整體結構及對應的配體結合位點；其中SBD來自7個具澱粉結合能力的CBM超級家族(CBM45除外)，包括米根黴菌葡萄糖澱粉酶的Ro SBD、黑麴菌葡萄糖澱粉酶的An SBD、嗜鹼芽孢桿菌的Bh CBM25和Bh CBM26、普通高溫放線菌的TvAI CBM34、產氣克雷伯氏菌的Ka CBM41及溝鼠的Rn CBM48(J.Y.Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)。目前已發現兩種拓樸結構：第一類(type I)SBD和第二類(type II)SBD，若將二者的第一個β股及最後一個β股互相轉換，即具有相似的整體結構。CBM超級家族中CBM20、CBM25、CBM26及CBM41屬於第一類拓樸，而CBM21、CBM34及CBM48則屬於第二類拓樸。
SBD整體結構
Ro SBD與βCD複合體(SBD-βCD)及Ro SBD與麥芽七糖複合體(SBD-G7)的晶體結構解析度分別為1.8和2.3。該兩種複合體(圖1A及圖1B)具非常相似的整體結構，且能折疊成約為28×30×42尺寸的密集區(compact domain)。Ro SBD的整體結構屬於類免疫球蛋白構造，為一種典型的β-三明治折疊。β-三明治為對稱結構，由8個β股組成，除了最後2股外均為反向平行。各股之間互相配對成為4個髮夾β股：β12、β34、β45及β67/8，並折疊成β桶形(圖1A)。β桶形中含堅實的疏水性核心，為令Ro SBD能穩定的主要原因。
SBD-βCD及SBD-G7複合體均有兩個碳水化合物結合位點，分別標示為位點I及位點II。其中糖配體βCD及G7位於Ro SBD表面上垂直方向幾乎呈對角的端點(圖1A和圖1B)。結合位點I位於β34迴圈周圍的Trp47，位點II則位於β23迴圈周圍的Tyr32(圖1)。SBD-βCD及SBD-G7複合體的碳水化合物結合率均為每個SBD分子接1個糖配體(圖1)。然而，Ro SBD會與隔壁的分子共享每個結合位點，因此1個糖配體會由2個Ro SBD分子一起結合(圖1C)。
結合位點
位點I主要由3個保留的芳香族殘基：Trp47、Tyr83及Tyr94組成，以形成一個寬廣、平坦且穩定的疏水性環境。這些殘基的芳香環造成SBD的結合曲率，並會與配體的糖環藉由理想的疏水性堆積作用(ideal hydrophobic stacking interaction)互相影響(J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path, Biochem J,416(2008)27-36)。β34迴圈裡的Trp47會因碳水化合物結合而改變構形。Tyr83及Tyr94分別位於β6及β7位點I相當穩定。除了疏水性交互作用外，幾個天門冬胺酸(asparagine)殘基提供親水性交互作用。由連續的天門冬胺酸形成的兩個獨特多N迴圈：Asn48-Asn49-Asn50(β34迴圈)及Asn96-Asn97-Asn98-Asn101(β78迴圈)也與配體結合有關。多N迴圈可從兩邊抓住βCD分子，並協助βCD轉到正確的方向以與Trp47、Tyr83及Tyr94形成疏水性結合。特別的是，殘基Asn50、Asn96及Asn101會直接與βCD形成氫鍵。多N迴圈提供的額外交互作用，使RoSBD比其他CBM超級家族的成員產生更高的配體結合能力。目前已知其他的CBM21 GA超級家族也具有多N迴圈，如來自捲枝毛黴(Mucor circinelloides )的Mc SBD。
位點II一般由β23迴圈及β45迴圈形成，其中含兩個主要的芳香族殘基：Tyr32及Phe58。然而，Tyr32及Phe58均鄰近凡得瓦爾(van der Waals)表面與βCD緊密聚合的糖環。βCD的糖環與Tyr32迴圈幾乎平行，可伸入βCD的非極性凹穴並與βCD的O27形成氫鍵(J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)。這種獨特的鍵結只在SBD-βCD複合體中發現，且βCD的β-葡聚糖(β-glucan)鏈會纏繞在Tyr32周圍以使結合穩定。在環糊精葡萄糖基轉移酶及AMP活化蛋白激酶的肝醣結合區可觀察到相似的結合形態，其相對應的殘基分別為Leu600及Leu146。位點II另一個關鍵殘基為Phe58，其疏水性的苯環在βCD葡萄糖單位的糖環結構上形成平坦堆積作用(flat stacking interaction)。Tyr32及Phe58的兩個平面環與βCD分子的凡得瓦爾表面緊密聚合，就像一個將βCD拾起的夾鉗。除了疏水性的交互作用，殘基Asn29、Lys34及Glu68也提供與βCD間的氫鍵交互作用。這些殘基彼此之間以氫鍵互相作用，提供與βCD結合的穩固結合環境，對穩定Ro SBD的β23迴圈及β45迴圈也有貢獻。位點II的結合區域小且狹窄，比位點I的結合區域更為突出。
圖1D顯示每個不對稱單位含4個分子的SBD-G7複合體。4個SBD的整體結構與Cα中0.57到1.04的RMSD值十分相似。SBD-G7複合體的4個麥芽七糖配體結構可重疊在一起(J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)。除了仍位於SBD-G7複合體之G7中心的Tyr32以外，關鍵的芳香族殘基：Trp47、Tyr83、Tyr94及Phe58都面對同一個方向。雖然這些麥芽七糖的構形不盡相同，但是它們都可折疊成一種U形結構並配合Ro SBD的結合曲率，其主要的構形差異位於麥芽七糖分子的兩端。因此，SBD-βCD及SBD-G7複合體結構顯示SBD具有穩定的配體結合環境，可容納各式各樣不同構型及長度的糖類。
與配體結合前後的 Ro SBD
圖2顯示與配體結合之SBD、SBD-βCD複合體、SBD-G7複合體以及未與配體結合之SBD(PDB code:2djm)的疊加影像。SBD-βCD及SBD-G7複合體具非常相似的整體結構。與糖結合及疏水性環形堆積交互作用(hydrophobic and ring stacking interaction)有關的殘基均高度保留於這兩種複合體中。Ro SBD可接受不同的糖分子，幫助蛋白質結合後還能保持固定的構形。這些結果顯示SBD的糖結合位點相當固定且穩定。只要形成β-桶形支架並保存三個關鍵的結合位置：Trp47、Tyr83及Tyr94，便可與糖產生結合。已有研究報告報導βCD及G7複合體的結合分析結果，其Kd 值約為5μM。線性及較短的糖基質複合體，如麥芽三糖及麥芽四糖，其Kd 值約只有βCD及G7複合體Kd 值的二分之一。α-環糊精(αCD)複合體的Kd 值(約333μM)比βCD及G7複合體的Kd 值高許多，因為αCD之6個葡萄糖單位的圓環太小，以致於無法配合SBD的基本結合表面，使得結合能力大幅下降。
與配體結合前後的Ro SBD顯示相似的整體結構；SBD-βCD複合體Cα中的RMSD值為1.02，SBD-G7複合體中4個分子的RMSD值則為0.97-1.09。圖2A可觀察到三個主要的結構差異：Trp47(β34迴圈周圍)、Glu68(β45迴圈周圍)及Asn101(β78迴圈周圍)。圖2B及圖2C則顯示與直接疏水性及親水性交互作用有關的殘基比較。這些交互作用顯示與糖結合後會在β34迴圈周圍的位點I產生較大的構形改變，尤其是殘基Trp47、Asn50及Asn101，其中主鏈會呈現不同的方向。以位點I的關鍵芳香族殘基而言，與配體結合的SBD之Trp47的吲哚環會重新排列以與碳水化合物分子的糖環形成疏水性交互作用，然而Tyr83及Tyr94則未顯示結構差異。以位點II而言，Tyr32殘基會在同樣的方向，但與配體結合的SBD之Phe58的苯環則會倒轉以與葡萄糖交互作用(圖2B)。與配體結合的SBD中Asn50會往上彈並與βCD形成強健的氫鍵(NH2-O6:2.7)，Asn29則是用不同的方向促進與βCD間氫鍵的形成(NH2-O3:2.8)(圖2C)。
Ro SBD與其他CBM超級家族之澱粉吸附區的比較
An GA與Ro GA具相同的糖苷水解酶特性。然而An SBD及Ro SBD兩種蛋白質的SBD卻會折疊成不同的拓樸結構(J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)，並分別以其N端與C端與酵素催化區相連。若轉換二者的第一股及最後一股，可將兩種SBD的3D結構重疊在一起(圖3A)，相疊的結構顯示於圖3。大多數的CBM超級家族只有一個糖結合位點，然而An SBD及Ro SBD複合體都具有兩個糖結合位點。SBDSBD雖然這兩種蛋白質具有相似的糖結合位點，但仍可發現一些結構的差異(圖3A)，如糖結合區周圍的β34、β45及β78迴圈具不同的構形，提供An SBD及Ro SBD各自獨特的糖結合模式。
An SBD及Ro SBD兩種蛋白質的兩個結合位點之結構與功能不同，An SBD中位點I及位點II相對應的殘基為Trp543、Trp590(圖3B)、Tyr527及Tyr556(圖3C)。SBD位點I(W543)為澱粉的初始辨識位點，位點II(Y527)則可辨識不同方向的澱粉鏈。位點I含較大的表面區域，會因糖結合而改變構形，且為將配體固定於結合位置的特定位點。然而Ro SBD複合體的結構及功能分析數據顯示其與碳水化合物結合時，位點I(Trp47)是基本的結合位點，而位點II僅扮演輔助的角色。目前已知除Bh CBM26以外的大多數SBD超級家族中，與Trp47相對應的殘基均高度保留。
Tv AI與Ro GA具不同的水解酶特性，Ro SBD及Tv AICBM34兩種都屬於N端澱粉結合的CBM超級家族，並會折疊成同樣的第二類拓樸結構(J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)。雖然這兩種分子的序列相同度及相似度分別只有16%及36%，但二者的結構卻能高度重疊，尤其是二集結構中β股的部分。圖4A為Ro SBD及Tv AICBM34的立體結構重疊圖，其Cα鏈的RMSD值為1.6，然而其迴圈狀區出現部分結構差異，如β34迴圈及β78迴圈(圖4A)。Tv AICBM34的兩個糖結合位點與Ro SBD的方位相同，兩個糖分子則在互相垂直的方向。同時，此二蛋白質的兩個糖結合位點之功能角色相當；位點I及位點NA會專一地與配體糖分子結合，位點II及位點N則可辨識澱粉表面幫助酵素接近澱粉。
大多數的SBD超級家族，如Tv AICBM34、Bh CBM25及Ro GACBM21(Ro SBD)中具有獨特的碳水化合物結合曲率(binding curvature)。此主要蛋白質-碳水化合物相互作用的結合平台係由幾個關鍵殘基形成，如Ro GACBM21中的Trp47、Tyr83及Tyr94;Tv AICBM34中的Trp51、Tyr89及Tyr119；以及Bh CBM25中的His26、Trp34及Trp74(圖4B)。這些關鍵殘基出現於相似的位置，並以芳香迴圈的疏水性堆積作用結合糖分子(圖4B)。其中保留性最高的殘基為Ro SBD中的Trp47、Bh CBM25中的Trp74及Tv AICBM34中的Tyr89。結合曲率也會順著配體周圍移動以創造出緊密的結合口袋，並促使糖分子的至少3個葡萄糖單位彎曲成弧形以利結合。為與具不同催化功能的CBM相對應，結合位點II可辨識不同直鏈澱粉鏈的聯結，如α-1,4或α-1,6聯結。Ro SBD複合體的Tyr32及Phe58形成的結合位點II則與其他不同，其功能為辨識分枝直鏈澱粉(bramch amylose)且尚未於其他CBM家族(家族20、25、26、34、41、45及48)的SBD中發現。
澱粉及βCD的結合親和力
測定在複合體結構中與結合位點鄰近的基本胺基酸殘基可檢視多醣結合的機制。使用定量等溫結合反應曲線及螢光光譜分析，以測定Ro SBD突變體的特性(表2)。Ro SBD蛋白質單點突變處包括位點I(W47A,Y83A,and Y94A)及位點II(Y32A and F58A)與βCD及G7結合有關的芳香族殘基、兩個鄰近位點I及位點II的酪胺酸殘基：Y67A及Y93A、及位點I(N50A、N96A及N101A)和位點II(N29A、K34A及E68A)中與配體間直接氫鍵交互作用有關的親水性殘基。
實驗結果顯示與野生型Ro SBD的Kd 值相比，位點I突變體(W47A,Y83A,and Y94A)之澱粉及βCD的結合親和力降低(表2)，W47A突變體缺乏與βCD的結合親和力。W47A、Y83A及Y94A與澱粉的結合能力(Bmax )降低，尤其因為Tyr83位於位點I之結合曲率內，因此其Y83A的Bmax 最低，。位點I中W47A為識別澱粉主要的碳水化合物結合位點。至於位點II單點突變Ro SBD中Y32A及F58A，Y32A結合澱粉及βCD的Kd 值與野生型SBD的Tyr32相同。此外，Y32A對可溶性多醣結合的影響較小。F58A與澱粉結合的Kd 值增加，且在所有突變體中與βCD結合Kd 值最高，但是F58A對結合澱粉的能力幾乎無影響，與野生型SBD中Phe58的Bmax 相同。因此Phe58對澱粉及βCD的結合有很重大的影響，在位點II扮演關鍵的角色。
雖然在SBD-βCD及SBD-G7複合體中Tyr67和Tyr93並未直接與βCD和G7作用(圖1)，Y67A和Y93A單點突變卻明顯呈現較低的Bmax 及較高的Kd 值(表2)。特別是Y67A之Bmax (3.7μmole/g)大幅減少，為所有Ro SBD突變體中澱粉結合能力最低的。有趣的是，以結構為基礎的排列顯示Tyr67在大多數含SBD之CBM家族中的對應位置為一個芳香族殘基，Tyr93在大多數的CBM21超級家族中也高度保留(J.Y. Tung,M.D. Chang,W.I. Chou,Y.Y. Liu,Y.H. Yeh,F.Y. Chang,S.C. Lin,Z.L. Qiu,Y.J. Sun,Crystal structures of starch binding domain fromRhizopus oryzae glucoamylase reveal a polysaccharide binding path,Biochem J,416(2008)27-36)。本發明證實Tyr67在Ro SBD中扮演主宰澱粉結合能力的重要角色。
表2呈現Ro SBD中位點I(N50A、N96A及N101A)及位點II(N29A、K34A及E68A)之親水性殘基突變體的Kd 及Bmax 值。突變的N50A Bmax 較低，且在所有位點I及位點II突變體中其澱粉結合Kd 值(約10倍)最高。N50A的Kd 及Bmax 值歸因於Asn50和Tyr83間氫鍵作用的喪失，相關數據顯示Asn50必定在Ro SBD與不可溶性多醣結合時扮演重要的角色，並使位點I能維持完整性。突變體N96A及N101A(位點I)和K34A及E68A(位點II)與βCD結合都差，高Kd 值源於氫鍵作用的喪失。由此可知，位點I及位點II的親水性殘基在與可溶性或不可溶性多醣的結合作用中扮演相當重要的角色，可單獨或互相合作產生作用。
一種新穎的直鏈澱粉多醣-SBD結合模組
在Ro SBD複合體中，兩個碳水化合物結合位點I及II可藉由輔助性殘基Tyr67及Tyr93，穿過SBD表面上的11個胺基酸相連在一起。殘基Tyr67(β4-5迴圈)及Tyr93(β6-7迴圈)為連接兩個結合位點I及II的中點，並可為長鏈、較大的多醣、甚至澱粉產生連續的結合路徑(binding path)。此橫跨Trp47(位點I)、Tyr93、Tyr67及Tyr32(位點II)的潛在澱粉結合路徑長度約在45-60間，表面區域則約1,215。比較位點I及II強健又具專一性的結合位點，Tyr67與Tyr93周圍的連續結合區域對識別生澱粉或不可溶性多醣配體特別重要，但對可溶性及較小的碳水化合物分子如βCD及G7則較無影響。結合初始時位點I及II擔任可溶性或不可溶性多醣的結合標記，之後連續結合路徑可協助進一步地結合。從SBD-βCD複合體的分子堆積特性可測出一種新穎的直鏈澱粉多醣-SBD結合模組(圖5)，其中4個SBD分子排成一列並沿著垂直軸線堆積成一個螺旋形，βCD則構成連續的配體結合表面以模擬自然的直鏈澱粉螺旋形結構。雖然在直鏈澱粉結合模組中只顯示出Ro GA的N端區域(SBD)，但Ro GA的C端催化區由有彈性的連接肽以交錯的方式沿著垂直排列排在兩邊。將Ro SBD與Tv AICBM34中的Tv AI區相疊可模擬全長的Ro GA結構。直鏈澱粉結合模組及全長Ro GA模型，清楚證實酵素C端催化區的位置具合理的方向性，並不會阻礙SBD的多醣結合。藉由原子力顯微鏡(AFM)影像偵測，可知在An SBD中也有一個相似的直鏈澱粉鏈與SBD間結合模組。直鏈澱粉分子的平行股會在環狀結構中接到SBD的兩個結合位點，然後以SBD為模板配裝展開的直鏈澱粉雙螺旋。直鏈澱粉與Ro SBD之間的交互作用也可使用原子力顯微鏡測量(圖5B)。當將Ro SBD與直鏈澱粉一同混合定溫靜置，固態的直鏈澱粉外觀發生明顯的變化。原子力顯微鏡分析結果顯示如圖5C的直鏈澱粉瓦解模型。首先，Ro SBD接近直鏈澱粉聚集體並結合直鏈澱粉鏈的端點，其後Ro SBD鬆開直鏈澱粉聚集體以暴露出更多的多醣表面與Ro SBD結合。接著直鏈澱粉聚集體反捲以形成較小纖維，最後散開並轉變成較小的直鏈澱粉分子，如單一直鏈澱粉鏈。巨大絲狀的直鏈澱粉結構受Ro SBD破壞漸漸拆散，形成甜甜圈環形狀的Ro SBD。本發明的模型更進一步地提供一套原理，可解釋在自然界出現的SBD串聯重複序列，例如鏈球菌屬的普魯藍酶的Bh CBM26/CBM25串聯及CBM41串聯分子。其中單一SBD單位與多醣間的親和力很低，但多重SBD單位的配體結合親和力顯著提升。根據上述結果，本發明使CBM與長鏈多醣間交互作用的分子模組結構更清楚。以此模組為基礎的應用，包括調整SBD的連接肽或催化區組成及長度可製造出符合特定需求長度的寡醣，或將SBD連接螢光物質以定量多醣分子。
實施例2 重組SBD的製備
本發明建構幾種野生型及突變型SBD，包括SBD(SEQ ID NO：1)、SBD(ΔK108)(SEQ ID NO：2)、SBD(K108A)(SEQ ID NO：3)、SBD(K108R)(SEQ ID NO：4)、SBD(K108H)(SEQ ID NO：5)及SBD(K108D)(SEQ ID NO：6)，並使用pET-32a(+)為表現載體將SBD表現在大腸桿菌(Escherichia coli BL21 Gold(DE3))細胞中。蛋白質表現及純化係依據先前所述方法實行。使用BCA蛋白質分析套組(Pierce)測定蛋白質濃度，並以先前所述方法進行澱粉結合分析。
圓二色(Circular dichroism(CD))光譜學及熱穩定性分析
使用CD光譜儀(Aviv model 202)在0.1cm光析管中記錄CD光譜及熱穩定性。數據收集及計算則用依據先前所述方法實行。
飽和性結合試驗
將每份100μL純化的SBD(5到90μM)與1mg預先洗滌過的玉米澱粉(Sigma-Aldrich)混合並於25℃培養3個小時，然後用13,000×g 離心10分鐘。接著使用微量BCA蛋白質分析試劑套組(Micro BCA protein assay reagent kit(Pierce))測定未結合蛋白質的濃度。將最終蛋白質濃度減去最初濃度即可計算出被吸附蛋白質的數量。
胜肽設計與合成
與SBD的C端最後14個殘基相對應的合成胜肽CT-14(SEQ ID NO：7)及其各個殘基單點替換成丙胺酸的變異體(SEQ ID NO：11-27)，是由商業方式取得(Bio-Synthesis Inc.)，各胜肽的純度均大於90%。
以剛果紅分析原纖維的形成
製作新鮮的剛果紅溶液並使用0.2μm的過濾器過濾。將蛋白質溶液(100μg/mL)於37℃培養72小時後加入剛果紅(50μM)染色，再使用UV光譜儀測量波長範圍在400到600nm之間的吸光度。
以硫代黃素T(ThT)螢光分析原纖維的形成
將純化的SBD或合成的胜肽溶解於10mM檸檬酸鈉或磷酸-檸檬酸緩衝液中，使最終濃度為100μM(pH值則依指定數值調整)。將200μL可溶解蛋白質與10μM的2mL ThT溶液共同於37℃培養10分鐘，以證實β-澱粉樣原纖維的形成。使用分光螢光計(Perkin Elmer LS-55 spectrofluorometer)於25℃記錄。
將激發波長(狹縫寬度為4nm)設為450nm，並監測設定在470到630nm間的發射波長(狹縫寬度為8nm)。將測得的全部螢光減去緩衝液的背景訊號(波峰位於482nm)，即換算出原纖維聚集體的數量。
穿 透式電子顯微鏡(TEM)
將鍍銅網格放置在含SBD加熱形成澱粉樣原纖維的樣本10分鐘。清洗樣本以移除過剩的溶液，並用1%(w/v)的醋酸鈾醯(uranyl acetate)染色1分鐘。風乾網格然後用穿透式電子顯微鏡(Hitachi H-7500 TEM)依已知方法分析。
超高速離心法
用50,000rpm分別離心30μM(實線)及60μM(虛線)的SBD，以進行沈積速率的研究。記錄波長280nm的吸光度掃描圖譜。
原子力顯微鏡(AFM)
將野生型及變異型CT-14胜肽各別培養在10mM的檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.5)中，並調整最終濃度為100μM，於37℃分別培養0、6、12、24、48及72小時。將50μL的樣本溶液(25μM)分佈在新切割的雲母片上，於表面吸收10分鐘後，以10倍量的二次水(ddH2 O)清洗溶液並風乾之。使用具有氮化矽懸臂(JPK instruments,Germany)的生物式多功能原子力顯微鏡系統(JPK instruments,Germany)，以接觸模式獲偵測原纖維影像。
固態核磁共振(Solid-state NMR)光譜儀
使用布魯克進化300NMR光譜儀(Bruker Avance 300 NMR spectrometer,Rheinstetten,Germany)於75.47兆赫的13 C拉莫頻率(Larmor frequency)測量7.04特斯拉(Tesla)的NMR光譜。該光譜儀裝備有含4.0mm氧化鋯(zirconium oxide)MAS轉子的布魯克雙共振MAS探針。在13 C-CP/MAS實驗中，當1 H解耦(decoupling)電場強度為87.8千赫茲時，交叉極化接觸時間為1.0ms；rf 振幅為71.4千赫茲時使用3.5μs的質子90。脈寬。在擷取期間，當rf 振幅為79千赫茲時使用1 H TPPM解耦序列，循環延遲設為5秒。所有的MAS實驗都在環境溫度進行，並使用旋轉控制器調節樣本旋轉頻率在8.0千赫茲±1赫茲的範圍內。
SBD的熱誘導構象變化
米根黴菌GA中的SBD之3D結構是由8個β股組成。如同預期所示，遠紫外光(far-UV)CD光譜在波長215nm處有一個波谷，為β股結構的特徵(圖6A)。本發明中利用CD光譜學監測蛋白質折疊/去折疊現象。以波長215nm監測的SBD熱變性，顯示其於逐漸升高的溫度產生合作轉變(cooperative transition)的現象(圖6B的空心正方形)。在約65℃時，SBD的去折疊現象最為顯著。令人驚訝的是隨著溫度上升，該訊號的負值愈大，表示β折疊部份增加。此外，將SBD的C端殘基Lys108去除或替換成丙胺酸，則使此物理形態消失。有趣的是，當SBD的Lys108 被單獨替換成帶正電荷的殘基His或Arg時，SBD(K108H)及SBD(K108R)受熱處理依然產生強的β折疊信號(圖6B，空心圓形及空心三角形)。相反地，位置108帶負電荷的SBD(K108D)受熱處理十其β折疊訊號則逐漸減弱(圖6C，實心圓圈)。相關結果表示SBDC端的正電荷對構象變化過程的影響很大。此外，隨著溫度升高而逐漸增強的SBD CD光譜信號，證明原纖維的形成係伴隨蛋白質分子特定部位的排序集聚(圖6C)。另外，在Lys108處替換胺基酸對配體結合無重大影響(圖7)，顯示SBD變異體於正常情況仍然維持其結構及生物功能。由此可知，SBD C端的正電荷並不參與直接的配體結合，但卻為熱誘導原纖維形成所需。
測定熱誘導SBD寡聚化的特性
圖8顯示SBD的連續尺寸分佈概況(continuous size distribution profiles)，初始蛋白質濃度分別為30μM及60μM。低濃度(30μM)的SBD主要以單一的單體形式存在於溶液中，其s 20 為1.3S，與分子質量13,195Da相近。另一方面，高濃度(60μM)之SBD之沈降係數多重訊號分佈證實溶液中出現寡聚形式的SBD。利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native PAGE)可觀察SBD的寡聚化現象(圖9)。當加熱溫度上升、或加熱溫度維持不變，但令加熱時間增加時，SBD的寡聚化隨之增加。由此可知，SBD的寡聚化作用會依濃度及溫度的不同而變化。
鑑定SBD中原纖維的形成
剛果紅(Congo Red)是一種用於偵測澱粉樣原纖維形成的有用染料，其結合分析法可應用於測定於高溫形成的SBD結構之澱粉樣原纖維特性。當加熱高達97℃時，待側樣品之剛果紅吸光度光譜波峰之最高值產生明顯的紅色位移，從485到495nm移動至500到510nm(圖10A)。此外，亦可使用更敏感的螢光染料ThT偵測類澱粉聚集。圖10B顯示ThT發射強度的變化。加熱到97℃的SBD樣本其波長482nm的螢光發射強度增加9倍。剛果紅及ThT為檢測澱粉樣原纖維存在的指標。先行熱處理過的SBD會與剛果紅及ThT結合，證實獨特的澱粉結合CBM中出現澱粉樣原纖維的形成。
特性化形成原纖維的SBD
將SBD於37℃培養在2天，然後用穿透式電子顯微鏡(8000到12000倍的倍率)觀測，可觀察到SBD中高度組織的絲狀結構形成(圖11)，原纖維的平均直徑約為10到20μm。SBD的C端使得SBD受熱後能形成β-澱粉樣原纖維，其胺基酸特性扮演關鍵的角色。
鑑定SBD中形成原纖維的片段
很多研究已指出某些蛋白質的亞區(sub-region)或短胜肽片段，在澱粉樣原纖維的形成中扮演重要的角色。除此之外，各種具芳香族Asn或能與Asn芳香族共價鍵結的類澱粉胜肽普遍視為澱粉樣原纖維形成的起源點。由前述實驗藉果已知Lys108為必須的，所以合成不同突變體SBD的C端近尾端部位，包括CT-14(SEQ ID NO：7)、CT-13(SEQ ID NO：8)、CT-13’(SEQ ID NO：9)及CT-12’(SEQ ID NO：10)，以找出在形成原纖維之關鍵步驟中所需的片段(圖12A)。先於37。C培養CT-14胜肽，其ThT在波長482nm的螢光發射顯示澱粉樣原纖維的形成。但在同樣條件下，CT-13、CT-13’及CT-12’卻無陽性ThT(圖12A，虛線)反應。由此可知，SBD中第95到108的殘基是形成原纖維所需的最小基本片段。
原纖維形成胜肽的超微結構
依時間分佈的ThT偵測結果分析，顯示原纖維的形成為一種多步驟的過程(圖12B)，利用原子力顯微鏡可檢測不同時間CT-14原纖維的形態轉變(圖12C)。在0小時只能觀察到球狀結構，但於37℃培養6小時後便會開始形成微小的雛型原纖維(protofibril)。雛型原纖維漸漸伸長，並在第12小時可形成長度超過200nm的成熟原纖維。培養24小時後，原纖維不但繼續伸長同時也開始聚集在一起，此現象於第48到72小時之間最明顯。AFM測得之SBD纖維成長影像與482nm波長ThT信號逐步增強具一致性(圖12B)，因此可將SBD上第95到108的殘基片段定義為SBD初始化原纖維形成的亞區。
測定CT-14原纖維形成的決定性殘基
使用一組合成的CT-14胜肽類似物，進行丙胺酸掃描式突變分析(alanine scanning mutagenesis)，以鑑定CT-14胜肽中主宰原纖維形成的特定關鍵殘基。CT-14胜肽(SEQ ID NO：7)、CT-14(S5A)(SEQ ID NO：16)、CT-14(V10A)(SEQ ID NO：20)、CT-14(S11A)(SEQ ID NO：21)、CT-14(T12A)(SEQ ID NO：22)、CT-14(S13A)(SEQ ID NO：23)及CT-14(D1R＋K14D)(SEQ ID NO：27)的ThT發射光譜顯示其482nm的螢光強度上升，與野生型CT-14胜肽的結果相似(圖13A)；其他CT-14的變異體CT-14(D1A)(SEQ ID NO：12)、CT-14(D1K)(SEQ ID NO：11),CT-14(N2A)(SEQ ID NO：13)、CT-14(N3A)(SEQ ID NO：14)、CT-14(N4A)(SEQ ID NO：15)、CT-14(N7A)(SEQ ID NO：17),CT-14(Y8A)(SEQ ID NO：18)、CT-14(Q9A)(SEQ ID NO：19)、CT-14(K14A)(SEQ ID NO：24)、CT-14(K14D)(SEQ ID NO：25)及CT-14(D1A＋K14A)(SEQ ID NO：26)則都無法形成原纖維(圖13B)。這些數據與原子力顯微鏡觀察到的原纖維狀結構相一致(圖13C)。結果顯示CT-14胜肽中的Ser5、Va110、Ser11、Thr12及Ser13與原纖維的形成無關。另一方面，兩端帶電荷的殘基(Asp1及Lys14)及一個內部的Asn芳香族特徵片段(motif)(NNNxxNYQ，第2到9殘基)則為原纖維形成所需。本例子中CT-14胜肽的原纖維形成包含相反電荷對的交互作用與芳香環之間的堆積作用，如同之前報告中指出的，相鄰芳香環間的π鍵及電荷對之間的鹽橋能夠控制以及穩定β-澱粉樣原纖維的結構。綜合上述結果，可推斷兩端帶電荷的殘基(Asp1及Lys14)及NNN與NYQ特徵片段(分別為CT-14胜肽中的第2到4與第7到9殘基)為原纖維形成之所需。
原纖維狀CT-14胜肽的結構評估
近年來X光繞射分析及固態核磁共振法均可應用於測定澱粉樣原纖維之特性。因此使用固態核磁共振檢驗粉末狀及原纖維狀的CT-14胜肽，以測量13 C-CP/MAS(圖14A到14D)之特性。不規則卷曲(random coil)化學位移的正偏離(positive deviation)是α螺旋構形產生的指標，而負偏離則為β折疊構形出現的指標。粉末狀CT-14胜肽13 Cα化學位移的譜峰為51.4ppm(圖14A)，而原纖維狀CT-14胜肽13 Cα化學位移的譜峰則負偏離至50.9ppm(圖14B)；粉末狀及原纖維狀CT-14胜肽13 C=O化學位移的譜峰則分別出現於172.3及171.8ppm(圖14C及圖14D)。兩種負偏離數據均證明β折疊構形產生。總而言之，本發明證實CT-14胜肽主宰SBD含豐富β折疊的原纖維形成，關鍵因子為兩端帶相反電荷胺基酸對的交互作用及NNN與NYQ特徵片段的交互作用。
緩衝液與pH值對CT-14胜肽原纖維形成的影響
已知不同的pH值可改變胜肽的靜電荷，繼而影響β-澱粉樣原纖維的形成。在本發明中，首先將CT-14胜肽溶於10mM的檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.5)，經熱處理後再觀察原纖維的形成。因為檸檬酸鈉緩衝液的有效pH值在3.0到6.6的範圍間，因此測定原纖維形成的pH值分別設為3.5、4.5、5.5及6.5。磷酸-檸檬酸緩衝液的有效pH值範圍較寬，因此測定原纖維形成的pH值分別設為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0及8.0。圖15A及15B顯示pH值為3.5(接近Asp的pI值)時，與CT-14胜肽結合的ThT(溶於10mM檸檬酸鈉或10mM磷酸-檸檬酸)之482nm螢光發射強度減弱，主因為CT-14端點負電荷特性產生改變，無法形成相反電荷配對或鹽橋。當pH值增加到4.5、5.5或6.5時，在每個時間點測得之CT-14胜肽的螢光強度都比pH值為3.5之數據強。進一步發現當使用pH值為3.0或更低的磷酸-檸檬酸緩衝液時，螢光強度大幅下降到幾乎為0，表示在pH值為2.0、2.5及3.0時無法形成原纖維結構。在pH值為7.5及8.0的緩衝液中，ThT信號減低約20%至30%，推測應為接近Lys的pI值而導致中和作用所致。高於7.5的pH值會嚴重影響CT-14胜肽C端Lys殘基的離子特性，連動影響含豐富β折疊的原纖維形成。而當三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩衝液的pH值調到高於8.0時，在第72小時偵測到的482nm螢光發射強度很低，表示Lys14殘基的離子特性改變致破壞原纖維的形成。綜合而言，SBD中的原纖維生物合成需要一個pH值範圍為4.0到7.0的緩衝液系統，且必須維護在CT-14胜肽中兩端的Asp及Lys電荷對。
本發明的內容敘述與實施例均揭示詳細，得使任何熟習此技藝者能夠製造及使用本發明，即使其中有各種不同的改變、修飾、及進步之處，仍應視為不脫離本發明之精神及範圍。
任何熟習此技藝者均能從本發明中獲得足夠認知，以實行發明標的、達成目標、並獲得本發明中所提及或隱含之好處。其中熟習此技藝者將可能進行修飾或做其他應用，這些修飾已包含在本發明之精神中並於申請專利範圍中被定義。
圖1(A)顯示Ro SBD-βCD複合體的帶狀圖。βCD以棒狀結構表示。(B)顯示Ro SBD-G7複合體的帶狀圖。麥芽七糖以棒狀結構表示。(C)顯示Ro SBD-βCD複合體(1個βCD分子及2個Ro SBD分子)的帶狀圖。棒狀結構表示關鍵的芳香族殘基：位點I的Trp47、Tyr83及Tyr94和位點II的Tyr32及Phe58。(D)顯示Ro SBD-G7複合體。麥芽七糖以棒狀結構表示。
圖2(A)顯示Ro SBD與配體結合前後之3個主要的結構差異處，分別標示為Trp47、Glu68及Asn101。(B)顯示SBD-βCD複合體、SBD-G7複合體及未與配體結合的SBD之糖結合位點的重疊圖。棒狀結構表示在結合中扮演關鍵性角色的的疏水性殘基：Tyr32、Trp47、Phe58、Tyr83及Tyr94。(C)顯示SBD-βCD複合體、SBD-G7複合體及未與配體結合的SBD之糖結合位點的重疊圖。棒狀結構表示在結合中扮演關鍵性角色的的親水性殘基：N29、K34、N50、E68、N96及N101。
圖3(A)顯示Ro SBD(PDB編碼：2v81)與An SBD(PDB編碼：1ac0)複合體的構造重疊圖。其中包括3個主要的結構差異處：迴圈β34、β45和β78。Ro SBD的關鍵殘基Trp47、Tyr94、和Phe58及與其相對應之An SBD的殘基W543、W590和Y556也顯示在圖中。圖中未顯示βCD分子，以便地能清楚檢視結構差異。(B)顯示Ro SBD與An SBD複合體在結合位點I的構造重疊圖。棒狀結構表示Ro SBD的殘基Trp47、Tyr83和Tyr94及與其相對應之An SBD的殘基Trp543和Trp590。(C)顯示Ro SBD與An SBD複合體在結合位點II的構造重疊圖。棒狀結構表示Ro SBD的殘基Tyr32和Phe58及與其相對應之An SBD的殘基Tyr527和Tyr556。
圖4(A)顯示Ro SBD(PDB編碼：2v81)與Tv AICBM34(PDB編碼：1uh3)複合體的構造重疊圖。(B)顯示Ro SBD、Bh CBM25(PDB編碼：2c3x)與Tv AICBM34複合體在結合位點I的構造重疊圖。棒狀結構表示Ro SBD的殘基Trp47、Tyr83和Tyr94及與其相對應之Tv AICBM34的殘基Trp51、Tyr89和Tyr119，以及Bh CBM25的殘基His26、Trp34和Trp74。Ro SBD上的配體、Bh CBM25上的麥芽四糖及Tv AICBM34上的轉糖基阿卡波糖(transglycosylated acarbose)也以棒狀結構表示。
圖5(A)以立體圖形顯示直鏈澱粉的多醣-SBD結合模組。Ro SBD上的糖分子βCD以棒狀結構表示。與多醣結合有關之位點I的殘基Trp47及位點II的殘基Tyr93、Tyr67和Tyr32也以棒狀結構表示。Ro SBD的C端均加以標記。(B)加入Ro SBD時直鏈澱粉的超結構。於室溫將直鏈澱粉溶液與Ro SBD溶液共同培養16小時，然後以原子力顯微鏡(AFM)偵測之結構圖。【直鏈澱粉】與【蛋白質】的比例分別為(a)25ng/mL：30.55μM；(b)0.25μg/mL：30.55μM；(c)2.5μg/mL：30.55μM；(d)2.5μg/mL：3.06μM；(e)2.5μg/mL：0.31μM；及(f)2.5μg/mL：31nM。掃描尺寸為長5μm寬5μm。比例尺為1μm。(C)本發明之Ro SBD瓦解直鏈澱粉的模型。步驟1：接近。Ro SBD接近直鏈澱粉聚集體；步驟2：結合。Ro SBD與直鏈澱粉結合；步驟3：鬆開。Ro SBD鬆開直鏈澱粉聚集體以暴露出更多表面與Ro SBD結合；步驟4：解螺旋。Ro SBD令直鏈澱粉聚集體解螺旋使其變成較小纖維；步驟5：散開。Ro SBD最後會將纖維轉變成單一直鏈澱粉分子並使它們散開。
圖6顯示SBD遇熱誘導產生二級結構及構象的變化。(A)於25℃、10mM醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)中SBD濃度為50μM的條件，測得波長在200到260nm間的CD光譜。(B)監測215nm的遠紫外光(far-UV)CD光譜變化，以量測SBD的熱去折疊(Thermal unfolding)現象。(C)於不同溫度，記錄SBD波長在200到260nm間的CD光譜。
圖7顯示重組SBD變異體與配體結合的親和力。將重組蛋白質單獨與玉米澱粉於25。C共同培養3小時，接著以13,000 x g離心10分鐘，然後測出等溫結合反應曲線(binding isotherm)。
圖8顯示超速離心測得的SBD寡聚化現象。以50,000rpm的離心速度量測30μM(實線)及60μM(虛線)SBD的沉降速率。吸光度掃描的記錄波長為280nm。
圖9顯示加熱溫度及加熱時間對SBD寡聚化的影響。(A)加熱溫度對SBD寡聚化的影響。將15毫升的SBD(0.85mg/mL)於不同的溫度培養5分鐘：50℃(通道2)、60℃(通道3)、70℃(通道4)、80℃(通道5)及90℃(通道6)。(B)加熱時間對SBD寡聚化的影響。於60℃以不同時間培養SBD(0.85mg/mL)：1分鐘(通道2)、5分鐘(通道3)、10分鐘(通道4)、20分鐘(通道5)及40分鐘(通道6)。將15μL的蛋白質注入自然凝膠(native gel)(8%)的每個通道進行電泳，並以BSA(20μg)在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的結果(通道M)作為正控制組。
圖10顯示SBD原纖維的特性化。(A)熱處理或未經過熱處理時剛果紅(Congo Red)結合SBD樣本後的吸收光譜。(B)熱處理或未經過熱處理時，ThT結合SBD樣本之螢光發射光譜。
圖11顯示SBD原纖維的穿透式電子顯微鏡(TEM)影像。先將SBD樣本加熱到97℃，再經過兩天時間讓其慢慢回溫到37℃，接著與醋酸鈾醯(uranyl acetate)共染後以穿透式電子顯微鏡觀察。
圖12顯示CT-14胜肽中原纖維形成的特性化。(A)CT-14、CT-13、CT-13’和CT-12’胜肽的ThT結合分析。記錄波長在470到630nm間的ThT的螢光發射光譜(激發波長為450nm)。(B)將ThT加入CT-14並於37℃培養，然後紀錄其螢光發射光譜。(C)將從(B)中得到的原纖維化CT-14胜肽放置在新切割的雲母片上，並於不同的時間以原子力顯微鏡檢驗(比例尺=200nm)。
圖13顯示CT-14胜肽中原纖維形成的特性化。(A)6個CT-14胜肽的突變體(S5A、V10A、S11A、T12A、S13A及D1K+K14D)於37℃與ThT培養72小時，並以ThT測定原纖維的數量。(B)11個CT-14胜肽的變異體(D1A、D1K、N2A、N3A、N4A、N7A、Y8A、Q9A、K14A、K14D及D1A+K14A)分別於37℃與ThT培養72小時，並記錄其螢光發射光譜。(C)將從(A)中得到的原纖維化CT-14胜肽放置在新切割的雲母片上，並於不同的時間以原子力顯微鏡檢驗(比例尺=200nm)。
圖14顯示纖維形部份(CT-14)的結構特徵。(A)使用固態核磁共振儀(solid-state NMR)測量粉末狀CT-14胜肽之13 Cα化學位移並收集資料。(B)將CT-14胜肽培養在10mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.5)中72小時，以聚合成不可溶的原纖維。使用固態核磁共振儀測量原纖維化後CT-14胜肽的13 Cα化學位移。(C)使用固態核磁共振儀測量粉末狀CT-14胜肽之13 C=O化學位移。(D)將CT-14胜肽培養在10mM檸檬酸鈉緩衝液(pH 4.5)中72小時，以聚合成不可溶的原纖維。使用固態核磁共振儀測量原纖維化後CT-14胜肽的13 C=O化學位移。
圖15顯示CT-14胜肽原纖維形成與緩衝液及pH值之間的依賴關係。(A)將CT-14胜肽(100μM)培養在不同pH值(pH 3.5、4.5、5.5或6.5)的10mM檸檬酸鈉緩衝液或10mM磷酸-檸檬酸緩衝液中，然後與ThT於37℃培養10分鐘。利用光譜螢光量測術在波長470到630nm間掃描，以測量ThT的螢光發射光譜。(B)將CT-14胜肽(100μM)培養在pH值為2.0到8.0之間的10mM磷酸-檸檬酸緩衝液中，然後與ThT於37℃培養10分鐘。記錄波長在470到630nm間的ThT的螢光光譜。

Claims (14)

  1. 一種會形成原纖維的14殘基胜肽，其胺基酸序列為X1 NNNX2 X3 NYQX4 X5 X6 X7 X8 ，其中X1 和X8 代表一對具有相反電荷的胺基酸殘基，而X2 、X3 、X4 、X5 、X6 或X7 則代表一個在pH 7.4時側鏈為電中性的胺基酸殘基。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中該對具有相反電荷的胺基酸殘基由帶正電荷的殘基K、R或H，及帶負電荷的殘基D或E所組成。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中當X8 為K時，X1 為D。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中當X8 為D時，X1 為K。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中X2 為S或A。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中X3 為A。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中X4 為V或A。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中X5 為S或A。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中X6 為T或A。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其中X7 為S或A。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之胜肽，其胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
  12. 一種製造澱粉樣原纖維(amyloid-like fibril)的方法，包含加熱處理將如申請專利範圍第1項所述之胜肽溶解在pH值為4.0到7.0的溶液中， 供熟化原纖維。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該溶液係10 mM的檸檬酸鈉緩衝液或磷酸-檸檬酸緩衝液。
  14. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該原纖維可應用於碳水化合物分離、藥物投遞、發展生物可降解的3D支架、奈米線生產或奈米管的形成。
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