TWI385251B

TWI385251B - 利用乾冰顆粒之微型爆炸在轉染作用的設計

Info

Publication number: TWI385251B
Application number: TW099124780A
Authority: TW
Inventors: Fu Jen Kao; Yung En Kuo
Original assignee: Univ Nat Yang Ming
Priority date: 2010-07-27
Filing date: 2010-07-27
Publication date: 2013-02-11
Also published as: TW201204833A; US20120028356A1; US8415160B2

Description

利用乾冰顆粒之微型爆炸在轉染作用的設計

本案係關於一種轉染方法及系統，尤其本案係關於一種利用乾冰顆粒之微型爆炸的轉染方法及系統，使轉染作用的效率提高。

轉染(transfection)或轉殖技術是一種將去氧核醣核酸、核醣核酸分子或其他生物材料送入活體細胞的技術，作為研究基因及其表現的工具。目前基因轉殖的方法有下列幾種類型：(1)化學方法，通常使用磷酸鈣或陽離子聚合物，例如利用磷酸鈣沈澱法將質體DNA送入細菌，但效率約僅1%；(2)非化學方法，包括電穿孔法、超音波穿孔法(sono-poration)、光學轉染法(optical transfection)等，以電穿孔法為例，其係施加短暫電場於細胞，使細胞膜暫時性地產生一些對外開放的小洞，使質體DNA進入細胞，然而電穿孔法的成功與否繫於細胞及質體DNA製備之良窳，而且也並非適用於所有的細胞種類；(3)粒子轉殖法，包括基因槍、磁性轉染法(magnet assisted transfection)、穿刺轉染法(impalefection)等，以基因槍為例，其係以金屬顆粒作為載體，以高壓氣體加速金屬顆粒而將金屬顆粒上的生物材料送入細胞或組織，但須耗費氣體加速管、壓力膜、停止閥和真空密室等建置成本；(4)病毒法，其係將目標基因嵌入病毒基因，再將病毒感染宿主以期目標基因大量表現或抑制其他基因表現，然而病毒載體有基因容量限制及安全性疑慮等問題；及(5)其他方法，如雜交法、熱休克法、核轉染法(nucleofection)等。

然而，前述的基因轉殖方法仍存在一些缺點，包括較低的基因轉殖效率、較高的實驗建置成本、較複雜的實驗步驟、轉殖時對細胞或組織造成傷害、安全性疑慮等。

此外，美國專利公告號US 6,503,755揭露一種將核酸分子送入非附著細胞的方法，其係將配體(ligand)固著於固體表面，並且與非附著細胞表面的抗原結合，藉由攪拌方式使處於液體中的核酸分子有機會與非附著細胞產生碰撞而轉殖進入細胞內。然而，此技術需耗費技術於固定非附著細胞，當固定品質偏低，將直接降低核酸分子轉殖進入細胞的效率。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「利用乾冰顆粒之微型爆炸在轉染作用的設計」，能夠克服先前技術的不足，以下為本案之簡要說明。

本發明的轉染作用係利用類似生物彈道術的方法，以粒子為基礎達到轉染效果。首先將欲轉染的材料附著於乾冰顆粒表面或裡面，並將此乾冰顆粒噴灑於含有細胞的培養液或溶液表面。由於乾冰在常溫常壓下具有由固體直接昇華為氣體的特性，乾冰顆粒接觸培養液或溶液因受熱而瞬間昇華，在培養液或溶液內產生微型爆炸(micro explosion)，使附著於乾冰顆粒的材料因而獲得動能並突破細胞表面或組織表面而達到轉染的效果。由於球體積V=4/3 π r³，球面積A=4 π r²，r為球之半徑，故球之面積體積比A/V=3/r。此外立方體體積V=a³，面積A=6a²，a為立方體之邊長，故立方體面積體積比A/V=6/a。由上述A/V=3/r及A/V=6/a可知，當球或立方體體積越小，其面積體積比越大，當乾冰的尺寸降低至微米等級時，乾冰表面會受熱急速昇華汽化，產生相當於微型爆炸的現象。因此，本發明的轉染方法在實驗裝置或實驗手段上均遠比基因槍等粒子轉殖方法簡潔有效，並有效降低實驗成本，可送入細胞之生物材料尺寸以及實驗安全性也較病毒法高。

本發明之新技術可應用於生物技術之相關研究，包括原核細胞、真核細胞、植物細胞的轉殖及農業上新品種的開發等。因此，可選用的細胞包括細菌、真菌、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞，由細胞聚集而成的組織亦可成為實驗材料，而生物材料包括但不限於去氧核醣核酸、核醣核酸、互補去氧核醣核酸、小干擾核醣核酸、蛋白質、胜肽、病毒、粒腺體等。具有在常溫常壓下由固體昇華為氣體的材料均可成為運載生物材料的載體，包括乾冰、氯化氨、碘、萘、無水三氯化鐵、無水三氯化鋁等。

本案所提出之「利用乾冰顆粒之微型爆炸在轉染作用的設計」將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。

第1實施例

請參閱第1圖(a)至(c)的轉染方法，首先將DNA轉染片段2約10 Mbp(Mega bases pair)附著於尺寸約1至數十微米的乾冰1，惟乾冰尺寸必遠大於基因轉染片段長度，故該片段長度與乾冰尺寸並不於申請範圍中加以限制。DNA轉染片段2亦可依實驗所需置換為其他生物材料，如核醣核酸、互補去氧核醣核酸、小干擾核醣核酸、蛋白質、胜肽、病毒、粒腺體等。而DNA轉染片段2 除了可附著於乾冰1表面外，亦可混合於乾冰1內部。乾冰1亦可依實驗所需置換為其他具有在常溫常壓下由固體昇華為氣體的材料，如氯化氨、碘、萘、無水三氯化鐵、無水三氯化鋁等。接著，將帶有DNA轉染片段2的乾冰1直接噴灑於帶有細胞3的培養液4，乾冰1受熱昇華作用產生微型爆炸，DNA轉染片段2獲得動能得以衝破細胞膜進入細胞3內部。除了DNA轉染片段2得以進入細胞3內部，乾冰1亦有可能連同DNA轉染片段2進入細胞，但由於乾冰經過熱昇華作用轉變為二氧化碳氣體，且二氧化碳濃度相當低，對細胞並不具傷害性。DNA轉染片段2再嵌入細胞3的基因組，或是自行在細胞3內表現。

在此實施例中，培養液4在容器內的高度約與細胞厚度相同，使帶有DNA轉染片段2的乾冰1接觸培養液4至進入細胞3的路徑縮短，而培養液4亦可依實驗所需置換為其他液體，如無菌水、含有機離子/無機離子之溶液等。

第2實施例

請參閱第2圖(a)至(c)的轉染方法，首先將DNA轉染片段2附著於粒子A表面，再將粒子A附著於尺寸介於5至數十微米的乾冰1。在此，粒子A亦可混合於乾冰1內部；而粒子可選用奈米金粒子、奈米銀粒子、奈米鑽石等。接著，將帶有粒子A的乾冰1直接噴灑於帶有細胞3的培養液4。如同第1實施例所述，乾冰受熱昇華產生微型氣爆，使帶著DNA轉染片段2的粒子A一起獲得動能得以衝破細胞膜進入細胞3內部，或者僅DNA轉染片段2進入細胞3。由於粒子A相對於DNA轉染片段2等材料具有較大密度，因此，粒子A更能獲得更大的動能，而使DNA轉染片段2進入細胞3的機率提高。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由本領域技術人員做任何修改，但不脫離如所附權利要求所要保護的範圍。

1‧‧‧乾冰

2‧‧‧DNA轉染片段

3‧‧‧細胞

4‧‧‧培養液

A‧‧‧粒子

第1圖(a)至(c)為本發明的轉染方法之第1實施例示意圖。

第2圖(a)至(c)為本發明的轉染方法之第2實施例示意圖。

2‧‧‧DNA轉染片段

3‧‧‧細胞

4‧‧‧培養液

Claims

一種轉染方法，包括：(a)將一基因片段附著於一乾冰；(b)將該乾冰加入含有細胞的培養液；以及(c)該乾冰因一氣爆而將該基因片段送入該細胞。
如申請專利範圍第1項所述的方法，其中步驟(a)還包括：(a1)先將該基因片段附著於一粒子，再將該粒子附著於該乾冰。
如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該粒子與該基因片段均進入該細胞，或者僅該基因片段進入該細胞。
一種轉染方法，包括：(a)將一生物材料附著於一第一材料，該第一材料於常溫常壓下由固體昇華為氣體；(b)將帶有該生物材料的該第一材料加入含有細胞的培養液；(c)昇華該第一材料，使該生物材料進入該細胞。
如申請專利範圍第4項所述的方法，其中步驟(a)還包括：(a1)先將該生物材料附著於一第二材料，再將該第二材料附著於該第一材料。
一種轉染系統，包括：一細胞；一第一材料，於常溫常壓下由固體昇華為氣體；以及一生物材料，附著於該第一材料，帶有該生物材料的該第一材料經過一昇華作用而將該生物材料送入該細胞。
如申請專利範圍第6項所述的轉染系統還包括一第二材料，該生物材料附著於該第二材料，且帶有該生物材料的該第二材料附著於該第一材料。
如申請專利範圍第6項所述的轉染系統，其中該第二材料與該生物材料均被送入該細胞，或者僅該生物材料被送入該細胞。
如申請專利範圍第6項所述的轉染系統，其中該細胞包括細菌、真菌、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞，該生物材料包括去氧核醣核酸、核醣核酸、互補去氧核醣核酸、小干擾核醣核酸，該第一材料包括乾冰，且該第二材料包括一奈米粒子。
如申請專利範圍第9項所述的轉染系統，其中該奈米粒子包括奈米金粒子、奈米銀粒子、奈米鑽石粒子。