TWI373523B - Novel strain of bacillus amyloliquefaciens and its use - Google Patents

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1173523 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本案係關於一種新顆液化殿粉穿抱桿菌菌株一Bacillus s，尤其’本案係關於一種新穎液化澱粉芽孢桿菌 菌株一及zaY/ws amy/o/每似Ba-BPDl或其突變株，用以產生 多種酵素、多種抗生物質及生物表面活性劑。 【先前技術】 微生物及其產物已被廣泛應用以增進人類生活，例如在食 品、酒類、藥物、化學工業及農業等方面。這些應用大量地降低 生產及/或處理成本以及滿足人類需求。 某些微生物生產酵素以分解巨分子。例如，耶氏酵母菌 (yflmnWa处〇/声生產脂質分解酵素(解脂酶)用以降解橄欖研磨 廉污水處理的化學需氧量(chemical oxygen demand，COD)(15);綠膿 桿菌(Psewcfomowas izen/gewosfl)生產鹼性蛋白酶用以水解皮革製造 工業的主要蛋白固體廢棄物—動物肉質(14);及土類菌(乂少 ierrews)生產緩曱基纖維素酶(carboxymethyl cellulase, CMCase)用 以生物降解木質纖維素廢棄物(lignocellulosic waste)⑺。然而，這 些微生物被證明其主要酵素功能在於分解一種受質。當處理都市 污水中更複雜的成分時’加入多種微生物以降解多種巨分子是必 要且無可避免的。這將增加成本、降低經濟效益，而且處理過程 將更複雜。.再者’這些添加的微生物可能相互競爭生長優勢。若 一種微生物具有生產多種酵素的能力但只能應用於一種領域，此 微生物的經濟效益比其他具有產生多種酵素的能力及應用於多種 領域的微生物低。 5 13.73523 除了生物降解有機廢棄物，微生物也可生產抗生物質以拮抗 其他真菌或細菌。一般說來，抗生物質是由真菌生產或萃取且應 用於醫藥方面。然而，植物、果實及動物在成熟及生長時也面臨 真菌或細菌感染。傳統的殺真菌劑、殺細菌劑及化學合成藥劑不 抑制真囷及細囷感染，而且危害人體及環境。若細菌被發現能 生產生物性的抗生物質以抑制真菌或細菌生長，此菌株將有益於 農業及畜牧業。 . 近來，由微生物生產的獨特雙性(amphiphilic)生物性化合物— • 生物表面活性劑，已在有機及金屬污染地區的復原上顯現出多種 潛在的應用⑶。生物表面活性劑可降低表面張力、穩定乳化作用及 促進泡沫生成，而且通常不具毒性且可生物降解。生物表面活性 劑分為醣脂質(glyC〇lipid)及脂蛋白(lip〇pr〇tejn)兩類，其中脂蛋白包 括由枯草桿菌淨ad//⑽Sp.)生產的伊枯草菌素(iturin)、表面活性素 (smfactin)及豐原素(fengycin)等。生產生物表面活性劑的微生物在 碳氫化合物污染區域的生物復原上扮演重要角色。生物表面活性 劑也可用於促進油類回收，被認為在環境保護上具有其他應用潛 鲁力。其他應用包括殺草劑及殺蟲劑的劑型、清潔劑、保健及化妝 品、紙漿與製紙、煤炭、紡織品、陶器處理及食品工業、触礦處 理及泥碳機械脫水。 因此’若微生物被魏能生產多轉素及分子，此微生物將 有益於人賴生活及贿。本案ψ請人鑑料知技射的不足， 經過悉心試驗與研究’並-本義不捨之精神，終構思出本案「新 穎液化殿粉芽孢桿菌菌株及其應用」，筛選出的及

Ba-BPDl與其他微生物相較，具有生產上述酵 素、抗生物質及生物表面活性劑的能力’能夠克服先·術的不 6 1373523 足’以下為本案之簡要說明。 【發明内容】 本案提ίϋ選出的菌株’其具有特定的16S_體臟 (nbosomal RNA，fRNA)序列’分類為統殿料孢勤 ㈣/咖Ba-BPDl)，其財團法人食品工業發展研^所專利 微生物寄存編號為BCRC 910395。此新穎菌株生產且 益的酵素，例如脂質分解酵素用以分解脂質、澱粉解酵素用以 • 水解澱粉、纖維素分解酵素用以水解纖維素、及蛋白分解酵素用 以水解蛋白質。 〃 由於有機物質存在於污水中，生產多種酵素的新穎液化澱粉 芽孢捍菌(及似Ba-BPDl)應用於處理污水、水管道 系統、動物飼料、廚餘處理，以增進污水中的有機物質分解以及 污水、垃圾處理過程的品質及效率。因此，此新穎菌株及其酵素 可被製作成清潔劑並應用於除污及食品製造。 再者’該生產多種酵素的新穎液化澱粉芽孢桿菌應用於農 _ 業’包括青儲接種菌(silage inoculants)、家畜糞肥處理及動物飼料 組成的益生菌(Direct Fed Microbials)。 再者，由於其將巨分子分解為簡單有機分子的酵素活性，篩 選出的5. amy/i?/每Ba-BPDl可促進植物生長。 此外，由及似Ba-BPDl生產的血栓分解酵素 可水解血栓’以致於降低血液中的血栓量’預防及治療心血管疾 病、栓塞、動脈硬化、子宮内膜異位及癌症。因此，血栓分解酵 素可促進人類及動物的健康。 此外，分離出的5. Ba-BPDl生產抗生物質 7 1373523 素、表^性素及豐原素)及表面活性劑。尤其， '、疋9伊括草菌素A及其同源物。伊枯草ϋ素、表面活 ，素及豐原素屬於紐肽，對預防及治療真/或細賊染有 贫，而适些感染的對象為植物、動物及果實。 此外，5.咖3；/0%we/fldmBa七pm生產生物表面活性劑，包 括表面活性素、伊枯纽f原素，用以抑繼物病原菌及動 物病原菌的生長，並具有抗生物質生產的潛力。

本木另目的係k出新穎囷株—_β amyloliquefaciens Ba_BPDl及/或該菌株所生產的抗生物質，做為抗真菌劑，用以抑 制屬於下列組成群組中至少-種真誠屬之生長，該組成群組包 括：灰黴菌屬(及汾％·〇、刺盤孢屬（co//eto/r/dmw)、絲核菌屬 (Rhizocionia)、鐮胞菌屬(Fusarium)、小菌核屬(Scierotium)、交錯 ’黴蛰M (Altemaria)、疫徽慝(Phytophthora)、魏蛰屬(Aspergillus)、 月徽逢屬（Penicillium)、盤多毛抱屦（pes(ai〇fi〇pSis)反球二抱屬 (Botryodiplodia)。 其中’該真菌感染源自下列組成群組的真菌：百合灰黴病菌 (5〇的他β//^ρίίαζ)、玫塊灰徽病菌(及c/werefl[)、樣果炭症病菌 (G/omere/Za cz>^w/ato)、香煮炭疽病菌（Co/Zeioinc/mm mwscte)、甜柿 氣痕病菌（Colletotrichum gbec^porioides)、水稻 SL 括誇、槐镜 (Rhizoctonia solani)、统I鐮版蛰(Fusarium oxysporum f· sp.pisi)、 番茄鐮胞菌似Www f_ sp. /少cc^erdcz·)、蘭花鐮胞菌 (Fw如riwm⑽/㈣·）、荔枝鐮胞菌(尸奶加腕w/am·)、百合白絹病菌 (5c/汾*6>如所r<?你ϊ Saccardo)、蘋果褐斑病菌(J/imzana wa/〇、甜椒 疫菌(Phytophthom capsici)、洋惠票、觀菌(AspergiUus niger)、柏结青 徽菌(Penicillium italicum)、蓮霧栗腐菌(Pestalotiopsis eugeniae)JSi 8 B73523 緣果每賤畜(Botryodiplodia theobwmae)。 本案另提出新賴菌株一B. amybliquefaciens Ba-BFDi及/或該 囷株所生產的抗生物質，做為抗細菌劑，用以抑制屬於下列組成 群組中至少一種細菌菌屬之生長’該組成群組包括：伊文氏桿菌 屬(£>*wzma)、嗜酸桿菌屬、農桿菌屬、 伯免I德m屬(Burholderia)、脾桿菌屬(Enterobactor)、假單跑菌屬 (Pseudomonas)、青枯菌屬伽nia)、黃色單胞菌屬 (Xanthomonas)、芽孢桿菌屬(Backus)及沙門桿菌屬(βαίηιοηβίία)。 Φ ..其中’該細菌感染源自下列組成群組的細菌：細菌性軟腐桿 菌(Envinia chrysanihemi 反 Erwinia carotovom s\ibsp. carotovora)、 瓜類細菌性斑點菌(☆/而αν例此subsp· 、癌腫菌 tee/ade财）、石竹科花卉細菌性萎凋菌 (BwMdeHa caryophyUi)、茭白細菌性基賤菌（Enier〇bact〇r 、揚桃細菌性斑點菌(户⑽《/⑽⑽似5^n>2g<2e)、青枯病菌 咖&―0/麵ce_m)、柑桔潰瘍菌体^认⑽似⑽啊也pv _·)、蘇科植物細菌性斑點菌pv _ vesicaioria)、十字花科黑腐菌认anih〇m〇nas campes的 p ⑺的、水稻白葉枯菌(及⑽撕〇_ 〇%從ρν 、仙人 掌桿菌(BaciHus cereus)及沙門氏菌(SalmoneHa)。 再者，篩選出的及⑽少似Ba_BPD^為抑制真菌及 /或細菌生長的抗微生物製劑，抗真菌劑抑制屬於下列組成群組中 的真菌生長：百合灰黴病菌、玫瑰灰黴病菌、檬果炭疽病菌、香 蕉炭疽病菌、甜柿炭疽病菌、水稻立枯絲核菌、豌豆鐮胞菌、番 茄鐮胞菌、蓮花鐮胞菌、荔枝鐮胞菌、百合白絹病菌、蘋果褐斑 病菌、甜椒疫菌、洋蔥黑麴菌、柑桔青黴菌、蓮霧果腐菌及檬果 9 抗細菌劑抑制屬於下列組成群财的細菌生長：細菌性 菌、=j類細斑點菌、癌腫菌、石竹科花卉細菌性萎祠 仙人掌桿3綱=娜囷、恤葉枯菌、 性素抑制家畜及食物的病賴生長，並防及/或治 ίΓίί 料祕或植物。此外，由於對環境無毒及較佳 人物降解特性，表面活性素被廣泛地應用於清潔劑、化妝品、 艮品、樂物、錢#、農餘環境保護等方面。 ,」艮據上侧想，_選出敝伽爾卿加細削的應用 型悲為全液態培養液(whole broth culture)、上清液、可濕性粉劑 (wettable powder) ^ ^}(Μ) >，Jc^^^^#J(water dispersiWe granule)、水懸劑(suspensi〇n c〇ncemrate 〇r c__0及 微膠囊形式(microencapsulation)。 本案另-目的係提出專利微生物寄存編號為BCRC 9i〇395的 液化殺粉芽抱桿菌的筛選突變株’其具有特定的職亥醣體序列 (SEQIDN〇:l)。 本案另一目的係提出包括具有專利微生物寄存編號為BCRC 910395的液化澱粉芽孢桿菌的組合物。 【實施方式】 本案所提出之「新穎液化澱粉芽孢桿菌菌株及其應用」將可 由以下的貫施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可 以據以完成之’然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其 實施型·％，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例的精神 Π73523 推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。 實施例1 :新穎液化敕粉笫孢桿菌的锫徵 新穎液化澱粉芽孢桿菌(5. Ba-BPDl)是由發 明人自会中縣裂山的土壤篩選出來’並且進一步培養、鑑定及保 存。當培養5. Ba-BPDl時，接種其單一菌落並

.隔夜培養於 6 ml 的 LB 培養液(Lmia-Bertani，Miller，Difco)。培養 後的菌液再以1/100比例接種於500 ml LB培養液，於30。(：、ISO rpm培養6天。 φ 此外，及也抑we/fldews Ba-BPDl與其他細菌相較，具有特

定的16S核醣體RNA序列，其部分的16S核醣體序列被定序，且 將於2009年12月31日公開於美國國家生物科技資訊中心網站 (National Center for Biotechnology Information, NCBI http://www.ncbi.nlm.gov/Genbank/)，其 GenBank 序號命名為 EF137183。如後所述的該部分16S核醣體序列(SEQEDNO:l)成為 1373523 物、1.0%可溶性澱粉及1.5%洋菜)上。將YSA培養基置於3〇〇c培 養2至3天。培養後，以3至4 ml蛾液(含0.3% (w/v)蛾及3% (w/v) 碘化鉀(potassium iodine))覆滿YSA培養基，於5分鐘内測量及

Ba-BPDl的菌落大小及溶解圈(clearz〇ne)大小。 培養基變成藍黑色表示澱粉未被水解，然而，菌落周圍的溶解圈 表示殿粉被水解。三重複的結果顯示菌落直徑及溶解圈大小分別 為 1.57 cm 及 2.81 cm。

Ito等人(19.98)也證實嗜鹼性枯草桿菌生產鹼性胞外清潔酵 # 素’包括α_殿粉酶’應用於強效清潔劑及自動洗碗機清潔劑，用 以分解污水裡的激粉(12)。因此’及5 Ba_BPDl生 產的澱粉分解酵素可以應用於水解污水、廢棄物、農業及食品業 的澱粉。 竟施例3 :及g/yivfe/iVyKgf“dg/^Ba-BPDl生產的胥白分解睹音 為了證明及你cz’e似Ba-BPD. 1生產蛋白分解酵素(蛋 白酶)水解蛋白質，蛋白水解測試如下所述β 5 β叫也/ζχβα·_ Ba-BPDl的菌液如實施例2所述製備。將50 μ1菌液滴在1 em•直 φ 徑的濾紙上’再放置於脫脂乳洋菜培養基(skim milk agar (SMA) plate，含 1.5%脫月旨奶粉、1 3%營養液(nutrient broth, NB)及 1.5%洋 菜)上⑹。將此SMA培養基以30。(：培養2至3天，測量及 ★ Ba-BPDl的菌落大小及溶解圈大小。菌落周圍的 溶解圈表示脫脂乳中的蛋白質被細菌水解。三重複的結果顯示菌 落直禮及》谷解圈大小分別為1 77 cm及3.61 cm。

Kumar荨人(2〇〇8)發現綠濃桿菌生產驗性蛋白酶，用以水解皮 革製造工廠產出的蛋白固體廢棄物(岣。此外，Dr〇uin等人(2〇〇8) 6且貝地衣芽孢桿菌(及2也/奶为，讯的生產的蛋白酶對污水污 12 1373523 /有蛋白水解活性（}。在貫施例3中，丑.吻咖似 Ba-BPDl生產的蛋白分解酵素也可應用於污水、廢棄物、農業及 艮〇口業的蛋白水解’並可製造為清潔劑或洗衣劑的成分。 宜施例細/g财Ba-BPDl生產的蠘維素分解酴音 為了證明及awyo/iXaci’ens Ba-BPDl生產纖維素分解酵素 (纖維素酶）水解纖維素，纖維素水解測試如下所述。及 ⑽·m Ba_Bpm菌液如實施例2所述製備。將％ w菌 液滴在1 cm直徑的濾紙上，再放置於Mandel_Reese(M R)洋菜培 Φ 養基(含 10%羧甲基纖維素(carboxyl methyl cellulose，CMC)、0.1% 消化蛋白(peptone)、0.03%尿素、0.14% (NH4)2S04、0.2% ΚΗ2Ρ04、 0.04% CaCl2.H20、0.03% MgS04.7H20、5χ HT4% FeS04.7H20、 1.4x103% ZnS04.7H20、1.6xl0·3% MnS04.4H20、2X10"4%

CoC12.6H2〇及l·5%洋菜’調整pH至6 〇並滅菌）（坤。此M R洋 菜培養基於30°C培養2天後，將3至4 ml的0.1%剛果紅(c〇ng0 Red)覆滿M-R $菜培養基30分鐘’再以1 μ氣化鈉溶液洗去未 結合的剛果紅，剛果紅藉由氫鍵形成團塊(aggl〇merate)或膠體 鲁 （c〇U〇id)、再與纖維素結合，而溶解圈的形成表示纖維素未與剛果 紅結合。二重複的結果顯示5. Ba-BPDl形成的 溶解圈直徑為2.3 cm。

Alam等人(2008)證實哈茨木黴(Γπμ〇办心rz以⑽所)生產 纖維分解酵素用以在污水污泥的生物轉換上水解纖維素⑵。 Sangave 及 Pandit 於 2006 也發表纖維素 降解活性的前處理步驟，以將纖維素轉化為簡單的生物分子〇9)。 由於M-R洋菜培養基的主要成分是羧曱基纖維素所以及 似吵/〇/矽從似Ba-BPDl可生產纖維素分解酵素以消化纖維素 13 1373523 及在消化時親翻環是相㈣_ ^此，由於齡素分解酵 素的生產及水解活性，及㈣/〇/_加‘咖Ba_Bpm在處理廢水的 纖維素上具有顯著的經濟價值。新顆菌株—及^/

Ba-BPDl可以生產纖維素分解料，肋水解廢棄物處理的纖維 素。 宜雜例5 :及⑽ν/ο/ι’ΑΓΜ咖咏财Ba_Rpm生產的脂質分蛘蟀辛 為了證明及⑽少⑽’ewBa-BPDl生產脂質分解酵素(解 脂酶）以分解脂質，解脂酶水解測試如下所述。首先，接種及 • <ac_Ba_BpDl的單一菌落於5ml營養液，再以30〇C、 150 rpm培養1天。之後’將5 μ1的培養菌液滴在玫瑰紅3洋菜 培養基(Rhodamine B agar plate，含1%撖欖油、0 001%玫瑰紅Β 及I.5%營養洋菜)上，於3〇°C培養7天。做為染劑的玫瑰紅Β嵌 入脂質，在例如螢光顯微鏡的生物技術應用上做為螢光標誌。溶 解®表示脂質被水解，且玫瑰紅B無法嵌入脂質。因此，實驗結 果發現5. 顯現螢光菌落，且菌落周圍 的溶解圈直徑為0.6 cm。 鲁 Ertugrul等人於2007年發表：枯草桿菌屬生產的解脂酶顯現 其於分解撖欖研磨廠污水組成、甘油三乙酸酶(triacetin)、聚山梨 醇酯80 (Tween 80)及乳清(whey)等的解脂活性⑻。甚至，固定化的 解脂酶(immobilized lipase)被用於具有高油及油脂濃度的污水的水 /1 _ 解。因此，及Ba-BPDl生產的脂質分解酵素 可應用於污水、廢棄物、農業及食品業的脂質分解。 實施例6 :及awy/<?//<yng/^dg财Ba~BPD1决％的血於合链疲音 纖維蛋白(fibrin)為負責止血的關鍵性血液成分，已被廣泛地 做為組織工程的多功能生物聚合物骨架。單獨的纖維蛋白或愈盆 1373523 他材料結合(例如纖維蛋白原(flbrin〇gen)*凝血酶(thr〇mbin))已被 用於幹細胞或初生細胞的生物骨架，用以再生脂肪組織、心臟組 織、軟骨、肝臟、神經域、眼球組織、皮膚、輯及勤帶，並 顯現組織再生及傷口癒合的重大潜力⑴。·然而，是纖維蛋白在血管 或〜臟凝集為血栓(fibrin clot或thrombus)，將導致心血管疾病或 使人致死(1〇)。枯草桿菌屬菌株被證明生產血栓分解酵素用以藉由 自纖維蛋白溶酶原（plasmin〇gen)形成具活性的纖維蛋白溶酶 (plasmin)或藉由直接血栓溶解(flbrin〇lysis)分解血检。因此，由微 • 生物生產的血栓分解酵素在組織再生、傷口癒合及性命急救上相 當重要。 在本發明中，接種及⑽^BaBpD1的單一菌落 於5 ml營養液’於3〇°c培養12小時。離心5 ml營養液中的1〇〇 μ1 菌液後，將20 μΐ上清液滴入事先以tip在挖出的纖維蛋白洋菜培 養基(fibrin agar plate)的淺洞内，再將該纖維蛋白洋菜培養基以 37 C培養12小時，觀察其溶解圈的形成。結果顯示溶解圈直徑為 1.8 cm’證實及⑽少滅㈣/⑽·ewBa_BPD1具有生產血栓分解酵素 φ 以水解血栓的能力，並涉及例如血栓形成(tbrombosis)、動脈硬化 (arteriosclerosis)、子宮内膜異位(endometriosis)及癌症的病理狀態。 實施例7 :及财Ba-BPD1生產的伊枯草菌音及眷 原素 伊枯草菌素（一種生物表面活性劑）是一種抗真菌脂胜肽 (antifimgal lipopeptide) ’做為一種具生物活性的微生物二次代謝產 物’並顯示具吸引力的抗生素特性⑼。枯草桿菌屬生產的伊枯草菌 素A(iturin A)與固醇分子在致病真菌(例如立枯絲核菌⑺ 如/am·))的細胞膜表面形成複合物’以致於擴大離子通道大小、改 15 13.73523 變膜滲透壓，並進一步導致致病真菌的菌絲分解及抑制孢子萌 芽。由此達到植物病原菌的抑制效果。因此，伊枯草菌素A及枯 草桿囷屬被應用於飼料及/或食物保存，動物及植物的預防及/或治 療，可用於工業、農業、環境的生物降解及清除的表面活性素(或 .生物表面活性劑），以及做為動物及/或植物感染的抗生素〇7)。 °月參間弟1圖’為根據衣案實施例7，由β. amyloiiquefaciens Ba-BPDl生產的伊枯草菌素a的液態色層分析儀/飛行時間質譜儀 (liquid chromatography/time-to-flight-mass spectrometry, LC/TOF-• MS)分析圖譜。在第1圖中’伊枯草菌素A同源物(A2至A8)的分 子量鑑定為 1043、1057、1065 ' 1079、1095 及 1119 Da，這些伊 枯草il素A同源物及及訓少/〇/每“你咖似Ba-BPDl可應用於食品 業及農業。 豐原素是另一種由枯草桿菌孤祕/的生產的具生物活 性的脂胜肽及抗真菌物質，在5.⑽结抗葫蘆粉黴菌 ⑽ca，cucurbit powdery mildew) (4,18)扮演重要角色。 如同伊枯草菌素A，豐原素也應用於飼料及/或食物保存，做為工 ^ 業、農業、環境的生物降解及清除的表面活性素(或生物表面活性 劑），以及做為動物及/或植物感染的抗生素。 請參閱第2圖’為根據本案實施例7，由5. amj/o/句瓜 Ba-BPDl生產的豐原素的LC/TOF-MS分析圖譜。在第2圖中， 豐原素同源物的分子量鑑定為1449、1463、1477、1491及1505 Da， 這些豐原素同源物及5.Ba-BPDl可應用於食品 業及農業。 實施例8 :及flwv/0/tVyMgfac/gfts Ba-BPDl生產的表面活性素 表面活性素是一種細菌性環狀脂胜肽或表面活性劑，做為抗 16 1373523 生物質，其雙性(amphiphilic)特性幫助此物質存在於疏水及親水兩 種環境。例如，表面活性素在牛奶中可顯現其對大腸桿菌 (五^/^咖/^⑺❼的抗微生物活性“乂對牛奶殺菌⑼❶…^叩等人 (2008)證實表面活性素具有對柴油污染的水及土壌的生物降解能 力(20)。因此，表面活性素可以做為食品製造及食品保存的殺菌劑， 並做為工業、農業、環境的生物降解及清除的表面活性素(或生物 表面活性劑）。 為了證明及副咖/如吻咖似Ba-BPDl可生產表面活性素， φ 大規模的及㈣句w吻咖财Ba-BPD 1菌液及表面活性素製備如 下。以 30°C、200 rpm 培養 5. amy〇%we/acie肋 Ba-BPDl 16 小時， 培養後的菌液再以1/100比例接種於Cooper’s培養基，並於3〇°C 培養120小時。Cooper’s培養基為具有4%葡萄糖的無機鹽類 (mineral salts，含 0.05 M NH4N〇3 ' 0.03 Μ ΚΗ2Ρ04、〇.〇4 Μ Na2HP04、8.0ΧΚΤ4 Μ MgS04、7.〇χ1(Τ6 Μ CaCl2、4.(Μ(Γ6 Μ FeS04 及 4.〇xl〇6MNa2ethylenediaminetetraacetic acid (Na2EDTA))。 離心移除菌體後，加入濃鹽酸至万.β—/ο/每Ba-BPD 1 φ 培養菌液’分離出天然的表面活性素。收集、乾燥、以二氯甲院 萃取’在pH2生成沈澱物。以減壓移除二氯甲烷以獲得黃白色固 體。以再結晶進一步純化。二氯甲烷萃取物溶解於含有足量氫氧 化鈉的無菌水以達到pH 8。此溶液進一步以Whatman No. 1渡紙 過濾’並以濃鹽酸滴定至pH 2。離心後獲得白色固體沈澱物。此 外’精煉的表面活性素賭自Sigma公司(Steinheim, Germany)或由 枯草桿菌菌液純化，以做為校正標準品。 分離出的表面活性素沈澱物溶解於1 ml曱醇，再以活性炭處 理，並以0.22 μπι孔徑的濾紙過濾，過濾液注入高效液相層析儀 17 13.73523 (HPLC)的反向管柱(RP-18, 5 μπι，4 χ 250 mm; Merck)。該管柱以 3.8 mM 乙腈-三氟乙酸(acetonitrile-trifluoroacetic acid, 80:20 (v/v))、l.Oml/niiii的流速洗提’並以210nm波長偵測。表面活性 素的濃度以Sigma公司購買的精鍊表面活性素做為校正曲線而測 定’並以6種表面活性素異構物的總量做為表面活性素的濃度。 實驗證明：及如w Ba-BPD 1生產的表面活性素濃度為 460 mg/L。 请參閱苐1圖’為根據本案實施例8，由5. φ Ba-BPDl生產的表面活性素的LC/TOF-MS分析圖譜。在第1圖 中，表面活性素同源物的分子量鑑定為1022及1〇36 Da。因此， 由万· 似Ba-BPDl生產的表面活性素可應用於食品 殺菌、食品保存、生物降解，及工業、農業及環境的清除。 實麵例9 ·· R amybiie/uefaciensBa-BPm奥痳康直卑的锻$詁路 根據實施例7和8的結果’可知三種脂胜肽一伊枯草菌素a、 豐原素及表面活性素可抑制病原真菌及病原細菌的生長。為了確 定及Ba_BPDl的拮抗病原真菌能力，對峙培養 φ 及試驗操作如下。對峙試驗顯示出一種生物對另一種生物的生長 抑制。 培養5.⑽;;/。/句從为咖似Ba_BPDl及21種真菌。接種及 Ba-BPDl的單一菌落於5 ml LB培養液，並以 30QC、200rpm培養7天。在每一片馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基 dextrose agar (PDA) plate)中央放亶1 cm直徑的真菌菌絲塊 (mycelial disc) ’再培養於25〇c直到長滿，共培養21株真菌。 對峙試驗開始時，放置上述丨cm直徑的真菌菌絲塊於一片 PDA培養基中央，並放置3片9 mm直徑濾紙於pDA培養基上， B73523 每片濾紙距離真菌菌絲塊邊緣1.8 cm，放置在PDA培養基的3片 濾紙看似等邊三角形的三個頂點。在實驗組方面，在PDA培養基 的母一片渡紙上滴入30 μΐ.的及吻c如w Ba-BPDl菌液； 在對照組方面，在PDA培養基的每一片濾紙上滴入30 μΐ無菌水。 將這些PDA培養基培養於25°C直到長滿。濾紙周圍將會形成新 月形的抑制。紀錄及少Ba-BPDl與真菌菌株間的 對峙培養’並計算化似Ba-BPDl渡紙到真菌菌絲 塊間的對峙距離。 鲁 请參閱表1 ’為本案實施例9的5. <3m>»/c>/z々w吻cie似Ba-BPDl 濾紙與真菌菌絲塊間的平均對峙距離。對峙距離越長，抑制真菌 效果越佳。在表1中，可知此21種真菌生長可被及 吻e/acZm Ba-BPDl有效地抑制，其中5.細少化/如吻咖似 3&_册01與柑橘青黴菌(户洲以仏’1^如&1/所，縮寫為朽13)間的對 峙距離最長(13.5 mm)，5. am少/<?/句w吻Ba-BPDl與檬果炭疽 病菌（G/omere//a dngw/ato，縮寫為Gc)間的對峙距離最短(3.1 mm)。因此’及⑽少/池糾吻也似Ba-BPDl對真菌的生長抑制效果 φ 被加以證實。 實施例10 .及flmyto//ariig^ia.g/is Ba-BPDl輿病原細銪的掛峙談路 另一個B. 每從为咖似Ba-BPDl與病原細菌間的對峙試 驗如下所述。首先’將6〇 μΐ待測試的5. amy/c»/句Ba-BPDl 滴在營養洋菜培養基的濾紙上，於30°C培養24小時。每一待測 試的病原細菌均勻噴麗到培養好的及㈣Ba-BPD 1 的營養洋菜培養基上，再將此培養基以30°C培養24小時。每一 病原細鼬進行三重複測試。測定万⑽少/必押你汾似Ba-BPDl對 每一種病原細菌的抑制圈大小。 19 1373523 〇月 > 閱表2，為本案實施例1 〇的及^历少如句似Ba-BPDl 對病原、，，田囷的抑制圈大小。在表2中，可知及 Ba-BPDl可有效抑制這些病原細菌的生長。因此，由這些細菌引 起的病原植物及果實疾病被預防 '治療或控制。此外，及 amybhguefaciens Ba-BPDl 可抑制仙人掌桿菌⑶acinus cereus ^ ^(Salmonella TAIOO) , ^ amyloliquefaciens Ba-BPDl可職及治療由這些細g狀的細菌性食物中毒。 本發明的新穎液化澱粉芽孢桿菌真有獨特

，栓’並可生產抗生物質，對病原真菌及病原細菌皆且有顯 能的創新發明，深具產業價值，援依法提出 離如所附權利要求所要保護的範圍。. 仁不脫

20 1373523 am少/WgMg/adg»·? Ba-BPD 1濾紙與真菌菌絲塊間的平均對岵花雜

病原真菌 縮寫 Έ 合灰數病镜(Botrytis elliptica) Be 9.2 致鬼灰Mi病窜(Botrytis cinered) Be 8.8 樣果炭疽病菌(G7omere//a ciwgwZato) Gc 3.1 香舊、良痕病菌(Colletotrichum musae) Cm 9.8 水稻立枯絲核菌仍/am) Rs 4.0 婉豆錄胞菌(Ft^sariww f. sp./?/*«·) F307 10.5 番篇鑛：胞菌(Ft^anw/w a^sporwm f. sp. /少 F308 5.2 番蘇鐮胞菌(Fw^arz’wm o^yjwrwm f. sp. /少ccipe/wa·) Fol-33 7.7 蘭花錄胞菌(Fw^ar/w/n 如/flm·) FSO 7.3 蒸枝鐵跑菌(FusaHum solani) FSL 7.5 百合白絹病菌(iSc/e/Oriww ;ό 诉/ζ· Saccardo) Sr 3.0 犧果褐斑病菌(Alternaria ma!i) Am 8.0 甜祿i 疫菌(Phytophthora capsici) PcSl 5.0 洋慧黑麵菌(Ape喂7Zm5 /tiger) Anl2 5.0 洋蔓、黑餘菌(Aspergillus niger) An22 4.0 松结青徽菌(Penicillium itaiicum) ΡΠ3 13.5 掛結青徽菌(Pen/cz7/iw/w z7fl/z’cM/n) Pi28 12.3 辦掷良痕菌(Colletotrichum gloeosporioides) Cg-T4018 7.8 钱柿良痕镜(CoHetotrichum gloeosporioides) Cg-T4044 9.4 遂霧栗腐菌(Pestalotiopsis eugeniae) Pe 7.3 樣果蒂腐菌(jBotryodipbdia theobromae) Bot 9.3 21 1373523 ,f、Y ®¥a-s9 洄田來咚煤寂一adPQ-e«^^oQ/3s^o/?ssaCQ,<N< (令夕)趔一!:窗 ΓΙ 60 <Ν·εS.寸 S.寸 S.寸 6<n1·ε一 ·ε ρ ς(Ν ς·ε ε(Ν寸·ε (MUcOMod POOJJ.2J(uocag)#-B-®B-»>.^-#_ (su-aosod pooj 一.2J3pcag)#-5-#^ii®田他 oq.2p一 q JBJafBIJSUBg)壤龙觫疝梁« (sjssBJq JOOJ >PBS)嗦驾蜱志^许 4- (oiBmoJJOods IB;J3oBg)嗦^-Issi堀J.#ff:^5i (S>{UB3 snuu)堞嚓_龙老 (S.SSM1.2SPBCQ)媒龙命 (slods Jsl I.sJ3PBg )€鈸兹3!1-涵患寞弊 (3SS.2P0JCSOS )堞疼誕^iMJ., (3SB3s{poJ y〇s)煤铒誕siMJ. (oJ«SBqJ.sJ3PBCQ)堞疼硪^堀：疝埘 (supl;M.2J3oBffl)€l:^±lMJ+t^^^gr (=¾ ioJB堞想墚 (UOUIUJO lpoIq.t;nJJI.sJ3oBg)€s-lssi®J.黩4 (001VI ΰ/ρεοΜ/^co)堀ey,^ (I oDisf 32¾ 3/7/¾¾))堀*蚪 V (aQN£/°.Ad aezboiOwosoiz/w0^)堀龙踩^^^N (57-si/s§ .Ad-5-3i/s8 iw/ow/o-WQ^)溷與^^-^4- (•"CSS/SA .Ad-poi/o§§ §§so-§;f) g 鈸崁^-涵1荟趔盂-(/;kp .Ad-5/70i/OWOA77 swoss/;w/?^)堀蝶^-老 {lunjod°auojos ajuotsj0^}0媒龙_ (as5w_u/fy 8wow/o々W^J) ® 鈸55^涵--獎 (/ii//§5v{*-;?-sw/^u^)堀终命疼餐^'掘"· (50Λ°;αν§ -dsqns5§sofc5-s-sss堀 #疼餐21"-(a§u§p-涵^械^®^^^ (///rst'obs 1320-5303)堀熙！l±i馏4<玷实家 3T {maf:wfalu3um!J9looq£3^}0^^ (/7/n-/o .dsqnsam/aAQXHiM0/?·2^)涵^18^-堀-騷4 ττ 13.73523 【圖式簡單說明】 第1圖為根據本案實施例7及8 ’由5.

Ba_BPDl生產的伊枯草菌素A及表面活性素的LC/TOF-MS分析 圖譜。 第2圖為根據本案實施例7 ’由 生產的豐原素的LC/TOF-MS分析圖譜。 【主要元件符號說明】 益 參考文獻： 1. Ahmed, T. A.E., Dare, E. V. and Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 2008. 14(2): 199-215. 2. Alam, Μ. Z., Muyibi, S. A. and Wahid, R. Statistical optimization of process conditions for cellulase production by liquid state bioconversion of domestic wastewater sludge. Bioresour. Technol. 2008. 99(11):4709-16.

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<212>RNA <213>Bacillus amyloliquefaciens Ba-BPDl <220>

<223>PARTIAL 16S RIBOSOMAL RNA SEQUENCE

<400>1 caagucgagc ggacagaugg gagcuugcuc acguggguaa ccugccugua agacugggau gguuguuuga accgcauggu ucagacauaa acccgcggcg cauuagcuag uuggugaggu gaccugagag ggugaucggc cacacuggga cagcaguagg gaaucuuccg caauggacga ugaagguuuu cggaucguaa agcucuguug gcggcaccuu gacgguaccu aaccagaaag uaauacguag guggcaagcg uuguccggaa ucuuaagucu gaugugaaag cccccggcuc cuugagugca gaagaggaga guggaauucc gaggaacacc aguggcgaag gcgacucucu guggggagcg aacaggauua gauacccugg uguuaggggg uuuccgcccc uuagugcugc guacggucgc aagacugaaa cucaaaggaa ugugguuuaa uucgaagcaa cgcgaagaac cuagagauag gacguccccu ucgggggcag ucgugucgug agauguuggg uuaagucccg agcauucagu ugggcacucu aaggugacug acgucaaauc aucaugcccc uuaugaccug aagggcagcg aaaccgcgag guuaagccaa agucugcaac ucgacugcgu gaagcuggaa gugaauacgu ucccgggccu uguacacacc cgaagucggu gagguaaccu uuuaggagcc ccugauguua gcggcggacg ggugaguaac aacuccggga aaccggggcu aauaccggau aagguggcuu cggcuaccac uuacagaugg aacggcucac caaggcgacg augcguagcc cugagacacg gcccagacuc cuacgggagg aagucugacg gagcaacgcc gcgugaguga uuagggaaga acaagugccg uucaaauagg ccacggcuaa cuacgugcca gcagccgcgg uuauugggcg uaaagggcuc gcaggcgguu aaccggggag ggucauugga aacuggggaa acguguagcg gugaaaugcg uagagaugug ggucuguaac ugacgcugag gagcgaaagc uaguccacgc cguaaacgau gagugcuaag agcuaacgca uuaagcacuc cgccugggga uugacggggg cccgcacaag cgguggagca cuuaccaggu cuugacaucc ucugacaauc agugacaggu ggugcauggu ugucgucagc caacgagcgc aacccuugau cuuaguugcc ccggugacaa accggaggaa gguggggaug ggcuacacac gugcuacaau ggacagaaca ucccacaaau cuguucucag uucggaucgc ucgcuaguaa ucgcggauca gcaugccgcg gcccgucaca ccacgagagu uuguaacacc agccgccgaa g 1421 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 26 1380

Claims (1)

1373523 ' (。丨年q月zry日修正替換頁 101年7月27日修正替換頁 十、申請專利範圍·· ------- 1. 一種經分離之菌株，該菌株為液化澱粉芽孢桿菌(5ad//紹 咖吻咖㈣Ba-BPDl菌株，其專利微生物寄存編號為 BCRC 910395，其包含一 i6S核糖體⑽八，該核糖體⑽八至 少包含部份核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。 2. -種如申請專利範圍第i項菌株的用途，其係用於生產下列組 成群組中至少一種酵素，該組成群組包括：殿粉分解酵素、蛋 白分解酵素、纖維素分解酵素及脂質分解酵素。 鲁 3.種如申專利範圍第1項I)株的用途，其係用於分解下列組 成群組中至少一種有機組成份，該組成群組包括：澱粉、蛋白 質、纖維素、脂質及血栓。 4. -種如申請專利範圍第1項菌株_途，其侧於處理廢水、 水管道系統及有機廢棄物。 5. -種如中請專利範圍第1項菌株的用途，其係驗動物例料添 加劑。 6. -種如申請專利範圍第1項菌株的用途，其係用於促進植物生

長。 7. -種如中請專利範圍第1棚株的用途’其係祕生產下列組 成群組中至少一種成分，該組成群組包括：伊枯草菌素、表面 活性素及豐原素。 μ 8. -種如巾請專利第丨韻株的用途，其_於生產生物表 面活性劑。 9. -種如中請專利範圍第i項菌株的用途，其係用於預防或治療 被真菌感染或細菌感染的植物或水果。 10. 如申請翻範圍第9項_途，其中該真菌感㈣由下列組成 1373523 Η年々·月t 5修正替換頁 101年4月6日修正替換頁 群組中至少一種真菌所造成，該組成群組包括：百合灰黴病菌 (Botrytis elliptica)、故來反黴病菌(Botrytis cinerea)、檬茱羡痕病 菌（Gbmerella cingulata)、香 I、良症病蛰（CoUetotrichum mwsae)、甜柿炭疽病菌苕/oet?职?、水稻立 枯缘核M(Rhizoctonia solani)、婉鐮跑菌[Fusarium oxysporum f. sp./7/幻·）、番茄鐮胞菌(Fi^rzwm f. sp. 、蘭 花鐮胞菌(Fusarium sokmi)、荔枝鐮胞菌(Fusariumsokmi)、百合 白絹病菌OSWera如m ro诉// Saccardo)、蘋果褐斑病菌(A如

mali)、始场l'Sl菌(Phytophthom capsici)、洱H觀镜(Aspergillus «/ger)、掛结青徽菌（Pem’czY/z·· /to/z’c_)、蓮霧果腐菌 {Pestalotiopsis eugeniae)及檬杲蒂腐菌（Botryodiplodia ;以及該細菌感染係由下列組成群組中至少一種細 菌所造成，該組成群組包括：細菌性軟腐桿菌体

认em/;五rvwmh mwtovora subsp. cflwiovora )、瓜類細菌 性斑點菌〇4d也vorax ave如e subsp. dinJ/z·)、癌腫菌 (jgrMfleieWwm iwme/izcz’e似）、石竹科花卉細菌性萎凋菌 (Burholderia caryophylli)、茭白細菌性基腐菌（Enter〇bact〇r c/oizceae)、揚桃細菌性斑點菌肌y叹咖公從）、青枯病 菌（Ralsionia sokmaceamm) ' 柑秸潰瘍菌（xanihommas 似⑽卬pv. drri)、茄科植物細菌性斑點菌(义⑽決撕例似 axonopodis Pv. vesicatoria)、十字花科黑腐蛰认anth〇m〇nas campestris 趴 compestris)與水稻白葉枯溘(Xanthom〇nas 〇ryzae pv. 、仙人掌桿菌cerews)及沙門氏菌 (Sahnonella)。 11. 一種如申請專利範圍第1項菌株的用途，其係用於抗真菌劑和 2 1373523 101年4月6日修正替換頁 1 /或抗細菌劑。 12.如申請專利範圍第n項所述的用途，其中該抗真菌劑和/或抗 細菌劑抑制下列組成群組中至少一種真菌生長，該組成群組包 括·. $合灰黴病菌(Botrytis eUiptica)、玫來疚黴病菌(Botrytis ckerea)、樣果炭症病菌咖⑼/加2)、香焦炭疽病菌 (Colletotrichum musae)、甜柿复疽病镜（CoUetotrichum gloeosporioides)、水稻 jt枯綠、核菌(j^hizoctonia solani)、紙立嫌 胞菌f. sp.户加.）、番茄鐮胞菌（凡紐咖所 馨 oxysporum f. sp. fycopersici)、籣花鐮胞菌(Fusarium sokmi)、萬 枝鐮胞菌(Fusarium solani)、合白绳病菌(Sclerotium rolfsii Saccardo)、蘋果褐斑病菌（j/如細//)、甜椒疫菌 (Phytophthora capsici)、沣蒐累、徵菌(Aspergillus niger)、甜蛣黃 钣蛰（Penicillium italicum)、蓮霧朱賤镆（pestai〇ti〇psis eugeniae)、樣杲等腐菌(Botryodiplodia theobmmae) ·，以反該抗樹 生物劑抑制下列組成群組中至少一種細菌生長，該組成群組包 括：細菌性軟腐桿菌(五’rvw'm’a c/zwimi/zemz·;五rvWm.a caroiovora I subsp. carotovora )、瓜類細菌性斑點菌ave⑽e subsp. citmlli)、癌後病(Agrobacterium tumefaciens)、石竹科在弁多田菌 性萎调菌（BurhoZderia caryophyHi)、茭白細菌性基腐菌 (£>?ieri?0ac欣c/i?flceae)、楊桃細菌性斑點菌（竹從而所⑽似 、青枯病菌(及fl/wom’fl奶/imacearwm)、柑桔潰瘍菌 0¾«认pv. dm·)、茄科植物細菌性斑點菌 (Xanthomonas axonopodis pv. vesicatoria)、十字屯科票、腐菌 (Xanthomonas campestris pv. 的與水稻白葉枯菌 (Xanthomonas oryzaepv. oryzae)、仙人掌桿溘(Bacillus cereus)反 3 1373523 101年4月6日修正替換頁 '/少門氏逢(Sabnonena)。 " -- 13.如申請專利範圍第2、3、4、5、6、7、8、9或11項所述的用 途’其中該菌株之型態係用於全液態培養液、上清液、可濕性 粉劑、粒劑、水分散性粒劑、水懸劑及微膠囊型式。 H. —楂包含液化殿粉芽抱桿菌（BaciHus amybliquefaciem; Ba-BPDl)菌株的組合物，其中該液化澱粉芽孢桿菌菌株具有專 利微生物寄存編號BCRC 910395。 1373523 十一、圖式 4年&月。日#正隻換頁 101年4月6日修正替換頁

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