TWI373334B - - Google Patents

Description

1373334 六、發明說明：，. 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關於一種具雌激素活性之化合物、組成物 及其用途，特別是關於一種氫化-Q9苯並吡喃(Hydro-Q9 chromene)、組成物、用於製備活化人類雌激素受體之藥物 的用途、及含氫化-Q9苯並。比喃(Hydro-Q9 chromene)的山 藥萃取物。 【先前技術】 停經期婦女於停經期通常會伴隨著出現種種不適的症 狀(如熱潮紅、盜汗、心悸等等）’為減少這些症狀所引發 的不適’通常婦女會於停經期接受贺爾蒙補充治療 (Hormone replacement therapy，HRT)。但從先前的研究報告 中已知，單獨服用雌激素會增加罹患子宮内膜癌的風險 性，因此為避免此一問題’目前所進行之HRT除了服用雌 激素（例如’ 0.625mg/天的結合型馬雌激素（c〇njugated equine estrogens，CEE))外，尚會合併服用黃體素（例如， 2.5mg/天的甲羥助孕酮乙酸鹽（medr〇xypr〇gester〇ne 3咖批， MPA》’藉以預防因單獨服用雌激素所造成之子宮内膜癌 發生率上升的問題。另一方面，美國婦女健康促進計晝 (Women’s Health Initiative，WHI)於 2002 年 7 月的研究結果 顯示，連續接受HRT五年以上，會增加乳癌的發生率，甚 至會增加心臟病發作、中風與肺血栓的發生率，但其好處 為可減少髖骨骨折與大腸直腸癌的發生率。 3 1373334 _ · 停經婦女於減少分泌雌漱素後，若沒有適時補充雌基 - 素，則婦女會有產生更年期症狀，以及罹患心臟病與骨質 . 疏鬆危險率提高的.問題。 習知分子生物學的研究結果顯示，雌激素的作用乃透 “過其專一性核受器(Estrogen Receptor，ER)的結合，並啟動 , 雌激素所調控的基因（啟動子具有Estr〇gen Response

Element (ERE)之基因），而呈現其作用活性。可與ER結合 並引起部分作用者，稱為局部促效劑(partial ag〇nist)，如己 • 烯雌酚(diethylstilbestr〇l，DES);而可與ER結合但不引起 作用者，即稱之為拮抗劑(antag〇nist)，或稱為抗雌激素 (anti-estrogen)，如泰莫西芬(tam〇xifen)，其對雌激素依賴 性癌症具有抑制效果。目前，已有兩種ER被鑑定出來， 即ERa與ΕΙΙβ，其在人體組織中的分布上有相當大的不 同。改變雌激素作用之分子若能選擇性地作用於血管盘骨 組織中的細胞，但卻對乳腺子宮内細胞作用微弱，即可成 為理想之選擇性雌激素受體調節劑（Sdeetive細〇卿 * ReCept〇r M〇dUlat〇r，舰Μ) ’其對停經後婦女之保健將有 莫大貢獻。 有馨於習知來自動物的雌激素(例如，CEE)會具有前述 之問題，因此積極尋找-種習知動物性雌激素的替代物， 便成為一件極為重要的事。 【發明内容】 為解決前述習知技術之問題，本發明之目的即在於提 t 4 1373334 供-種雌激素活性之化合物在製備活 藥物的用途。 頌雌教素跫體之 為達成本發明之目的，根據本發明 ::r合物’其係氫…並二:： 根據本發明所指出之具雌激素 學合献㈣加时成，或自 樂）中鱗取及純化而得，但並不僅限於此。

根據本發明所w之具有雌激纽 脑與ERP活化，並展現出極佳的雌激素活性/物錢 本發明另提供-種活化雌激素受體的組合物，直可 獨包含-纽缝的本發聽合物， ^ 理上可接受之載體。 凡各樂 本發明另提供一種氫化-Q9苯並吼喃用於製備活化人 類雌激素受體之藥物的用途的方法，其包含 量的本發明化合物。

本發明又提供一種具有雌激素活性之山藥萃取物，係 ，含氫化-Q9苯並如南(Hydr〇-Q9 chr〇mene)，且藉由將山 藥以溶劑萃取而得，其中該溶劑係包含乙酸乙g|、正己炫、 甲醇、二氯P烷、酒精、水或其混合物。 本發明將藉由參考下列的實施方式做進一步的說明， 在此所述之㈣方式並稀制本發财面所料之内容。 A習本發狀技#者’可做鱗之改良雜飾，但仍不脫 離本發明之範舞。 1373334 【實施方式】 根據本發明所指出具雌激素活性的化合物，其係選自 及似生育醇（兄狀-a-tocopherol)、氫化-Q9笨並吡喃 (Hydro-Q9 Chromene)、輔酶（¾ (Coenzyme Q9)、環木波羅 烧(Cycloartane)、阿魏醯基甘油（1-Feruloyl glycerol)、γ-生 育醇-9 (y-tocopherol-9)及其化學結構類似物所組成之族 群。

本發明中所稱之兄βπ-α-生育醇係指具有如下列式（1) 所示之化學結構式：

其中，R!係為氫(Η)、醋酸基(Ac，CH3COO-)、碳數為 1-6的烷基或具有如下式（1-1)或（1-2)所示之化學結構式； R2係為具有如下式（1-3)、（卜4)或（1-5)所示之化學結構式； R3、R>4與尺5分別為風或甲基。 (1-1) (1-2) 1373334 -CH；

(1-4) (1-5) 其中，上述式（1-3)、（1-4)與(1-5)中的n=0〜6 本發明中所稱之氫化-Q9苯並吼喃係指具有如下列式 (2)所示之化學結構式：

Me(

〇Me (2) 其中，Ri係為氫(Η)、醋酸基(Ac, CH3COO-)、碳數為 1-6的烷基或具有如下式(2-1)或(2-2)所示之化學結構式； R2係為具有如下式(2-3)、（2-4)或(2-5)所示之化學結構式； Me係為甲基。

CH2 (2-1) 0 II II -c— (2-2) 4: (2-3) -CH; η 7 1373334 ‘ . (2-4) (2-5) 其中，上述式(2-3)、（2-4)與(2-5)中的n=0〜6。 本發明中所稱之辅酶Q9係指具有如下列式(3)所示之 化學結構式： 0

MeO nA^CH3 (3) 其中，Me係為甲基，且η=0-9 本發明中所稱之環木波羅烷係指具有如下列式(4)所 示之化學結構式：

其中，h係為氫(Η)、醋酸基(Ac，CH3COO-)、碳數為 1-6的烷基或具有如下式(4-1)或(4-2)所示之化學結構式； R2係為氫(H)、甲烷基或羧基(-COOH); R3係為具有如下式 (4-3)、（4-4)、（4-5)、（4-6)、（4-7)、（4-8)、（4-9)、（4-10)、（4-11) 或(4-12)所示之化學結構式： 1373334 〇^2 (4-1)

(4-2)

00H

(4-10) 本發明中所稱之阿魏醯基甘油係指具有如下列式(5) 所示之化學結構式：

/R3 (5) 1373334 .其中，R!係為氫(Η)、碳數為1-6的烷基或具有如下式 (5-1)或(5-2)所示之化學結構式；R2係為氫(Η)或-0-R, ; X 係為氧(0)、氮(N)或硫(S) ; R3係為具有如下式(5-3)或(5-4) 所示之化學結構式

(5-1) (5-2) (5-3)

(5-4) 本發明中所稱之γ-生育醇-9 (Y-tocopherol-9)係指具有 如下列式(6)所示之化學結構式：

r3 其中，Ri、R2與R3係分別為氫(Η)、醋酸基(Ac， CH3C00-)、碳數為1-6的烷基或具有如下式(6·1)或(6-2) 所示之化學結構式，且η=0-9 1373334

(6-1) (6-2) 根據本發明所指出之具雌激素活性 的活化咖與卿，並展現出極佳的雖激素二性=^ 發明化合物將可用作為動物雌激素之替代物或辅助補充

實施例一 建立雌激素活性的檢測方法 為評估雌激素活性’在此將含有GAL4hER(x (或p) LBD 嵌合體受體(Chimeric receptors)之 pBKCMV 質體，與 含（UAS)4·鹼性磷酸酶報導基因（Alkaline ph〇sphatase Reporter gene)之質體共同轉染至CH0-K1細胞中。當待測 樣品與ER作用’則誘發GAL4與報導基因前的(UAS)專一 性結合’進而啟動基因表現。故可利用測量驗性填酸酶 (Alkaline phosphatase, ALP)的活性來判定其雌激素活性。 首先，取得CHO-K1細胞株（菌種編號CCRC 60006， 取自食品工業發展研究所），以含10%胎牛血清(FBS)及 Ham’s F12 營養混合物（nutrient mixture, GIBC0BRL® 11765-054)培養液培養。於進行轉染前一日，將長至融合 (confluence)的細胞植入96孔培養盤中，當天將含血清之 11 1373334 . 培養基洗除乾淨。接著，將前述兩種質體 DNA等比例加.. -入Fugene 6轉染劑及轉染專用培養基使其形成DNA微脂 體(liposome)複合體，再加入上述洗淨的細胞中，轉染5小 時。 於進行雌激素活性測試時，於含有上述經轉染後之細 胞的k養基中直接加入待測的jgR活化劑(activat〇rs)。經培 養2天後，吸取定量培養基測定鹼性磷酸酶(ALp)活性。 ALP活性係以4-硝苯基磷酸二鈉鹽六水合物(4 Nitr〇phenyj • ph〇Sphate dlsodlum salt hexahydrate, pNPP)為受質，於 96 孔培養盤中測定波長4〇5nm的吸光值。另以已知之ER活 化劑（ΙηΜ 17β雌二醇)作為正對照組。 為確疋此一檢測方法的有效性，在此使用雌激素(17β 雌二醇，簡稱Ed與三種異黃酮(Genistein、Daidzein與 Geistein)進行驗證。經驗證結果顯示，當&濃度增加時， ALP的活性亦隨之增加，其中活化ERa與ERp的EC%分 別為8.79xl〇-6nM與2xl〇-5 —。而以異黃酮處理活化ERa • 與 ER|3 的 EC50 ’ 於 Genistein 分別為 298.49nM 與 3.41nM、

Daidzein 分別為 874.86nM 與 31.81nM ,以及 Geistein 分別 為726·03ηΜ與13.4lnM。由此可看出異黃酮對卿有較 好的活性。 實施例二 自山藥+萃取出具雌激素活性之區分物與純化的化合物 取18公斤未殺菁之山藥的粉末，分批(每次5〇〇公克） 12 1373334 加入l〇倍體積溶劑（乙酸乙酯），於室溫下以磁石（stir bar) 攪拌兩日，再以抽氣過濾裝置抽氣過濾（白磁漏斗上方放 Whatman No. 2濾紙），重複萃取一次後，合併取得之濾液 以減壓濃縮機於45-50°C下進行濃縮，除去溶劑後即可得 乙酸乙酯萃取物。 將山藥乙酸乙S旨萃取物以EA溶解後，加入1.5倍體積 粗矽膠(silica gel) (230-400 mesh)進行吸附，並以15倍體積 細矽膠(70-230 mesh)進行管柱色層分析。沖提液由正己烧 _ 與乙酸乙S旨不同比例組成’從100%正己烧開始直到 乙酸乙酯（含1%曱醇）為止。以5%乙酸乙酯/95%正己烷作 為流洗液。經流洗2.5升後收集2升流洗液，之後流洗液 再換成10%乙酸乙酯/90%正己烷流洗1.5升，共收集3 5 升之流洗液’經減壓濃縮後所得之樣品，再經由一次石夕膠 管柱層析，收集以1%乙酸乙酯/99%正己烷流洗出之區分 物。 經由前述矽膠管柱所分出之山藥EA萃取物，再以 φ HPLC方式進行進一步的純化。在此使用之管柱為

Phenomenex Lunas 5μ Silica 10mm X 250mm ’ 檢測器為 RID-lOA Shiniadzu Refactive Index Detector，移動相為 ι〇% 乙酸乙酯/90%正己烷，流速為3 mi/分，在6分4〇秒至7 分40秒所收集到之區分物再經由HpLC更進一步純化，移 動相改為2%乙酸乙酯、1〇/0曱醇、87〇/〇正己烷、1〇%三氣甲 烷0^1(：13)，流速為21111/分，收集11至11.5分流洗出之區 分物。將此區分物經以核磁共振測量氫譜判定其結 13 1373334 .構後’可得其為狀及-α-生育醇（化.合物丨），分子式為 C29H50O2且分子量(M.W.)為430.38，且其具有如下式⑺所 示之化學結構式： >

⑺ 將化合物1以無水酒精溶解後，以其處理實施例一中 _ 的細胞，以進行ER活性測試，所得結果示於第—圖中。 由第一圖中可得知，以化合物丨處理細胞時可發現隨 著其濃度的增加，ALP活性有隨之增加的趨勢，且有劑量 效應。當濃度為5pg/mL時，會達活化ERa的最大值；濃 度為2(^g/mL時，會達活化ERp最大值，計算其EC5q為： ERa=1.08pg/mL (2.5 μΜ) ; ERp=3.96Mg/mL (9.2 μΜ)。 實施例三 Φ 將只細例一中所得之山藥ΕΑ萃取物以石夕膠管柱方式 進行純化，流洗液為5%乙酸乙酯/95%正己烷，且於流洗 2.5升後收集2升流洗液，再更換流洗液為1〇%乙酸乙酯 /90%正己燒流洗L5升所收集共3 5升之流洗液，經減塵 濃縮復所得之樣品，再經由一次矽膠管柱層析，收集以2% 乙酉文乙S曰/98%正己烧流洗出之區分物。再以進一步 分離，移動相為10%乙酸乙酯/9〇%正己烷，流速為3 ml/ 分，在6分30秒至8分20秒所收集到之區分物，經由矽 14 再經由正己出之樣品 1〇%^6δΙ 流洗出之區分物。將此區分物亦至7分34秒 其為二== 之衍生物。其分子式為⑽〇4且分子 里（）為94.62’且其具有如下式⑻所示之化學結構式：

將化。物2以無水酒精溶解後，以其處理實施例一中 的細胞:以進行ER活性測試，所得結果示於第二圖中。 -t第—圖中可得知’以化合物2處理細胞時可發現隨 著其濃度的增加，ALP活性有隨之増加的趨勢，且有劑量 效應。虽/辰度為4(^g/mL時，會達活化ERa與ΕΚβ的最 φ 大值倍數分別為3.68倍與3.79倍，計算其£C5〇為： ERa=8.54pg/mL (10.8 μΜ) ; ERp=5.85pg/mL (7·4 μΜ)。 實施例四 將實施例二中所得之山藥ΕΑ萃取物同樣以矽膠管柱 方式進行純化，流洗液為10%乙酸乙酯/90%正己烷，且於 流洗1.5升後收集500ml流洗液，經減壓濃縮復所得之樣 品’再以HPLC進一步分離，移動相為2%乙酸乙酯、1〇/〇 15 1373334 δ/ /。正己烷與10ο/〇. 在8分30秒至9分20秒 <區分二 磁共振_r)測量氮譜判定其結構後，可得^π (化合物3)’ .其分子式為CAW且、= 而2，且其具有如下式(9)所示之化學 ·W·)為 h3co、 h3co ο ch3 (9) 將化合物3以無水酒精溶解後，以其處 的細:第:7活性測試，所得結果示於第:圖中。 度ί r，mrr:時 ’ r伽b 咖一= ΕΙΐρ=0.84μ_Μΐ.()6μΜ)βΚα 4G 5Mg/mMl3.3 μΜ); 實施例五 將實施例二中所得之山藥ΕΑ萃取物同樣卿膠管柱 方式進d流洗㈣1()%乙酸_9()%正^ 流洗2.5升後收集1升流洗液，經減壓濃縮復所得之樣％ 俨Η-PLC進-步分離，移動相為10%乙峻乙醋廣。正己 二机速為4.5 ml/分’收集在8分14秒至9分1G秒之區 ^二將此區分物亦經⑽磁共振(NMR㈣量氫譜判定其 d後，可得其為環木波靴（化合物4)，其分子式為 成50〇且分子量(龍)為426J2，且其具有如 所不之化學結構式：

另將具錢化合物4近健構之—㈣壤木波羅烧類 乂二物，其代號與化學結構式請參閱第四圖。將這些化合 物分別以無水酒精溶解後，以其處理實施例一中的細胞， 以進行ER活性測試，所得結果示於第五圖中。

由第五圖中可得知，在ERa方面，當濃度為2pg/mL 時，CY7、CY8、CY9及CY10的ALP有較高之活性，其 中以CY9活化倍數最高，為2.245倍，相較於Daidzein活 化百分比為73.8%，且為lnME2之44.5%。在ERp方面， 當濃度為 2pg/mL 時，CY1、CYla、CY7、CY8、CY9 及 CY10的ALP則有較的活性，其中活化倍數以CY9最高， 為2.776倍’相較於Daidzein活化百分比為65%，且為1 nM 17 E2 之 51%·〇 貪施例六 將實施例二中所得之山藥EA萃取物同樣以矽膠管柱 方式進行純化’流洗液為50%乙酸乙酯/50%正己烷，且於 流洗2_5升後收集1升流洗液，經減壓濃縮後所得之樣品， 再經矽膠管柱層析，並以三氣甲烷/曱醇為流洗液。接著再 以HPLC進一步分離，移動相為2%乙酸乙醋、2%甲醇、 96%二氯曱烧’流速為3 _分收集在1〇分至“分扣 秒之區分物。將此區分物亦經以核磁共振(NMR)測量氫级 判定其結職，可得其巾含有1·阿舰基甘油(化合物^ 其分子式為C13H16〇d分子量(M w)為268 〇9，且其 如下式（11)所示之化學結構式：

och3

(11) 將含杨絲5 _分如財 理:施例一中的細胞’以進…性測試，所“果; 於第六圖中。 π付、、、0果不 由第六圖中可得知，以化合物5處理細胞時可發現’ 1373334 當其濃度於三個測試濃度中皆可看到alp活性顯著增加。. 實施i列六 將實施例二中所得之山藥EA萃取物同樣以矽膠管柱 方式進行純化’流洗液為10%乙酸乙酯/90%正己烷，且於 流洗1.5升後收集500ml流洗液，經減壓濃縮復所得之樣 品’再以HPLC進一步分離，移動相為2〇/〇乙酸乙酯、ι〇/〇 甲醇、87%正己烷與10%三氯曱烷，流速為2mi/分，收集 在12分36秒至14分39秒之區分物。再以HPLC做更進 一步之純化，移動相改為12%乙酸乙酯/88%正己烷，流速 為3 _分，收集8分26秒至9分32秒之區分物。將此區 分物亦經⑽磁舰(應聯彳量.氫譜狀其結構後，可得 其中含抑生膝9㈣e___9)，其奸式為純2〇2

HO. 八

(12) 將此化合物6以無水酒精落解後 中的細胞，以進行ER活性測試 里、處理實施例- 由第七圖中可得知，以化合物6處1^於第七圖中。 著其濃度的增加，ALP活性有隨之增=時可發賴 —勢’且有劑量 1373334 效應。當濃度為20pg/mL·時，.會達活化ERa及Είφ的最 大值(倍數分別為2.91倍及3.26 倍），計算其活化之EC50 為：ERa=9_56pg/mL(12.7 μΜ) ; ERp=2.40pg/mL(3.2pM)。 【圖式簡單說明】 第一圖為化合物 1 對(A) GAL4-hERa 與(B) GAL4-hERp 之劑量反應曲線； 第二圖為化合物 2 對(A) GAL4-hERa 與(B) GAL4-hERp 之劑量反應曲線； 第三圖為化合物3對(A) GAL4-hERa與(B) GAL4-hERp 之劑量反應曲線； 第四圖為環木波羅烧系列化合物之化學結構與其縮寫； 第五圖為環木波羅烷系列化合物對(A) GAL4-hERa與(B) GAL4-hERp之活化結果； 第六圖為化合物5對(A) GAL4-hERa與(B) GAL4-hERp 之活化結果； 第七圖為化合物6對(A) GAL4-hERa與(B) GAL4-hERp 之劑量反應曲線。 【主要元件符號說明】 Μ "、、 20

Claims (1)

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七、申請專利範圍： I —種活化雌激素受體之醫藥組成物，包含氫化-Q9苯並 吡喃(Hydro-Q9 chromene)以及一藥理上可接受之載體， 其中該氫化-Q9苯並吡喃具有下列式(8)所示之化學結構 式：

2.如申請專利範圍第1項所述之醫藥組成物，其中該式(8) 化合物係分離自一山藥。 • 種虱化_Q9苯並°比喃(Hydro-Q9 chromene)在製備活化 人類雌激素受體之藥物的用途，其中該氫化苯並吡 。南具有如申請專利範圍第1項之式(8)所示之化學結構 式。 4·如申睛專利範圍第3項所述之用途，其中該氫化-Q9笨 並吡喃係分離自一山藥。 5.如申凊專利範圍第3項所述之用途，其中該人類雌教素 受體係為人類雌激素受體α或人類雌激素受體y3。 21