TWI359198B - Gene expression profile predicts patient survival - Google Patents

Description

九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 係有：=二=症手術後存活率的方法，尤其 鏈反應聊癌術;存圖讀’以反轉錄聚合酶 【先前技術】 月癌係為，界上4見的癌症之―，且居台灣地區羅癌率 广=位。目前臨床上f遍係簡視鏡進行㈣，以期於癌 ，正早鹰段診斷出，但仍有部分病患於麟時，其癌症已處 於較厫重的癌症期(stage)。根據先前的研究報告指出，癌症 期(stage I)的病患通常具有較好的預後㈣g廳is)，而癌症 四期(stage IV)的病患則顯示出非常差的預後。但令人困擾的 疋，癌症一期(stage II)與三期(stageIII)病患的預後情形卻有 著極大的差異，目前尚無法得知其生物原因。 已有一些研究報告指出，習知的一些臨床病理因子與數 個有趣的分子，包括細胞週期調控因子(cellcycleregulati〇n factors)(例如’ p27或轉胞蛋白E(cyclin E))、細胞貼附分子 (cell adhesion molecules)(例如，細胞黏著分子(E-cadherin)、 血管形成因子(angiogenic factors)(例如，血管内皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)與胎盤生成因子 (placenta growth factor))、致癌因子(oncogenes)(例如，c-erbB2 與c-myc)，以及腫瘤抑制基因（tumor suppressor genes)(例如 1359198 p53))等，可能與胃癌患者的預後有關。然而，這在不同的 研究中卻存在著不-致的結果，並且由於疾病的生物學十分 複雜’因此在這些先前報告中的參數僅能提供有限的個別病 患之預後貧訊。由於胃癌的細胞與分子具有異質性 (heterogeneity)，以及有許多的基因可能參與胃癌致病機 (pathogenesis)的多個步驟，因此這意味著考量研究這多個基 因的變異(alterations)是一件重要的事。 近來，由於能系統化進行基因表現研究之cDNA微陣 列(micr〇array)技術的改良，使得我們得以看見人類腫瘤基因 的表現圖譜。這些基因表現圖譜可用以幫魏別基因活化圖 形’藉以區別胃腫瘤的亞綱(subclasses)。基因圖譜的研究亦 曾被使用於篩選有較高復發危險性的病患，以進行輔助治 療。最近’ Grodon等人揭示一種使用4〜6個自微陣列筛^ 出的基因之簡單的基因表現量圖形，其在間皮瘤 (mesothelioma)的預測結果上有很高的準確度。 但由於前述習知的研究中，很少自相當大量的基因中收 集資料，且其大多係使用昂貴的資料取得平台與複雜的演算 及/或軟體，加上該财法並餘於轉考其_本的狀況 下分析獨立的樣本，因此這使得習知方法在臨床應用上有其 限制。此外，目前仍亦無實際有用的方法，可用以辨別各個 罹患胃癌者，於手術切除後的復發危險性。 7 【發明内容】 為解決前述習知技術之缺點，本發明之目的即在於提供 一種藉由基因微陣列的分類圖譜，利用反轉錄聚合酶鏈反 應，以習知統計方法建立一 D2胃切除術(D2 gastrectomy)後 存活狀況之預測模式的方法。 根據本發明所指出之一種藉由基因表現的微陣列分類 圖谱’利用反轉錄聚合酶鏈反應，建立胃癌病患術後存活狀 況之預測模式的方法，步驟包含： (1) 藉由複數個已知胃癌術後存活狀況之成對的腫瘤與 非腫瘤組織樣本，以其基因表現的微陣列分類圖 譜’於該些組織樣本中篩選出表現顯著不同的特異 性基因； (2) 對該特異性基因進行反轉錄聚合酶鏈反應，並確認 其結果與該微陣列分類圖譜結果的一致性；以及 (3) 以習知的統計模式選取法，自該特異性基因中選出 腫瘤調節基因，並藉由一訓練組樣本以該腫瘤調節 基因建立該預測模式的公式。 做為本發明前述步驟(1)之例子，例如將基因微陣列資 料，藉由三步驟分類方式，以建立表現顯著不同的基因分類 圖_，但並不僅限於此。前述的三步驟包含： (0將位於該微陣列上之該組織樣本中與腫瘤調節相 關之基因的表現量之對數比值(log rati〇)進行正規 化(Normalization); (ii) 利用摺疊改變法(fold-change)過濾、掉該對數比值表 現較不顯著的該基因；以及 (iii) 以多重排列檢定法(multiple permutation test)與交叉 驗證(cross validation, CV)進一步篩選出表現顯著 不同的該基因。 前述微陣列上基因的表現量，例如可藉由檢測該基因的 cDNA表現量來獲得。 前述步驟(2)中，該特異性基因之反轉錄聚合酶鏈反應 的結果與其cDNA表現結果進行比較，以確認一致性時，可 藉由一選定的篩選標準來執行，於本發明中可做為此篩選標 準的例子，例如斯皮爾曼等級相關(Spearman rank coefficient)檢定法 p<〇.〇5。 於則述步驟⑶中’較佳為進—步包含配合羅吉斯迴歸 分析(logistic regression)進行該腫瘤調節基因的選取。可應用 於本發明巾做為前述統龍式選取法關子，例如逐步模式 法，但並不僅限於此。為避免因樣本數目不足，所產生的過 度配適(fitting)問題，前述訓練組樣本的樣本數目，較佳 為不少於制模式巾腫朗節基因數目的5倍。 本毛月之另目的即在於提供一種藉由基因表現圖譜 預測胃癌術後存活狀況的方法，藉以預測胃癌病患於的胃 切除術後的存活率’以供後續治療以及是否進行輔助性治療 (adjuvant chemotherapy)的參考。 根據本發明所指出之—種預測胃癌病患胃癌術後存活 狀況的方法’其步帮包含： 自該月癌病患取得腫瘤組織與非腫瘤組織的成對樣 本； ()X反轉錄聚合酶鏈反應檢測該成對樣本中腫瘤調節 基因的表現；以及 ⑷=步驟(b)中所得之反轉錄聚合酶鏈反應結果，藉由 月'J述方法所得之預測模式計算該胃癌病患的存活狀 況。 〜此本發明藉由基因表現圖譜所構成之預測模式，較習知技 術月b更·^確的預測胃癌病患於治療姆後的存活情形。本發 明方法能成功的避免f知無法將微陣顺術應用在臨床上 的缺點。 【實施方式】 於本發明中，係對由不良存活與良好存活組所構成之 18位病患，使用包含有328個已知基因序_基因，以及 具有呈色檢測的自製(in-house)尼龍膜小型微陣列，以三步 驟的分類選方絲尋找侧胃癌病患存活的基因表現圖 譜。於第一步中，在此係使用328個基因，分別分析其於腫 瘤與非腫瘤組織中的cDNA表現量，並計算出其cDNA表 現量的對數比值。為避免在每個微陣列樣本上系統的誤差， 在此使用非線性的局部加權迴歸法〇〇cally Wdghted

Sactterplot Smoother，LOWESS)，將 328 個基因的對數比值 (log ratios)正規化至經由ΜΑ做圖配適的LOWESS曲線上。 於對數比值正規化後，第二步驟再藉由摺疊改變法 (fold-change method)自328個基因中選出141個基因。最 後，於第三步驟中使用多重排列檢定法(multiple permutation test)與交又驗證(cross validation，CV)進一步篩選出6個表現 顯著不同的特異性基因。這些篩選出的特異性基因，包括 CD36抗原、訊號淋巴球活化分子(SLAM)、轉錄因子ΑΡ-2α (transcription factor AP-2 alpha，TFAP)、類胰島素生長因子 (insulin-like growth factor 1，IGF-1)、PIM-1 致癌基因，以及 金屬蛋白酶的組織抑制劑-4 (tissue inhibitor of metalloproteinase-4, TIMP-4)。 接著，再藉由反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測前述6 個基因在腫瘤於非腫瘤組織中的表現。將RT-PCR的結果與 前述的微陣列結果比較。結果顯示，前述6個基因中有4個 (CD36、SLAM、TFAP與PIM-1)，在兩者的結果中具有高 的一致性(60%以上）’且其斯皮爾曼等級相關檢定亦顯示出 具有顯著性，且p<0.05。 於本發明中，另外隨機選自18位病患中所挑選出的4 位病患用以進行重複研究，以測試此自製尼龍膜之微陣列的 再現性。這4個病患的總RNAs以兩個不同的微陣列尼龍膜 於不同時間進行雜交。經計算交叉雜交所得之皮爾森相關係 數(Pearson correlation coefficients)皆超過 0.75 (p<0 〇5)，此 即表示本發明方法具有良好的重複性。 將每個所選基因於腫瘤組織與非腫瘤組織中的rT-PCR 表現量之狀態分成四種類別，分別為：（1)腫瘤的表現量高 於非腫瘤的表現量，以”腫瘤►正常’’表示；（2)非腫瘤的表現 量高於腫瘤的表現量，以”正常►腫瘤，，表示；（3)腫瘤與非腫 瘤均為陽性；以及(4)腫瘤與非腫瘤均為陰性。接著，選用 數個已知存活情形樣本，將其RT-PCR的結果以上述四種類 別進行分類’藉以分別計算出每個所選基因於這四種 RT-PCR狀態中之樣本的出現頻率，藉以建立預測模式。 藉由 Akaike’s 法則（Akaike’s information criterion, AIC) 使用羅吉斯迴歸分析(logistic regression)模式與逐步模式選 擇預測模式，再自前述4個基因中，獲致由其中3個基因 (CD36、SLAM與PIM-1)所組成之最有效的羅吉斯預測模 式0 在前述這3個基因中，習知SLA1V[係為藉由活化的τ 細胞、B細胞及樹狀細胞(dendritic cells)所表現之CD2相關 的表面受器。常於胃癌病患中受損的ThO/Thl免疫反應亦可 為SLAM所誘發，藉以增強CD8+腫瘤專一性淋巴細胞的增 殖與細胞毒殺能力。雖然SLAM於胃癌病患的腫瘤相關免 疫反應中的真實角色仍然不清楚，但其似乎於抗腫瘤免疫反 應上具有潛在性的影響。習知CD36係為調節細胞凋亡 (apoptosis)與血管新生(angiogenesis)以反應其配位體凝血因 子（ligand thrombospondin-1， TSP-1)的轉膜受器 (trans-membrane receptor)。TSP-1係位於腫瘤相關的細胞外 12 間質(e血cellular matrix)中，且CD36係表現於腫瘤細胞的 表面。腫瘤細胞中CD36S現的調節可能於腫瘤生長、轉移 與血管新生上扮演-健要的角色。刪]係為絲胺酸/路 胺酸激酶的產物’其可於胃的上皮細胞中藉由關螺旋桿菌 (//.外㈣所誘發’其可能參與胃的致癌形成。ρΐΜ_ι於τ 細胞的增殖、分化與成熟中亦扮演一個重要的角色，其可能 與腫瘤的免疫反應有關。簡_丨可藉由組織缺氧(hyp〇xia)所 誘發’其參與實體腫瘤細胞的抗藥性(drugresistance)與腫瘤 形成(tumorigenesis)，並且會導致基因的不穩定性 instabiHty)。最近的研究顯示，piM的表現與前列腺癌 (prostate cancer)的臨床檢查結果有顯著的相關連性。因此， 於本發明預職式巾所朝的三個基因可能以某種方式參 與跟病患存活極為相關之腫瘤的血管新生與職免疫反應。 本發明預測模式使用取自RT_PCR狀態的資料，來建立 於成對樣本中3個基因的表現分類。由於本發明方法係藉由 獨立的微陣列平台來執行，因此健要少量的RNA(例如， 當使用RT-PCR時僅需要2阳)即可於一般的實驗室中執行。 於本發明中，微陣列的數據經以LOWESS法正規化 後’可避免於每贿陣列樣本巾可能過度正規化的系統化錯 誤。於預測模式的選擇過程巾，過度配適問題是一個重要的 關鍵。於本發明中使崎機產生樣本以克服此潛在的陷啡， 並建立較使用1或2個基因之模式靈敏且特異性高之3基因 預測模式。 Α 習知已有報告指出，辅助性治療對全部已施予D2胃切 除術的胃癌病患皆具有邊際效應(贿ginal effeet)。假如胃癌 病患的存活結果能被合理的_，辅助治療將可用以幫助這 感有不良存活之可能性高的病患，而具有良好存活可能性 南的病患則可省去獅治療的副仙。_被綱為具有不 好結果之可能性Γ%的病患’是否能自輔助治療獲得實質的利 益仍無法得知，但是此預測的結果可被驗開發新的醫藥組 合物的臨床實驗上，或是惡㈣胃癌絲(制是第三期病 患）的控制上。 實施例— 預測模式的建立 18對腫瘤與非腫瘤的胃組織樣本，係獲自臺大醫院中 位患有月癌，並接受過D2胃切除術(gaStreCt〇my)且無顯 著殘留腫瘤的病患。病患所處腫瘤期(tumw stag。)的範圍從 第一期至第四期。其中，9名病患於手術後12個月内死於 腫瘤復發，在此將其定義為，，不良存活(p〇〇rsurvival)”，而另 外9名病患於手術後存活超過3()個月，在此將其定義為” 良好存活(goodsundval)，，。不良存活組中，包含2位第二期 的病患、4位第三期的絲，以及3位第四期的病患。良好 存活組中’包含3位第一期的病患、2位第二期的病患以 及4位第三期的病患。在不良存活組中沒有第—期的病患， 且在良好存活組中亦沒有第四期的病患。所有的病患皆沒有 1359198 接受手術後化學治療及放射線治療。將此18位病患的腫瘤 與非腫瘤組織的成對樣本進行解剖，並於30分鐘内移至液 態氮桶中冷凍。其中，非腫瘤的黏膜樣本係取自位於離腫瘤 範圍至少3 cm以上，且明顯正常的黏膜區域。 本發明在此使用自製尼龍膜cDNA微陣列，其係由包 含3 84個點(spots)的尼龍膜，藉由習知cDN A微陣列的製造 方法所製備。位於尼龍膜上的384個點係以每列16個點、 母行24個點，以及點距為25〇μιη的方式排列。cDNA微陣 列包含328個選自被認為可能與癌症有關的且已知的人類 基因之經定序確認的(sequence verified) cDNA殖株(d〇ne)， 用以做為雜交反應的標的。這些基因包括致癌基因、腫瘤抑 制基因、細胞凋亡相關的基因（ap〇pt〇sis_related群⑽）、基 質蛋白酶基因（matrix proteinase genes)、血管新生相關的基 因（angi〇genesis_reiated genes)、免疫相關的基因 (immUne-reiated genes)等等。在此另以j 6個植物基因及甘油 醛磷酸去氫酶（glyceraldehydes phosphate dehydrogenase， GAPDH)做為微陣列的内部控制基因。 接著，分別自前述18對樣本中抽取其RNAs，以用於 執行微陣列雜交(hybridizations)。在此係藉由Triz〇1試劑 (Invitrogen Life Technologies，Lie. Carlsbad，CA)，自每個胃 癌腫瘤組織與其相對應的非腫瘤部份的樣本中，分別抽取 30pg的總RNAs ’並將其進行逆轉錄並標記生物素。 則述攜帶雙股cDNAs的微陣列先於lml的雜交緩衝液 1359198 (5X RNA 萃取標準擰橡酸鹽(extracti〇n stan(jard saline citrate， SSC)、0.1%十一烧基肌氨酸(N-lauroylsarcosine)、0.1%硫酸 十一醋納（sodium dodecyl sulfate，SDS)、1 % 由 Roche Molecular Biochemicals公司所製造的阻隔試劑（blocking reagent)/»^合物，以及缝魚精（saim〇n_Sperm) dna(50 pg/rnL)) 中’在63°C下’預雜交(prehybridized) 1.5小時。將生物素 標記的cDNA探針與含有人類⑺丁-丨DNA的雜交溶液 (13μΙ〇和一微陣列封入於一雜交袋中，並將雜交袋置於63 C下10小時。之後，微陣列的尼龍膜以含有〇 1〇/〇sDS的2χ SSC於室溫下清洗5分鐘，接著以含有〇 1〇/〇 sds的〇.1χ SSC 於63 C下清洗3次，每次5分鐘。於雜交反應後，將前述 尼龍膜置於lml含有鹼性磷酸酶連結的卵白素(alkaline phosphatase-conjugated streptavidin) 、4% 聚乙二醇 (polyethylene glycol)與〇.3%牛血清白蛋白(即八)之1χ磷酸 鹽緩衝溶液(PBS)中進行初步的呈色反應。用於呈色的係為 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽/氮藍四唑（5_br〇m〇_4‘1〇Γ〇 3- indolyl-phosphate/ nitro blue tetrazolium，BCIP/NBT)基質。最 後，以含有20 mM EDTA的lx磷酸鹽緩衝溶液終止呈色反 應。 於呈色後，刖述尼龍膜藉由使用平台式掃描器(υΜΑχ (Fremont，CA) MagicScan at 3，_ dpi)進行掃描並取得影 像，並將所得結果的資料庫以標記影像檔案格式(tagged image file format，Tiff)儲存。為定量基因的表現量在此藉

1359198 由 GenePix Pro 軟體程式(Axon Instruments, Foster City，CA) 測量數位化的影像。 之後’將前述每個點上藉由酵素反應產生的顏色轉換成 灰階景^像。該點的每個像素的明亮值範圍，以〇至256表示 (自黑色經由灰影到白色）。接著’將藉由Umax 6000掃描所 的影像，以GenePix Pro 2.0軟體計算產生每個微陣列點的 表現值，並將這些數據收集成excel檔。將微陣列上每個基

因的表現值以對數比值(log rati〇)(底為2)表示，其定義為腫 瘤組織中每個基因的點表現值對上非腫瘤組織中每個基因 的點表現值。

前述所獲致之18對樣本的微陣列資料（包含良好存活 組與不良存活組），接著經由三步驟的管理分類法，以於其 兩個存活組中挑出最顯著不同的表現基因。在第一步驟中^ 為避免在每個微陣列樣本上㈣統誤差，在此非線性的 局部加權迴歸法（l〇cally Weighted Sactterpl〇t s邮她沉 LOWESS)，藉以將328個基因的對數比值正規化至經由祖 做圖配適的L0WESS曲線上。第二步驟，係藉由指叠改變 法於每個微陣列樣本中定義調節基因，看誰的摺4改 規化，對數比值)大於卜藉以自所有18個微陣列樣本中挑 出顯著的調節基因。在全部18個微陣列樣本中， 疊改變在18個樣本中至少有兩個係大於i，將其挑出 顯著性調節基因。藉此，於本發明中係自似個基因出 ⑷個基因。第三步驟，為了料存活組間挑出最不 的表現基因，在此係使用多重排列檢定法同時檢定所有於第 二步驟中過«過的顯著性卿基因，並獲得每個基因的調整 P值。多重檢定是-個用以控制產生不正確檢定結論(假陽性 與假陰性)之可能性的方法。為評估18個樣本的内部一致

性，在此使用留一（leave-one-out)交又驗證法產生18個CV 樣本，並挑出不同的表現基因（調整p值小於〇 〇5 family 錯誤率）。藉此自前述141個基因中篩選出6個顯著不同的 表現基因。這6個基因分別為CD36抗原、訊號淋巴球活化 分子(SLAM)、轉錄因子ΑΡ-2α (TFAP)、類胰島素生長因子 (IGF-1)、PIM-1致癌基因，以及金屬蛋白酶的組織抑制劑 (TIMP-4)。 於用以描述存活特性的基因被篩選出後，為確認此微陣 列結果及進一步釐清在前述所選基因的表現上之區別，在此 使用反轉錄聚合酶鏈反應(RT_PCR)分析所選基因，以前述 18個樣本中具有足夠RNA的1〇個樣本之微陣列資料進行 確認。於本發明中，使用莫洛尼氏白血病病毒逆轉錄酶 (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase)、隨 機引子，及其他套組試劑(Promega)，藉由習知聚合酶鏈反 應(PCR)逆轉錄出2pg的總RNAs。PCR產物藉由習知電泳 於1,5%瓊脂膠（agarose gel)上進行分離，並於漠化乙錠 (ethidium br〇mide，EtBr)染色後，於紫外光下使其顯現。接 著，使用NIH Image 1.62軟體決定平均染色帶密度，並計算 所選基因相對於β肌動蛋白（β-actin)基因的值，藉以決定6 個所選基因之微陣列表現比與RT_pCR結果之間的關係。 為建立供胃癌病患用的存活預測模式，在此於這些不同 的基因中挑選出微陣列與RT-PCR結果之間的一致率大於 60%或斯皮爾曼等級相關係數具有顯著性，且p<〇 〇5者， 將其用於預測模式的訓練(參閱第一圖）。並自其中挑選出4 個基因’分別為CD36、SLAM、TFAP與PIM-1。 將母個所選基因於腫瘤組織與非腫瘤組織中的 表現I之狀態分成四種類別，分別為：（1)腫瘤的表現量高 =腫瘤的表現量’以，，職►正f，，表示；（2)非腫瘤的表現 量南於腫瘤的表現量’以，，正常►腫瘤，，表示；⑶腫瘤與非腫 ，均為陽性；以及(4)腫瘤與非腫瘤均為陰性（第二圖）。接 著，選用20個樣本做為預測模式訓練組，此2〇樣本包含前 述18個樣本中的i0個，及另外新登錄的4〇個樣本中^ 選出的10個，其中10個為良好存活，另10個 在訓練財，將每讎核RT_PCR分_得 配至前述四種RT_PCR狀態類別中。最後，藉由訓練二戶^ 之四個齡j RT-PCT結果的鮮建立—制料。接著 由Akaike，s法則使用羅吉斯迴歸模式與逐步模 女《 =?。可自前述4個基因中，獲致由其中1個基: (CD36、SLAM與ρΐΜ·υ所組成之最有 式，其預财程式可推算如下式—所示：斯預測模 (式一） ^ = 0.833 CD36-0J62 SLAM- 0.317 π = exp(i) /(1+ exp(^)) 19 1359198 其中’ ”CD36”、’’SUM5’與’分別為前述樣本的 CD36、SLAM與PIM1於四種RT_PCR狀態分類中的出現頻 率；”π”為”不良存活狀況”的可能性。當，v，小於或等於〇 5 時，會被預測為良好存活(定義為存活時間>3〇個月）。當，，π” 大於0.5時，則會被預測為不良存活(定義為存活時間<12個 月）。CD36、SLAM與ΡΙΜ-1的羅吉斯迴歸係數的標準偏差 分別為為 0.411、0.436 與 0.173。 熟習本技術領域之技藝者’藉由閱讀本發明說明書所載 之内容可了解到，前述(式一）中係數會因所使用之預測模式 s川練組之病患樣本的不同或數量不同而會有些許差異，但其 並不影響本發明之實施。可以理解的是，當預測模式訓練組 中所包含之樣本數量越多，根據本發明方法所得之預測公式 將會越準確。 實施例二 將30位病患的獨立測試組，應用本發明所指出由 CD36、SLAM與PIM-1所組成之預測模式進行存活預測。 將這30位病患的腫瘤與非腫瘤組織樣本，分別進行反轉錄 聚合酶鏈反應’藉以獲致每位病患組織樣本中CD36、slam 與PIM-1的RT-PCR表現狀態。將每個基因的表現狀態對照 實施例一中RT-PCR狀態分類表，由表中取得前述由訓練組 20個基因所計算出之出現鮮’並將每位病患的每種基因 所對應的出現頻率數值帶入(式一）中，藉此即可計算出，該 20 1359198 名胃癌病患可能的術後存活狀況。 經分析後所得結果顯示，其中23位病患被正確的預測 (76.7%) ’並產生80%的特異度(speciflcity)、73.3%的靈敏度 (sensitivity)、75%的陽性預測值，以及78.57%的陰性預測 值。頻率分佈如表一 A所示《此結果顯示，本發明預測模 式在獨立測试組中表現出向度的預測能力。病患的存活率被 預測為具有”良好存活，，顯著高於被預測為具有”不良存活” 者(P = 0.00531)。（第三圖 A) 7位第一期的病患中有6位藉由此模式正確地被預測。 其中1位病患被預測為，，不良存活，’，且其於第12個月時死 於多重肝臟轉移(metastases)。其他6位病患中有5位被正確 的預測，其頻率分布示於表一 B。5位第二期病患中有3位 破正確的預測。這3位病患中的2位被預測為具有，，不良存 活”，並於12個月内死於疾病，其頻率分布示於表一 c。2 位第四期的病患藉由此模式被正確的預測，其頻率分布示於 表一E。 本發明預測模式應用於16位第三期病患所得之準確度 的頻率分布示於表-D。Π位病患被正確的預測(Μ)，复 特異度為刚％、靈敏度為63.6%、陽性預測值為1〇〇%，二 及陰，預雕為55.6%。病患的存活率被_為具有，，良好 存活”顯著高於被預測為具有”不良存活，，者(ρ = 〇〇4 (第三圖Β)

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表一 A 在全部30位測試病患中準確度的頻率分佈 臨床存活狀態 不良 良好 總合 預測的存活 不良 11 3 14 狀態 良好 4 12 16 總合 靈敏度=73.33% 特異性=80.00% 陰性預測值=78.57% 陽性預測值=75.00% 15 15 30 表一 B 在7位第一期病患中準確度的頻率分佈 臨床存活狀態 不良 良好 總合 預測的存活 不良 1 1 2 狀態 良好 0 5 5 總合 1 6 7

靈敏度= 100.00% 特異性=85.71% 陰性預測值= 100.00% 陽性預測值=50.00% 22 1359198 表一 C在5位第二期病患中準確度的頻率分佈 臨床存活狀態

總合

靈敏度=50.00% 特異性=66.67% 陰性預測值=66.67% 陽性預測值=50.00% 表一 D在16位第三期病患中準確度的頻率分佈

臨床存活狀態 一------- 預測的存活 不良 __^態_良好 總合 靈敏度=63.64% 特異性=100.00% 陰性預測值=55.56% 陽性預測值= 100.00% 不良 良好 7 0 4 5 11 5 總合 7 9 16 23 1359198 表一 E 在2位第四期病患中準確度的頻率分佈 臨床存活狀態 _不良 良好 總合

預測的存活 不良_1_0_1_ 狀態_良好 0_1_1_ 總合 1 1 2

靈敏度= 100.00% 特異性= 100.00% 陰性預測值= 100.00% 陽性預測值= 100.00%

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【圖式簡單說明】 第一圖（A)係為代表6個基因與β肌動蛋白内控組的逆轉錄 PCR結果；（Β)藉由逆轉錄PCR確認6個所選基因 的微陣列資料； “Ν”表正常組織；”Τ”表腫瘤組織； “CD36”表 CD36 抗原； “SLAM”表訊號淋巴球活化分子； “TFAP”表轉錄因子ΑΡ-2α ; “IGF-1”表類胰島素生長因子； “ΡΙΜ-1，，表ΡΙΜ-1致癌基因； ΤΙΜΡ-4”表金屬蛋白酶的組織抑制劑_4 ; “G”表良好存活； “ρ”表不良存活； 第二圖4個樣本中每個所選基因的成對逆轉錄PCR狀態； “CD36”表 CD36 抗原； “SLAM”表訊號淋巴球活化分子； “TFAP”表轉錄因子Αρ_2α ; “ΡΙΜ_1”表ΡΙΜ-1致癌基因； “β-actin”表β肌動蛋白； “Ν”表正常組織；”τ，，表腫瘤組織； Τ^Ν”表腫瘤的表現量高於非腫瘤的表現量；

25 1359198 “NkT”表非腫瘤的表現量高於腫瘤的表現量； 第三圖被預測有良好存活與不良存活之病患的存活曲線。 (A) 全部測試病患的存活率； (B) 第三期病患的存活率。 【主要元件符號說明】

Claims (1)

1359198 十、申請專利範圍： 1. 一種以特定統計模式分析基因表現量的方法，至少 包含： 提供複數個胃癌腫瘤組織樣本與複數個非 胃癌腫瘤組織樣本成為複數個成對組織樣本； 篩選該複數個成對組織樣本中的一特異性 Φ 基因，係藉由一基因表現的一微陣列分類圖譜結 果； 對該特異性基因進行一反轉錄聚合酶鏈反 應以產生一反轉錄聚合酶鏈反應結果； 自該特異性基因中選取一腫瘤調節基因； 以及 以一特定統計模式進行計算所選取之該 腫瘤調節基因，藉以完成該以特定統計模式分 • 析基因表現量的方法；其中該特異性基因係選 自由CD36抗原、訊號淋巴球活化分子以及 PIM-1致癌因子所組成之群組。 2. 如申請專利範圍第1項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中該胃癌腫瘤樣本係為 已知胃癌術後存活狀況之腫瘤組織樣本。 27 1359198 3. 如申請專利範圍第1項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中篩選該複數個成對組 織樣本中的該特異性基因進一步更包含下列步 . 驟： 正規化位於該微陣列分類圖譜上之該成 對樣本中之該特異性基因的一表現量之一對數 φ 比值； 使用一摺疊改變法，以該特異性基因的該 對數比值之該表現量進行過濾該特異性基因； 以及 篩選該特異性基因，係以一多重排列檢定 法與一交叉驗證法。 4. 如申請專利範圍第3項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中該特異性基因的該表 • 現量係為該成對樣本中該基因的一 cDM表現量。 5. 如申請專利範圍第3項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中該位於該微陣列分類 圖譜上之該成對樣本中之該腫瘤調節基因的該表 現量之該對數比值係使用一非線性局部加權回歸 28 1359198 法 6·如申請專利範圍帛丨項所述之以特定統計 析基因表現量的方法，其中該反轉錄聚合酶 應結果須確認與該微陣列分類圖譜結果成為一

如申請專祕圍第6項所述之則找崎八 析基因表現量的方法，其中該反轉錄聚合酶= 應結果須確認與該微陣列分類圖譜結果成為— 係由執行一所選定的篩選標準而成。 如申請專利範圍第7項所述之以敎統計模式八 析基因表現量的方法，其巾該篩選標準係為^ 爾曼等級檢定法。 •如申請㈣_帛1項所述之以特定統計模式分

析基因表現量的方法，其中該特定統計模式選取 法係為逐步模式法。 10·如申請專職圍第1項所述之則找統計模式分 析基因表現量的方法，其中選取—腫瘤調節基因 至少包含使用羅吉斯迴歸分析法選取該腫瘤調節 基因。 29 1359198 11. 如申請專利範圍第1項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中特定統計模式進行計 算之方式係以方程式表示： λ =0.833 (CD36) - 0.762 (SLAM) - 0.317 (PIM-1)； 7Γ 二 exp( λ ) / (l+exp( λ))，其中該 7Γ 為胃癌 • 術後存活狀況的一頻率狀況，係統計複數個待 測組織樣本，分別經由一腫瘤調節基因於一狀 態分類中所相對應的一出現頻率狀況所得到。 12. 如申請專利範圍第11項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中該CD36係為一 CD36 抗原待測組織樣本，該SLAM係為一訊號淋巴球活 化分子待測組織樣本以及該PIM-1係為一 PIM-1 致癌因子待測組織樣本。 > 13.如申請專利範圍第11項所述之以特定統計模式分 析基因表現量的方法，其中該7Γ為胃癌術後存活 狀況的頻率狀況，當該π小於或等於0. 5時，係 為良好存活，表示胃癌術後之存活時間大於30個 月以上。 30 ’如申請專利範圍第u項所述 析基因表現量的方法，符疋統计模式分 狀況的頻率狀況，當該U 厂癌街後存活 1 5時，係為不良 存活’表不胃癌術後之存活 吁間小於12個月以下。