TWI338774B - Methods of detecting drug resistant microorganism by surface plasmon resonance system - Google Patents
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Description
Imaging - Proceedings of SPIE; and (5) Choi, J. W., K. W. Park, et al. (2005). "Cell immobilization using self-assembled synthetic oligopeptide and its application to biological toxicity detection using surface plasmon resonance." Biosensors and Bioelectronics 20(11): 2300-2305,已提供的抹 些進展’但這些先前技藝仍有一些缺失需要改善。 【發明内容】 除非另有定義’所有在此使用之技術及科學性用字皆可以此發明 同領域之通用詮釋理解。雖然任何與此發明描述類似或等效之方法材 料亦可應用於此發明的使用或試驗,較佳的方法材料描述於此。 細菌細胞具有四個不同於人體細胞之特徵,可作為臨床藥物有效 作用之依據: (A) .抑制細胞壁生成: 如盤尼西林,頭孢類抗生素,亞胺培南,氨曲南等藥物皆設計為抑制 細胞壁生成,作用於抑制肽聚醣之交聯(轉肽作用)或其他肽聚醣合 成步驟。 (B) .抑制蛋白質生成: 如氣黴素,四環素,氨基糖苷類抗生素等藥物皆設計為抑制蛋白質的 合成,主要作用於508及3〇8核糖體子單位。 (C) .抑制核酸生成: 作用原理主要分為三種。如績齡丨及❻料_制於阻斷核甘酸生 成。奈啶酸及奎諾_類抗生素用於抑制DNA生成。利肺寧用於抑 mRNA生成。 (D)改變細胞獏功能: 之裒狀構造為其抗菌活性所必須。青黴素酶(又稱乙内酰胺酶)可切 開,,阻斷此藥物之活性。對於革蘭氏陰性桿菌,盤尼西林之抗菌效 果I藉由一連串側鏈之化學變化來提升。氨比西林即由是可殺死一些 革蘭氏陰性桿菌,如大腸桿菌。 ^在臨床實驗室測試細菌對抗生素敏感度的常用方式有二,紙錠擴 散技術及試管擴散技術。紙錠擴散技術是將含有多種抗生素之紙錠置 於曾接種生物體之培養皿’在35t:培養18_24小哺產生結果但此 結果精確度不夠。 試管擴散技術則將抗生素溶液稀釋至不同濃度,再以等量溶液培 養生物體。在35t:培養18小時後觀察結果。然此技術耗費時間,精力, 及金錢’所以通常用於測試生長緩慢之生物體。 膜表面共振生物感測器之基本原理 藤i面笮里王主要是位於金屬表面,在金屬及電介質介面之能量 吸收會導致電子振盈。SPR現象可藉由配對金屬與電介質之邊界條件 及配對邊界光學相。若將金屬上的電子視為電子氣,色散關係為 Ι^Ρ=(°^)[(^εά)/(εηι+ε:ί)] l/2=kx,矣 ή1 表面電漿子波之波向量 C:光速
Sm:金屬之電介質常數 ω:光學頻率
Sd:電介質之介電常數; 此現象指出電介質電磁波與金屬表面之表面電漿子波必須在波向 量及光學鮮上-致。此金屬-電介f介面之—贱向量被視為動量守 恆。光頻一致則被視為能量守恆。然而,在正常情況下,表面電漿子 1338774 帝’。量#认射光讀向量為大。人射光之波向量必須增加至與表面 電水子波向量-致。有兩種方法可提高波向量使達到—致狀態·· 一是 經由光柵耦合器,二是經由衰逝全反射耦合器。 、對於光她合H相對於電介f,—光柵結構被結合至金屬側 面以提供外加波向量。配對條件變為 其中V光柵衍射級數十2♦其中β為光柵常數,Θ。為光(雷射光束) 入射角。
對ATR系統’可藉由在金屬側面,相對於電介質附加棱鏡以外 加波向量。配對條件如下 k、P=k,kX , ,中叩下標意指稜鏡折射率。心為共振角度,由是雷射光束大部分的 能量皆麵合絲面電漿子。當此現象魅時,稱其馳合達成共振。 其又名為表面《子共振。當電介質折射較變時,共㈣度偏移。 因此,偵測共振角度偏移可決定電介質折射率之改變。另一方面改 變折射率柯縛反射自域·電対介面雷射光束之光她。因此折
射率的改變可由干涉測量方法_,此法可測量光她偏移並決定折 射率改變量。 以稜鏡為基礎之SPR系統可被應用至不同的表面配置。在〇tt〇排 列’金屬與TIR表面之間有距離。此空間被具有較低反射率之媒介所 填滿。此配置對使用固相媒介之SPR研究相當有用。然而,因金屬與 TIR表面之距離會降低SPR效率,故對溶液之應用性有限。對 Kretchman配置而言,金屬層直接位於TIR表面上方,使其生成電漿 子之效率更高。第三種配置看似〇tto排列但使用一特殊層加強tir。 利用共振鏡(RM)原理達成TIR光及電漿子之耦合。於全光内反射稜
II 1338774 • . 此發明VW2比率大於謂。較佳的比率為i 〇16〇。最佳之比率為 1.5。此發明D膽比率大於_。較佳的比率為i⑴♦更佳之比 率為3-5。最佳之比率為1,5。 本發㈣傭供-種由膜表面共纖職生物賴觀敏度之設 備,包括⑻-於稜鏡底覆以金屬薄膜或妓柵金屬薄膜之稜鏡,⑼一 可讓微生物流經之腔室,該腔室與薄膜相接,⑷一覆於腔室内層之固 ㈣質’⑼-投射光至薄膜產生輸出光之光源,(e)—接收輸出光之 光偵測器,及⑺一分析表面電漿子共振角度偏移之設備。 【實施方式】 Φ 例1:測量表面電漿子共振曲線 SPR曲線 表面電聚子共振曲線可由五參數描述之,但主要被討論之參數為表面 電漿子共振角度及表面電漿子共振曲線之半峰寬β χ軸代表由參考光 電二極體之訊號光電二極體測量之光強度,Υ軸則為掃瞄角度。當雷 射光束掃瞄某一特定角度,能量會被生成於金膜表面之表面電漿子吸 收。注入光波向量與表面電漿子波向量一致。在此角度下,反射係數 為曲線最小值,趨近於零。對應角為表面電漿子共振角度。表面電漿 子共振角度會隨標本之折射率增加或減少。折射率越小,表面電漿子 共振角度越小,反之亦然。 設定槽 移動平台:生產自SIGMA公司,產品編號為SGSP-120YAW (θζ),用 於移動光電二極髅。此移動平台之最低解析度為0.005度。 雷射:在此使用之雷射光源生產自Melles Griot,圓柱狀氛氖激光系統 線性極化(25 LHP 213-249),紅光波長632.8 nm,輸出光率〇·5 mW。 光接收二極體:在此使用之二光接收二極體生產自HAKUT0,其被分 別置於移動平台並用於測量訊號光強度及參考光強度。 底座:底座被用於沈澱折射率1.75之黃金,材質SF11。 稜鏡:稜鏡購自Edmund ’大小為l5*21*15mm,材質SFLU,產品編 13 1338774 • · . · 號為H45-950右角稜鏡。 表面電漿子共振設定系統 - 在設定表面電漿子共振上,使用一氦氖雷射(波長=632.8nm)作為光 源。雷射光束經過偏光透鏡自s_偏振元件阻斷p_偏振,僅p—偏振元件 可激發表面電漿子。穿透之P-偏振雷射光束經由分光鏡(BS)分為兩 束’一由光電二極體偵測為參考光’另一束則於特定角度範圍射入稜 鏡以決定表面電漿子角度。反射光由在稜鏡對面之光電二極體偵測為 sil號光。表面電漿子激發自平滑玻璃表面上沈殿之金膜。平滑玻璃由 φ 介質液附著在稜鏡上。光電二極體所偵測之即時訊號經由放大器擴大 並由16-位元A/D轉換器(Adventechpa_1716)轉成電壓訊號。γ轴 代表參考光及訊號光之比率,x轴代表棱鏡與標本介面之入射角。入 射角由配備有電控雙臂載物台之控制器所控制。偵測表面電漿子共振 角度時,射入光之能量被吸收,且達到表面電漿子共振。實驗設定由 國立成功大學電機科學系調適光子實驗室設立。 黃金薄膜 黃金薄膜,國立成功大學電機科學系調適光子實驗室提供。鍍金膜之 方法為超高真空電子束蒸發。金膜厚度為仍職,基底材質為折射率 9 1.78 之 SF11。 細菌製備 JM109菌株 在此使用之細菌為麗09菌株,帶有recA1突變確保插入片段之穩定 性德1 $變可提高微量快速抽提法所得之質體職品質。Η禮7 突變藉由一内源性内切核酸酶系統預防複製DNA之裂解。 細菌培養 因為乙内酰胺環對盤尼西林的重要性,其又被稱為乙内醜胺藥物。一 14 完整之環狀構造為其抗菌活性所必須。青黴素酶(又稱乙内酰胺酶) 可切開環來阻斷此藥物之活性。在此使用之抗生素細菌株被含氨比西 林抗性之質體轉形’該質體可轉譯生成乙内酰胺酶切開氨比西林的 環。細菌由鐵絲環挑起並植於5 ml LB培養液培養過夜,之後轉至1〇〇 ml LB培養兩小時。 例2:系統靈敏度測試 在系統靈敏度試驗中,製備不同濃度之蔗糖溶液,且在此採用兩種程 序測試表面電漿子共振系統之靈敏度。蔗糖溶液被用為一種測試平台 靈敏度之工具’因其折射率已知。折射率與蔑糖重量百分比溶液呈線 性關係。 程序一為在流動腔室注入五種不同重量百分比之蔗糖溶液(1%、25 %、5%、7.5%、1〇%)。當每種溶液達到系統平衡時,不同重量百分 比之溶液會有所改變。 程序二為注入較小濃度溶液,在流動腔室注入五種不同重量百分比之 蔗糖溶液(0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1%)。當每種溶液達到系 統平衡時,不同重量百分比之溶液會有所改變。 多聚L-賴氨酸塗層 多聚L-賴氨酸在不同生化處理過程中被證明為一有效之組織膠黏劑。 在塗層之前,以去離子水稀釋多聚L-賴氨酸。將鍍有黃金金屬薄骐之 平滑玻璃表面以多聚L-賴氨酸溶液浸潤(濃度200 ug)至少24小時使 與黃金金屬薄膜反應,細胞在浸置培養後會被固定於生物晶片。 例上氨比西林靈敏度及抗性試驗 當覆有多聚L-賴氨酸之生物晶片組裝完成,將無菌DI水注入流動腔室 30分鐘使系統穩定。平衡過後,將浸置之LA培養液注入流動腔室21〇 1338774 • · · · 分鐘覆蓋黃金金屬薄膜。接著,注入抗生素溶液,用電腦觀察表面電 漿子共振曲線。
表面電漿子共振系統連續測量SPR角度’並於相同條件下比較具抗性 與不具抗性菌株之SPR曲線。具抗生素抗性菌株之spr曲線如圖二所 示,而不具抗性菌株之SPR曲線則如圖三。實驗結果顯示,SPR系統 平衡後30分鐘,注入LB菌液會提高SPR角度。210分鐘後,用去離 子水洗去多餘細菌且SPR角度變小,之後再平衡1〇_2〇分鐘。在平衡 曲線後注入抗生素溶液。圖三可見於不具抗生素抗性菌株。SPR角度 在注入抗生素30分鐘後急遽減少,表示抗生素破壞細菌細胞壁並使其 破裂。結構鬆散之細胞壁因此降低折射率,電腦上則顯示SPR角度變 小。具抗生素抗性之曲線則沒有測量到此SPR角度之顯著減少。不具 抗生素抗性之SPR角度落差為-0.06876度,較具抗性菌株之_0.02128 度為大,落差幾乎為三倍之多。 \菌株型 重複試裝\ 不具氨比西林抗性 之表面電漿子 共振角度偏移 具氨比西林抗性 之表面電漿子 共振角度偏移 不具抗性 ~ 之表面電漿子 共振角度偏移/具抗性 之表面電漿子 共振角度偏移 1st -0.04909 -0.02475 1.9834 2nd •0.07286 -0.0278 2.6208 3rd -0.06876 -0.02128 3.2312 4th -0.0729 •0,04355 1.6729 平均值 -0.0659 -0,02935 2.377075 標準差 0.11375 0.009837 0,692766 表一比較不具氨比西林抗性與具氨比西林抗性之表面電漿子共振角 度偏移之重複實驗數據
施用抗生素短時間内便有偏移現象發生,故連續測量抗生素施用後3〇 分鐘之表面電漿子共振曲線。此曲線可比較不具抗生素抗性及具抗生 素抗性菌株之曲線(圖四)。不具抗生素抗性菌株之表面電漿子共振曲 線有顯著的降低現象(圖五)。由是,可結論在抗生素施用後至少3〇分 16 1338774 .· . · • . 鐘,細菌結構與外型產生改變。此改變可由表面電漿子共振系統偵測。 不具抗生素抗性之SPR角度落差為-0.01702度,大於具抗生素抗性菌 株之-0.00332度,落差幾乎為五倍之多。 SEM (掃瞄式電子顯微鏡) 固定 細胞用含2%戊醛之〇.〇2Μ ΡΒ溶液(0.2Μ NaH2P04.H20 115 ml及 0.2MNa2HPO4 385 ml, ρΗ7·4)固定一小時’之後用PBS溶液浸潤二至 三回(NaCl 8g,Kcl 0.2g,Na2HP04 1.44g,及含 KH2P〇4 〇.24g 之一升 φ 溶液,PH7.4)。PBS溶液浸潤後,用2% 〇S〇4溶液後固定一小時。用 PBS浸潤二至三回後,用酒精梯度脫水,50%酒精1〇分鐘,7〇%酒 精10分鐘,90%酒精1〇分鐘,及三次100%酒精1〇分鐘。固定好 之標本用臨界點乾燥儀(Tousimis)乾燥,並用離子覆膜機(jpc—noo) 120分鐘將黃金灑上。 SEM掃瞄 SEM使用一鎢纖或lamanhexaborid來生成電子進行熱離子發射。之 後,用不同電壓2.5-50kV加速電子朝標本前進。電子經透鏡系統導向 單一位點使產生遍及標本之電子流。入射電子流與標本作用產生不同 ® 種之訊號。這些訊號之後被偵測器收集,其輸出於CRT螢幕放大來調 整強度。在此使用之掃瞄式電子顯微鏡(JE〇L JSM_53〇〇, Japan)放大倍 率為 15 x 至 200,000。 ° 細菌之,ΕΜ掃描照片如圖六,七,八。由這些圖片可發現不具抗生素 , 抗性之齡在施贱比西林分鐘後已對細菌造摘分損害。細菌 型態已被改變,但具氨比西林抗性菌株之SEM照片則與未施用抗生素 細菌照片類似。 、 圖九跟十為施用氨比西林三十分鐘後之細菌㈣電顯照片。由圖可知 17 不管在外型或結構上具抗性與不具抗性之菌株在施用抗生素三十分鐘 後皆無甚改變。然而,SPR系統可以偵測細菌之些微改變。因此spR 系統可用於測量快速而微小之改變。 例4:四環素之靈敏度及抗性試驗 如例三,將金黃色葡萄球菌施以四環素。將不具四環素抗性菌株施用 以50pg/ml抗生素之SPR曲線如圖十一所示,而將具四環素抗性菌株 施用以50μ8/ηι1抗生素之SPR曲線如圖十二所示。將不具四環素抗性 菌株施用以l(^g/rnl抗生素之SPR曲線如圖十三所示,而將具四環素 抗性菌株施用以l(^g/ml抗生素之SPR曲線如圖十四所示。由圖十 三,十四可知’施用30分鐘l〇Ug/ml四環素情況下,不具四環素抗性 菌株之SPR曲線較具抗性菌株有更明顯之波動情況。已知四環素機制 為結合至30S核糖體子單位並預防氨基酰_tRNA結合至核糖體a位 點,且四環素對細胞壁之影響相較於氨比西林為間接影響:由上可知, 不具抗性菌株之SPR角度偏移為不規則形而超過五小時之具抗性菌株 之SPR角度偏移為平滑且單調。此SPR角度偏移差紐_於辨 具抗性與具抗性菌株。 熟知此領域的人會知道此發明可圓滿達成實現目的並獲得上述及固 之結果與優點’亦包括其他。測量具抗生素抗性有機體之過程方法之 代表如較佳實_,其為觀,輕植發明之獅制。熟知 2進-步修正並衍生出其麵途。這些修正亦符合此發明之 疋義於專利申請範圍。 不背 顯而易見的’對熟知此領域人士而言,對此發明之替代與修 離此發明之範圍及精神。 、> ' 在此專利書魄及之所有專概發表反映此發__域之常用 技術水平。所有在此引用之 引用以為參考。 货表之參考程度皆個別且專一地被 例作專-描述,選擇性料駐雜此發明目前由較佳之實案 反異雜正變異如附加聲明之“被視為屬於此發明範圍内。
【圖式簡單說明】 圖一為此發明方法之簡略描述。 圖二為具氨比西林抗性菌株其SPR角度偏移之標準動力圖。 圖二為不具氨比西林抗性菌株其SPR角度偏移之標準動力圖。 圖四為將具氨比西林抗性菌株以抗生素施打30分鐘後其SPR角度偏移
在此描述以為例證之發明或 被完成。在此使狀詞彙與 ^何未述之元件或關的情況下 用語表達排除其他無述特徵語而非蚊,且無意使用此 明範圍内多種修正皆有可行性。因^心類似之替代物,已知於此發 動力圖。 圖五為將不具氨比西林抗性菌株以抗生素施打30分鐘後其SPR角度偏 移動力圖。 圖六為未施打抗生素之大腸桿菌照片。 圖七為不具氨比西林抗性大腸桿菌菌株施以3pg/ml抗生素300分鐘後 的照片。 圖八為具氨比西林抗性大腸桿菌菌株施以抗生素300分鐘後的 照片。 丄哪774 圖九為不具氨比西林抗性大腸桿菌菌株施以3μβ/ηι1抗生素3〇分鐘後的 照片。 圖十為具氨比西林抗性大腸桿菌菌株被施以3μ8/ιη1抗生素3〇分鐘後的 照片。 圖十一為不具四環素抗性表皮萄球菌株被施以5(^g/ml抗生素300分鐘 後之SPR角度偏移。 • 圖十二為具四環素抗性表皮萄球菌株被施以5(^g/ml抗生素300分鐘後 之SPR角度偏移。 圖十二為不具四環素抗性表皮萄球菌株被施以丨〇μβ/ιη1抗生素3〇〇分鐘 後之SPR角度偏移。 圖十四為具四環素抗性表皮萄球菌株被施以丨〇|IgA^抗生素3〇〇分鐘後 之SPR角度偏移。 20
Claims (1)
- Π38774 申請專利範園 種伽表面電漿子共振設備_微生物對 細嫩柵金軸犧1可= 投射,(G)—覆於腔室内層之固定物質,⑼一 投射先至_產生輪出光之光源,(e)—接 軟則娜⑴ 使或為原生型’(2)分別將控制組與標本流經腔室 ΐί / ()將熱加入腔室,⑷記錄實驗組之選用數據, 角驗角賴移νι值及縣之表《漿子共振 之表面賴子共振角度偏料差a值及標本 it落差m值’(即控制組及標本之表面電襞子 ^ t==5n)r_f_識具#輪_本,__ V1/V2 比率大於 1.001,(id Di/fy? μμ .玄-丄从 1 λ/λ J ㈣ϋ 率於h刪,及⑽相較於控制組, 心本之表面賴子共鋪度偏移平穩或單調。 【圍第1項之方法,其中_比率為〗_。 4 ’ 第1項之方法,其中VW2比率為1.67-3.23。 其中D1/D2比率為〗.〇1_1〇 其中D1/D2比率為3-5。 其中D1/D2比率為1.5。 其中微生物為細菌或細胞 =!::ί利範圍第1項之方法,其中νι/ν2比率為b。 6 根據申叫專利範圍第1項之方法 根據申請專利範圍第1項之方法 根據申請專利範圍第丨項之方法 8. 根據申請專利範圍第1項 9. 根射請專利範圍第二微生物為細菌或細胞。 球菌。 方去,其中該細菌為大腸桿菌或金黃色葡萄 10. 根據申請專利範圍第丨項之 素,氨比西林,氣黴素,四環♦ ^ ’其中樂物為盤尼西林,頭抱類抗生 η.根據申請專利範圍第10項之方法, 12.根據申請專利範圍第u項 二:該樂物為氰比西林β 決定,該記錄包_谓2 ’其㈣識由實驗組選狀數據記錄 +大於1顧,(II)D1/D2比率大於1.001。 21 13.根射物咖第㈣ R η 別,標本組之曲線較控制組平滑或單調。 15根據申請專利範園第1項之方法,其中金屬薄膜為黃金薄膜。 16根據申請專利範園第1項之方法’其中固定物質為多聚L-賴氨酸,抗 體,或寡肽。 _ 17根據申請專利範圍第1項之方法,該光源為波長為632.8nm之乱乱雷射。22
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