TWI336333B

TWI336333B - Specific binding agents of human angiopoietin-2 (6)

Info

Publication number: TWI336333B
Application number: TW96129864A
Authority: TW
Inventors: Daniel Oliner Jonathan; Min Hosung
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-14
Publication date: 2011-01-21
Also published as: TW200635953A; TW200635952A; TW200808833A; TWI324612B; TWI317281B; TW200635950A; TW200635951A

Description

九、發明說明：本申請案宣稱2001年1〇月Ua申請之美國臨時申請案第60/328,624號的益處，將其完整地以引用的方式併入本文中。【發明所屬之技術領域】本發明係關於認得並與血管生成素_2 (Ang_2)結合的專〜結合劑，更特定而言，本發明係關於該專一結合劑及其片·^的產製、診斷用途和治療用途，.其專一地與Ang_2結合。【先前技術】企笞生成作用，從現存的血管中形成新的血管，對於許多生理學和病理學過程而言是必要的。通常，血管生成作用疋緊密地由前-和抗-血管生成之因素調節，但在疾病的

If况下，像疋癌症、眼睛的新生血管疾病、關節炎和牛皮癬，該過程可能錯誤地進行。Folkman，Nat Med，1: 27-3 1 (1995)。 ^知許多疾病與取消管制或不想要的血管生成作用有關。這些疾病包括，但不限於眼睛的新血管形成，像是視網、病括糖尿病性的視網膜病）、與年齡有關的黃斑變性牛皮癖、血官母細胞瘤、血管瘤、動脈粥樣硬化、炎症 :病’像是類風濕或風濕性的炎症疾冑，尤其是關節炎( 2風濕性關節炎），或其他的慢性炎症疾病，像是慢性轧喘、動脈或移植後的動脈粥樣硬化、子宮内膜異位症和

O:\121\121929.DOC 1336333 贅生物的疾病，例如 J如所明的固體腫瘤和液體（或造血的）腫瘤（像疋白血病和 '肤P,益、甘/UA* . 网刊淋巴瘤）。其他與不想要之血管生成作用有關的疾病’對熟諳此藝者而言將是明顯的。

雖然血f生成作用的調節’已經涉及許多信號轉導系統，但最具特色和最主要的内皮細胞_選擇系統，涉及受體酪胺酸激酶（稱為”Tie-2"或"Tie-2R"(亦稱為"〇RK"); 亦將老鼠的Tie-2稱為i，tek”）及其配體，血管生成素（GaU， N.W.和 YanCopoui〇s，G D , Genes Dev 13: 1〇55_ ι〇66 [1999]) 〇有4個已知的血管生成素；血管生成素u ("Ang_ 1 )到血官生成素_4 ("Ang-4")。亦將這些血管生成素稱為

"Tie-2配體"。（Davis, S.等人，Cell，87: 1161-1169 [1996] ，Grosios，K.等人，Cytogenet Cell Genet，84: 118-120 [1999]，Holash，J.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science, 42: 1617-1625 [1999] ; Koblizek，T.I.等人 ’ Current Biology，8:529-532 [1998] ; Lin，P.等人，Proc Natl Acad Sci USA, 95: 8829-8834 [1998] ； Maisonpierre, P.C.等人，Science, 277: 55-60 [1997] ; Papapetropoulos， A.等人，Lab Invest, 79:213-223 [1999] ; Sato, T.N.等人， Nature, 375: 70-74 [1998] ; Shyu，K.G.等人，Circulation， 98: 2081-2087 [1998] ; Suri，C.等人，Cell，87: 1171-1180 [1996] ; Suri，C.等人 ’ Science，282: 468-471 [1998];

Valenzuela，D.M.等人，Proceedings of the National

Academy of Sciences of the USA, 96: 1904-1909 [1999]； Witzenbichler，B.等人 ’ J Biol Chem，273: 18514-18521

0:\121\121929.D0C 1336333 [1998] )。然而，Ang-l與Tie-2結合，在培養的内皮細胞中，刺激受體的磷酸化作用，已經觀察到Ang-2激動並拮抗

Tie-2受體的磷酸化作用（Davis，S.等人，[1996]，在前； Maisonpierre，P.C.等人，[1997]，在前；Kim，I.，J.H. Kim，等人，Oncogene 19(39): 4549-4552 (2000) ; Teichert-Kuliszewska, K.，P.C. Maisonpierre 等人，Cardiovascular Research 49(3): 659-70 (2001)) 〇老鼠Tie-2和Ang-l基因剔除的表現型是類似的，並提出 Ang-1刺激之Tie-2填酸化作用，經由維持内皮細胞-支持細胞的附著，傳達了在子宮中正在發育之血管的改造和穩定化作用（Dumont, D.J.#A，Genes&Development，8:1897-1909 [1994] ; Sato, T.N.等人，Nature，376: 70-74 [1995]; Suri，C.等人，[1996]，在前）。認為在成年時仍保留Ang-l 在血管穩定化作用中的角色，在那裏被廣泛地並在組成上表現（Hanahan，D.等人，Science, 277: 48-50 [1997]; Zagzag, D.等人，Experimental Neurology, 159: 391-400 [1999] )。相反的，Ang-2的表現主要限於血管改造的地方，認為它在那裏阻斷了 Ang-1的功能，藉此誘導有助於血管生成作用之血管可塑性的狀態（Hanahan，D.等人，[1997] ，在前；Holash，J.等人，Science，284: 1994-1998 [1999] ;]\^18〇叩161^，？.(^.等人，[1997]，在前）。許多已發表的研究，可能已經證實血管-選擇性Ang-2在疾病狀態中的表現，與血·管生成作用有關。這些病理學的狀況包括，例如牛皮癬、黃斑變性和癌症（Bunone，G.等人

O:\121\121929.DOC ，American Journal of Pathology, 155: 1967-1976 [1999]; Etoh, T.等人，Cancer Research, 61: 2145-21 53 [2001]; Hangai，M.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science，42: 1617-1625 [2001] ; Holas.h，J.等人，[1999]，在前；Kuroda，K.等人，Journal of Investigative Dermatology, 1 16: 713-720 [2001] ; Otani，A.等人，

Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40: 1912-1920 [1999] ; Stratmann，A.等人，American Journal of Pathology，153: 1459-1466 [1998] ; Tanaka, S.等人，J Clin Invest, 103: 34-345 [1999] ; Yoshida， Y.等人，

International Journal of Oncology, 15: 1221-1225 [1999]; Yuan, K·等人，了〇111*1181〇£?61^〇£1〇1^压1仗68631>。11，35:165-171[2000] ; Zagzag，D.等人，[1999]，在前）。這些研究中，大多數集中於癌症，其中許多腫瘤類型似乎展現血管的 Ang-2表現。與其在病理學之血管生成作用中的表現相反，Ang-2在正常組織中的表現是極度受限的（Maisonpierre, P.C.等人，[1997]，在前；Mezquita，J.等人，Biochemical and Biophysical Research Communications, 260: 492-498 [1999])。在正常的成人中，三個主要的血管生成作用位置為卵巢、胎盤和子宮；在已經在其中檢測到Ang-2 mRNA 的正常（也就是非-癌性的）組織中，這些是主要的組織。某些功能性的研究提出Ang-2可能涉及腫瘤的血管生成作用。Ahmad 等人（Cancer Res·，61: 1255-1259 [2001])描述 Ang-2過度表現，並顯示其在老鼠異種移植的模式中，可 OA121M21929.DOC -9- 1336333 能與在腫瘤生長上的增加有關。亦參見Etoh等人，在前和 Tanaka等人，在前，其中提交的資料，可能使Ang-2過度表現與腫瘤血管過多化發生關連。然而，相反的，Yu等人 (Am. J· Path.，158: 563-570 [2001])報告的資料則顯示 Ang-2在Lewis肺癌和TA3乳癌細胞中的過度表現，可能延長注射相對應之轉移感染物（transfdctant)之老鼠的存活。在過去數年中，各種出版物建議以Ang-1、Ang-2及/或 Tie-2作為抗癌治療的可能標靶。例如，美國專利第 6，166，185 號、5,650,490 號和 5,814,464 號，分別揭示抗-Tie-2配體抗體和受體本體的觀念。Lin等人（Proc. Natl. Acad. Sci USA，95: 8829-8834 [1998])將腺病毒表現的可溶性Tie-2注射到老鼠内；可溶性Tie-2可能降低了老鼠發展之腫瘤的數目和尺寸。在相關的研究中，Lin等人（J. Clin. Invest” 100: 2072-2078 [1997])將 Tie-2 的可溶形式注射到大鼠内；該化合物可能降低了大鼠中腫瘤的尺寸。

Siemeister 等人（Cancer Res” 59: 3185-3189 [1999])產製表現Tie-2之細胞外功能部位的人類黑色素瘤細胞株，將這些細胞株注射到裸鼠内，並認定可溶性的Tie-2可能導致腫瘤生長和腫瘤血管生成的”明顯抑制作用”。回顧該資訊，並得到Ang-Ι和Ang-2兩者均與Tie-2結合，從這些研究中，不清楚Ang-1、Ang-2或Tie-2是否將是抗-癌治療之有吸引力的標乾。已經在例如2000年5月4日發表之PCT出版物WO 00/24782 中，描述了將某些肽與穩定的血漿蛋白質，像是Ig恆定區 O:\121\121929.DOC • 10· 1336333 融合，而改善這些分子的半衰期。已經多方面地描述了蛋白質或其片段與穩定之血漿蛋白質，像是ig恆定區的融合，改善了這些分子的半衰期（參見，例如美國專利第5,480,981號；Zheng等人，j. Immun〇1， 154: 5590-5600，（1995) ; Fisher等人，N. Engl, j· Med·， 334: 1697-1702，（1996); Van Zee, Κ·等人，j_ Immun〇1， 156: 2221-2230，（1996) ; 1998年9月15日發證的美國專利第 5,808,029號；Capon等人，Nature，337: 525-531，（1989) ;Harvill 等人，Immunotech·, 1: 95-105，（1995); 1997年 7 月3日發表之WO 97/23614 ; 1997年12月11日申請之 PCT/US 97/23183 ; Linsley，J. Exp. Med.，174: 561-569 (1991) ; 1995年 8月 10 日發表的 WO 95/21258)。有效的抗-Ang-2治療可能有益於龐大族群的癌症患者，因為大多數的固體腫瘤需要新血管形成，以便生長至直徑 1 -2宅米以上。這類治療在其他與金管生成作用有關的疾病上’可能具有廣大的應用，像是視網膜病、關節炎和牛皮癖。對於確認專一地認得並與Ang-2結合的新製劑，有尚未發展的需求。這類製劑將可用於診斷篩選，並治療干涉與 Ang-2活性有關之疾病狀態。因此，本發明的目標是提供調節Ang-2活性的Ang-2之專一結合劑。本發明的這類製劑採用肽體之形式，也就是與其他分子融合的肽，像是抗體的Fc功能部位，其中肽部分專一地與Ang-2結合。

0:\121\121929.D0C 1336333 【發明内容】在與Ang-2結合之肽（在本文中亦稱為多肽）的具體實施例中指示本發明。在本發明中亦包含這類肽的變體和衍生物。在其他的具體實施例中，本發明之肽及其變體和衍生物與媒介附接。在其他的具體實施例中，肽可與F c功能部位融合，藉此提供肽體。肽體可視需要包括至少一個，例如序列識別： 3號至序列識別：6號，或序列識別：76號至序列識別： 157號的肽，以及其變體和衍生物。此外，肽亦可包括至少一個根據在序列識別：65號至序列識別：75號和序列識別：158號中陳述之公式的肽。在另一個具體實施例中，本發明提供編碼該專一結合劑的核酸分子’以及其變體和衍生物。在另-個具體實施例中，本發明提供編碼肽體的核酸分子，以及其變體和衍生物。這類核酸分子可視需要包含序列識別：3 3號至序列識別：5 3號。在另一個具體實施例中，本發明提供藉著對需要其之個體投與有效含量的本發明之專一結合劑，來減少腫瘤的方法》本發明亦提供在個體中抑制血管生成的方法，包括對需要其之個體投與有效含量的本發明之專一結合劑。本發明更提供在個體中治療癌症的方法，包括對需要其之個體技與有效含量的本發明之專一結合劑。本發明亦關於能夠與Ang_2結合的多肽，其中該多肽包

O:\121\121929.DOC 1336333 括胺基酸序列WDPWT (序列識別：65號）’且其中該多肽之長度是從5至50個胺基酸，及其在生理學上可接受的鹽類。該多肽亦可包括胺基酸序列： WDPWTC (序列識別.6 6號）及其在生理學上可接受的鹽類。此外，該多肽可包括胺基酸序列：

Cz2WDPWT (序列識別：67號）其中z2為酸性或中性的極性胺基酸殘基，及其在生理學上可接受的鹽類。該多肽尚可包括胺基酸序列：

Cz2WDPWTC (序列識別：68號）其中z2為酸性或中性的極性胺基酸殘基，及其在生理學上可接受的鹽類。在其他的具體實施例中，本發明係關於能夠與Ang-2結合的多肽，其包括下式的胺基酸序列： aVa^a^DPWTCaiW4 (序列識別：69號）其中： a1、a2和a3分別為胺基酸殘基； a5為胺基酸殘基； a12缺少或是胺基酸殘基； a13缺少或是中性疏水性的、中性極性的，或鹼性的胺基 O:\121\121929.DOC •13- 1336333 酸殘基； a14為中性疏水性的，或中性極性的胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中： a1為V、I、p、W、g、s、q、n、e、Kr^h; a2為V、P、M、g、s、q、d、e、k、mh; a3為A、V、P、m、F、T、G、D、E'K^H; a5為 A、V、G、Q、n、D*E; a 為S、Q、N、D、E、K*R; a13為L、T或H ;且 a14為 V、L、I、w或 M。在更佳的具體實施例中，a1為Q ; a2為E ; a3為E ; a5為D 或E; a12為D或E; an為H;且汪14為]^。 i應瞭解在本文中使用帶有肩上數字之小寫字母（像是&1和 b1) ’企圖確認胺基酸位置，而非意圖代表特定胺基酸的單一字母縮寫。在本文中以大寫字母提供單—字母的胺基酸縮寫。本發明更關於能夠與Ang_2結合的多肽，包括下式之胺基酸序列： b1b2b3b4b5b6Cb8WDPWTCb15b16b17b18b19b20 (序列識別：70號）其中： b1缺少或是胺基酸殘基； b2缺少或是中性疏水性的、中性極性的或鹼性的胺基酸

O:\121\121929.DOC 14- 1336333 殘基； b3、b4、b5和b6分別缺少或是胺基酸殘基； b8為胺基酸殘基； b15缺少或是胺基酸殘基； b缺少或疋中性疏水性的、中性極性的或鹼性的胺基酸殘基； b17缺少或是中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； b18、b19和b2Q分別缺少或是胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中： b1 缺少或是A、V、L、P、w、F、T、G、S、Q、N、K 、R或 Η ; 1)2缺少或是八、乂、1^、1、？、，、]\1、丁、0、8、丫、：^ 、Κ、R或 Η ; b3 缺少或是A、L、I、P、w、M、T、G、S、Q、N、E 、R^H ; 1)4為乂、1、卩、1^、0、8、（^、：^、丑、〖、11或11; b5為V、P、M、G、S、Q、D、E、K、R或 Η; b6為A、V、P、M、F、T、G、D、E、K*H; b8為A、V、G、Q、N、D或 E; b15為8、〇、1^、〇、丑、艮或汉； b16為 L、T或 Η ; b17為 V、L、I、W或 Μ ; b18缺少或是 A、V、L、P、w、F、T、G、Y、Q、D、E 或R ; O:\121\121929.DOC •15- 1336333 b19缺少或是V、L、I、P、T、G、S、Y、q、n、De 或R ;且 b20 缺少或是V、L、P、W、M、T、G、s、y、q、n、 D、K或 R。在更佳的具體實施例中，b1缺少或是P或T ; b2缺少 < 是i 或N ; b3缺少或是R或I; b4為Q; b5為E; b6為e; b8為d咬E ;b15為D或E ; b16為Η ; b17為Μ ; b18缺少或為…或？； bi9缺少或為G或E;且b2G缺少或為V或K。亦應瞭解本發明最好係關於包括至少一個選自由序列識別：4號和序列識別：76號至序列識別：118號所組成之群的胺基酸序列之多肽，其中該多肽能夠與Ang-2結合，及其在生理學上可接受的鹽類。在下文中陳述肽序列：

O:\121\121929.DOC 16- 1336333 表1

肽序列識別號肽序列 Con4-44 76 PIRQEECDWDPWTCEHMWEV Con4-40 77 TNIQEECEWDPWTCDHMPGK Con4-4 78 WYEQDACEWDPWTCEHMAEV Con4-31 79 NRLQEVCEWDPWTCEHMENV Con4-C5 80 AATQEECEWDPWTCEHMPRS Con4-42 81 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW Con4-35 82 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG Con4-43 83 SISHEECEWDPWTCEHMQVG Con4-49 84 WAAQEECEWDPWTCEHMGRM Con4-27 85 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST Con4-48 86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS Con4-46 87 QHWQEECEWDPWTCDHMPSK Con4,41 88 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR Con4-36 89 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN Con4-34 90 VKTQEHCDWDPWTCEHMREW Con4-28 91 AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM Con4-39 92 PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM Con4-25 93 RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK Con4-50 94 HGQNMECEWDPWTCEHMFRY Con4-38 95 PRLQEECVWDPWTCEHMPLR Con4-29 96 RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ Con4-47 97 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS Con4-20 98 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL Con4-45 99 WAQQEECAWDPWTCDHMVGL Con4-37 100 LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS Con4-33 101 PMNQVECDWDPWTCEHMPRS AC2-Con4 102 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST Con4-32 103 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP Con4-17 104 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL Con4-8 105 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD AC4-Con4 106 VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW Con4-l 107 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG

O:\121\121929.DOC -17- ^ 5 > 1336333

Con4-Cl 108 TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG Con4-21 109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG Con4-C2 110 TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG Con4-18 111 WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP Con4-19 112 WQVGMCQWDPWTCKHMRLQ Con4-16 113 AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV Con4-ll 114 QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR Con4-C4 115 TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG Con4-23 116 TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT Con4-15 117 QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS Con4-9 118 GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG TN8-Con4* 4 QEECEWDPWTCEHM 應瞭解某些肽及/或肽體可含有字首的"ΤΝ"、"TN8"或 "ΤΝ12",並可以或可以不提供特定肽體該字首。因此，在本文中可交替使用例如"TN8-Con4"和"Con4"—詞。在另一個具體實施例中，本發明係關於具有下式之物質的組合物：及其多聚體，其中： # F1為媒介； X1和X2分別選自 -(L^c-P1 ； -(L^e-P'-CL^d-P2 ； -(ι/νρ'ι^νρ^αΐ-ρ3 ;和 -(i^c-p^o^vpMlVpMlVp4 ; 其中一或多個P1、P2、P3和P4分別包括如同在本文中描述之多肽。例如，在較佳的具體實施例中，P1、P2、P3和 O:\121\121929.DOC -18 - 1336333 p可分別包括序列識別：3號至序列識別·· 6號，及/或序列識別：76號至序列識別：157號的多肽。在另一個具體實施例中，物質之組合物是式：

Xl-¥l 或 F!-X2 及其在生理學上可接受的鹽類，其中χΐ、沪和X2如同在本文中之定義。在另一個具體實施例中，物質之組合物是式： F1-(L1)c-P1 及其在生理學上可接受的鹽類，其中L1、Fi和pi如同在本文中之定義。在另一個具體實施例中，物質之化合物是式： F'-CL^c-P'-iL^d-P2 及其在生理學上可接受的鹽類，其中L1、F1、；p1、P2和c與 d’如同在本文中之定義。在另一個具體實施例中，物質之組合物是式： P^CL^c-F^iL^a-P2 及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中， F1是Fc功能部位或其片段。本發明更關於能夠與Ang-2結合的多肽，包括下式之胺基酸序列：

Pc2Dc4Lc6c7c8LY (序列識別：71號）其中 O:\121\121929DOC -19- 1336333 C2為中性疏水性的胺基酸殘基； c為A ' D或E ; c6為酸性的胺基酸殘基； c7為胺基酸殘基；且 c為中性疏水性的、中性極性的或鹼性的胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中 ’ c2為L或M。在另一個較佳的具體實施例中，c6為〇或e。本發明更關於能夠與Ang-2結合的多肽，包括下式之胺基酸序列： d,d2d3d4Pd6Dd8Ld10d11d12LYd15d16d17d18d19ci20d21d22 (序列識別：72號）其中， d1缺少或是胺基酸殘基； d2缺少或是中性極性的、酸性的或鹼性的胺基酸殘基； d3缺少或是中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； d4缺少或是胺基酸殘基； d6為中性疏水性的胺基酸殘基； d8 為 A、D 或 E ; d1()為酸性的胺基酸殘基； d11為胺基酸殘基； d12為中性疏水性的、中性極性的或驗性的胺基酸殘基； d15缺少或是中性極性的、酸性的或鹼性的胺基酸殘基； d16缺少或是中性極性的、酸性的或鹼性的胺基酸殘基； d17缺少或是中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； d18缺少或是中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； 0:\121\121929.DOC •20- 1336333 d缺少或疋中性疏水性的、中性極性的或驗性的胺基酸殘基； d2G缺少或是胺基酸殘基； d21缺少或是中性極性的、酸性的或鹼性的胺基酸殘基； d22缺少或是中性疏水性的' 中性極性的或鹼性的胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中： d1為 T、S、Q、R 或 ; d2 為 T、Q、N 或 K ; d3 為 F ; d4 為 Μ、Q、E 或 K ; d6為L或Μ ; d8為D或Ε ; d10為 E ; d11為Q或E ; d12為T或R ; d15為 Y、D、E或 K ; d16為 Q ; d17為W或F ; d18為L、I ' Μ或 T ; d19為 L、F或 Υ ; d20為 Q、D 或 E ; d21缺少或是Q或Η ; d22缺少或是A、L、G、S或R。在較佳的具體實施例中，該多肽包括至少一個選自由序 -21-

O:\121\121929.DOC 1336333 列識別：6號和序列識別：119號至序列識別：142號所組成之群的胺基酸序列，其中該多肽能夠與Ang-2結合。在下文中陳述序列識別：6號和序列識別：119-142號：

肽序列識別號肽序列 L1-1 119 QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT L1-2 120 LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS L1-3 121 TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ L1-4 122 VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA L1-5 123 VKYKPLDELDEILYEQQTFQER L1-7 124 TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG L1-9 125 SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA L1-10 126 QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA L1-11 127 ONFKPMDELEDTLYKQFLFQHS L1-12 128 YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV L1-13 129 QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR L1-14 130 SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ L1-15 131 QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG L1-16 132 QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR L1-17 133 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ L1-18 134 QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS L1-19 135 QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH L1-20 136 EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG L1-21 137 HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL L1-22 138 YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA AC6-L1 139 TNYKPLDELDATLYEHWILQHS L1-C1 140 QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR L1-C2 141 TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR L1-C3 142 TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR L1 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ O:\121\121929.DOC -22· 1336333 本發明亦關於能夠與Ang-2結合的多肽，包括下式的胺基酸序列： RPe3e4e5e6e7G (序列識別：73號）其中 e3為中性極性的胺基酸殘基； e4為酸性的胺基酸殘基； e5為中性極性的或酸性的胺基酸殘基； e6為中性疏水性的胺基酸殘基； e7為中性疏水性的胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類《在較佳的具體實施例中 ’ e3為γ或〇在另一個較佳的具體實施例中，64為〇或^。在另一個較佳的具體實施例中，e6為I或Μ。本發明更關於能夠與Ang-2結合的多肽，包括下 P式的胺基酸序列： flf2f3 f4Rpf7f8f9f10fllGf13f14f15f16f17f18fi9f2〇 (序列識別：74號）其中， fl為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； f2為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； f3為中性極性的或酸性的胺基酸殘基； f4為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； f7為中性極性的胺基酸殘基； f8為酸性的胺基酸殘基； O:\121\121929.DOC •23· 1336333 f9為中性極性的或酸性的胺基酸殘基； f1Q為中性疏水性的胺基酸殘基； f11為中性疏水性的胺基酸殘基； f13為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； f14為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； f15為中性極性的胺基酸殘基； f16為中性極性的胺基酸殘基； f17為中性極性的或酸性的胺基酸殘基； • f18為中性疏水性的或鹼性的胺基酸殘基； f19為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基；且 f2G為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中： f1為 S、A或 G ; f2 為 G、Q 或 P ; f3 為 Q、G 或 D ; _ f4 為 L、Μ 或 Q ; f7為C或Υ ; f8為E或D ; f9 為 E、G 或 D ; f1()為 I 或 Μ ; f11為F或L ; f13為C或W ; f14為G或P ; O:\121\121929-DOC -24- 1336333 f15為T或N ; f16為 Q、Y或 K ; f17為 Ν、D或 Q ; f18為 L、V、W或 R ; f19為 A、Q、Y或I ;且 f20 為 L、A、G 或 V。在更佳的具體實施例中，本發明係關於包括至少一個選自由序列識別：3號和序列識別：143號至序列識別：148 號之胺基酸序列的多肽所組成之群，其中該多肽能夠與 Ang-2結合，及其在生理學上可接受的鹽類。序列識別：3 號和序列識別：143號至序'列識別：148號如下。

肽序列識別號肽序列 Conl-1 143 AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA Con 1-2 144 QTWDDPCMHILGPVTWRRCI Con 1-3 145 APGQRPYDGMLGWPTYQRTV Con 1-4 146 SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL Coni-5 147 FGDKRPLECMFGGPIQLCPR Con 1-6 148 GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG Coni 3 KRPCEEDFGGCTYO

在其他方面，本發明係關於能與Ang-2結合的多肽，包括下式的胺基酸序列：

Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13 (序列識別：75號）其中 g2為酸性的胺基酸殘基； O:\121\121929.DOC -25· 1336333 g4為中性疏水性的胺基酸殘基； g5 為 E、D 或 Q ; g1Q為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； g13為酸性的殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中 g2為E或D。在另一個較佳的具體實施例中，g4為▽或μ 在另一個具體實施例中，gi〇為F或Q ^在另一個具體實施例中，g13為D或E。本發明更關於能夠與Ang-2結合的多肽，包括下式的胺基酸序列： hVh3h4Ch6Gh8h9DPFTh14GCh17h18h19h20 (序列識別：158號）其中， h缺少或是中性疏水性的、中性極性的或驗性的胺基酸殘基； h2為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； h3為酸性的胺基酸殘基； h4為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； h6為酸性的胺基酸殘基； h8為中性疏水性的胺基酸殘基； h9 為 E、D 或 Q ; h14為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基； h17為酸性的胺基酸殘基； h18為中性疏水性的、中性極性的或鹼性的胺基酸殘基； O:\121\121929.DOC -26 - 1336333 h19為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基；且 h2G缺少或是胺基酸殘基；及其在生理學上可接受的鹽類。在較佳的具體實施例中： h1缺少或是A、L、Μ、G、K或Η ; h2為 L、F 或 Q ; h3為D或E ; h4為W或Y ; h6為D或E ; h8為V或M ; h14為F或Q ; h17為D或E ; h18為Μ、Y、N或 K ; h19為L或Q ;且 h20 缺少或是M、T、G、S、D、K或 R。在更佳的具體實施例中’本發明係關於包括至少一個選自由序列識別：5號和序列識別：149號至序列識別：157 號之胺基酸序列的多肽所組成之群，其中該多肽能夠與 Ang-2結合，及其在生理學上可接受的鹽類。在下文中陳述序列識別：5號和序列識別：149號至序列識別：157 號。 -27-

O:\121\121929.DOC 1336333

肽序列識別號肽序列 12-9-1 149 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT 12-9-2 150 KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS 12-9-3 151 LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9-4 152 AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK 12-9-5 153 LLDYCEGVQDPFTFGCENLD 12-9-6 154 HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG 12-9-7 • 155 MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM 12-9-C2 156 LQDYCEGVEDPFTFGCENQR 12-9-C1 157 LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR 12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH 寶在極佳的具體實施例中，本發明係關於具有下式之物質的組合物： (X'-F 丨-(X2)r 及其多聚體，其中： F1為媒介； X1和X2分別選自 -(L^s-P1 ； -(L^s-P^CL^t-P2 ； • -(i^s-pWlVpMi^u-p3 ;和 -(L1)s-P1-(L2)t-P2-(L3)u-P3-(L4)v-P4 ；其中一或多個P1、P2、P3和P4分別包括選自由下列所組成之群的多肽： (a) 胺基酸序列WDPWT (序列識別：65號），其中該多肽之長度是從5至50個胺基酸； (b) 胺基酸序列WDPWTC (序列識別：66號）； (c) 胺基酸序列Cz2WDPWT (序列識別：67號），其中z2 為酸性或中性極性的胺基酸殘基； O:\121\121929.DOC -28- (d) 胺基酸序列Cz2WDPWTC (序列識別：68號），其中 z2為酸性或中性極性的胺基酸殘基； (e) 胺基酸序列pc2Dc4Lc6c7c8LY (序列識別：71號），其中c2為中性疏水性的胺基酸殘基；c4為a、D或E ; c6為酸性的胺基酸殘基；c7為胺基酸殘基；且c8為中性疏水性的、中性極性的或鹼性的胺基酸殘基； (f) 胺基酸序列RPe3e4e5e6e7G (序列識別：73號），其中 e3為中性極性的胺基酸殘基；e4為酸性的胺基酸殘基；e5 為中性極性的或酸性的胺基酸殘基；e6為中性疏水性的胺基酸殘基；且e7為中性疏水性的胺基酸殘基； (g) 胺基酸序列Cg2Gg4g5DPFTg10GCg13 (序列識別：75 號），其中g2為酸性的胺基酸殘基；g4為中性疏水性的胺基酸殘基；g5為中性極性的或酸性的胺基酸殘基；gi〇為中性疏水性的或中性極性的胺基酸殘基；且gi3為酸性的殘基； (h) 序列識別：1號之多肽； (i) 序列識別：2號之多肽；以及 (j) 序列識別：7號之多肽；其中L丨、L2、L3和1/分別為聯結子；且q、r、s、t、_ V分別為〇或1，其限制條件為^和Γ中至少有一個是1 ;及其在生理學上可接受的鹽類。〃應瞭解本發明更關於融合多肽，包括至少一個如同在本文中描述的肽和媒介，其十該融合多肽能夠與Ang_2结合，及其在生理學上可接受的鹽類。在融合多肽中，媒好疋至少一個Fc功能部位、聚乙二醇、脂質 '膽固醇群、碳水化合物和寡骑。熟諳此藝者應瞭解其他適當的媒介，像是白蛋白及其類似物，亦包括在本發明的範圍内。 O:\121\121929.DOC •29· 1336333 熟諳此藝者將承認可將各種分子插入專一結合劑的結構内。因此，可在例如專一結合劑的肽和媒介部分之間插入特定的分子，或是在肽部分本身内插入，同時仍保留該專一結合劑的想要活性。可輕易地插入例如分子，像是F c功能部位或其片段、聚乙二醇或其他相關的分子，像是葡聚醣、脂肪酸、脂質、膽固醇群、小的碳水化合物、肽、細胞毒性製劑、化學治療劑、如同在本文中描述的可檢測部分（包括螢光劑、放射性標記，像是放射性同位素）和寡醣、寡核苷酸、多核苷酸、干涉（或其他的）RNA、酵素、荷爾蒙或其類似物。熟諳此藝者應瞭解其他適合以此方式插入的分子，並包括在本發明的範圍内。這包括例如在兩個連續的胺基酸之間插入想要的分子，可視需要藉著適當的聯結子連接。舉例來說，在Con4(C)肽體序列中： M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE(序列識另|J : 23號）熟諳此藝者可輕易地在例如兩個相鄰的榖胺醯胺（"QQ”) 殘基之間插入想要的分子，獲得想要的結構及/或功能，同時仍保留該肽與Ang-2結合的能力。因此，可如下修改該序列： M-Fc-GGGGGAQ-[分子]-QEECEWDPWTCEHMLE 如果需要可加入適當的聯結子分子。更知道可將該分子插入在分子上的許多位置，包括在適當的側鏈上，在媒介和肽序列之間，如下： M-Fc-[分子]-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE 或是在任何熟諳此藝者想要的其他位置。熟諳此藝者應瞭解其他適當的具體實施例。在另一個具體實施例中，本發明係關於編碼如同在本文

O:\121\121929.DOC -30- 1336333 中描述之本發明專一結合劑（包括但不限於肽及/或肽體）的多核甞酸。熟諳此藝者應瞭解在已知胺基酸序列之處，可使用已知的技術，輕易地判定相對應的核甞酸序列（們）。參見，例如 Suzuki，D.，An Introduction to Genetic Analysis，W.H. Freeman Pub. Co. (1986)。在下文中陳述編碼本發明之肽的代表性核苷酸序列。熟諳此藝者將承認有一個以上的密碼子可編碼特定的胺基酸，並因此本發明係關於任何編碼本發明之肽及/或肽體的核甞酸序列。

. 肽序列識別號肽序列代表性的 DNA序列 Con4-44 76 PIRQEECDWDPWTCEHMWEV ccgatccgtcaggaagaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgtgggaagtt(專列織別： 159 號） Con4-40 77 TNIQEECEWDPWTCDHMPGK accaacatccaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgacc acatgccgggtaaa(外列勒J: 160¾) Con4-4 78 WYEQDACEWDPWTCEHMAEV tggtacgaacaggacgcttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggctgaagtt (并列識別： 161 號） Con4-31 79 NRLQEVCEWDPWTCEHMENV aaccgtctgcaggaagtttgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca catggaaaacgtt (寿列勒J: 162%) Con4- C5 80 AATQEECEWDPWTCEHMPRS gctgctacccaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgccgcgttcc’(/i·列 1^·】： 163«；) Con4-42 81 LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW ctgcgtcaccaggaaggttgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgttcgactgg (房列識别： 164«) O:\121\121929.DOC -31 - 1336333

Con4-35 82 VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG gttccgcgtcagaaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgtacgttggt (寿列糊： 165¾) Con4-43 83 SISHEECEWDPWTCEHMQVG tccatctcccacgaagaatgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca catgcaggttggt (房列糊： 360») Con4-49 84 WAAQEECEWDPWTCEHMGRM tgggctgctcaggaagaatgcga atgggatccgtggacttgcgaaca catgggtcgtatg (存列糊： 166ft) Con4-27 85 TWPQDKCEWDPWTCEHMGST acttggccgcaggacaaatgcga atgggatccgtggacttgcgaaca catgggttctact (寿列識利： 167») Con4-48 86 GHSQEECGWDPWTCEHMGTS ggtcactcccaggaagaatgcgg ttgggacccgtggacctgcgaac acatgggtacgtcc (4 列制： 168%) Con4-46 87 QHWQEECEWDPWTCDHMPSK cagcactggcaggaagaatgcga atgggacccgtggacctgcgacc acatgccgtccaaa(岸列HM1】： 169%) Con4-41 88 NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR aacgttcgtcaggaaaaatgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca catgccggttcgt (寿列糊： 170¾) Con4-36 89 KSGQVECNWDPWTCEHMPRN aaatccggtcaggttgaatgcaac tgggacccg^gacctgcgaaca catgccgcgtaac ： 171%) · Con4-34 90 VKTQEHCDWDPWTCEHMREW gttaaaacccaggaacactgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgcgtgaatgg (房列 172 號） Con4-28 91 AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM gcttggggtcaggaaggttgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgctgccgatg(房列_ : 173始 Con4-39 92 PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM ccggttaaccaggaagactgcga atgggacccgtggacc^cgaac acatgccgccgatg(岸列識对： 174ft) 0:\121\121929.D0C •32- 1336333

Con4-25 93 RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK cgtgctccgcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgctc acatggacatcaaa (序列織別： 175¾) Con4-50 94 HGQNMECEWDPWTCEHMFRY cacggtcagaacatggaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatgttccgttac (序列識利： 176«) Con4-38 95 PRLQEECVWDPWTCEHMPLR ccgcgtctgcaggaagaatgcgtt tgggacccgtggacctgcgaaca catgccgctgcgt (序列識别： 177Sfc) Con4-29 96 RTTQEKCEWDPWTCEHMESQ cgtaccacccaggaaaaatgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggaatccc^ (岸列蝴： 178¾) Con4-47 97 QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS cagacctcccaggaagactgcgtt tgggacccgtggacctgcgacca catggtttcctcc (序列細： 179 號） Con4-20 98 QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL caggttatcggtcgtecgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgaaca cctggaaggtctg (序列識利： 180%) Con4-45 99 WAQQEECAWDPWTCDHMVGL tgggctcagcaggaagaatgcgc ttgggacccgtggacctgcgacc acatggttggtctg (序列酬： 181%) Con4-37 100 LPGQEDCEWDPWTCEHMVRS ctgccgggtcaggaagactgcga atgggacccgtggacctgcgaac acatggttcgttcc (序列織利： 182 號）' Con4-33 101 PMNQVECDWDPWTCEHMPRS ccgatgaaccaggttgaatgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatgccgcgttcc (岸列渺J: 183¾) AC2- Con4 102 FGWSHGCEWDPWTCEHMGST ttcggttggtctcacggttgcgaat gggatccgtggacttgcgaacac atgggttctacc (存列棚： 184 號） Con4-32 103 KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP aaatccacccaggacgactgcga ctgggacccgtggacctgcgaac acatggttggtccg i(序列_ : 185 號） O:\121\121929.DOC •33- 1336333

Con4-17 104 GPRISTCQWDPWTCEHMDQL ggtccgcgtatctccacctgccag tgggacccgtggacctgcgaaca catggaccagctg (房列識别： 1869t) Con4-8 105 STIGDMCEWDPWTCAHMQVD tccaccatcggtgacatgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgctca catgcaggttgac (岸列識利： 187ft) AC4- Con4 106 VLGGQGCEWDPWTCRLLQGW gttctgggtggtcagggttgcgaa tgggacccgtggacctgccgtctg ctgcagggttgg (序列識利： 188%) Con4-l 107 VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG gttctgggtggtcagggttgccag tgggacccgtggacctgctccca cctggaagacggt (房列識利： 189%) Con4- C1 108 TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG accaccatcggttccatgtgcgaa tgggacccgtggacctgcgctca catgcagggtggt (房列識利： 190%) Con4-21 109 TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG accaaaggtaaatccgtttgccag tgggacccgtggacctgctccca catgcagtccggt (序列 : 191¾) C〇n4- C2 110 TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG accaccatcggttccatgtgccag tgggacccgtggacctgcgctca catgcagggtggt (岸列制： 192«) Con4-18 111 WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP tgggttaacgaagttgtttgcgaat gggacccgtggacctgcaaccac tgggacaccccg (外列識利： 193¾) Con4-19 112 VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ gttgttcaggttggtatgtgccagt gggacccgtggacctgcaaacac atgcgtctgcag (岸列議別： 194¾) O:\121\121929.DOC 34- 1336333

Con4-16 113 AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV gctgttggttcccagacctgcgaat gggacccgtggacctgcgctcac ctggttgaagtt (外列細： 1954t) Con4-ll 114 QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR cagggtatgaaaatgttctgcgaat gggacccgtggacctgcgctcac atcgtttaccgt (序列 1¾¾ : 196¾) Con4- C4 115 TTrGSMCQWDPWTCEHMQGG accaccatcggttccatgtgccag tgggacccgtggacctgcgaaca catgcagggtggt (序列識利： 197¾) Con4-23 116 TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT acctcccagcgtgttggttgcgaat gggacccgtggacctgccagcac ctgacctacacc (淨列識别： 198«) Con4-15 117 QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS cagtggtcctggccgccgtgcga atgggacccgtggacctgccaga ccgtttggccgtcc (序列織利： 199«) Con4-9 118 GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG ggtacctccccgtccttctgccagt gggacccgtggacctgctcccac atggttcagggt (片列織利： 200¾) TN8- Con4 4 QEECEWDPWTCEHM caggaagaatgcgaatgggaccc atggacttgcgaacacatg (序列識別：201 ft) Ll-1 119 QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT cagaactacaaaccgctggacga actggacgct^ccctgtacgaaca cttcatcttccactacacc (序列識別：202统> LI-2 120 LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS ctgaacttcaccccgctggacgaa ctggaacagaccctgtacgaaca gtggaccctgcagcagtcc i(序列識別：203«t) Ll-3 121 TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ accaaattcaacccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcaccag (序列識別：204號） O:\121\121929.DOC 35 1336333

Ll-4 122 VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA gttaaattcaaaccgctggacgct ctggaacagaccctgtacgaaca ctggatgttccagcaggct (專列識別：20?號） Ll-5 123 VKYKPLDELDEILYEQQTFQER gttaaatacaaaccgctggacgaa ctggacgaaatcctgtacgaacag cagaccttccaggaacgt (序列識別：20641) LI-7 124 TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG accaacttcatgccgatggacgac ctggaacagcgtctgtacgaaca gttcatcctgcagcagggt (序列識別：207») Ll-9 125 SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA tccaaattcaaaccgctggacgaa ctggaacagaccctgtacgaaca gtggaccctgcagcacgct (序列識別：208就） Ll-10 126 QKFQPLDELEQTLYEQFMLQQA cagaaattccagccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agttcatgctgcagcaggct (序列識別：209ft) Ll-11 127 QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS cagaacttcaaaccgatggacga attggaagacaccctgtacaaaca gttcctgttccagcactcc (庠列識別：210SO Ll-12 128 YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV tacaaattcaccccgctggacgac ctggaacagaccctgtacgaaca gtggaccctgcagcacgtt (序列識別：211號） Ll-13 129 QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR caggaatacgaaccgctggacga actggacgaaaccctgtacaacc agtggatgtt(5caccagcgt (房列識別：212號） Ll-14 130 SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ tccaacttcatgccgctggacgaa ctggaacagaccctgtacgaaca gttcatgctgcagcaccag (岸列識別：213ft) Ll-15 131 QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG cagaaataccagccgctggacga actggacaaaaccctgtacgatca gttcatgctgcagcagggt (序列識別：214ft)

O:\121\121929.DOC 36 · 1336333

Ll-16 132 QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR cagaaattccagccgctggacga actggaagaaaccctgtacaaac agtggaccctgcagcagcgt (序列識別：2J5ft) Ll-17 133 VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ gttaaatacaaaccgctggacgaa ctggacgaatggctgtaccacca gttcaccctgcaccaccag i(序列識別：216ft) Ll-18 134 QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS cagaaattcatgccgctggacgaa ctggacgaaatcctgtacgaacag ttcatgttccagcagtccc (序列識別：217ft) Ll-19 135 QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH cagaccttccagccgctggacga cctggaagaatacttgtacgaaca gtggatccgtcgttaccac i痒列儎別：218ft) LI-20 136 EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG gaagactacatgccgctggacgc tctggacgctcagctgtacgaaca gttcatcctgctgcacggt (序列識別：219ft) Ll-21 137 HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL cacaccttccagccgctggacga actggaagaaaccctgtactacca gtggctgtacgaccagetg (序列議別：220ft> LI-22 138 YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA tacaaattcaacccgatggacgaa ctggaacagaccctgtacgaaga attcctgttccagcacgct (序列識刺：221ft) AC6-L1 139 TNYKPLDELDATLYEHWILQHS accaactacaaaccgctggacga actggacgctaccctgtacgaaca ctggatcctgcagcactcc (序列識別：222號） Ll-Cl 140 QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR cagaaattcaaaccgctggacga actggaacagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (序列識別：223«) L1-C2 141 TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR accaaattccagccgctggacga actggaccagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (岸列識別：224號） O:\121\121929DOC 37- 1336333

L1-C3 142 TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR accaacttccagccgctggacga actggaccagaccctgtacgaac agtggaccctgcagcagcgt (序列識別：225统） LI 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ aaattcaacccgctggacgagctg gaagagactctgtacgaacagttt acttttcaacag (房列識別： 226») Conl-1 143 AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA gctggtggtatgcgtccgtacgac ggtatgctgggttggccgaactac gacgttcaggct (序列朗：. 227¾) Conl-2 144 QTWDDPCMHILGPVTWRRCI cagacttgggacgatccgtgcatg cacattctgggtccggttacttggc gtcgttgcatc丨(岸列議別： 228號） Coni-3 145 APGQRPYDGMLGWPTYQRIV gctccgggtcagcgtccgtacga cggtatgctgggttggccgaccta ccagcgtatcgtt (序列拟(I: 229ft) Con 1-4 146 SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL tccggtcagctgcgtccgtgcgaa gaaatcttcggttgcggtacccag aacctggctctg (寿列咖： 230ft) Conl-5 147 FGDKRPLECMFGGPIQLCPR ttcggtgacaaacgtccgctggaa tgcatgttcggtggtccgatccag ctgtgcccgcgt (岸列朗： 231«) Conl-6 148 GQDLRPCEDMFGCGTKDWYG ggtcaggacctgcgtccgtgcga agacatgttcggttgcggtaccaa agactggtacggt (序列tftM : 232«) 12-9-1 149 GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT ggtttcgaatactgcgacggtatg >aagacccgttcaccttcggttgc ;acaaacagacc 列獻J: 233 號） 12-9-2 150 KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS aaactggaatactgcgacggtatg gaagacccgttcacccagggttg cgacaaccagtcc(岸列渺J: 234«) 12-9-3 151 LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR ctgcaggaatggtgcgaaggtgtt O:\121\121929.DOC -38- 1336333 gaagacccgttcaccttcggttgc gaaaaacagcgt (岸列勒J: 235«) 12-9-4 152 AQDYCEGMEDPFTFGCEMQK gctcaggactactgcgaaggtatg gaagacccgttcaccttcggttgc gaaatgcagaaa (岸列織利： 236¾) 12-9-5 153 LLDYCEGVQDPFTFGCENLD ctgctggactactgcgaaggtgtt caggacccgttcaccttcggttgc gaaaacctggac ： 237¾) 12-9-6 154 HQEYCEGMEDPFTFGCEYQG caccaggaatactgcgaaggtat ggaagacccgttcaccttcggttg cgaataccagggt (序列_: 238¾) 12-9-7 155 MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM atgctggactactgcgaaggtatg gacgacccgttcaccttcggttgc gacaaacagatg (房列朗： 239*) 12-9-C2 156 LQDYCEGVEDPFTFGCENQR ctgcaggactactgcgaaggtgtt gaagacccgttcaccttcggttgc gaaaaccagcgt (祠酬： 240») 12-9-C1 157 LQDYCEGVEDPFTFGCEKQR ctgcaggactactgcgaaggtgtt gaagacccgttcaccttcggttgc gaaaaacagcgt (相識利： 241¾) 12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH ttcgactactgcga^gtgttgaa gacccgttcactttcggctgtgata accac (序列識別：242號}

z在另一個具體實施例中，本發明係關於包括至少一個本發明之多核苷酸的表現載體。在其他的具體實施例中，本發明係關於包括該表現載體的宿主細胞。應暸解該宿主細胞最好是原核生物的細胞（例如大腸桿菌細胞）或真核生物的細胞。本發明亦關於包括有效含量的如同在本文中描述之組合物，與在藥學上可接受之載劑混合的醫藥組合物。本發明亦關於在哺乳動物中，抑制不想要的血管生成作用的方法，包括投與在治療上有效之含量的如同在本文中 O:\121\121929.DOC -39- 丄说333 描述之多肽或組合物。本發明亦關於在哺乳動物中，調節 ^管生成作用的方法，包括投與在治療上有效之含量的如 5在本文中描述之多肽或組合物。本發明更有關於在哺乳動物中，抑制其特徵為不想要的血管生成作用之腫瘤生長的方法，包括投與在治療上有效之含量的如同在本文中描述之多肽或組合物^此外，本發明亦關於在哺乳動物中治療癌症的方法，包括投與在治療上有效之含量的如同在

本文中指述之多肽或組合物，以及化學治療劑。在較佳的〆、體實施例巾，該化學治療劑為至少—Uu、和勉癌易（tax〇tere)。‘然而，應瞭解亦可使用其他適當的化學治療劑和癌症治療劑。本發明亦關於在哺乳動物中，調節至少一種血管通透性或血漿漏出的方法，包括投與在治療上有效之含量的如同在本文中描述之多肤或組合物。本發明更有關於在哺乳動物中，治療至少-種眼睛的新生血管疾病、肥胖、金管母細胞瘤、血管瘤、動脈粥樣硬化、炎症疾病、炎症病症、動脈粥樣硬化、子宮内膜異位症、贅生物的疾病、與骨骼有關的疾病或牛皮癬，包括投與在治療上有效之含量的如同在本文中描述之多肽或組合物。應瞭解本發明之專—結合劑，可用來治療許多與取消管制或不想要的血管生成作用有關的疾病。這類疾病包括，但不限於眼睛的新血管形成，傻异滞娘|胳丨皿& I風诼疋視網膜病（包括糖尿性的視網膜病和與年齡有關的黃斑變性）、牛皮癬、血母細胞瘤、血管瘤、動脈粥樣硬化、炎症疾病，像是類

O:\121\121929.DOC 濕或風濕性的炎症症疾病，尤其是關節炎（包括風濕性關節火），或其他的慢性名 p κ症疾病，像是慢性氣喘、動脈或移植後的動脈粥樣硬化、兄移子呂内膜異位症和贅生物的疾病，例如所謂的固體膀、丙蓺 A —，和液體腫瘤（像是白血病對熟諳此 2而言，可藉著投與專一結合劑治療的額外疾病是顯而易見的。這_外的疾病包括，但不限於肥胖、血管通透漿漏出卩及與骨路有關的疾㊆’包括1f質疏鬆症因此，本發明更有關於治療這些與取消管制或不想要之血管生成作用有關的疾病的方法。從在本文_提供的揭示内容中，將更容易瞭解本發明的其他具體實施例。的【實施方式】在本文中使用的段落開頭，僅為了組織化的目的，而不可解釋成以任何方式限制所描述的主題物質。關於重組的DNA分子、蛋白質和抗體的產製，以及組織培養和細胞轉化，均可使用標準技術。酵素反應和純化技術，通常根據製造者的說明書來進行，或在此項技藝中，使用傳統程序，像是在8&111131：〇〇]^等人（M〇lecular Cloning A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press’ Cold Spring Harbor，NY [1989])中陳述的那些，或按照在本文令描述的來完成。除非提供特定的定義，與在本文中描述之實驗室程序和分析化學技術、合成有機化學，以及醫學和藥理化學一起使用的術語，是那些在此項技藝中已熟知並普遍使用的。關於化學合成、化學分析、藥 O:\121\121929.DOC •41· 理予製備、調配和遞送’以及患者的處理，均可使用標準技術。定義如下定義在本說明書中使用的名詞，除非另行以特定的例子來限制之。

Ang-2"—詞意指在美國專利第6,166,185號之圖6中陳述的多肤（Tie-2配體-2")或其片段’以及相關的多肽，包括對偶基因變體、接合變體、衍生物、取代、刪除及/或插入變體、融合肽和多肤’以及物種間的同系物。Ang_2多肽可以或可以不含額外的終端殘基’例如前導序列、瞄準序列、胺基終端之甲硫胺酸、胺基終端之甲硫胺酸和離胺酉欠殘基’及/或標籤或融合蛋白質序列，視製備其之方式而定。 "在生物學上有活性的，，一詞，當與Ang_2或Ang_2專一結合劑一起使用，意指該肽或多肽具有至少一種Ang_2或 Ang-2專一結合劑特有的活性。Ang_2的專一結合劑’可能對於至少一種Ang-2的生物活性，具有激動劑、拮抗劑，或中和或阻斷活性。 •'專一結合劑"一詞，意指一分子，最好是蛋白質的分子，專一地與Ang-2結合，及其變體和衍生物，如同在本文中定義的。專一結合劑可以是蛋白質、肽、核酸、碳水化合物、脂質，或小分子量的化合物，其優先與Ang_2結合。在較佳的具體實施例中，根據本發明之專一結合劑是肽或肽體，以及其片段、變體或衍生物，單獨或與其他的胺 O:\121\121929.DOC -42- 1336333 土馱序列結合，由已知的技術提供。這類技術包括，但不於酵素切開、化學切開、肽合成或重組技術。本發明之抗Ang-2專一結合劑能夠與Ang_2的結合部分結合，調節，例如抑制或促進Ang-2的生物活性及/或其他的Ang_2•相關活性。在本文中使用的"變體”一詞，包括其中將胺基酸殘基插入、纟。合劑之天然存在的（或至少一個已知的）胺基酸序列内，從其中刪除胺基酸殘基，及/或在其内取代的那些肽和夕月太。本發明之變體包括如同下述的融合蛋白質。 ••衍生物"包括那些已經以化學方式修改，以一些與插入刪除或取代變體不同的方式修改的結合劑。 "專一地與Ang-2結合"，意指本發明之專一結合劑（像是肽體或其肽部分），認出並與成熟的、全長或部分長度的人類Ang-2多肽或其異物種同源基因（〇rth〇1〇g)的能力，使得其親和力（藉著例如如同在本文中描述的親和力ELIS A或 BIAcore測定來判定），或其中和能力（藉著例如如同在本文中描述的中和ELISA測定，或類似的測定來判定），為相同物對於任何其他的血管生成素，或其他肽或多肽的親和力或中和能力的至少10倍那樣大，但可視需要至少5〇倍那樣大，100、250或500倍那樣大，或甚至至少1〇〇〇倍那樣大，其中該肽體的肽部分首先與人類Fdp分融合，以便在這類測定中進行評估。 "抗原決疋位"一詞意指任何分子中，能夠在一或多個結合劑的抗原結合區，被專一結合劑，例如肽體認出並被其 0:\121\121929.D0C -43- 結合的部分。抗原決定位通常包括具有化學活性的分子之表面基團，像是例如胺基酸或碳水化合物側鏈，並具有特定之二度空間的結構特徵，以及特定的電荷特徵。在本文中使用的抗原決定位可以是相鄰或不_相鄰的。 "抑制並/或中和抗原決定位"一詞，為一抗原決定位，當它被諸如肽體之類的專一結合劑結合時，結果在活體内、在活體外或就地喪失了（或至少減少了）含有這類抗原決定位之分子、細胞或生物的生物活性。在本發明的前後文中 ’中和抗原決定位係位在Ang_2之具有生物活性的區域上，或與其結合。或者，”激活抗原決定位，，一詞為一抗原決定位，當它被諸如抗體之類的本發明之專一結合劑結合時，結果激活，或至少維持Ang_2的具有生物活性之構形。肽體片段”一詞意指肽或多肽，其包括少於完全、完整的肽體。 "天然存在的"一詞，當與諸如核酸分子、多肽、宿主細胞及其類似物的生物學物質一起使用時，意指在自然界中發現’且未被人類修改的那些。 "經過分離”一詞，當與Ang_htAng_2的專一結合劑一起使用時，意指不含至少一種在其天然環境中找到之污染多肽或化合物的化合物，且最好實質上不含任何其他污染的哺乳動物多肽’其將干擾它的治療或診斷用途。 "成熟”一詞，當與Ang-2肽體或其片段，或任何其他蛋白質的Ang-2之專一結合劑一起使用時，意指缺乏前導或信號序列的肽或多肽。當例如在原核生物宿主細胞中表現 O:\J21\121929.DOC -44- 1336333 本發明之結合劑時，"成熟的”肽或多肽亦可包含額外的胺基酸殘基（但仍缺乏前導序列）’像是胺基終端的甲硫胺酸，或一或多個曱硫胺酸和離胺酸殘基。可利用以此方式產製’有或無已經移除這些額外胺基酸殘基的肽或多肽。 "有效含量"或"在治療上有效之含量"，當與Ang-2之專一結合劑一起使用時，意指該專一結合劑的含量，對於在一或多種Ang-2之生物活性的程度上，支持可觀察的改變是有用或必需的。該改變可以是增加或降低Ang-2活性的程度。該改變最好是降低Ang-2之活性。 "肽體”一詞意指包括與至少一個肽附接之抗體Fc功能部位的分子。肽體的產製通常描述在2000年5月4日發表之 PCT 出版物 WO 00/24782 中。在本文中使用的"變體"一詞，包括諸如肽或肽-媒介組合的那些分子，像是本發明之肽體，其中將胺基酸殘基插入這類分子之胺基酸序列中，從其中刪除胺基酸殘基，及/ 或在其内取代。變體具有一或多個被插入的胺基酸，包括如同下述的融合蛋白質。 "衍生物"包括那些肽及/或肽-媒介組合，像是已經以化學方式修改，以一些與插入、刪除或取代變體不同的方式修改的肽體。 ··片段"一詞意指肽或肽-媒介組合，其包括少於這類肽及/ 或肽-媒介組合的全長胺基酸序列。這類片段可起因於例如在胺基終端截短、在羧基-終端截短，及/或從該肽或肽· 媒介組合的胺基酸序列中刪除内部的殘基（們）。片段可以 O:\121\121929.DOC -45- 1336333 疋另一種RNA接合，及/或在活體内或在活體外之蛋白酶活性的結果。亦可藉著化學肽合成方法，或藉著修改編碼肽、肽-媒介組合，或肽體之Fc部分及/或肽部分的多核苷酸，來建構這類片段。 "Fc"—詞意指一種類型的本發明之媒介，且包括抗體之非-抗原·結合片段的序列，起因於完整抗體的蛋白水解消化作用，無論是以單體或多聚體的形式。在本發明中，h 之來源最好是完整的人類Fc，並可以是任何的免疫球蛋白 ’雖然IgGl和IgG2是較佳的。然而，在本文中亦包括一部分是人類，或得自非-人類物種的Fc分子。Fc，s由單體的多肽構成，可藉著共價（也就是二硫鍵）和非_共價的結合，將其連接成二聚體或多聚體的形式。在天然以分子的單體亞單元之間，分子間二硫鍵的數目範圍從丨至4，係視類別（例如 IgG、IgA、IgE)或亞類（例如 IgGl、IgG2、IgG3、

IgAl、IgA2)而定。天然^的一個實例是二硫鍵結的二聚體，起因於IgG的木瓜蛋白酶消化作用[參見E1Hs〇n等人 (1982)，Nucl. Acids. Res. 1〇: 4071_9]。在本文中使用的"天然的Fc" —詞，通常是單體、二聚體和多聚體的形式。 ••Fc功能部位"一詞，包括天然的以和以變體分子以及如同上文定義之序列。因為有Fc變體和天然的Fc,s，"以功能部位"一詞包括單體或多聚體形式的分子，無論是從完整抗體中消化或藉著其他方法產製的。當應用在Fc功能部位或包括Fc功能部位之分子上時，"多 I體一 δ司忍指具有二或多個以共價、非共價之方式， O:\121\121929DOC -46- 1336333 或藉著共價和非共價之交互作用結合的多又狀鍵的分子。

IgG分子通常形成二聚體；IgM，五聚體 _ y •聚體· 而¥’丨體、二聚體、三聚體或四聚體。可藉著利用F’e 之天然Ig來源的序列和所得的活性，或藉著衍生（如之定義）天然的Fc ’而形成多聚體。當應用在Fc功能部位或包括Fc功能部位之分子上時，, 二聚體"一詞意指具有兩個以共價或非_共價之’ J 、?σ 的多肤鍵的分子。

"媒介"一詞意指防止降解並/或增加半衰期，降低毒性，降低免疫原性，或增加治療性蛋白質之生物活性的Ζ子。代表性的媒介包括卜功能部位，以及直線的聚合物（例如聚乙二醇（PEG)、聚離胺酸 '葡聚醣等等）；支鍵的聚合物 (參見，例如Denkenwalter等人，1981年9月15曰發證之美國專利第4,289,872號；Tam，1993年7月2()日發證之美國專利第5,229,490號；Frechet等人，1993年1〇月28日發表之

WO 93/21259);脂質；膽固醇群（像是類固醇）；碳水化合物或募醣；或任何與補救受體結合的天然或合成的蛋白質、多肽或肽。在後文中進一步說明媒介。 "衍生"、"衍生的"或"經過衍生的"一詞，分別包括過程和所得的化合物’纟中⑴具有環狀部分的化合物；例如，在該化合物内的半胱胺醯基殘基之間交聯；（2)將該化合物交聯，或具有交聯位置；例如該化合物具有半胱胺醯基殘基’並因此在培養時或在活體内形成交聯的二聚體；（3)藉著非·肽鍵結置換一或多個肽鍵結；（4)藉著、 O:\I21\12I929.DOC •47- ?* ? > 1336333 -NRC(0)R1、_NRC(0)0R1、_NRS(〇)2R1、nhc(〇)nhr 、琥珀醯亞胺基基團，或經取代或未經取代之苄氧羰基_ NH-置換N-終端，其中R*R1及環取代基如同在後文中之定義；（5)藉著-C(0)R2或-NR3R4置換C-終端，其中R2、 R3和R4如同在後文中之定義；以及（6)其中個別的胺基酸部分在整個處理之中，利用能夠與選出之側鏈或終端殘基反應的製劑修改的化合物。在後文中進一步說明衍生物。 "肽"一詞意指大約3到大約75個胺基酸的分子，較佳的疋大約5至50個胺基酸，更佳的是8至4〇個胺基酸，而大約 10至25個胺基酸的那些是最佳的。肽可以是天然存在或人造的（也就是非-天然存在的）胺基酸序列。可藉著在本文中陳述的任何方法來產製代表性的肽，像是在肽庫（例如噬菌體展示庫）中所具有的、藉著化學合成來產製、藉著蛋白質之消化作用而衍生，或使用重組DNA技術來產製。在藥理予上具有活性的"一詞，意指判定如此描述之物質/、有衫響醫學參數（例如jk壓、血球細胞計數、膽固醇含量）或疾病狀態（例如癌症、自體免疫病症等等）的活性。拮抗劑肽”或"抑制劑肽"一詞，意指阻斷或以某些方式干擾感興趣之相關蛋白質的生物活性，或具有可與感興趣之相關蛋白質的已知拮抗劑或抑制劑相比擬之生物活性的肽。因此’ "Ang-2-拮抗劑肽"一詞，包括可視為或衍生成具有Ang-2-拮抗特徵的肽。此外，在本文中亦包括本發明化合物之在生理學上可接受的鹽類》"在生理學上可接受的鹽類"意指任何已知或稍

O:\121\121929.DOC •48· ^ ς 1336333 後發現疋在樂學上可接受的鹽類。一些特定的實例為：乙否文鹽，二乱乙酸鹽，風鹵化物，像是鹽酸鹽和氫漠酸蜜；硫St鹽，棒樣酸鹽；酒石酸鹽；乙醇酸鹽；和草酸鹽、甲磺酸鹽和磷酸鹽。肽體本發明一方面係關於Ang-2肽體的發展。蛋白質配體與其受體的交互作用’通常在相對上較大的界面處發生。然而，如同對於人類生長荷爾蒙與其反應所證實的，在界面處僅有少數的關鍵殘基貢獻大多數的結合能。clacks〇n等人，Science 267:38：3-ό (1995)。魔大的蛋白質配體主要以正確的拓樸學展示結合的抗原決定位，或提供與結合無關的功能。因此’僅有"肽"長度的分子（通常是2至4〇個胺基酸）可與特定的大蛋白質配體之受體蛋白質結合。這類肽可模仿大蛋白質配體的生物活性（"肽激動劑"），或經由競爭性結合作用’抑制大蛋白質配體的生物活性（"肽拮抗劑"）。 .已經顯現噬菌體展示技術，在確認這類肽激動劑和拮抗劑時’是有效的方法。參見，例如Scott等人，Science 249: 386 (1990) ; Devlin等人 ’ Science 249:404 (1990); 1993年6月29日發證之美國專利第5,223,409號；1998年3月 31曰發證之美國專利第5,733,731號；1996年3月12日發證之美國專利第5,498,530號；1995年7月11曰發證之美國專利第5,432,018號；1994年8月16曰發證之美國專利第 5,338,665號；1999年7月13日發證之美國專利第5,922,545 號；1996年12月19日發表之W0 96/40987 ;和1998年4月16 O:\121\121929.DOC -49- 1336333 曰發表之WO 98/15833 (分別以引用的方式併入本文中）。在肽噬菌體展示庫中，可藉著與絲狀噬菌體的外殼蛋白融合’來展示任意的肽序列。如果想要，可對固定-抗體的受體之細胞外功能部位，以親和力-洗脫展示的肽。可藉著連續循環的親和力純化作用和再繁殖，增強保留的噬菌體。可定序最佳結合的肽，在一或多個在結構上相關的肽家族中，確認出關鍵性的殘基。參見，例如Cwirla等人， Science 276: 1696_9 (1997) ’其中確認出兩個不同的家族。亦可提出可藉著丙胺酸掃描或藉著在DNA層面之突變生成作用’安全地置換其殘基的肽序列。可創造並篩選突變庫’以便更充份地運用最佳結合劑之序列。Lowman，Ann.

Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 401-24 (1997)。亦可使用蛋白質-蛋白質之交互作用的結構分析，提出模仿大蛋白質配體之結合活性的肽。在這類分析中，結晶結構可暗示大蛋白質配體之決定性殘基的身分和相關方位 ’便可從其中來設計肽◊參見，例如Takasaki等人， Nature Biotech 15: 1266-70 (1997)。這些分析方法亦可用來調查在受體蛋白質和藉著嗟菌體屐示而選出的肽之間的交互作用，其可建議進一步修改肽，以便增加結合親和力。其他的方法在肽研究中與噬菌體展示競爭。可將肽庫與 lac阻遏物的羧基終端融合，並在大腸桿菌中表現。其他以大腸桿菌為基礎的方法，容許藉著與肽多醣結合之脂蛋白（PAL)融合，在細胞的外膜上展示。在後文中，將這些和相關的方法集體地稱為"大腸桿菌展示"。在其他方法中

O:\121\121929.DOC ’在核糖體釋放之前，使任意RNA的轉譯停止，導致多肽庫將附加其相關的RNA。在後文中，將該方法及相關方法集體地稱為”核糖體展示"。其他方法使用肽與RNA的化學鍵、’、° ° 參見’例如Roberts 和 Szostak，Proc Natl Acad Sci USA’ 94: 12297-3 03 (1997)。在後文中，將該方法和相關方法集體地稱為"RNA-肽篩選，％已經發展出以化學方式衍生的肤庫，其中將肽固定在穩定的、非_生物學的材料上像疋聚乙烯棒或溶劑可通透的樹脂。其他以化學方式衍生的肽庫，使用照相平版法，掃描固定在玻片上的肽。在後文中’將該方法及相關方法集體地稱為"化學·肽篩選"β 化學-肽篩選可能是有利的’其容許使用D_胺基酸和其他非天然的類似物，以及非-肽的元件。在Weiis和Lowman， Curr· 〇pin. Biotechnol.，3: 355-62 (1992)中回顧生物學和化學方法》在概念上’可使用噬菌體展示和其他上文提及的方法，發現任何蛋白質的肽模仿物《已經為了抗原決定位作圖、在蛋白質-蛋白質之交互作用中確認決定性的胺基酸而使用這些方法，並作為發現新治療劑的指導❶參見，例如

Cortese等人 ’ Curr. Opin. Biotech. 7: 616-21 (1996)。目前最常在免疫學的研究中使用肽庫，像是抗原決定位作圖。參見 Kreeger，The Scientist 10(13): 19-20 (1996)。已經將藉著噬菌體展示庫篩選所確認的肽，視為發展治療劑的"指導”，而非治療劑本身。像其他的蛋白質和肽一樣，將可能迅速地在活體内藉著腎臟過濾、藉著在網狀内 O:\121\121929.DOC 51 1336333 皮系統中的細胞清除機制，或藉著蛋白水解的降解作用㈣ncis，（在前）]移除它們。結果，該技藝目前使用肽，批准藥物標輕或作為設計有機化合物的廣架其可能不像經由化學庫篩選來仙㈣樣容易或那樣快[LGwman，（在前广

Kay等人，（在前）]。該項技藝將獲益於過程經由該過程 ’這類肽可更容易產製對抗血管生成作用的治療劑。肽體的結構

*在根據本發明製備之物質的組合物中，可經由肽的Ν'終山或、、端>1字肽與媒介附接。因此，可藉著下列的五個化學式及其多聚體，來描述本發明之媒介-肽分子： (Xl)a-F,-(X2)b (式I) Xi-F! — (式 II) Fi-X2 -~—-____ (式 in) Fi-(Li)c-Pi (式 IV) Fl-(L〇c-Pi-(L2)d-P2 (式V) 中： ~ 1鄉；丨（敢好是Fc功能部位）； ! .(Li)c_Pi ^ .(Li)c.Pi.(L2)d_p2 ^ _(Li)c P] 3 C'P3 5 #〇 '(Ll^P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3.(L4)rP4 , 1 2 P# p4分別為具有藥學活性的肽中描述的； j · L, ' L；且"a" 、La和L4分別為聯結子；丨b' d' 件為"a"和"b"中至少有_ 和"Γ分別為〇或1，其限制條

O:\121\121929.DOC -52- 1336333 肽 ^明_選擇性地結合或專—地結合心_2的肤。任二ST類肽’可連同本發明—起使用。在產製可在本發月中使用的肽時’Μ體展示是特別有用的，因為已經 .紅可使用來自任意肽之庫的親和力選擇，來確認任何基因產物之任何位置的肽配體。Dedman等人，】臟

Chem. 268: 23025-30 (1993)。

可藉著=何在此項技藝中揭示的方法，來製備本發明之肽。使用單—字母的胺基酸縮寫。在任何序列中(且在本說明書中，除非另行特別舉例指定）的"χ"，意指2〇個天缺存在之胺基酸殘基中的任一㈤，或任何可出現之非-天然存在的胺基酸（在下文"變體"中說明ρ這些肽的任一個均可以縱列連接（也就是連續地），有或無聯結子，並在表中提供縱列-連接的實例》以"1，列舉聯結子，並可以是在本文中描述的任何聯結子·>為了清楚起見，以破折號分開所示的縱列重覆段和聯結子。可使任何含有半胱胺酸殘基的肽與其他含有Cys的肽交聯，其中任一或兩者皆可與媒介連接。任何具有一個以上Cys殘基的肽，均可形成肽内的二硫鍵結。這些肽中的任一個均可按照在本文中的描述衍生。關於其t可利用胺基基團加帽之羧基終端的衍生物，加帽之胺基基團為-NH2。至於其中胺基酸殘基被胺基酸殘基以外的部分取代的衍生物，以S代表取代作用，其表示在 Bhatnagar 等人，J. Med· Chem. 39: 3814-9 (1996)和

Cuthbertson等人 ’ J. Med. Chem. 40: 2876-82 (1997)中描 O:\121\121929.DOC -53-

述的任何部分，將A 將-以引用的方式併入本文中。除非私不，所有的肽均經由肽鍵結連接。媒介在一個具體實施财，本㈣提供至少—㈣，該肽（們）之N-終端、c狄婭七加❼好 …，’由、％ C_終知或一個胺基酸殘基之側鏈與至 %個媒介（Fl，f2)附接。亦可使用多個媒介，例如在每個 '端的Fc s，或在一終端為Fc，且在另一個終端或側為PEG基團。

Fc力月b σρ位疋一種較佳的媒介。可將功能部位與該肽的N或C終端，或N和C終端兩者融合。如同上文提及的，在本發明之範圍内，Fc變體是適當的變體。可廣泛地修改天然的卜，形成根據本發明之&變體，其條件為仍維持與補救受體結合。參見，例如W〇 97/34631和WO 96/32478。在這類Fc變體中，可移除天然

Fc的或夕個位置，其提供本發明之融合分子不需要的結構特徵或功能活性。例如，可藉著取代或刪除殘基、在該位置插入殘基，或截短含有該位置的部分，移除這些位置。插入或取代的殘基亦可以是經過更改的胺基酸，像是肽模仿物或D-胺基酸。因為許多理由，可能想要Fc變體，在下文中描述數個理由。代表性的以變體包括分子和序列，其中： 1·移除涉及二硫鍵形成的位置。這類移除可避免與出現在用來產製本發明之分子的宿主細胞中，其他含有半胱胺酸之蛋白質的反應。為了該目的，可截短在N-終端含有 O:\121\121929.DOC •54· 半脱胺酸的斷片，或可刪除半胱胺酸殘基，或以其他的胺基酸（例如丙胺醯基、絲胺醯基）取代。甚至在移除半胱胺酸殘基時’單鏈的Fc功能部位仍可形成二聚體的Fc功能部位’其以非-共價之方式維持在一起。 2·修改天然的Fc，使其較可與選出之宿主細胞相容。例如’可移除接近典型天然以之斗終端的PA序列，其可被在大腸桿菌中之消化酵素認出，像是脯胺酸亞胺基肽酶。亦可加入N-終端的甲硫胺醯基殘基，尤其是在以重組方式在諸如大腸桿菌之類的細菌細胞中表現該分子時。 3. 移除天然Fc的一部分N-終端，以防止在選出之宿主細胞中表現時，N·終端的異質性。為了該目的，可刪除任何在N·終端前的20個胺基酸殘基，特別是在位置i、2、3 、4和5處的那些》 4. 可移除一或多個糖基化作用位置^通常糖基化的殘基（例如天冬醯胺），可賦與細胞溶解的反應。可刪除這類殘基，或以未糖基化的殘基（例如丙胺酸）取代之。 5·移除涉及補體交互作用的位置，像是Clq結合位置。例如，可刪除或取代人類IgG1的EKK序列。補體的徵募對於本發明之分子可能不是有利的，故可利用這類&變體避免。 6. 移除影響與補救受體以外之Fc受體的結合的位置。天然的Fc可具有與某些白血球細胞產生交互作用的位置，疋本發明之融合分子不需要的，故可將其移除。 7. 移除ADCC位置》ADCC位置是此項技藝中已知的。 O:\121\121929.DOC -55- 1336333 參見，例如Molec. Immunol. 29(5): 633-9 (1992)，關於在 IgGl中的ADCC位置。該位置是本發明之融合分子完全不需要的，故可將其移除。 8.當天然的Fc衍生自非-人類抗體時，可將該天然的Fc 人類化。通常，欲人類化天然的Fc，將在非-人類的天然 Fc中，以正常在人類天然Fc中發現的殘基，取代選出的殘基。抗體人類化的技術是此項技藝中已熟知的。另類的媒介將是能夠與補救受體結合的蛋白質、多肽、肽、抗體、抗體片段或小分子（例如肽模仿化合物）。例如，可使用在Presta等人，於1998年4月14日發證的美國專利第5,73 9,277號中描述的多肽作為媒介。亦可藉著噬菌體展示，針對與FcRn補救受體的結合來選擇肽。這類補救受體-結合化合物，亦被包括在”媒介”的意義内，並在本發明的範圍内。應針對增加半衰期（例如藉著避免被蛋白酶認出之序列）和降低免疫原性（例如藉著偏愛非-免疫原性的序列，如同在抗體人類化中揭示的）來選擇這類媒介。如同上文提及的，關於FjnF2亦可使用聚合物媒介。目前可獲得各種附接可用來作為媒介之化學部分的方法，參見，例如專利合作條約（"PCT")國際出版物第WO 96/1 1953 號，標題為"以化學方式修改N-終端的蛋白質組合物和方法（N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods)”，完整地以引用的方式併入本文中。該PCT 出版物中，揭示水溶性聚合物與蛋白質之N-終端的選擇性附接。 O:\121\121929.DOC -56- 丄^6333 較佳的聚合物媒介是聚乙二醇（PEG)。PEG基團可具有 T何便利的分子量，並可以是直線或分支的。PEG的平均刀子里最好將是在大約千道爾吞（"kDa")到大約1〇〇 kDa的範圍内，更佳的是從大約5 kDa到大約5〇 kDa，最好是從大約5 kDa到大約10 kDa。pEG基團通常將經由酿化作用或還原性烷基化作用，經由在PEG部分上的反應性基團（例如醛、胺基、硫醇或酯基團）與在本發明化合物上的反應性基團（例如駿、胺基或酯基團），與本發明之化合物附接。合成肽之PEG化作用的有用策略，包括經由在溶液中形成共輛鍵結，混合肽和PEG部分，其分別攜帶特殊的官能度，互相對另一個反應。可利用此項技藝中已知的傳統固相合成，輕易地製備肽。利用適當的官能基團，在指定的位置預先激活”肽。純化前驅物，並在與pEG部分反應之前，先完全定出特徵。肽與PEG的連接作用，通常在含水相中發生，並可輕易地藉著逆相分析HpLC監視之。可藉著製備HPLC輕易地純化PEG化的肽，並藉著分析HpLc: 胺基酸分析和激光解吸質譜分析定出特徵。多醣聚合物是另一類的水溶性聚合物，其可用來進行蛋白質修改。葡聚醣是多醣聚合物，包括主要藉著卜6鍵結連接的葡萄糖之個別亞單元。可利用很多分子量範圍的葡聚聽本身，並可輕易地利用從大約！ kDa到大約7〇咖的分子量。對於在本發明中用來作為媒介而言，葡聚醋本身或與其他媒介（例如Fc)混合，均是適當的水溶性聚合物。參見，例如WO 96/1 1953和貿〇 96/〇53〇9。已經報告與治

O:\121\121929.DOC -57- 療性或診斷用的免疫球蛋白共軛之葡聚醣的用途；參見，例如歐洲專利出版物第0 315 456號，將其以引用的方式併入本文中。當根據本發明使用葡聚醣作為媒介時，最好是大約1 kDa至大約20 kDa的葡聚醣。聯結子任何"聯結子"基團均是任意的。當出現時，其化學結構不具決定性，因為其主要擔任間隔基。聯結子最好是由胺基k組成’藉者肽鍵結連接在一起。因此，在較佳的具體實施例中，聯結子由從1至20個胺基酸組成，藉著肽鍵結連接，其中該胺基酸係從20個天然存在的胺基酸中選出。可將這些胺基酸中的一或多個糖基化，如同熟諳此藝者已 π全瞭解的。在更佳的具體實施例中，這i至2〇個胺基酸可從甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、天冬醯胺、穀胺醯胺和離 fe酸中選出。更佳的是，聯結子大多是由無空間位阻的胺基酸組成，像是甘胺酸和丙胺酸。因此，較佳的聯結子是聚甘胺酸（特別是（Gly)5、（Gly)8)、聚（Gly-Ala)和聚丙胺酸。Gly和Ala的組合亦是較佳的，像是在本文中稱為κι，並具有在本文實例中陳述之胺基酸序列的聯結子。亦可能使用非-肽聯結子。例如可使用烷基聯結子，像是-NH-(CH2)s-C(0)- ’其中s=2-20。這些烷基聯結子可進一步被任何非-空間位阻的基團取代，像是低碳數烷基（例如Ci-C6)低碳數醯基、鹵素（例如ci、Br)、CN、NH2、苯基等等。代表性的非-肽聯結子是PEG聯結子，並具有100 kDa至5000 kDa之分子量，較佳的是1〇〇至5〇〇 kDa。可以 O:\121\121929.DOC • 58 方式―子物專一結合劑的變體和衍生物，亦包括在本發明的範圍内在變體中’包括插入、刪降知朴剛除和取代邊體。應瞭解本發明特定的專-結合劑可含有―、二或所有三種類型的變體。插入和取代變體可含有天然、的胺基酸、非傳統的胺基酸（如下文陳述），或兩者。在一個實例中，提供其I或多個胺基酸殘基，天然存在的或非傳㈣胺基酸，補紐紐體之胺錢序列的插入I體插入可位在蛋白質的任一或兩4，或彳位在肽體胺基酸序列的内部區域中。在任一或兩端帶有額外殘基的插入變體，可包括例如融合蛋白質，以及包括胺基酸標籤或標記的蛋白質。包括肽和肽體的插入變體，其中將一或多個胺基酸殘基加至肽或肽體的胺基酸序列，或其片段。本發明之變體產物亦包括成熟的肽和肽體，其中移除前導或信號序列，且所得的蛋白質具有額外的胺基終端序列 ’該胺基酸可以是天然的或非-天然的。期待在胺基酸位置-1處帶有額外曱硫胺醯基殘基的專一結合劑（像是肽體） (Met·1-肽體）’像是在位置_2和_丨處帶有額外之甲硫胺酸和離胺酸殘基的專一結合劑（Met^-Lys·1-)。帶有額外之Met 、Met-Lys、Lys殘基的變體（或一或多個鹼性殘基，一般而言）’對於在細菌宿主細胞中提高重組蛋白質之產製是特別有用的。本發明亦包括具有起因於使用特定表現系統之額外胺基 O:\121\121929.DOC •59· 1336333 酸殘基的專一結合劑。例如，使用以穀胱甘肽_s_轉移酶 (GST)融合蛋白質的一部分，來表現想要多肽的市售載體 ’使得在從想要的多肽中切開GST組份之後，該想要的多肽在胺基酸位置-1處帶有額外的甘胺酸。亦期待在其他載體系統中表現而產生的變體，包括其中將聚-組胺酸標籤併入胺基酸序列内的那些，通常是在該序列的羧基及/或胺基終端。插入變體亦包括融合蛋白質’其令使肽或肽體之胺基及/ 或缓基終端與其他多肤、其片段或胺基酸融合，通常不認為它是任何特定蛋白質序列的一部分。這類融合蛋白質的實例為免疫原性的多肽、具有長循環半衰期的蛋白質，像疋免疫球蛋白f亙定區、標記蛋白質、有助於純化想要之肽或肽體的蛋白質或多肽’以及促進多聚體蛋白質之形成的多肽序列（像是在二聚體形成/穩定性上有用的亮胺酸拉鍊主題）。這類型的插入變體通常具有全部或實質上一部分的天然分子，在N-或C-終端與第二個多肽的全部或一部分連接。例如，融合蛋白質通常使用得自其他物種的前導序列，以便容許蛋白質在異種宿主中的重組表現。其他有用的融合蛋白質包括加入具有免疫活性的功能部位，像是抗體的抗原決定位，以便有助於該融合蛋白質的純化。在融合接合之處或附近包括切開位置，將有助於在純化之後，移除外來的多肽。其他㈣的融合包括連接具有功能的功能部位，像是得自哮素的活性位置、糖基化作用功能部位、細胞

O:\121\121929.DOC -60 - 瞄準信號或穿透膜區域。有各種市售的融合蛋白質表現系統，可在本發明中使用。特別有用的系統包括，但不限於榖胱甘肽-S-轉移酶 (GST)系統（Pharmacia)，麥芽糖結合蛋白質系統（NEB， Beverley, MA)、FLAG 系統（IBI，New Haven，CT)和 6xHis 系統（Qiagen，Chatsworth，CA)。這些系統能夠產生重組的肽及/或肽體，僅攜帶少量的額外胺基酸，其不可能明顯地影響該肽或肽體的活性。例如，FLAG系統和6xHis系統兩者僅加入短的序列，已知它們兩個均是不佳抗原性的，而不會不利地影響多肽折疊成其天然的構形。另一個預期有用的N-終端融合，是在蛋白質或肽之N-終端區域的Met-Lys二肽融合。這類融合在蛋白質表現或活性上，可產生有益的增加。其他的融合系統產生多肽雜化物，其中想要從想要的肽或肽體中，切除融合夥伴。在一個具體實施例中，融合夥伴藉著含有對蛋白酶專一認知之序列的肤序列，與重組的肽體連接。適當序列的實例，是被Tobacco Etch Virus protease (Life Technologies，Gaithersburg，MD)或 Factor Xa (New England Biolabs，Beverley，MA)承認的那些。本發明亦提供融合多肽，其包括全部或一部分的本發明之肽體或肽，與截短之組織因子（tTF)混合。tTF是血管瞄準劑，由截短形式的人類凝固-誘導蛋白質所組成，其擔任腫瘤血管凝固劑，如同美國專利第5,877,289號； 6,004,555 號；6，132,729 號；6，132,730 號；6，156,321 號； O:\121\121929.DOC -61- 1336333 以及歐洲專利第EP 0988056號的描述。tTF與抗_Ang_2肽體或肽’或其片段的融合，有助於將抗_Ang_2遞送至標靶細胞。另一方面，本發明提供刪除變體，其中移除一或多個在肽或肽體中的胺基酸殘基。可在肽體的一或兩端完成刪除 ’或移除一或多個在肽體胺基酸序列内的殘基。刪除變體必然包括肽或肽體所有的片段。另一方面，本發明提供本發明之肽和肽體的取代變體。取代變體包括其中移除一或多個胺基酸殘基，並以一或多個另類胺基酸殘基置換的那些肽和肽體，該胺基酸可以是天然存在或非-天然存在的。取代變體所產生的肽或肽體，"類似"原始的肽或肽體，在這兩個分子中具有某些百分比的胺基酸是相同的。取代變體在肽或肽體中，包括1、2 、3、4、5、ό、7、8、9、10、15、20、25、30個胺基酸的取代’其中取代的數目可高達10%肽或肽體的胺基酸或更多。一方面’取代在性質上可以是保留性的，然而，本發明包括非-保留性的取代作用，亦包括非-傳統的胺基酸。可藉著已知的方法迅速地計算相關之肽和肽體的同一性和類似性。這類方法包括，但不限於在Computational Molecular Biology，Lesk，A.Μ.編輯，Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects，Smith，D_W.編輯，Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M.，和 Griffin，H.G.編輯，Humana Press, New O:\121\121929.DOC -62- 1336333

Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov，M.和 Devereux，J.編輯，M. Stockton Press，New York (1991);以及 Carillo 等人，SIAM J. Applied Math.，48:1073 (1988)中描述的那些。

設計判定兩個肽或多肽，或多肽和肽之關係或同一性百分比的較佳方法，以便提供在受試序列之間的最大相配。在可公開獲得的電腦程式中，描述了判定同一性的方法。在兩個序列之間判定同一性的較佳電腦程式方法，包括但不限於GCG套裝程式，包括GAP (Davereux等人，Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group,

University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul等人，J. Mol. Biol.，215 :403-410 (1990))° 從National Center for Biotechnology Information (NCBI)和其他來源（BLAST Manual，Altschul 等人， NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894; Altschul等人，在前 (1990))公開獲得BLASTX程式。亦可使用已熟知的Smith Waterman演算法來判定同一性。某些將兩個胺基酸序列排列成一直線的排列計劃，可導致僅將兩個序列的短區域配對，而這個小的排列區可能具有極高的序列同一性，即使在這兩個全長的序列之間沒有顯著的關係。因此，在某些具體實施例中，選出的排列方法（GAP程式）將導致跨越待比較之標靶至少10%全長的排列，也就是在欲比較至少400個胺基酸的序列處，為至少 O:\121\121929.DOC -63- 1336333 40個連續的胺基酸，在待比較至少300至大約400個胺基酸的序列處’為30個連續的胺基酸，在待比較至少2〇〇至大約300個胺基酸的序列處，為至少2〇個連續的胺基酸，且在待比較大約100至200個胺基酸的序列處，為至少丨0個連續的胺基酸。例如’使用電腦演算法GAP (Genetics Computer Group， University of Wisconsin，Madison, WI)，將兩個欲判定其序列同一性百分比的多肽排成一直線，以便使其各自的胺基酸最為相配（由演算法決定”配對跨幅，，）。在某些具體實施例中’連同演算法一起使用間隙開放罰點（其通常按照 3X平均對角線來計算；”平均對角線”是欲使用之比較矩陣對角線的平均值；"對角線••是由特定之比較矩陣指派給每個最佳胺基酸配對的分數或數目），和間隙延伸罰點（其經常是間隙開放罰點的1/10倍），以及比較矩陣，像是PAM 25 0或BLOSUM 62。在某些具體實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣（關於PAM 250比較矩陣，參見Dayhoff等人 * Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978)；關於 BLOSUM 62比較矩陣，參見Henikofff>^，proc.Natl· Acad· Sci USA, 89:10915-10919 (1992)。在某些具體實施例中，多肽序列比較的參數，包括下列：演算法：Needleman等人，J. Mol. Biol.，48:443-453 (1970)；比較矩陣：BLOSUM 62得自Henikoff等人，在前（丨992); 間隙罰點：12 O:\121\121929.DOC -64- ^ ν> 1336333 間隙長度罰點：4 類似性之閾值：〇利用以上的參數，GAP程式可 ^ .., 疋有用的。在某些具體實施例中，上文提及的參數是使用GAp演算法之多肤比較的預设參數（連同末端間隙無罰點）。在某些具體實施例中，多核访酿公夕孩香敲刀子序列（與胺基酸序列相反）比較的參數包括下列：

演算法：Needleman等人，在前（197〇)· 比較矩陣：相配=+1〇，誤配=〇間隙罰點：50 間隙長度罰點：3 利用以上的參數，GAP程式亦可能是有用的。上文提及的參數是多核苷酸分子比較的預設參數。可使用其他代表性的演算法、間隙開放罰點、間隙延伸罰點、比較矩陣、類似性之閾值等等，包括在pr〇gram

Manual，Wisconsin Package，第 9版，1997年 9月中陳述的那些。進行特定的選擇’將是熟諳此藝者所瞭解的，並將視待進行的特定比較而定，像是DNA-對-DNA，蛋白質_ 對-蛋白質，蛋白質-對-DNA ;此外，是否是在特定的序列對之間（在此情況下，GAP或BestFit通常是較佳的），或是在一個序列與大的序列資料庫之間（在此情況下FASTA或 BLASTA是較佳的）進行比較。在本文中使用時，20個傳統的胺基酸及其縮寫，依循慣

例使用。參見 Immunology--A Synthesis (第 2 版，E.S O:\121\121929.DOC -65· 1336333

Golub和D.R. Gren編輯，Sinauer八训仏…，

Mass· (1991))’為了任何目的將其以引用的方式併入本文中〇胺基馱可具有L或D立體化學（除了 Gly之外，它不是^也不是D)’而本發明之多肽和組合物可包括立體化學的組合。然而，L立體化學是較佳的。本發明亦提供相反分子，其中胺基酸之胺基終端至羧基終端的序列是相反的。例如 ’具有正常序列Χι-χ2_Χ3之分子的相反將是X3-X2-X,。本發明亦提供逆-相反分子，其中，如同上文，胺基酸之胺基終端至敌基終端的序列是相反的，並將正常是"L"對映體的殘基更改為"D"立體異構物之形式。 20個傳統胺基酸之立體異構物（例如D_胺基酸）、非天然的胺基酸’像是α·，α_二經取代之胺基酸、N_烷基胺基酸、乳酸和其他非傳統的胺基酸，亦可以是本發明之多肽的適當組份。非傳統胺基酸的實例包括，但不限於：胺基己二酸、β-丙胺酸、β-胺基丙酸、胺基丁酸、六氫吡啶酸、胺基己酸、胺基庚酸、胺基異丁酸、胺基庚二酸、二胺基丁酸、鎖連素、二胺基庚二酸、二胺基丙酸、Ν-乙基甘胺酸、Ν-乙基天冬醯胺、羥基離胺酸、別-羥基離胺酸、羥基脯胺酸、異鎖連素、別-異亮胺酸、Ν-曱基甘胺酸、肌胺酸、Ν-甲基異亮胺酸、Ν_曱基纈胺酸、正纈胺酸、正亮胺酸、鳥胺酸、4-羥基脯胺酸、γ-羧基榖胺酸、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基離胺酸、ε·Ν_乙醯基離胺酸、〇_磷酸絲胺酸、Ν-乙醯基絲胺酸、Ν-甲醯基甲硫胺酸、3-曱基組胺酸、5-羥基

O:\121\121929.DOC 1336333 離胺馱σ N_甲基精胺酸，以及其他類似的胺基酸和胺基酸（例如4·經基脯胺酸）。同樣的，除非另行指定，單股多核甞酸序列的左-手端為5'端；雙股多核：y：酸序列的左-手方向則意指5，方向。將初生RNA轉錄本的5,至3,方向添加，稱為轉錄方向；在具有與RNA相同之序列的DNA股上的序列區，且它是5，對 RNA轉錄本的5,末端，將其稱為，，上游序列"：在具有與 RNA相同之序列的DNA股上的序列區，且它是3,對rna轉錄本的3'末端’則將其稱為"下游序列,，。應瞭解可以其共同的側鏈特性為基礎，將胺基酸殘基分類： 1·中性疏水性的：丙胺酸（Ala; A);纈胺酸（Val; V); 亮胺酸（Leu; L);異亮胺酸（ne; 脯胺酸（Pr〇; p);色胺酸（Trp; W);苯丙胺酸（Phe; F)和甲硫胺酸（Met; M)。 2. 中性極性的：甘胺酸（Gly; G);絲胺酸（Ser; S);蘇胺酸（Thr; T);赂胺酸（Tyr; Y);半胱胺酸（Cys; c);榖胺醯胺（Gin; Q);天冬胺酸（Asn; N)和正亮胺酸。 3. 酸性的：天冬胺酸（Asp;D)，穀胺酸（Glu;E); 4. 鹼性的：離胺酸（Lys; K)，精胺酸（Arg; R)，組胺酸 (His; Η) ° 參見 Lewin，B·，Genes V，Oxford University Press (1994)，第11頁。保留性胺基酸置換可包括非傳統的胺基酸殘基，其通常是藉著化學肽合成，而非藉著在生物學系統中的合成併入 O:\121\121929.DOC •67· 1336333 。這些包括，但不限於肽模仿物和胺基酸部分的其他相反或逆向形式。非-保留性置換可涉及交換這些種類之一的成員與得自其他種類之成員。在進行這類改變時’根據某些具體實施例，可考慮胺基酸的疏水指數。已經以其疏水性和電荷特徵為基礎，來相派母個胺基酸的疏水指數。其為：異亮胺酸（+4 5);纈胺心（+4_2);亮胺酸（+3.8);苯丙胺酸（+2.8);半胱胺酸/胱胺酉夂（+2.5);甲硫胺酸（+1-9);丙胺酸（+1.8);甘胺酸（-0.4); 蘇胺酸（-0.7);絲胺酸（-〇_8);色胺酸（-0.9);酪胺酸（_ι·3) ’脯胺酸（-1.6);組胺酸（-3.2);穀胺酸（-3.5);穀胺酿胺 (-3.5)，天冬胺酸（_3.5);天冬醯胺（_3.5);離胺酸（·3.9); 和精胺酸（-4.5)。在此項技藝中瞭解疏水胺基酸指數，在賦與蛋白質交互作用之生物學功能上的重要性。Kyte等人，J. Mol. Biol.， 157:105-131 (1982)。已知某些胺基酸可被其他具有類似疏水心數或分數的胺基酸取代’並仍保留類似的生物學活性。在以疏水指數為基礎來進行改變時，在某些具體實施例中’胺基酸的取代作用包括其疏水指數在±2内的胺基酸。在某些具體實施例中，包括在±1内的那些，而在某些具體實施例中，包括在±0· 5内的那些。在此項技藝中’亦瞭解類似胺基酸的取代作用，可以親水性為基礎有效地進行，特別是在藉此創造想要用在免疫學具體實施例中之具有生物功能的肽體或肽之處。在某些具體實施例中’蛋白質的最大局部平均親水性，由其相鄰 O:\121\121929.DOC •68- 1336333 胺基酸之親水性支配，與其免疫原性和抗原性，也就是該蛋白質的生物學特性有關係。

已經對這些胺基酸殘基指派了下列的親水性值：精胺酸 (+3.0);離胺酸（+3·0);天冬胺酸（+3 〇±1);榖胺酸（+3 〇± 1) ’絲胺酸（ + 0.3);天冬醯胺（+ 〇_2);穀胺醯胺（+〇 2);甘版酸（〇)’蘇胺酸（_〇.4);脯胺酸（·〇·5±ι);丙胺酸（_〇5); 組胺酸（-0·5);半胱胺酸（-1.0);甲硫胺酸（-1.3);纈胺酸（-1.5);焭胺酸（-1.8);異亮胺酸（_ 18);酪胺酸（-2.3);苯丙胺酸（-2.5)和色胺酸（_3.4)。在以類似的親水性值為基礎進行改變時，在某些具體實施例中，胺基酸之取代作用包括其親水性值在±2内的胺基酸，在某些具體實施例中，包括在±1内的那些，而在某些具體實施例中，包括在±0.5内的那些。亦可以親水性為基礎，確認得自原始胺基酸序列的抗原決定位。亦將這些區域稱為"抗原決定位核心區"。在下文表2中陳述了代表性的胺基酸取代作用。

表2 胺基酸取代作用原始殘基代表的取代較佳取代 Ala Val，Leu, lie Val Arg Lys, Gin, Asn Lys Asn Gin, Glu, Asp Gin Asp Glu, Gin, Asn Glu Cys Ser, Ala Ser Gin Asn, Glu, Asp Asn Glu Asp, Gin, Asn Asp

O:\121\I2I929.DOC -69- ^ 5 > 原始殘基代表的取代較佳取代 Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gin, Lys, Arg Arg lie Leu, Val，Met，Ala, Phe，正亮胺酸 Leu Leu 正亮胺酸，lie, Val, Met, Ala, Phe lie Lys 心旦，1，4-二胺基-丁酸，〇111,八511 Arg Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr, Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val lie, Met, Leu, Phe, Ala,正亮胺酸 Leu 熟諳此藝者將能夠使用已熟知的技術，判定在本文中陳述之多肽的適當變體。在某些具體實施例中，熟諳此藝者可藉著瞄準不相信其對於活性是很重要的區域，來確認分子中可加以改變，但不破壞活性的適當區域。在某些具體實施例中，可確認分子被保留在類似之肽或多肽中的殘基和部分。在某些具體實施例中，即使對生物活性或結構可能很重要的區域，亦可使其經歷保留性胺基酸置換，而不破壞生物活性，或對多肽結構有不利的影響。此外，熟諳此藝者可回顧結構-功能的研究，確認在類似多肽中對於活性或結構很重要的殘基。從這類比較來看，可預期在蛋白質中，與在類似蛋白質中對於活性或結構很重要的胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的重要性。熟諳此藝者可為這類預期很重要的胺基酸殘基，選擇在化學上類 O:\121\121929.DOC •70· 似的胺基酸取代作用。熟諳此藝者亦可分析三維結構和胺基酸序列，與在類似多肽中之結構的關係。從這類資訊來看，熟諳此藝者可預期抗體之胺基酸殘基的排列，與其三維結構的關係。在某些具體實施例中，熟諳此藝者可選擇對於預期是在蛋白質表面上的胺基酸殘基’不進行徹底的改變，因為這類殘基可能涉及與其他分子的重要交互作用。此外，熟諸此藝者可產製測試變體’其在每個想要的胺基酸殘基處，含有單一胺基酸取代。然後可使用熟諳此藝者已知的活性測定來篩選變體。可使用這類變體收集有關於適當變體的資訊。例如’如果發現對特定胺基酸殘基的改變，導致受到破壞、不想要地降低，或不適當的活性，便可避免這類改變。換句話說’以收集自這類例行實驗的資訊為基礎，熟諳此藝者可輕易地判定應避免單獨或與其他突變組合，進一步取代的胺基酸。許多科學出版物已經致力於二級結構的預測。參見 Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou 等人，Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou 等人， Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou 等人，Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou 等人，Ann. Rev. Biochem.，47:251-276 和 Chou 等人， Biophys. J.，26:3 67-3 84 (1979)。此外，目前可利用電腦程式來幫助預測二級結構。一種預測二級結構的方法是以同種性塑型為基礎。例如，具有超過30%之序列同一性，或 O:\121\121929.DOC •71 · 1336333 超過40%之類似性的兩個多肽或蛋白質，通常具有類似的結構拓樸學。蛋白質結構資料庫（PDB)最近的成長，已經提供了增強的二級結構可預測性’包括在多肽或蛋白質之結構中’可能的折疊次數。參見Holm等人，Nucl. Acid

Res·，27(1):244-247 (1999)。已經暗示（Brenner 等人，Curr.

Op· Struct. Biol.，7(3):369-376 (1997))在特定的多肽或蛋白質中，有限制次數的折疊，且一旦已經解決結構的決定性次數，結構的預測便變成戲劇化地更精確。預測二級結構的其他方法’包括"穿線（threading)" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997)； Sippl 等人，Structure，4(1):15-19 (1996)) 輪廓分析" (Bowie 等人，Science，253:164-170 (1991); Gribskov 等人 ’ Meth. Enzym·，183:146-159 (1990); Gribskov等人，proc. Nat. Acad. Sci.，84(13):4355-4358 (1987))，以及"進化連鎖" (參見 Holm,在前（1999)和 Brenner,在前（1997))。在某些具體實施例中，肽體變體包括糖基化作用變體，其中已經將一或多個糖基化作用位置，像是N-連接的糖基化作用位置，加至該肽體中。N-連接的糖基化作用位置是序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr所特有的，其中以X表示的胺基酸殘基可以是脯胺酸以外任何的胺基酸殘基。胺基酸殘基的取代或添加創造該序列，提供可能加入N-連接之碳水化合物鏈的新位置。或者，排除該序列的取代作用，將移除現存的N-連接之碳水化合物鏈。亦提供N-連接之碳水化合物鏈的重新排列，其中排除一或多個N-連接之糖基化 O:\121M21929.DOC -72- 作用位置（通常是天然存在的那些），並創造一或多個新的連接位置。本發明亦提供"衍生物"，其包括攜帶不同的修改，或胺基酸殘基之添加、插入、刪除或取代的肽體。該修改在性質上最好是共價的，並包括例如與聚合物、脂質、其他有機和無機部分的化學結合。可製備本發明的衍生物，以便增加肽該體的循環半衰期，或可設計以便改良該肽體對想要之細胞、組織或器官的瞄準能力。代表性的衍生物包括其中已經進行一或多個下列修改的部分： •已經藉著非-肽基鍵結，像是_CH2_胺基甲酸酯鍵結卜 CH2_0C(0)NR-];膦酸酯鍵結；_Ch2_磺醯胺[_CH2_ s(o)2nr-]鍵、结；服鍵結；_Ch2 二級胺鍵結；或焼基化了的肽基鍵結[_C(〇)nr6_，其中R6 為烧基]，置換一或多個肽基[_C(〇)NR-]鍵結（鍵）； •其中N-終端被衍生成_NRRi基團；_nrc(〇)r基團；_ NRC(0)OR基團；·ΝΚ8(〇)2Κ基團；_NHC(〇)NHR基團（其中R和R1為氫或低碳數烷基，其限制條件為R和 R1並非兩者都是氬）；琥珀酿亞胺基團；芊氧羰基_ NH-(CBZ-NH-)基團；或芊氧羰基_NH_基團（在苯基環上具有從1至3個取代基，選自由低碳數烷基、低碳數烧氧基、氯和溴所組成之群）的肽； •其中自由C終端被衍生為_c(〇)R2 (其中R2選自由低碳數院氧基所組成之群）和_nr3r4 (其中R3和R4分別選自 O:\121\121929.DOC •73· 1336333 由括氫和低碳數烷基所組成之群）的肽。"低碳數•'意指具有從1至6個碳原子的基團。此外，亦可藉著使肽中被瞄準之胺基酸殘基與能夠與選出之側鍵或終端殘基反應的有機衍生劑反應，將個別胺基酸的修改導入本發明之多肽或組合物中。下列的是典型的：離胺醯基和胺基終端的殘基可與琥珀酸或其他的羧酸酐反應。利用這些製劑的衍生作用，具有逆轉離胺醯基殘基之電荷的效果。其他適合衍生含有α-胺基之殘基的製劑 ’包括醯亞胺酯，像是甲基吡啶醯亞胺曱酯；磷酸吡。多醛 ;吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；〇_甲基異脲； 2,4-戊二酮；以及利用乙醛酸之轉胺基酶催化的反應。可藉著與一或數個傳統試劑的反應，來修改精胺醯基殘基’其中有苯曱醯甲醛、2,3·丁二酮、1，2-環己二酮和茚三酮。精胺酸殘基的衍生作用需要在鹼性的條件下進行反應，因為胍官能基的高pKa。此外，這些試劑可與離胺酸之基團，以及精胺酸的胍基團反應。酪胺醯基殘基的特定修改，本身已經被廣泛地研究，而特別感興趣的是藉著與芳香族之重氮化合物或四硝基甲烷的反應，將光譜標記導入酪胺醯基殘基内。最常見的是，可使用N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷，分別形成〇_乙醯基酪胺酿基物種和3 -硝基衍生物。了藉者與峡化一酿亞胺（r’_N=c=N-R·)的反應，像是1-環己基-3-(2-嗎啉基_(4_乙基）碳化二醯亞胺或卜乙基_3(4氮

O:\121\121929.DOC 1336333 鑌-4,4-二甲戊基）碳化二醯亞胺，選擇性地修改羧基側鏈基團（天冬胺酿基或榖胺醯基）。此外，亦可藉著與錢離子的反應’將天冬胺臨基和榖胺酿基殘基轉變為天冬酿胺酿基和穀胺醯胺醯基殘基。通常將榖胺醯胺醯基和天冬醯胺醯基殘基脫醯胺化，成為相對應的榖胺酿基和天冬胺酿基殘基。或者，可在弱酸性的條件下將這些殘基脫醯胺化。這些殘基的任一個形式均在本發明的範圍内。利用雙重功能之製劑的衍生作用，對於將肽或其功能衍生物與不溶於水的支撑矩陣或其他大分子載劑交聯是有用的。常用的聯結子包括，例如込卜雙（重氮乙醯基）_2_苯基乙烷、戊二醛、N_羥基琥珀醯亞胺酯，例如帶有4_疊氮水楊酸的酯、高雙重功能的醯亞胺酯，包括二琥珀醯亞胺基酉曰’像疋3,3’-二硫雙（琥珀醯亞胺基丙酸酯），以及雙重功月b的順丁烯二醯亞胺，像是雙_\•順丁烯二醯亞胺基-is· 辛烷。諸如甲基_3_[(對·疊氮苯基）二硫代]丙醯亞胺酯之類的何生劑，產生光可激活的中間物，其能夠在光的存在下形成父聯。或者，為了固定蛋白質，可使用反應性的不溶於水之矩陣，像是在美國專利第3,969,287號，· 3 691，〇16號 ’ 4，195，128 號，4,247,642 號；4,229,537 號和 4,330,440 號中描述的溴化氰激活之碳水化合物和反應性受質。其他可能的修改包括脯胺酸和離胺酸的羥化作用，絲胺醯基或蘇胺醯基殘基之羥基基團的磷酸化作用，在Cys中硫原子的氧化作用，離胺酸、精胺酸和組胺酸側鏈之心胺

〇：\121\121929.DOC -75· 1336333 基基團的甲基化作用（Creight〇n，T.e.，Proteins: Structure and Molecule Properties, W.H. Freeman & Co., San

FranciSC0 ’第79_86頁（1983))，N終端胺的乙醯化作用，以及在一些例子中，C-終端羧基基團的醯胺化作用。這類衍生的部分最好改善一或多個特徵，包括化合物的抗-血管生成之活性、溶解性、吸收、生物學的半衰期，及其類似者。或者，衍生的部分可導化合物具有與未衍

生之化合物相同，或基本上相同的特徵及/或特性。該部分可另行排除或減少該化合物任何不想要的副作用，及其類似者。另外也可在DNA層面改變本發明之化合物。可將化合物之任何部分的DNA序列，改變成更可與選出之宿主細胞相容的密碼子。關於大腸桿菌，其為最佳的宿主細胞，最適切之密碼子為此項技藝中已知的。可取代密碼子以便排除限制位置，或包括不活動的限制位置，其可幫助dna在選出之宿主細胞中的加卫。可修改媒介、聯結子和肤麵序列，使其包括任何前述的序列改變。因此，所有在本文中討論的修改、取代、衍生作用等等，同等地適用於本發明的所有觀點，包括但不限於肽、肽二聚體和多聚體、聯結子和媒介。此外’熟諸此藝者可回顧結構_功能研究，確認在類肽中對活性或結構很重要的殘基。從這類比較來看，可期在肽中，與在類似肽中對成甘L 丨Α、、Ό構很重要的胺基i 殘基一致之胺基酸殘基的重要性。受怔熟03此藝者可為這類；

〇：\121\121929.DOC -76- 期很重要之肽的胺基酸殘基，選擇在化學上類似的胺基酸取代作用。熟諸此藝者亦可分析三維結構和胺基酸序列，與在類似多肽中之結構的關係。從這類資訊來看，熟諳此藝者可預期肽之胺基酸殘基的排列，與其三維結構的關係。熟諳此藝者可選擇對於預期是在蛋白質表面上的胺基酸殘基，不進行徹底的改變，因為這類殘基可能涉及與其他分子的重要交互作用。此外’熟諳此藝者可產製測試變體，其在每個想要的胺基酸殘基處，含有單_胺基酸取代。然後可使用熟諳此藝者已知的活性測定來篩選變體。可使用這類變體收集有關於適當變體的資訊。例如，如果發現對特定胺基酸殘基的改變，導致受到破壞、不想要地降低，或不適當的活性，便可避免這類改變。換句話說，以收集自這類例"ί于實驗的資訊為基礎，熟諸此藝者可輕易地判定應避免單獨或與其他突變組合，進一步取代的胺基酸。許多科學出版物已經致力於二級結構的預測。參見 Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou 等人，Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou 等人， Biochemistry, 113(2):21 1-222 (1974); Chou 等人，八心· Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou 等人 ’ Ann. Rev. Biochem.，47:251-276 和 Chou 等人， Biophys. J” 26:367-3 84 (1979) »此外，目前可利用電腦程式來幫助預測二級結構。一種預測二級結構的方法是以同種性塑型為基礎。例如，具有超過30%之序列同一性，或 O:\121\121929.DOC •77- 1336333 超過40%之類似性的兩個多肽或蛋白質，通常具有類似的結構拓樸學。蛋白質結構資料庫（PDB)最近的成長，已經提供了增強的二級結構可預測性，包括在多肽或蛋白質之結構中，可能的折疊次數。參見Holm等人，Nucl Aeid

Res” 27(1).244-247 (1999)。已經暗示（Brenner等人，Curr

Op. Struct. Biol·，7(3):369-376 (1997))在特定的多肽或蛋白質中’有限制次數的折疊’且一旦已經解決結構的決定性次數’結構的預測便變成戲劇化地更精確。預測二級結構的其他方法，包括"穿線"（J〇nes，D，Curr

Opin. Struct. Biol.，7(3):377-87 (1997); Sippl 等人，

Structure’ 4(1):15-9 (1996))、"輪廓分析"（B〇wie等人， Science， 253:164-170 (1991); Gribskov 等人，Meth Enzym” 183:146-159 (1990); Gribskov等人，proc· Nat. Acad. Sci.，84(13):4355-8 (1987))，以及"進化連鎖"（參見 Holm，在前和Brenner，在前）。本發明尚包括衍生的專一結合劑’例如肽體，共價修改以便包括一或多個水溶性聚合物附接，像是聚乙二醇、聚氧乙二醇’或聚丙二醇，如同美國專利第4,64〇,835號； 4,496,689 號；4,301，144 號；4,670,417 號；4,791，192 號和 4,179,3 37號的描述。此項技藝中已知其他有用的聚合物，包括單甲氧基-聚乙二醇、葡聚酷、纖維素或其他以碳水化合物為基礎的聚合物、聚_(N_乙稀基峨洛院酮）·聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物聚氧乙烯化的多元醇（例如甘油）和聚乙烯醇，以及這些聚合物 O:\121\121929.DOC -78- 的Μ合物。特佳的是利用聚乙二醇（PEG)亞單元共價修改的肤體°可在特定的位置與水溶性聚合物結合，例如，在肽體的胺基終端處’或隨機地附接在多肽的一或多個側鏈上使用PEG，以便改善專一結合劑，例如肤體的治療效力並將抗體人類化，特別在Gonzales等人，2000年10月 17曰發證之美國專利第6，133,426號中描述之。本發明亦企圖衍生化合物的肽及/或媒介部分。這類衍 ’生物可改善化合物的溶解性、吸收、生物學的半衰期，及其類似者。該部分可另行排除或減少化合物任何不想要的副作用，及其類似者。代表性的衍生物包括化合物，其中： 1.化合物或其某些部分是環狀的。例如，可修改肽部分，使其含有二或多個Cys殘基（例如以聯結子），可藉著二硫鍵的形成將其環化。 2·化合物在分子之間交聯，或使其成為能夠交聯的。例如’可修改肽部分’使其含有一個Cys殘基，並藉著能夠與類似分子形成分子間的二硫鍵。化合物亦可經由其c_ 終端交聯》 3 .藉著非-肽基鍵結置換一或多個肽基[_c(〇)NR_]鍵結 (鍵）。代表性的非-肽基鍵結為-CH2-胺基甲酸酯[-CH2-OC(0)NR-]、膦酸酯、-CH2-磺醯胺[-CH2-S(0)2NR-]、脲 [-NHC(0)NH-]、-CH2-二級胺和烷基化了的肽[-C(0)NR6-，其中R6為低碳數烷基]。 4.將N-終端衍生。通常，可將N-終端醯基化或修改成經取代之胺。代表性的N-終端衍生基團包括-NRI (·ΝΗ2 O:\121\121929.DOC •79· 1336333 以外）、-NRC^O)!^、-NRC^C^ORi、-NRSiOhRi、-NHC(O) NHR丨、琥珀醒亞胺，或苄氧羰基-NH-(CBZ-NH-)，其中r 和心分別為氫或低碳數烷基’且其中苯基環可利用1至3個選自由CpC4烧基、C1-C4烧氧基、氣和漠所組成之群的取代基取代。 5. 將自由的C-終端衍生。通常’可將c-終端酯化或酿胺化。例如，可使用在此項技藝中描述的方法，在c_終端處將（NH-CH2-CH2-NH2)2加至本發明之化合物上。同樣的

’可使用在此項技藝中描述的方法，在C_終端處將·ΝΗ2加至本發明之化合物上。代表性的C-終端衍生基團包括，例如-C(0)R2 ’其中R2為低碳數烷氧基，或_NR3R4，其中R3 和R4分別為氫或C「C8烷基（最好是匚广匕烷基）。 6. 以其他的’最好是更穩定的交聯部分（例如伸烷基）來置換二硫鍵。參見，例如Bhatnagar (在前）；Alberts等人 » Thirteenth Am. Pep. Symp., 357-9 (1993) »

7. 修改一或多個各別的胺基酸殘基。已知各種專一地與所選擇之側鏈或終端殘基反應的衍生劑，如同在下文中詳細說明的。離胺醯基殘基和胺基終端的殘基，可與琥珀酸或其他的羧酸酐反應，其逆轉離胺醯基殘基的鼋荷。其他適合衍生含有α-胺基之殘基的製劑，包括醯亞胺酯，像是甲基吡啶醯亞胺曱酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；Ο-甲基異脲；2,4-戊二剩；以及利用乙醛酸之轉胺基酶催化的反應。 O:\121\121929.DOC •80· 可藉著與任一或數個傳統試劑之組合的反應，來修改精胺醯基殘基’包括苯甲醯甲醛、2,3 丁二酮、環己二酮和印二酮。精胺酸殘基的衍生作用需要在鹼性的條件下進行反應，因為胍官能基的高pKa ^此外，這些試劑可與離胺酸之基團’以及精胺酸£_胺基基團反應。、路胺酿基殘基的特定修改，已經被廣泛地研究，而特別感’、趣的是藉著與芳香族之重氮化合物或四硝基甲烷的反應，將光譜標記導入酪胺醯基殘基内。最常見的是，可使用N-乙醯基咪唑和四硝基甲烷，分別形成〇·乙醯基酪胺醯基物種和3-硝基衍生物。可藉著與碳化二醯亞胺（R，_N=C=N_R,)的反應’像是丨_環己基-3-(2-嗎啉基_(4-乙基）碳化二醯亞胺或卜乙基•氮鏑-4,4-二甲戊基）碳化二醯亞胺，選擇性地修改羧基側鏈基團（天冬胺醯基或榖胺醯基p此外，亦可藉著與銨離子的反應，將天冬胺醯基和榖胺醯基殘基轉變為天冬醯胺醯基和穀胺醯胺醯基殘基。可將榖胺酿胺醯基和天冬醯胺醯基殘基脫醯胺化，成為相對應的穀胺醯基和天冬胺醯基殘基。或者，可在弱酸性的條件下將這些殘基脫醯胺化。這些殘基的任一個形式均在本發明的範圍内。可藉著胺基酸殘基或其他部分置換半胱胺醯基殘基排除二硫鍵結’或相反地穩定交聯作用。參見，例如 Bhatnagar (在前）〇利用雙重功能之製劑的衍生作用，對於將肽或其功能衍 O:\I21\121929.DOC • 81 · 1336333 生物與不溶於水的支撐矩陣或其他大分子載劑交聯是有用的。*用的聯結子包括，例如丨，卜雙（重氮乙醯基）·2_苯基乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀醯亞胺酯，例如帶有4·疊氮水揚酸的酯、高雙重功能的醯亞胺酯，包括二琥珀醯亞胺基 S曰，像疋3，3’-二硫雙（玻珀酿亞胺基丙酸酯），以及雙重功月b的順丁烯二醯亞胺，像是雙_N_順丁烯二醯亞胺基-丨，^ 辛烷。諸如甲基_3_[(對-疊氮苯基）二硫代]丙醯亞胺酯之類的衍生劑，產生光可激活的中間物，其能夠在光的存在下形成交聯。或者，為了固定蛋白質，可使用反應性的不溶於水之矩陣，像是在美國專利第3,969,287號；3,691，〇16號 ’ 4，195，128 號；4,247,642 號；4,229,537 號和 4,330,440 號中描述的溴化氰激活之碳水化合物和反應性受質。可便利地將碳水化合物（寡醣）附接在蛋白質中已知是糖基化作用位置的位置上。通常，將〇_連接之寡醣類附接在絲胺酸（Ser)或蘇胺酸（Thr)殘基上，同時將沐連接之寡醣類附接在天冬醯胺（Asn)殘基上，此時它們是序列Asn_x· Ser/Thr的一部分，其中X可以是脯胺酸以外的任何胺基酸。X最好脯胺酸以外19個天然存在的胺基酸之一。N_連接和0-連接之寡醣類的結構，以及在每種類型中找到的糖殘基都疋不同的。一種經常在兩者中找到之糖的類型是乙醯基神經氨糖酸（稱為唾液酸）。唾液酸經常是N_連接和〇_ 連接之寡醣類的終端殘基，且憑藉著它的負電荷，可賦與糖基化之化合物酸性的性質。可將這類位置（們）併入本發明之化合物的聯結子中，且最好是在多肽化合物之重組產 0:\121\121929.D0C -82- 1336333 製期間，被細胞糖基化（例如在哺乳動物細胞中，像是 CHO、BHK、COS)。然而，尚可藉著此項技藝中已知的合成或半-合成程序，將這類位置糖基化。其他可能的修改，包括脯胺酸和離胺酸的羥化作用，絲胺酿基或蘇胺酿基殘基之羥基基團的磷酸化作用，在Cys 中硫原子的氧化作用，離胺酸、精胺酸和組胺酸侧鏈之α_ 胺基基團的甲基化作用[Creighton，Proteins: Structure and Molecular Properties (W.H. Freeman & Co., San Francisco) ，第 79-86頁（1983)]。另外亦可在DNA層面改變本發明之化合物。可將化合物之任何部分的DNA序列，改變成更可與選出之宿主細胞相容的密碼子。關於大腸桿菌，其為最佳的宿主細胞，最適切之密碼子為此項技藝中已知的。可取代密碼子，以便排除限制位置，或包括不活動的限制位置，其可幫助dna在選出之宿主細胞中的加工。可修改媒介、聯結子和肽dna 序列’使其包括任何前述的序列改變。親和力成熟本發明的一個具體實施例包括"親和力成熟的"肽和肽體。該過程企圖使用噬菌體展示或其他選擇技術，增加本發明之肽和肽體的親和力或生物-活性。以一致序列（為了相關肽的集合而產製）為基礎，可產製指引的二級噬菌體展示庫，其中"核心"胺基酸（從一致序列來判定）不變地受到保留’或傾向於頻繁地發生。或者，可使用各別的肽序列來產製傾向一方、指引之噬菌體展示庫。淘洗這類的庫，

0:\121\121929.D0C -83 - 1336333 可產生提高對Ang-2之結合作用，或具有提高之生物活性的肽（可將其轉變為肽體）。非-肽類似物/蛋白質模仿物此外，亦期待肽的非·肽類似物，其提供穩定化之結構或減少的生物降解作用。可以選出的抑制肽為基礎，藉著以非肽部分置換—或多個殘基，來製備肽模仿類似物。非肽部分最好容許該肽保留其天然的證實，或穩定較佳的，例如具有生物活性之證實，其保留認出並與Ang々結合的能力。一方面，所得的類似物/模仿物對八叫_2顯示出增加的結合親和力。*Nachman等人，Regul㈣UN·”。 (1995)中，描述了一種從肽來製備非肽模仿類似物之方法的實例。如果想要，可修改本發明之肽，例如藉著糖基化作用、醯胺化作用、羧基化作用或磷酸化作用，或藉著創造本發明之肽的酸加成鹽、醯胺、酯，特別是c —終端的酯，以及Ν-醯基衍生物。亦可修改肽體，藉著與其他部分形成共價或非共價的複合物，來創造肽衍生物。可藉著使化學部分與在包括肽體之胺基酸側鏈上，或Ν-或C-終端處的官能基交聯，來製備共價-結合的複合物。特別期待可與報告者基團共輕的肢，該報告者基團包括仁不限於放射性標記、螢光標記、酵素（例如催化比色或螢光反應）、受質、固相矩陣或載劑（例如生物素或抗生物素蛋白）。因此，本發明提供包括肽體分子之分子，其中該分子最好尚包括報告者基團，選自由放射性標記、螢光標記、酵素、受質、固相矩陣和載劑所組成之群。這類

O:\121\121929.DOC -84· 1336333 標記是熟諳此藝者已熟知的，例如特別期待生物素標記。這類標記的使用為熟諳此藝者已熟知的，並描述在例如美國專利第 3,817,837 號；3,850,752 號；3,996,345 號和 4,277,437號中。其他有用的標記包括，但不限於放射性標記、螢光標記和化學發光標記。關於使用這類標記的美國專利，包括例如美國專利第3,817,837號；3,850,752號； 3,939,350號和3,996,345號°任何本發明之肽體均可包括一、二或多個這些標記的任一個。製造肤的方法可使用各式各樣在此項技藝中已知的技術，來產製本發明的肽。例如，可根據傳統的技術，在溶液中，或在固相支撐物上合成這類肽。有各種市售的自動合成器，並可根據已知的草案使用之。參見，例如Stewart和Young (在前） ;Tam等人，J. Am. Chem. Soc.，105:6442 (1983); Merrifield， Science 232:341-347 (1986); Barany 和 Merrifield，The

Peptides, Gross 和 Meienhofer 編輯，Academic Press，New York，1-284; Barany等人，1111;.<!.?6卩.？1*〇161111168.，30:705-739 (1987);以及美國專利第5,424,398號，分別以引用的方式併入本文中。固相肽合成法使用含有0.1-1.0 mM胺/克聚合物的共聚（苯乙烯-二乙烯苯）。這些合成肽的方法，使用乙氧羰基（t-BOC)或9-穽基曱氧羰基（FMOC)保護的a-胺基基團。兩種方法均涉及逐步合成，藉此在每個步驟中，從肽之C-終端 -開始加入單一的胺基酸（參見，Coligati等人，Curr_ Prot. O:\121\121929.DOC -85 - 1336333

Immunol., Wiley Interscience, 1991，單元 9)。在完成化學合成時，可將合成的肽脫保護，以便移除卜B0C4FM0c 胺基酸阻斷基團，並藉著在降低的溫度下以酸處理，從聚合物中切開（例如液態HF-10%茴香醚，在ye下大約〇 25至大約1小時）。在蒸發試劑之後’利用1%乙酸溶液，從聚合物中萃取肽’然後冷凍乾燥’產生粗製的物質。可藉著諸如在交聯葡聚糖G-15上，使用5%乙酸作為溶劑的凝膠過濾之類的技術，正常地純化該粗製物質。管柱之適當溶離份的冷凍乾燥，將產生均質的肽或肽衍生物，然後可藉著諸如胺基酸分析、薄層層析、高效率液相層析、紫外線吸收光譜、莫耳旋光、溶解性之類的標準技術，《出特徵，並藉著固相Edman降解作用定量。

亦可利用其他方法，像是從噬菌體展示庫中選擇肽。可從按照在本文中之描述的胺基酸組，來製備庫。嗟菌體展示在確認可根據本發明使用的肽上，可能是特別有效的。簡言之，製備嗟菌體庫（使用例如mll3fdU喔菌體），展示從4至大約議胺基酸殘基的插入物。該插人物可代表例如個疋王退化或偏愛的陣列。然後可選擇攜帶喔菌體的插入物，其與想要的抗原結合。可經由數次再選擇與想要抗原結合之噬菌體的回合，重覆誃、導致富含攜帶特殊序列的噬菌體 _ 、的回合 J的嗟菌體。可進行DNA序列分柄，以便確認經表現之肽的序列。列的最小錢料。可合之序用含有插入物之偏愛的庫重覆姑過程，該插入物含有部分戋重覆該刀次全部的最小直線部分，加

O:\121\121929.DOC * 86 · 1336333 多個額外的退化殘基上游，或其下游。這些技術可確認本發明之肽’仍對Ang-2具有比業已在本文中確認之製劑更大的結合親和力。與製備肽的方式無關，可使用標準重組DNA程序，來產製編碼每個這類肤和肤體的核酸分子。可適當地操縱這類 DNA分子的核#㈣列’不需改變其編碼的胺基酸序列，以便說明核酸密碼的簡併，並說明在特定宿主細胞中的密碼子優勢。重組的DNA技術是製備本發明之全長肽體和其他大蛋白質專一結合劑，或其片段的便利方法。可將編碼肽體或片段的DNA分子插入表現載體内，其可依序再被插入宿主細胞内，來產製抗體或片段。一般而言，可使用在本文中，在實例中描述的程序，獲得編碼肽或肽體的DNA分子。探針和典型的雜交條件，是諸如在 Ausubel 等人（Current Protocols in M〇iecular

Biology，Current Protocols Press [1994])中陳述的那些。在雜交之後，可在適當的嚴格度下沖洗探測到的墨點，將視諸如探針尺寸、預期之探針對純種系的同種性、待篩選之庫的·類型，以及待篩選之純種系的數目之類的因素而定。高嚴格度筛選的實例為在50-65 °C之間的溫度下，〇 ! χ SSC和 0.1% SDS。亦可使用酵母菌兩個-雜化物的篩選方法，來確認與 Ang-2結合的本發明之肽。因此，可使用抗原或其片段來篩選肽庫，包括噬菌體展示庫’以便確認和選擇A%]锋 O:\121\121929.DOC -87 _ 1336333 合劑’例如本發明之肽體。或者’可利用各種表現載體/宿主系統，容納並表現本發明之肽。這些系統包括但不限於微生物’像是以重組嗟菌體、質體或接合質體DNA表現載體轉化的細菌；以酵母菌表現載體轉化的酵母菌；以病毒表現載體（例如桿狀病毒）轉移感染的昆蟲細胞系統；以病毒表現載體（例如花椰菜花葉病毒，CaMV ;煙草花葉病毒，TMV)轉移感染，以

及以細菌表現載體（例如Ti或pBR322質體）轉移感染的植物細胞系統，或哺乳動物細胞。在重組蛋白質產製中有用的哺乳動物細胞，包括但不限於VER〇細胞、HeLa細胞、中國倉鼠卵巢（CHO)細胞株、C〇s細胞（像是c〇s_7)、wiy 、ΒΗΚ、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、 K562和293細胞。在後文中描述重組表現肽的代表性草案。

"表現載體"一詞意指質體、噬菌體、病毒或載體，以便從DNA (RNA)序列中表現多肚。表現載料包括轉錄單元 ’包括（1)在基因表現中具有調節角色的遺傳元件或元件（們），例如啟動基因或促進序列，⑺編碼結合劑的結構或序列，將其轉錄成mRNA，再轉譯成蛋白質，以及（3)適當之轉錄開始和終止序列的集合。想要在酵母菌或真核生: 表現系統中使用的結構單位，最好包括能夠由宿主細胞將所轉譯之蛋白質分泌至細胞外的前導序歹卜或者，在無前導或運送序列’表現重組蛋白質之處，可包括胺基終端的甲硫胺醯錢基。㈣可以或可^從所表現之重組蛋白質中切開該殘基，提供最終的肽產物。

〇：U21\121929.DOC •88· 1336333 例如’可使用市售的表現系統，例如Pichia Expression

System (Invitrogen，San Dieg〇, cA)，依據製造者的指示，在酵母菌中以重組的方式表現肽。該系統亦依賴先（pre)_ 别（pro)-a系統來指揮分泌，但插入物的轉錄作用，則在藉著甲醇誘導時由醇氧化酶（alc〇h〇1 〇xidase)(A〇xl)啟動基因來推動。藉著例如用來從細菌和哺乳動物細胞上清液中，純化肽的方法，從酵母菌生長培養基中純化已分泌的肽。或者’亦可將編碼肽的cDNA選殖到桿狀病毒表現載體 PVL1393 (PharMingen，San Diego, CA)内。可根據製造者的指引（PharMingen)使用該載體，在不含sF9蛋白質之培養基中感染秋黏蟲（Spodoptera frugiperda)細胞，並產生重組的蛋白質》可使用肝素-遠脂糖管柱（pharmacia)，從培養基中純化並濃縮該重組蛋白質。或者，可在昆蟲系統中表現肽。可供蛋白質表現之昆蟲系統疋熟諳此藝者已熟知的。在一種這類系統中，可使用首藉尺蠖顆粒體病毒（Aut〇grapha calif〇rnia nUClear polyhedrosis virus)(AcNPV)作為載體，在秋黏蟲細胞或夜蛾（Trichoplusia)幼蟲中表現外來基因。可將肽密碼序列選殖到病毒的非必要區域内，像是多面素（p〇lyhedrin)基因，並放在多面素啟動基因的控制之下。該肽的順利插入，將使多面素基因成為無活性#，並i生缺乏外殼蛋白殼的重組病t。可使用該重組病毒來感染秋黏蟲細胞或夜蛾幼蟲 ’在其中表現該肤。Smith等人，丁 vir〇1 46:584 (1983); O:\121\121929.DOC 〇〇 1336333

Engelhard 等人，Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 91:3224-7 (1994)。在其他實例中，可藉著PCR擴大編碼肽的DNA序列，並選殖到適當的載體内，例如pGEX-3X (Pharmacia)。設計 pGEX載體，產生包括由該載體編碼之穀胱甘肽-S-轉移酶 (GST)，以及由插入載體之選殖位置内的DNA片段編碼之蛋白質的融合蛋白質。可產製PCR用的引子，包括例如適當的切開位置。在單獨使用融合部分，以便促進表現，或另外不想要附接感興趣的肽之處，可從融合蛋白質之GST 部分中切開重組的融合蛋白質。將PGEX-3X/專一結合劑肽構築體轉化至大腸桿菌XL-1 Blue細胞（Stratagene, La Jolla CA)内，分離各別的轉化物，並使其生長。可純化得自各別轉化物的質體DNA，並使用自動定序器部分地定序，以便證實編碼想要之專一結合劑的核酸插入物，以適當的方位出現。本發明的某些肽組合物是其中肽體與任何抗-腫瘤肽，像是腫瘤壞死因子（TNF)共軛的那些。在特佳的方法中，在架構中將編碼肽之序列與編碼TNF (Novagen，Madison, WI)之序列融合，以重組體融合來產製TNF-專一結合劑肽嵌合體。可將肽-TNF cDNA選殖到pET-llb載體（Novagen) 内，並可根據pETllb製造者的指示，誘導在BL21大腸桿菌中表現TNF-肽。可從細菌的溶胞產物中，藉著硫酸銨製備、在苯基-瓊脂糖6速流上的疏水性交互作用層析法、在 DEAE-瑗月旨糖速流上的離子交換層析法，和在Sephacryl- O:\121\121929.DOC -90- 1336333 S-300 HR上的凝膠過濾層析法，來純化可溶性的TNF-肽。可如下純化可在細菌中，以不溶包涵體之形式產製的融合蛋白質。可藉著離心犧牲宿主細胞；以0.15 M NaCl，10 mM Tris，pH 8，1 mM EDTA沖洗；並在室溫下以0.1毫克/ 毫升溶菌酶（Sigma，St. Louis，MO)處理15分鐘。可藉著超音波振盪使溶胞產物澄清，並藉著以12,000 X g離心10分鐘，使細胞碎屑形成小球。可將含有小球之融合蛋白質再懸浮於50 mM Tris，pH 8和10 mM EDTA中，在50%甘油上分層，並以6000 X g離心30分鐘。可將小球再懸浮於不含 Mg++和Ca++的標準磷酸緩衝生理鹽水溶液（PBS)中。可藉著在變性之SDS-PAGE中，分級分離再懸浮的小球 (Sambrook等人，在前），進一步純化融合蛋白質。可將凝膠浸於0.4 M KC1中，使蛋白質呈像，可將其切下，並在缺乏SDS之跑凝膠的緩衝溶液中進行電洗脫。如果在細菌中產生的GST/融合蛋白質為可溶的蛋白質，則可使用GST 純化基本單位（Pharmacia)純化之。可消化融合蛋白質，從本發明之肽中切開GST。可在室溫下培養消化反應（20-40毫克融合蛋白質，20-30單位人類凝血酶（4000單位/毫克，Sigma)，在0.5毫升PBS中）16-48 小時，並裝入變性的SDS-PAGE凝膠中，分級分離反應產物。可將凝膠浸於0.4 M KC1中，使蛋白質譜帶呈像。可藉著胺基酸序列分析，使用自動定序器（Applied Biosystems 473A型，Foster City，CA)，證實與肽之預期分子量一致的蛋白質譜態之身分。或者，可藉著進行肽的 O:\121\121929.DOC -91 - 1336333 HPLC及/或質譜分析，來證實其身分。或者’可將編碼肽的DNA序列選殖到含有想要之啟動基因’可視需要還有前導序列的質體内[Better等人，Science 240:1041-43 (1988)]。可藉著自動定序證實該構築體之序列。然後可使用標準程序，使用細菌的Caci2培養和熱休克處理（Sambrook等人，在前），將質體轉化到大腸桿菌品系MC1061内。可使經過轉化的細菌生長在補充有羧芊青黴素的LB培養基中，並可藉著使其在適當培養基中生長，誘導表現蛋白質的產製。如果出現前導序列，便可完成肽的分泌，並在分泌期間切開。可藉著在下文中描述的方法，從細菌培養基中純化已經分泌的重組蛋白質。表現重組蛋白質之哺乳動物宿主系統，是熟諳此藝者已熟知的。可針對加工經表現之蛋白質，或產生某些在提供蛋白質活性時有用的轉譯·後修改之特殊能力，選擇宿主細胞品系。這類蛋白質之修改包括，但不限於乙醯化作用、羧化作用、糖基化作用、磷酸化作用、脂質化作用和醯化作用。不同的宿主細胞，像是CH〇、HeLa、mdck、 293、WI3 8及其類似物，對於這類轉譯_後活性，具有特定的細胞機構和獨特的機制，並可選擇以便確保導入之外來蛋白質的正確修改和加工。希望所使用的轉化細胞，最好可供長期、高產量的蛋白貝產製，且本身穩定的表現。一旦利用含有可選擇標記’ 連同想要表現之卡匣的載體轉化這類細胞，便可容許該細

O:\121\121929.DOC -92· 1336333 胞在增強的培養基中生長1-2天’隨後再將它們轉至選擇性培養基。設計可選擇標記，賦與對選擇的抵抗力，而它的出現容許成功表現導入序列之細胞的生長和回收。可使用適合該細胞的組織培養技術’使具有抵抗力之穩定轉化的細胞叢增殖。可使用許多選擇系統，回收已經為了重組蛋白質產製而轉化的細胞。這類選擇系統包括，但不限於在tk_、hgprt_ 或aprt-細胞中，分別為HSV胸腺核苷激酶、次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖基酶，和腺嘌呤轉磷酸核糖基酶基因。亦可使用抗-代謝產物的抗藥性，作為選擇DHFR的基礎，其賦與對胺曱碟呤的抵抗力；gpt，其賦與對黴酚酸的抵抗力；neo ’其賦與對胺基糖甞G418的抵抗力，並賦與對氣硫昂（chlorsulfuron)的抵抗力；以及hygr〇,其賦與對潮黴素的抵抗力。其他可能有用的可選擇基因，包括trpB，其容許細胞使用啕哚代替色胺酸，或hisD ’其容許細胞使用組胺醇（histinol)代替組胺酸》對於確認轉化物提供可見指示的標。己包括t青素替類、β-尿甘酸酶及其受質GUS，和蟲螢光素酶及其受質蟲螢光素。專一結合劑的純化和再折疊在一些案例中，專一結合劑，像是本發明之肽及/或肽體’可能需要”再折疊"並氧化成適當的三級結構，並產生一硫鍵結，以便成為有生物活性的。可使用許多此項技藝中已熟知的程序完成再折疊。這類方法包括，例如在促溶劑的存在下，使加溶多肽製劑暴露在通常大於7的pH值下 •93·

O:\121\121929DOC 促/奋劑的選擇類似包涵體溶解所使用的選擇法，然而，、系X低辰度使用促溶劑^代表性的促溶劑為胍。在大多的if况下’再折疊/氧化作用的溶液亦將含有還原劑，加上其氧化形式，按照特定的比例，以便產生特定的氧化還原電位’容許二硫化物的洗牌，而發生半胱胺酸橋的形、二*用的氧化還原對包括半胱胺酸/胱胺、穀胱甘肽/二硫雙GSH、氯化銅、二硫蘇糖醇DTT/二遠烧DTT，乂及2-疏基乙醇（bME)/二硫_bME。在許多例子中，可使用共-溶劑，增加再折疊的效率。常用的共溶劑包括甘油、各種分子量的聚乙二醇，和精胺酸。可能想要純化本發明的肽和肽體。蛋白質純化技術是熟諳此藝者已熟知的。在一個標準上，這些技術涉及蛋白質和非-蛋白質溶離份的粗略分級分離。已經從其他蛋白質中分離出的肽及/或肽體，可使用層析和電泳技術進一步純化感興趣的肽或肽體，達成部分或完全的純化（或同質性的純化）。特別適合製備本發明之肽或肽體的分析方法，疋離子父換層析法、排阻層析法；聚丙烯醯胺凝膠電泳 ;等電聚焦。本發明在某些方面係關於純化作用，且在特定的具體實施例中，為本發明之肽體或肽的實質純化作用。在本文中使用的"經過純化的肽體或肽，，一詞，企圖意指可從其他組份中分離的化合物’其中相對於其天然可獲得的狀態將肽體或肽純化成任何等級。因此，經過純化的肽或肤體，亦意指不含其可能天然存在之環境的肽體或肽。 O:\121\121929.DOC •94· 1336333 一般而言，"經過純化的"將意指已經接受分級分離，移除各種其他組分的肽或肽體組合物，且該組合物實質上仍保留其表現的生物活性。在使用，，實質上經過純化的"一詞之處，該稱呼將意指肽或肽體組合物，其中肽體或肽形成組合物的主要組份，像是構成組合物中大約5〇%、大約 6〇%、大約70%、大約80%、大約9〇%、大約％%或更多的蛋白質。各種定量肽或肽體之純化程度的方法，從本揭示内容來看，將是熟諳此藝者已知的。這些包括，例如判定活性溶離份的專一结合活性，或藉著SDS/PAGE*析評估肽或肽體在溶離份中的含量。評估肽或肽體溶離分之純度的較佳方法，是計算該溶離份的結合親和力，將其與原始萃取物之結合活性作比較，並如此計算出純化的程度，在本文中係藉著，，-倍純化數"來評估。用來代表結合活性之量的實際單位，當然將視在純化之後選用的特定測定技術，以及肽體或肽是否顯示出可檢測的結合活性而定。適用於純化作用的各種技術，將是熟諳此藝者已熟知的。這些包括，例如利用硫酸銨、PEG、抗體（免疫沉澱）及其類似物的沉澱作用，或藉著熱變性，接著離心；層析步驟，像是親和力層析法（例如蛋白質_A_瓊脂糖）、離子交換、凝膠過濾、逆相、羥基磷灰石和親和力層析法；等電聚焦；凝膠電泳；以及這類及其他技術的組合。如同在此項技藝中普遍已知的，咸相信可改變進行各種純化步驟的順序’或可省略某些步称’而Μ可產纟適合製備實質上純的 °：Μ 21\121929.DOC -95· 1336333 專一結合劑的方法β .吊不力Hu其最純的狀態來提供本發明之肽或肤體。確實，預期實質上較少的專一結合劑產物，在某些且體實施例中仍具有利用性。可藉著在組合中使用較少的純 :步驟’或藉著使用相同之共同純化計晝的不同形式，來 :成部分純化作用。例如’瞭解使用HpLc裝置來進行的陽離子·父換管柱層析法，通常將產生比使用低·壓力層析系統的相同技術更多倍"的純化。顯示出較低相對純化程度的方法，可能有利於肽或肽體的總回收，或有利於維持肽或肽體的結合活性。已知可利用SDS/PAGE的不同條件，有時明顯地改變肽或肽體的移動[Capaldi等人，Biochem· Bi〇phys Res c〇mm， 76:425 (1977)]。因此應瞭解在不同的電泳條件下，可改變經過純化或部分純化之專一結合劑表現產物的表面分子量。結合測定免疫結合測定通常使用專一地結合，且經常固定分析物標乾抗原的捕捉劑。捕捉劑是與分析物專一結合的部分。在一個本發明的具體實施例中，捕捉劑是與Ang_2專一地結合的肽或肽體或其片段《這些免疫結合測定是此項技藝中已熟知的[Asai,編輯，Methods in Cell Biology，第 37冊，Antibodies in Cell Biology，Academic Press, Inc.，New

York (1993)] 〇免疫結合測定經常使用標示劑，其將發送由捕捉劑和抗原形成之已結合複合物出現的信號。標示劑可以是一個包 O:\121\121929.DOC -96- 1336333 括已結合複合物的分子，也就是說，它可以是已標示之專一結合劑或已標示之抗-專一結合劑的抗體。或者，標示劑可以是第三個分子，通常是其他抗體，其與已結合之複合物結合。標示劑可以是’例如攜帶標記之抗-專一結合劑的抗體。第二個抗體，對已結合之複合物是專一的，可能缺乏標記，但可被對第二個抗體所屬之抗體物種專一的第四個分子結合。例如’可利用可檢測部分，像是生物素 ’來修改第二個抗體’然後使其與第四個分子結合，像是

以酵素標示之鏈黴菌抗生物素蛋白。亦可使用能夠專一地與免疫球蛋白恆定區結合的其他蛋白質作為標示劑，像是蛋白質A或蛋白質G。這些結合蛋白質是鏈球菌細菌之細胞壁的正常成分，並對得自各種物種之免疫球蛋白怪定區顯示出強的非-免疫原反應性。Akerstrom，j immunol， 135:2589-2542 (1985); Chaubert, Mod. Pathol., 10:585-591 (1997)〇

在測疋之中，可能在每次混合試劑之後，需要培養及/ 或沖洗步驟《培養步驟可從大約5秒變化至數小時，最好疋從大約5分鐘至大約24小時。然而，培養時間將視測定格式、分析物 '溶液體積、濃度及其類似者而定。通常，測定將在周圍溫度下推#，&站.+ 1 + X卜進仃，雖然亦可在一定範圍的溫度下進行。 A _非-競爭性結合測定· 免疫結合測定可以县dfc扯& … t 尺非-競爭性的類型。這些測定畫接測量被捕捉之分析物的人旦 — 的3里。例如，在一種較佳的"三明

O:\121M21929.DOC 97· 1336333 /σ測定中’捕捉劑（抗體或肽體）可直接與固體受質結合，而被固疋在那裏。然後這些已經固定的捕捉劑再捕捉（結 « )出現在受試試樣中的抗原。然後如此固定的蛋白質再與私不劑結合，像是具有標記的第二個抗體。在另一種較佳的二明治”測定中，第二個抗體缺乏標記，但可與對從其中何生第二個抗體之抗體物種專一的已標示抗體結合。亦可利用可檢測部分，像是生物素，來修改第二個抗體，而使第三個已標示分子’像是鏈黴菌抗生物素蛋白與其專地、、。合。參見Hari〇w*Lane，Antib〇dies，A Lab〇rat〇ry

Manual ’ 第 14 早 ’ c〇ld Spring Harb〇I· Laboratory，NY (1988)，以引用的方式併入本文中。 B.競爭性結合測定：免疫結合測定可以是競爭性的類型。藉著測量所加入之分析物，被出現在試樣中之分析物取代，或競爭遠離捕捉劑（抗體或肽體）的含量，間接地測量出現在試樣中之分析物的含量。在一種較佳的競爭性結合測定中，在試樣中加入通常已標示的已知含量之分析物，然後使試樣與捕捉劑接觸。已標示分析物與抗體結合的量，與出現在試樣中的分析物濃度成反比（參見Harlow和Lane，Antibodies, A Laboratory Manua卜第 14章，第 579-583 頁，在前）。在其他較佳的競爭性結合測定中，將捕捉劑固定在固體受質上。可藉著測量出現在蛋白質/抗體複合物中之蛋白質的量，或另外藉者測量仍未複合之蛋白質的量，來判定與捕捉劑結合之蛋白質的量。可藉著提供已標示的蛋白質 O:\121\121929.DOC •98· 1336333 來心測蛋白質之含量。Harlow和Lane (在前）。另一種較佳的競爭性結合測定，利用半抗原的抑制作用。在那裏，將已知的分析物固定在固體受質上。在試樣中加入已知含量的抗體，並使試樣與已經固定的分析物接觸與已固疋分析物結合之抗體的量，與出現在試樣中之分析物的含量成反比》可藉著檢測已固定之抗體溶離份，= 仍留在溶液中之溶離份的量，來檢測已固定之抗體的量。在標不抗體之處，可直接檢測，或藉著後續加入已標示部分，其按照上述專一地與抗體結合，間接地檢測之。 C ·競爭性結合測定的利用：可為了交又-反應性的判定，使用競爭性結合測定，容許熟諳此藝者判定被本發明之肽體認出的蛋白質或酵素複合物，是否是想要的蛋白質，而不是交叉_反應的分子，或判定該肽體是對抗原專一的，且不與無關的抗原結合。在這類型的測定中，可將抗原固定在固相支撐物上，並在測疋中加入未知的蛋白質混合物，其將與已固定之蛋白質競爭與該肽體的結合^競爭性分子亦與一或多個與該抗原無關的抗原結合。將蛋白質與已固定之抗原競爭該肽體結合的能力’與被固定在固相支撐物上之相同蛋白質的結合做比較’來判定蛋白質混合物的交又-反應性。 D.其他的結合測定：本發明亦提供西方墨點法，來檢測或定量Ang_2在試樣中的存在。該技術通常包括藉著凝膠電泳，以分子量為基礎’分離試樣蛋白質，並將該蛋白質移至適當的固相支撐

O:\121\121929.DOC •99· 1336333 物上’像是硝基纖維素濾紙、尼龍濾紙，或衍生的尼龍濾紙。將試樣與專一地結合Ang-2的肽體或其片段一起培養，並檢測所得的複合物。可直接標示這些肽體，或另行使用已標示之抗體，其專一地與該肽體結合，進行後續的檢測。診斷測定衍生的結合劑，像是本發明之肽和肽體或其片段，可用來診斷其特徵為Ang-2或亞單元之表現的病況或疾病，或用於監視待利用Ang-2之誘導劑、其片段、Ang-2活性之激動劑或抑制劑治療之患者的測定。Ang-2的診斷測定，包括使用肽體和標記，來檢測在人類體液或細胞或組織之萃取物中的Ang-2的方法。可使用有或無修改之本發明的肽體。在較佳的診斷測定中，將藉著附接，例如標記或報告者分子，來標不肽體。各種標記和報告者分子均是已知的，已經在本文中描述了其中的一些。本發明對於診斷人類疾病是特別有用的。各種使用對各個蛋白質專一之肽體，來測量Ang_2蛋白質的草案，為此項技藝中已知的。實例包括酵素連結之免疫吸附測定（ELISA)、放射性免疫測定（RIA)和螢光激活的細胞分類(FACS)。兩個位置、以單株為基礎的免疫測定是較佳的，其利用與在Ang_2上兩個不_抵觸之抗原決定位起反應的單株抗體，但亦可使用競爭性結合測定^在例如

Maddox等人，j. Exp. Med

Med·’ 15 8·121 1 (1983)中描述了這些測定。

O:\121\121929.DOC •100· :為了提：診斷的基礎，通常建立人類—2的正常或標準可藉著在適合複合物形成的條件下，這在此項技藝中已夫的，將仵自正常個體，最好是人類的體液或細胞萃取物’與對抗Ang-2的肽體混合，來完成該判定。可藉著比較控制和疾病試樣兩者，肽體與已知含量之Ang2蛋白 ,質的、..。合作用，來定量標準複合物形成的量。㈣，可將從正常試樣中獲得的標準值，與從來自可能受疾病影響之個體的试樣中獲得的值作比較。在標準和個體值之間的偏差’暗示Ang-2在疾病狀態中的角色。為了診斷應用，在某些具體實施例中，通常將利用可檢測部分標示本發明之肽體或肽。可檢測部分可以是任何能夠直接或間接產生可檢測信號的部分。例如，可檢測部分可以是放射性同位素，像是3H、uc、32p、35§或⑵丨，螢光或化學發光化合物，像是勞光素異硫代氰酸醋、若丹明或蟲螢光素；或酵素，像是鹼性磷酸酶、p_半乳糖苷酶或根過氧化酶。Bayer等人，Meth. Enz，184:138 163 (199〇)。疾病本發明提供與Ang-2結合的結合劑，像是肽、肽體，或其片段、變體或衍生物，其可用來治療人類疾病和病理學狀況》調節Ang-2結合活性或其他細胞活性的製劑，可與其他治療劑混合使嗷用，以便提高其治療效果或降低的副作用。 _ b 本發明一方面提供可用來治療疾病和病況的試劑和方法，該疾病和病況之特徵為在細胞中有不想要或越執程度的 O:\121\12J929.DOC -101- 1336333 包括癌症，以及其他過度增殖的狀況 '接觸性皮膚炎、免疫學的病症，以在包括人類的動物中’治療癌症的方法，括對該動物技與有效含量的專 '结合劑，像是抑制或降低Ang·2活性的肽體。本發明尚針對抑制癌細胞生長的方法’包括在生物系統中之細胞增殖、侵入性和轉移的過程

Ang-2活。這些疾病 ’像是增生、牛皮癬及不孕。法已括使用本發明之化合物作為癌細胞生長的抑制劑 °最好是在活動物中’像是哺乳動物，使用該方法來抑制或降低癌細胞生長、侵人性、轉移或腫瘤發生率。亦可迅速地改編本發明之方法，以便使用在測定系統中，例如，測疋癌細胞生長及其特性，以及確認影響癌細胞生長的化合物。可藉著本發明之方法治療的癌症，最好是發生在哺乳動物中。哺乳動物包括，例如人類和其他靈長類，以及寇物或同伴動物，像是狗和描，實驗室動物，像是大鼠、老鼠和兔子，還有農場動物，像是馬、豬、綿羊和牛。腫瘤和贅生物包括其中細胞的增加是不受控制並前進的組織細胞生長。一些這類的生長是良性的，但將其他的稱為惡性的，並可導致生物的死亡。惡性贅生物或癌症與良性生長的區別在於除了顯示攻擊性的細胞增殖之外，它們可能侵犯周圍的組織並轉移。此外，惡性贅生物之特徵為它們相對於彼此及其周圍組織，顯示出喪失較多的分化（較多的反分化）和它們的組織化。亦將該特性稱為"退行發育、 O:\121\121929.DOC -102- 可藉者本發明治療的贅生物亦包括固體腫瘤，也就是癌和肉瘤。癌包括衍生自上皮細胞的那些惡性贅生物，其浸潤(侵犯)周圍組織’並引起轉移。腺癌是衍生自腺體組織的癌’或其形成可認出的腺體結構。其他廣泛的種類或癌症’包括肉瘤’其為腫瘤，它的細胞被埋入原纖維或均一的物質中，像是胚胎的結締組織。本發明亦能夠治療骨髓或淋巴系統的癌症，包括白血病'淋巴瘤和其他通常不是以腫瘤團塊之形式出現’但是被散布在血管或淋巴網狀系統中的癌症。可根據本發明服從治療之癌症或腫瘤細胞的類型，包括例如產生ACTH的腫瘤、急性淋巴細胞白血病、急性非淋巴細胞白血病、腎上腺皮質的癌症、膀胱癌、腦癌、乳癌、子宮頸癌、慢性淋巴細胞白血病、慢性骨髓細胞白血病、結直腸癌、皮膚的T-細胞淋巴瘤、子宮内膜癌、食道癌、尤英氏（Ewing’s)肉瘤、膽囊癌、毛細胞白血病、頭和頸部的癌症、霍奇金氏（Hodgkin’s)淋巴瘤、卡波西氏 (Kapos^s)肉瘤、腎癌、肝癌、肺癌（小細胞和非-小細胞）、惡性腹腔積液、惡性胸腔積液、黑色素瘤、間皮瘤、多發性骨髓瘤、神經胚細胞瘤、神經膠質瘤、非-霍奇金氏淋巴瘤、骨肉瘤、卵巢癌、卵巢（生殖細胞）癌、胰臟癌、陰莖癌、前列腺癌、視網膜胚細胞瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、睪丸癌、曱狀腺癌、滋養層的資生物、子宮癌、陰道癌、外陰的癌症和腎母細胞瘤。關於某些類型以實驗定義之癌症的治療，在本文中特$ O:\I21\121929.DOC -103· =釋本發明。在這些解釋性㈣射，已較㈣準的現之最尚技術的在活體外和在活體内m使用這此方法來確認預期它在活體内之治療攝生法中是有效的製劑。然而’應瞭解本發明之方法不限於這些腫瘤類型的治療，而延伸至來自任何器官系統的任何固體腫瘤。其侵入性或轉移與Ang·2表現或活性有關的癌症，特別容易受到本發明的抑制，或甚至引起其退行。

亦可藉者包括本發明化合物，像是肽體，與其他抗_癌症之化學治療劑混合，像是任何傳統的化學治療劑，來實行本發明。I一結合劑與這類其他製劑的⑧合，可產生化學治療草案的效力。許多化學治療草案將依熟諳此藝者的想法呈現它們自& ’而能夠併入本發明之方法中。可使用任何化學治療齊I ’包括焼基化製劑、抗·代謝產物、荷爾蒙和括抗劑、放射性同位素，以及天然的產物。例如，可將本發明之化合物與抗生素混合，像是阿黴素和其他氨菌環黴素類似物，氮芥，像是環磷醯胺，嘧啶類似物，像是 5-氟尿嘧啶、順氣氨鉑（cisplatin)、羥基脲、紫杉醇（hxw) ，及其天然和合成的衍生物，及其類似物。像其他實例一樣，在混合腫瘤的案例中，像是乳房的腺癌，其中腫瘤包括促性腺激素-依賴性和促性腺激素_獨立性的細胞，可連同亮丙里德（leuprolide)或戈舍瑞林（g〇sereUn)(LH RH之合成的肽類似物）一起投與化合物。其他的抗贅生物草案包括使用四環素化合物與其他的治療用藥程式，例如手術、放射線等等，在本文中亦稱為"輔助的抗贅生物用藥程式" O:\121\121929.DOC •104· 1336333 。因此，本發明之方法可與這類傳統攝生法一起使用，具有降低副作用和提高效力的優點。

因此，本發明提供可用來治療各種癌症的組合物和方法，包括固體腫瘤和白血病。可治療之癌症的類型，包括但不限於.乳房、前列腺和結腸的腺癌；所有形式的肺臟之支氣官源的癌症；骨髓的；黑色素瘤；肝腫瘤；神經胚細胞瘤’乳頭狀瘤；胺前體攝取與脫羧細胞瘤；迷行瘤；鰓原瘤；惡性的類癌徵候群；類癌心臟病；癌（例如沃克 (Walker)、基底細胞、基底鱗狀細胞、布朗皮爾斯 (Br〇wn-Pearce)、導管的、艾瑞區（EhrUch)腫瘤、克瑞伯茲（Krebs) 2、默寇（Merkel)細胞、黏蛋白的、非·小細胞肺、燕麥細胞 '乳頭狀的、硬癌的、細支氣管的、支氣管源的、鱗狀細胞和移行細胞）；組織細胞的病症；白血病；惡性的組織細胞增生；霍奇金氏症；免疫增殖性小肺臟細胞癌’非-霍奇金氏的淋巴瘤；漿細胞瘤；網狀内皮增殖黑色素瘤；軟骨母細胞瘤；軟骨瘤；軟骨肉瘤；纖維纖維肉瘤；巨細胞腫瘤；組織細胞瘤；脂肪瘤；脂肉間皮瘤；黏液瘤；黏液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；軟骨瘤 ;顱咽瘤；無性細胞瘤；錯構瘤；間葉瘤；中腎瘤；肌肉瘤；釉質母細胞瘤；齒堊質瘤；齒瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；痛風石胚的腫瘤（t〇ph〇blastic tumor)。此外，亦可治療下列類型的癌症：腺瘤；膽管瘤；膽硬脂瘤；圓柱瘤；囊腺癌’囊腺瘤；粒層細胞腫瘤；兩性胚細胞瘤，·肝腫瘤；汗腺腺瘤；胰島細胞瘤；萊狄吉（Leydig)細胞瘤；乳頭狀瘤 O:\121\121929.DOC •105· 1336333 ;賽托利（Sertoli)細胞瘤；卵泡膜細胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；肌胚細胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；橫紋肌瘤；橫紋肌肉瘤；室管瘤；神經節瘤；神經膠質瘤；神經管胚細胞瘤；腦膜瘤；神經鞘瘤；神經母細胞瘤；神經上皮瘤；神經纖維瘤；神經瘤；副神經節瘤；非嗜路性副神經節瘤；也管角化瘤；血管淋巴樣增生伴嗜曙紅細胞增多症；硬化性血管瘤；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；

企管外皮細胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果體瘤；癌肉瘤；軟骨肉瘤；葉狀囊肉瘤；纖維肉瘤；金管肉瘤；平滑肌肉瘤；白企病性肉瘤；脂肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；黏液肉瘤；卵巢癌；橫紋肌肉瘤；肉瘤；贅生物；多發性神經纖維病和子宮頸發育不全。

本發明的其他-觀點是使用本發明的材料和方法，預防及/ 或治療任何皮膚之過度增殖的狀況，包括牛皮癣和接觸性皮膚炎’或其他過度增殖的疾病。已證實罹患牛皮癬和接觸性皮膚炎的患者，在這些病變中具有升高的Ang2活性 [Ogoshi等人，J· Inv. Dermatol.，11〇:818_23 (1998)]。最好是，將對Ang-2專一的專一結合劑與其他的藥理學製劑混合使用，來治療表現這些臨床症狀的人。可使用各種載劑的任一種’經由在本文中描述的，卩及其他熟諸此藝者已熟知的投藥途徑，來遞送專一結合劑。血管生成作用的視與年齡有關的黃斑像是子宮内膜異位本發明的其他觀點包括治療各種涉及網膜病變（包括糖尿病性視網膜病變和變性），以及雌性生殖道的病症/疾病， O:\121\121929.DOC •106· 1336333 症、子宮纖維樣，以及在雌性生殖周期中，其他與血管增殖功能障礙有關的這類病況（包括子宮内膜微血管生長）。本發明的其他觀點係關於治療異常的血管生長，包括大腦動靜脈畸型（AVMs)'胃腸道黏膜傷害和修補、在具有消化性潰瘍疾病之病史的患者中’胃十二指腸黏膜的潰瘍，包括起因於猝發的局部缺血，在罹患非_肝臟門靜脈壓過尚的患者中，在肝病和門靜脈壓過高時的廣泛肺血管病症。本發明的其他觀點是使用由本發明提供之組合物和方法來預防癌症。這類試劑將包括專一結合劑，像是對抗Ang_ 2的肽體。醫藥組合物

Ang-2專一結合劑，像是肽體的醫藥組合物，是在本發明的範圍内。醫藥組合物包括在例如Lam等人，於2〇〇1年 1月9日發證之美國專利第6，171，586號中詳細描述的抗體。這類組合物包括在治療上或在預防上有效之含量的專一結合劑，像是如同在本文中描述的抗體或其片段、變體、衍生物或融合蛋白質，並與在藥學上可接受的製劑混合。在杈佳的具體實施例中，醫藥組合物包括拮抗的專一結合劑，其部分或全部地調節至少一種Ang_2的生物活性，並與在藥學上可接受的製劑混合。通常，為了投與動物將充份地純化該專一結合劑。醫藥組合物可含有調配物質，以便修改、維持或保留例如該組合物的pH值' 滲透性、黏度、澄清度、顏色、等張

O:\121\121929.DOC -107· 性、味道、無菌性、穩定性、溶解或釋放、吸收或穿透的速率。適當的調配物質包括，但不限於胺基酸（像是甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸）；抗微生物製劑；抗氧化劑（像是抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉） ;緩衝溶液（像是硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽；其他的有機酸類）；填充劑（像是甘露糖醇或甘胺酸）；螯合劑[像是乙二胺四乙酸（EDTA)];錯合劑（像是咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-環糊精或羥丙基環糊精） ;填料；單醣類；雙醋類和其他的碳水化合物（像是葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白質（像是血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白）；色素；調味劑和稀釋劑；乳化劑；親水性聚合物（像是聚乙稀扯洛烧酮）；低分子量的多肽；形成鹽的抗衡離子（像是鈉）；防腐劑（像是氣化苯甲烴銨、苯甲酸、水揚酸、乙基采硫代水楊酸納、苯乙醇、對經苯甲酸甲醋、對羥苯甲酸丙酯、氣己定（chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫）；溶劑（像是甘油、丙二醇或聚乙二醇）；糖醇類（像是甘露糖醇或山梨糖醇）；懸浮劑；表面活性劑或濕潤劑（像是普魯尼克（pluronics)、PEG、脫水山梨糖醇§旨、多乙氧基趟類，像是多乙氧基謎20、多乙氧基謎8〇、=通三甲醇氨基甲烧（tromethamine)、卵磷脂、膽固薛、啤'、泰洛沙泊（tyloxapal));穩定性促進劑（蔗糖或山梨糖醇）；張力促進劑（像是鹼金屬齒化物（最好是氯化鈉或鉀）、甘露糖醇、山梨糖醇）；遞送媒劑；稀釋劑；賦形劑及/或藥學佐劑。(Remington's Pharmaceutical Sciences，第 18 版，欣，A.R· O:\121\121929.DOC •108· 1336333

Gennaro編輯，Mack Publishing Company, 1990) 0 最適切的醫樂組合物將由熟諳此藝者依據例如期待的投藥途徑、遞送格式，和想要的劑量來判定。參見，例如 Remington's Pharmaceutical Sciences，在前。這類組合物可影響專一結合劑的物理狀態、穩定性、在活體内的釋放速率’和在活體内的清除速率。在醫藥組合物中，主要的媒劑或載劑之性質可以是含水的或不-含水的。例如，適當的媒劑或載劑可以是注射用水、生理鹽水溶液或人造的腦脊髓液，可能補充有其他經常在非經腸投藥之組合物中使用的物質。中性緩衝之鹽水或與jk清白蛋白混合的鹽水，是更具代表性的媒劑。其他代表性的醫藥組合物包括大約pH 衝溶液，或pH 4.0-5.5的醋酸緩衝溶液，其尚可包括山梨糖醇或其適當之取代物。在本發明的一個具體實施例中，藉著將所選擇、具有想要純度的組合物與任意的調配劑 (Remingtons Pharmaceutical Sciences ,在前）混合，以冷凍乾燥餅或含水溶液之形式，製備可供儲存的結合劑組合物。此外，可使用適當的賦形劑，像是蔗糖，將結合劑產物調配成冷凍乾燥物。可選擇醫藥組合物以供非經腸遞送。或者，可選擇組合物以供吸入或經腸遞送，像是口服、經耳、經眼、經直腸或經陰道。這類在藥學上可接受之組合物的製備在此項技藝的技術範圍内。調配組份以投藥部位可接受的濃度存在。例如，使用緩

O:\121\121929.DOC -109- /下，液a將組' 合物維持在生理學的pH值，或稍低的？)11值通吊疋在從大約5到大約8的pH值範圍内。止圖非經腸投藥時，在本發明中使用的治療組合物可 ^無㈣、非經料接受之含水職的形式，在在藥學 :可接受的媒劑中’包括想要的專一結合劑。特別適合非射的媒劑為無菌的蒸餾水，在其中將結合劑調配成適合保存的無菌、等張之溶液。另—種製品可涉及與諸如 :主射的中心體、生物可腐蝕的顆粒、聚合化合物(聚乳聚乙醇馼）、小珠或微脂粒之類的製劑，一起調配想要的分子，其提供產物的控制或持續釋放，然後可經由積儲注射遞送它們。亦可使用透明質酸，而這具有在循環中增進持續期間的效果。其他導人想要分子的適#方法，包括植入藥物遞送裝置。在其他方面可在含水溶液中調配適合非經腸投藥的醫藥調配物，最好是在生理學上可相容的緩衝溶液_，像是漢克氏（Hants)溶液、林格氏液或在生理學上經過緩衝的溶液。含水的注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度的物質，像是羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚醣。或者，可將活性化合物的懸浮液製備成適當的油性注射懸浮液。適當的親脂性溶劑或媒劑，包括脂油，像是芝麻油，或合成的脂肪酸酯，像是油酸乙酯、三酸甘油酯或微脂粒。亦可使用非-脂質聚陽離子的胺基聚合物來進行遞送。該懸浮液亦可視需要含有適當的穩定劑，或增加化合物溶解度的製劑，並容許製備極高濃度的溶液。 O:\121\121929.DOC 110 ^336333 在其他的具體實施例中，可調配吸入用的醫藥組合物。例如’可將結合劑調配成吸入用的乾粉。亦可為了氣溶膠的遞送’利用推進劑來調配多肽或核酸分子的吸入溶液。在另一個具體實施例中，可將該溶液霧化。在pct申請案第PCT/US94/001875號中’進一步描述了肺臟投藥，其描述以化學方式修改之蛋白質的肺臟遞送。亦嘗試可口服投與某些調配物。在本發明的一個具體實

施例_，以該方式投與的結合劑分子，可與或不與習慣上在混合固體劑量形式，像是錠劑和膠囊時使用的那些載劑一起調配《例如，可將膠囊設計成在胃腸道中某處釋放調配物之活性部份，此時生物利用性最高，而前-全身性的降解作用最低。可含有額外的製劑，以便促進結合劑分子的吸收《亦可使用稀釋劑、調味劑、低熔點的蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、錠劑崩解劑和黏合劑。亦可使用在此項技藝中已熟知的在藥學上可接受之载劑 ’以適合口服投藥之劑量，來調配可供口服投藥的醫藥組合物。這類載劑得以將醫藥組合物調配成錠劑、藥丸’、'糖衣鼓、膠囊、液體、凝膠、糖漿、於漿、懸浮液及其類似物，以供患者攝取。 ' ° 嚴加工所餐顆粒混合物（可視需要在磨碎之後），獲得錠劑或糖衣金心，而獲得口服使用蝻醫藥組合物。如果想要，可加> 當的辅助劑。適當的賦形劑包括碳水化合物或蛋，像是糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨 O:\121\121929.DOC •111· 1336333 自玉米、小麥、稻米、馬鈴薯或其他植物的搬粉；纖維素，像是甲基纖維素、羥丙基曱基_纖維素或羧甲基纖維素鈉；樹膠類，包括阿拉伯樹膠和黃蓍膠；以及蛋白質，像是明膠和膠原蛋白。如果想要，可加入崩解劑或加溶劑，像是交聯的聚乙烯-吡咯烷酮、瓊脂和藻酸，或其鹽類，像是藻酸鈉。可連同適當的塗膜一起使用糖衣錠核心，像是濃縮的糖溶液’其亦可3有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙締吨洛院剩、卡波醇（carbopol)凝膠、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆溶液和適當的有機溶劑或溶劑混合物。可在錠劑或糖衣錠塗膜中加入染料或色素，用來確認產物，或用來顯示活性化合物的含量特性，也就是劑量。可口服使用的醫藥製品亦包括推入配合的明膠製造之膠囊，以及以明膠製造之軟的密封膠囊，和塗料，像是甘油或山梨糖醇。推入配合的膠囊可含有活性成分，與填料或粘合劑’像疋乳糖或澱粉，潤滑劑，像是滑石或硬脂酸鎂混合，並可視需要還有穩定劑。在軟膠囊中，可將活性成分溶解或懸浮於適當的液體中，像是脂油、液體，或液體聚乙二醇，可有或無穩定劑。其他的醫藥組合物可涉及在帶有適合製造錠劑的無毒性賦形劑之混合物中的有效含量之結合劑。藉著將該錠劑溶解於無菌的水’或其他適當的媒劑中，可製備單位劑量形式的溶液。適當的賦形劑包括，但不限於惰性稀釋劑，像疋礙酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或填酸鈣；或粘合劑

0:\121\121929.D0C -112- ’像是澱粉、明膠或阿拉伯樹膠；或潤滑劑，像是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。額外的醫藥組合物對於熟諳此藝者而言將是明顯的，包括涉及以持續-或控制-遞送之方式調配結合劑分子的調配物。調配各種其他的持續-或控制-釋放方法的技術，像是微脂粒載劑、生物可腐蝕的微顆粒，或多孔小珠和積儲注射，亦是熟諳此藝者已知的。參見，例如PCT/US93/00829 ，描述用來遞送醫藥化合物之控制釋放的多孔聚合微顆粒。持續-釋放之製品的其他實例，包括半透性的聚合物基質，以成形物件的形式，像是薄膜或微膠囊。持續釋放的基質可包括聚酯、水膠體、聚交酯（美國專利第3,773 919 號’歐洲專利58，4 81號）、L-穀胺酸和γ乙基·縠胺酸酯的共聚物[Sidman等人，Biopolymers，22:547-556 (1983)]、聚 (2-羥乙基-異丁烯酸酯）[Langer 等人，J· Biomed. Mater. Res” 15:167-277，（1981)]和[Langer 等人，Chem· Tech.， 12:98-105 (1982)]，乙稀乙酸乙稀酯（Langer等人，在前）或聚-D(-)-3-羥基丁酸（歐洲專利133,988號）。持續-釋放之組合物亦包括微脂粒，可藉著任何此項技藝中已知的數種方法來製備之。參見，例如Eppstein等人，Proc. Natl. Acad.

Sci. (USA)，82:3688-3692 (1985);歐洲專利 36,676號；歐洲專利88,046號；歐洲專利143,949號。欲用於活體内投藥的醫藥組合物，通常必須是無菌的。這可藉著通過無菌過濾膜過濾而達成。在組合物被冷凍乾燥之處’可在冷凍乾燥和重建之前或之後，進行使用該方 0:\121\121929.D0C •113- 1336333 法之滅菌作用。可以冷來乾燥之形式，或以溶液形式儲存非經腸投藥的組合物。此外，通常將非經腸植合物放在且有滅菌接頭的容器中，例如靜脈内的溶液袋，或具有可被皮下注射針頭刺穿之塞子的小瓶中。一旦已經調配好醫藥組合物，便可轉液、懸浮液、凝膠、礼劑、固體，或脫水或冷束乾燥散劑的形式，將其儲存在滅菌的小瓶中。可以隨時可使用之形式，或在投藥之前需重建（例如冷康乾燥）的形式，儲存這類調配物。在特定的具體實施例中，本發明針對產生單一-劑量之投=單位的套組。#組可分別I有第一個具有脫水蛋白質的谷器，以及第二個具有含水調配物的容器。在本發明的範圍内亦包括含有單一和多個·分開隔間之預先裝填的注射器（例如液體注射器和溶解注射器（ly〇syring))的套組。在治療上使用之醫藥組合物的有效含量，將視例如治療之前後關係和目標而定。熟諳此藝者將瞭解適合治療之劑量含量，因此一部分將依據遞送之分子、欲使用結合劑分子的適應症、投藥的途徑，以及患者的尺寸（體重、體表面積或器官尺寸）和狀況（年齡和一般的健康）而改變。因此 δ»床醫師可滴疋劑量，並修改投藥的途徑，以便獲得最佳的治療效果。代表性的劑量，範圍可從大約〇1毫克/公斤到高達大約1〇〇毫克/公斤或更多，視上文提及的因素而定。在其他的具體實施例中，劑量範圍可從〇丨毫克/公斤同達大約100毫克/公斤；毫克/公斤高達大約1〇〇毫克/ 公斤；或5毫克/公斤高達大約100毫克/公斤。

〇：M21\121929.DOC -114- 對於任何化合物，一開始可先在細胞培養測定中，或在諸如老鼠、大鼠、兔子、狗、豬或猴子之類的動物模式中建立在治療上有效之劑量。亦可使用動物模式來判定適备的濃度範圍和投藥途徑。然後可使用這類資訊來判定在人類中有用的劑量和投藥途徑。將從與需要治療之個體有關的因素，來判定精確的劑量。調整劑量和投藥，以便提供充分含量的活性化合物，或維持想要的效果。可考慮的因素包括疾病狀態的嚴重性、個體的一般健康狀況、個體的年齡、體重和性別、投藥的時間和頻率、藥物之組合（們）、反應敏感性和對治療之反應。長期作用的醫藥組合物’可每隔3至4天、每週或兩週一次投與’將視特定調配物之半衰期和清除速率而定。投藥的頻率將視在調配物中使用之結合劑分子的藥物動力學參數而定。通常投與組合物，直到達到獲得想要效果的劑量為止。因此，可在一段時間内，以單一劑量或多個劑量（以相同或不同的濃度/劑量），或以連續輪液之方式投與組合物。例行地更詳細地討論適當的劑量。可經由使用適當的劑量-反應資料，來探查適當的劑量。醫藥組合物的投藥途徑，係根據已知的方法，例如口月艮、經由靜脈内注射、腹腔内、大腦内（實質内）、腦室内、肌肉内、眼内、動脈内、門脈内（intraportal)、病灶内的路徑、脊髓内、鞘内、心室内、經皮、皮下、腹腔内、鼻内、經腸、局部、舌下、尿道、陰道或直腸之方式，藉著持續釋放的系統’或藉著植入裝置。在想要之處，可藉著團 O:\12IM21929.DOC -115- 塊注射或連續輸液，或藉著植入裝置投與該組合物。另外或額外地，亦可經由將膜、海綿，或其他已經在其中吸附或包封想要分子的適當物質植入，局部投與該組合物。在使用植入裝置之處，可將該裝置植入任何適當的組 j或器官中，並可經由擴散、按時釋放之團塊，或連續投藥’來遞送想要的分子。在某些情况下，可能想要以在活體外之方式，使用醫藥 # '組合物。在這類例子中’冑已經從患者中移出的細胞、組織或器官暴露在醫藥組合物了，隨後再將該細胞、組織及/ 或益g移植回患者内。在其他的案例中，可藉著植入某些已經使用像是在本文中描述的那些方法，以遺傳之方式設計，以便表現和分泌該多肽的細胞，來遞送本發明之結合劑，像是肽體。這類細胞可以是動物或人類的細豸，並可以是自㈣異種的或八種的該細胞可視需要為永存不死的。為了降低免疫 φ 學反應的改變，可將細胞包膠，以避免周圍組織的浸潤。包膠的材料通常是生物可相容的、半_透性的聚合封入物或膜，其容許蛋白質產物（們）的釋放，但防止該細胞被患者的免疫系統，或被其他來自周圍組織的有害因素破壞。混合治療本發明之專一結合劑，像是肽體，可與其他治療與 2表現有關之疾病的治療劑一起使用。這些其他的治療劑包括，例如玫射線治療、化學治療，以及瞄準治療，像是 -HercepUn™、RituxanTM、⑴eevecTM及其類似物。在本文

O:\121M21929.DOC -116- 中未特別列舉其他的混合治療，亦在本發明的範圍内。化學治療可使用抗-贅生物製劑，包括例如烷基化製劑 ’包括氣介’像是氮芥（mechl〇rethamine)、環填醯胺、異環磷醯胺（ifosfamide)、苯丙胺酸氮芥（melphalan)和苯丁酸氮芥（chlorambucil);亞硝基脲，像是亞硝基脲氮芥 (BCNU)、洛莫司汀（l〇mustine)(CCNU)和西莫司汀 (semustine)(曱基-CCNU);氮丙啶/甲基蜜胺，像是三伸乙基蜜胺（TEM)、三伸乙基硫代磷醯胺（嘧替派（thiotepa))、六甲基蜜胺（HMM，六甲蜜胺）；烷基磺酸酯，像是白消安 (busulfan);三畊，像是甲嗪咪唑胺（dacarbazine)(DTIC); 抗代謝產物，包括葉酸類似物，像是胺曱碟呤和三甲曲沙 (trimetrexate) ’嘧啶類似物，像是5-氟尿嘧咬、氟脫氧尿甞、吉西他濱（gemcitabine)、阿拉伯糖胞甞（AraC，胞嘧啶糖茹）、5-氮胞甞、2,2'-二氟脫氧胞苷，嘌呤類似物，像是 6-巯基嘌呤、6-硫代烏嘌呤、硝基脒唑硫嘌呤、2'-脫氧助間型黴素（喷司他丁（pentostatin))、紅經基壬基腺嗓呤 (erythrohydroxynonyladenine)(EHNA)、麟酸氟達拉濱 (Fludarabine phosphate)和 2-氣脫氧腺：y：(克拉君賓 (cladribine) ’ 2-CdA);天然產物，包括抗-有絲分裂藥物，像是紫杉酵（paclitaxel)、長春花生物驗，包括長春花驗 (VLB)、長春新驗和長春瑞賓（vinorelbine)、勉癌易、雌莫司丁（estramustine)和雌莫司丁磷酸酯；表鬼臼素 (epipodophyllotoxins)，像是依托泊嘗（etoposide)和替尼泊替（teniposide);抗生素，像是放線菌素D、道諾黴素（紅比 O:\121\121929.DOC -117- 1336333 黴素）、阿徽素、米托惠酿（mitoxantrone)、伊達比星 (idarubicin)、博菜徽素、普卡徽素（plicamycin)(光神黴素）、絲裂黴素C和放線菌素；酵素，像是L-天冬醯胺酶；生物反應修改劑，像是干擾素-a、IL-2、G-CSF和GM-CSF ; 雜項的製劑，包括鉑配位錯合物，像是順氯氨鉑和卡鉑 (carboplatin)，慈二酮，像是米托惠自昆，經取代之脲，像是羥基脲，甲基肼衍生物，包括N-曱基肼（MIH)和丙卡巴肼（procarbazine)，腎上腺皮質抑制劑，像是米托坦 (mitotane) (o，p’-DDD)和氨魯米特（aminoglutethimide);荷爾蒙和拮抗劑，包括腎上腺皮質類固醇拮抗劑，像是脫氫可的松和相等物，地塞米松和氨魯米特；黃體製劑，像是己酸經孕 _ (hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲經孕酮 (medroxyprogesterone acetate)和醋酸曱地孕酮（megestrol acetate);雄激素，像是己稀雌醇（diethylstilbestrol)和炔雌醇（ethinyl estradiol)相等物；抗雌激素，像是他莫昔芬 (tamoxifen);雄激素，包括睪固酮丙酸酯和氣甲睪酮 (fluoxymesterone)/相等物；抗雄激素，像是1他胺 (flutamide)、促性腺激素-釋放荷爾蒙類似物和亮丙里德；以及非-類固醇的抗雄激素，像是氟他胺。利用生長因子之混合治療，包括細胞激動素、淋巴細胞活素、生長因子或其他造血因子，像是M-CSF、GM-CSF 、TNF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、 IL-16、IL-17、IL-18、IFN、TNF0、TNF1、TNF2、G- O:\121\121929.DOC -118- 1336333 CSF、Meg-CSF、GM_CSF、血小板生成素、幹細胞因子和红血球生成素。其他的組合物可包括已知的血管生成素，例如Ang-Ι、·2、_4、_γ，及/或人類的類Ang多肽及/或血管内皮生長因子（VEGF)。生長因子包括促血管生長素 (angiogenin)、骨形態發生蛋白]、骨形態發生蛋白_2、骨形態發生蛋白-3、骨形態發生蛋白_4、骨形態發生蛋白_5 、骨形態發生蛋白_6、骨形態發生蛋白_7、骨形態發生蛋白-8、骨形態發生蛋白_9、骨形態發生蛋白_1〇、骨形態發生蛋白·ιι、骨形態發生蛋白_12、骨形態發生蛋白·13、骨形態發生蛋白-14、骨形態發生蛋白_15、骨形態發生蛋白受體IA、骨形態發生蛋白受體m、腦衍生之神經營養因子、纖毛的嗜中性因+、纖毛的嗜中性因子受體、細胞激動素-誘導的嗜中性白血球趨化因子1、細胞激動素·誘導的嗜中性白ik球趨化因子2、細胞激動素_誘導的嗜中性白血球趨化因子2、内皮細胞生長因子、内皮肽（endGtheiin)卜上皮生長因子、上皮_衍生的嗜中性白血球吸引劑、纖維母細胞生長因子4、纖維母細胞生長因子5、纖維母細胞生 .長因子6、纖維母細胞生長因子7、纖維母細胞生長因子8 、纖維母細胞生長因子扑、纖維母細胞生長因子8c、纖維母細胞生長因子9、纖維母細胞生長因子1〇、纖維母細胞生長因子酸㈣、纖維母細胞生長因子驗性的、神經細胞株·衍生之啥中性因子受體]、神經膠質細胞株-衍生之嗜中性因子受體_2、盥生具右的蛋白質-!、盘生長有關^有關的蛋白質、與生長有關〃長有關的蛋白質-2、與生長有關的蛋白

O:\121\12I929.DOC •119· 1336333 質3、肝素結合之上皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、類胰島素生長因子j、類胰島素生長因子受體、類胰島素生長因子Π、類胰島素生長因子結合蛋白質、角化細胞生長因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受體-1、神經生長因子 '神經生長因子受體、神經營養因子-3、神經營養因子_4、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生之内皮細胞生長因子、血小板衍生之生長因子、血小板衍生之生長因子A鏈、血小板衍生之生長因子AA、血小板衍生之生長因子AB、血小板衍生之生長因子B鏈、血小板衍生之生長因子BB、血小板衍生之生長因子受體-1、血小板衍生之生長因子受體_2、前·Β細胞生長刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子受體、轉化生長因子-1、轉化生長因子-2、轉化生長因子_丨、轉化生長因子_ 1-2、轉化生長因子_2、轉化生長因子_3、轉化生長因子_5 、潛伏轉化生長因子_丨、轉化生長因子_丨結合蛋白質丨、轉化生長因子-1結合蛋白質„、轉化生長因子_丨結合蛋白質 III、腫瘤壞死因子受體第I型、腫瘤壞死因子受體第Η型、尿激酶-型血纖維蛋白溶酶原激活劑受體、血管内皮生長因子，以及嵌合型蛋白質，及其在生物學或免疫學上具有活性的片段。免疫治療免疫治療通常依賴瞄準並破壞癌細胞之免疫效應物細胞和分子的使用。免疫效應物可以是，例如本發明之肽體，其認得在標靶細胞表面上的一些標記。肽體可單獨作為治

O:\121\121929.DOC -120· 1336333 療的效應物’或它可徵募其他實際完成殺死細胞的細胞。亦可使肽體與藥物或毒素（化學治療劑、放射性核素、莲麻蛋白A鏈、霍亂孤菌毒素、百日咳毒素等等）結合，而因此主要擔任瞄準劑。根據本發明’可藉著免疫治療，以本發明之肽體或肤體共軛物瞄準Ang-2的突變形式。特別期待在連同八叫_2瞄準治療的混合治療方法中，使用本發明的肽體組合物。已經證實被動免疫治療’對許多癌症是特別有效的。參見’例如 W0 98/39027。下列的實例僅為了解釋之目的’不應以任何方式解釋為限制本發明之範圍。實例1 在病理學和正常組織中的Ang2表現使用就地雜交作用，在正常和病理學組織中檢查Ang-2 的表現。藉著逆轉錄酶_PCR ’從人類或老鼠胎兒肺臟 cDNA中，擴大人類（Genbank登錄編號：AF〇〇4327，核苷酸 1274- 1726)和老鼠（Genbank 登錄編號：AF004326,核：y：酸1 135-1588) Ang-2序列的片段，選殖到pGEMT質體内，並藉著定序證實。從直線化的質體模板中，使用33ρ_υτρ 和RNA聚合酶，轉錄33Ρ-標示之反義RNA探針。將曱醛固定、石蠟包埋的組織塊切成5微米，並收集在帶電的玻片上。在就地雜交之前，先使〇.2M ^^^透過組織，接著以蛋白酶K消化，並利用三乙醇胺和乙酸酐將其乙醯化。在乃 °0下，使切片與放射性標示的探針雜交過夜，然後接受 O:\121\121929.DOC -121 - 1336333 RNA酶消化，以及在55°C下，在大約0.1 X SSC中的高嚴格沖洗。將玻片浸在Kodak NTB2乳劑中，在4。(：下暴露2-3 週’顯影並對比染色。以暗場和標準照明檢查切片，容許同時評估組織形態學和雜交信號。結果指出在正常的出生後人類中，Ang-2的表現受限於 3有血管生成之血管分布的少數組織，像是卵巢、胎盤和子S。在正常成人的心臟、腦、腎臟、肝臟、肺臟、胰臟 φ 脾臟 '肌肉、扁桃腺、胸腺、闌尾、淋巴結、膽囊、前列腺或睪丸中，沒有可檢測到的Ang_2表現。在5_週齡的老鼠中（但在成年猴子或人類中沒有），腎臟在直管中展現出顯著的Ang-2表現。欲判定該表現是否為胚胎發育的遺物’在衍生自年齡範圍高達丨歲大之老鼠的腎臟上，使用老鼠Ang-2探針和上述的條件，重覆該表現。觀察到Αη§·2 的表現，在新生兒發育的期間降低，但在丨歲大老鼠的腎臟中仍然是明顯的。 • 亦在幾乎所有的受試腫瘤類型中，檢測Ang-2表現，包括原發性人類腫瘤，像是結腸癌（5個案例）、乳癌（ι〇個案例）、肺癌（8個案例）、神經膠質母細胞瘤（1個案例）、轉移的人類腫瘤’像是乳癌(2個案例）、肺癌(2個案例)和印巢癌（2個案例），其已經轉移至腦，以及屬齒類腫瘤模式像是C6 (大鼠神經膠質瘤）、町29 (人類結腸癌）、c〇i〇k 人類結腸癌）、HCT116 (人類結腸癌）、細（人類表皮樣癌）A673 (人類橫紋肌肉瘤）、Ητιο只〇决s诚 m } (人類纖維肉瘤）、 PC-3 (人類前列腺癌）、b16F1〇 (宅鼠…色素瘤）、MethA (

O:\121\121929.DOC -122- 1336333 老鼠肉瘤）和路易斯（Lewis)肺癌。此外，亦在反應VEGF而正生長至Matrigel塞子内的新血管中，並在早熟之視網膜病的老鼠低氧症模式中，檢測Ang-2表現。實例2 評估Ang-2肽體的分子測定發展分子測定（親和力ELISA，中和£!^18八和81八(：〇^)來評估直接與Ang-2和相關之家族成員結合的肽體，以及肽體對Ang-2 : Tie-2交互作用的影響。描述這些在活體外的測定，如下。

親和力ELISA 關於候選之抗-Ang-2肽體的最初篩選，使用經過純化的人類 Ang-2 (R&D Systems，Inc·;目錄第 623-AN號；以 2種截短版本之混合物提供的ANg-2)，或老鼠Ang-2多肽（按照上述製備）。為了證實性的結合測定，以全長人類Ang-2 DNA轉移感染獲自人類293T細胞之調理培養基的人類Ang-2，並在不含血清、含有大約50微克/毫升牛血清白蛋白 (BSA)的杜貝可氏（Dulbecco's)經過修改的鹰式（Eagle)培養基（DMEM)中培養。使用微量滴定盤，在每孔中加入大約100微升的Ang-2，並培養該盤大約2小時，隨後以含有大約0.1%吐溫-20的磷酸緩衝之生理鹽水（PBS)沖洗培養盤四次。然後使用大約 250微升/孔的大約5%在PBS中之BSA阻斷各孔，並在室溫下培養該盤大約2小時。在培養之後，拋棄過量的阻斷溶液，並以從大約40毫微莫耳之濃度開始，然後以含有大約 -123-

O:\121\121929.DOC < 5 > 1336333 1% BSA之PBS連續稀釋4-倍的連續稀釋，在孔中加入大約 100微升的每種候選的抗- Ang-2肽體。然後在室溫下培養該盤過夜。在培養之後，以含有大約1 %吐溫_20之PB S沖洗該盤。重覆沖洗四次，隨後以100微升/孔，加入預先按照1 : 5000 ’以含有1% BSA之PBS稀釋的山羊抗-人類 IgG(Fc)_ HRP (Pierce Chemical Co·，目錄#31416)。在室溫下培養該盤大約1小時。然後以含有大約〇. 1%吐溫·2〇的 PBS沖洗5次，隨後加入大約1〇〇微升/孔的τμΒ (3,3·5,5·-四曱聯本胺液體受質系統；Sigma Chemical Company，St. Louis, MO ’目錄第T8665號）受質，並培養大約5-15分鐘，直到藍色展現為止。然後在分光光度計大約370毫微米處，讀取吸光度。

中和ELISA 按照親和力ELISA的描述，製備已經結合人類Ang-2多肽的微量滴定盤。滴定候選的抗-Ang-2肽體，從1〇〇〇 nM 到0.2 pM ’以含有大約l〇/〇 BSA和大約1 nM Tie-2 (以Tie-2-Fc分子之形式提供，其中Tie-2部分僅含有分子的可溶性細胞外部分；R&D Systems，目錄第313-TI號）的PBS溶液4-倍稀釋。在每孔中加入1〇〇微升抗體/Tie-2溶液之後，在室溫下培養該盤過夜，然後以含有大約0.1%吐溫_2〇的PBS沖洗5次。在沖洗之後，加入大約100微升/孔的抗·Τ4·2抗體 (Pharmingen Inc.，目錄#557039) ’至大約1微克/毫升的終濃度’並在室溫下培養該盤大約1小時。接下來，以利用含有大約1% BSA之PBS的1:10,000稀釋，加入大約1〇〇微 0:U21\121929.D0C -124· 1336333 升/孔的山羊抗-老鼠-IgG_HRP (Pierce Chemical c〇.，目錄 #31432)«»在室溫下培養該盤大約1小時，隨後以含有大約〇· 1 %吐溫-20的PBS沖洗5次。然後加入大約i 〇〇微升/孔的 TMB受質（上述），並容許顏色展現。然後在分光光度計 370毫微米處，讀取吸光度。親和力BIAcore 在 BIAcore® 2000 (Biacore，Inc” Piscataway, NJ)上進行每個候選Ang-2肽體的親和力分析，利用pBS和〇〇〇5% p2〇表面活性劑（Biacore，Inc.)作為執行緩衝溶液。將重組的蛋白質G (Repligen，Needham，MA)，經由一級胺基團，使用胺偶聯套組（Biacore，Inc.) ’根據製造者建議的草案，固定在研九等級的CM5感應晶片（Biacore，Inc.)上。藉著首先捕捉每種候選的抗-Ang-2肽體大約1〇〇 RU，至已經固定之蛋白質G上，隨後以50微升/分鐘之流速，將各種濃度（0-100 nM)的huAng-2或mAng-2注射至已結合的抗體表面上3分鐘’來進行結合測定。使用bia估計3 · 1電腦程式（Biacore，Inc.)判定肽體結合的動力學參數，包括締合速率常數）、kd (解離速率常數）和kd (解離平衡常數）。解離平衡常數越低，表示肽體對Ang-2的親和力越大。實例3

Ang-2結合狀的痒認 1.製備塗覆Ang-2的磁性小珠 A.將Ang-2固定在磁性小珠上為了非-專一的洗脫’針對所有三個選擇回合，以每1〇〇 0:\121\121929.D0C -125- 1336333 微升得自製造者的小珠母液含大約4微克生物素基化之 Ang-2蛋白質的濃度，將生物素基化的Ang_2蛋白質（生物素基化的重組人類金管生成素·2, R&D Systems，Ine ;目錄第BT623號）固定在鏈黴菌抗生物素蛋白Dynabeads (Dynal，Lake Success，NY)上。為了抗原（Ang_2)和受體 (Tie-2)的洗脫’針對兩個選擇回合，將2微克生物素基化的Ang-2蛋白質固定在50微升鏈黴菌抗生物素蛋白 Dyiiabeads上。對於第三個選擇回合，將塗覆濃度降低至籲每50微升小珠母液，含大約1微克的生物素基化之人％_2蛋白質。藉著使用磁鐵將小珠吸引至試管的一側，並吸移掉液體，以磷酸緩衝之生理鹽水（PBS)沖洗5次，並再懸浮於 PBS中。以上文的濃度將生物素基化的Ang2蛋白質加至經過沖洗的小珠中，並在室溫下培養丨小時，並加以旋轉 ’接者在4 C下過仗培養數小時，並加以旋轉。然後藉著加入BSA至大約1%之終濃度，阻斷Ang_2塗覆的小珠，並 φ 在4°C下培養，並加以旋轉。然後在接受選擇程序之前，先以PB S沖洗所得的Ang-2塗覆小珠5次。 B.製備陰性選擇用的小珠亦為了陰性選擇製備額外的小珠。針對每個淘洗條件，· 使500微升得自製造者的小珠母液接受以上的程序（段落 1A)’除了省略培養生物素基化之Ang_2的步驟。在最後的沖洗步驟中，將小珠分成5個1 00微升的等分β 2·選擇Ang-2結合噬菌體 A·全面的策略 O:\121\121929.DOC -126- 1336333 使用三個絲狀噬菌體庫，命名為"TN8-IX" (5X1 〇9個獨立的轉化物）、"ΤΝ12-Ι" (1.4Χ109個獨立的轉化物）和"直線" (2.3Χ109個獨立的轉化物）（全都得自Dyax Corp.)來選擇 Ang-2結合噬菌體。然後使每個庫接受非-專一的洗脫、 Ang-2洗脫和受體洗脫（Tie-2)。對於Ang-2，使用9種不同的淘洗條件（使用非-專一之洗脫方法的TN8-IX，使用Ang-2洗脫方法的TN8-IX，使用Tie-2洗脫方法的TN8-IX，使用非-專一之洗脫方法的TN12-I，使用Ang_2洗脫方法的 TNI2-1，使用Tie-2洗脫方法的TN12-1，使用非-專一之洗脫方法的直線，使用Ang-2洗脫方法的直線，和使用Tie_2 洗脫方法的直線對於全部的三個庫而言，僅以非-專一的方式’洗脫得自第一回合選擇的嗟菌體，進行下一回合的選擇。在第二和第三回合的選擇中，使用Ang_2和Tie-2 洗脫。至於直線庫’僅進行第二回合Ang_2和Tie-2洗脫的選擇。 B.陰性選擇關於每種淘洗條件，從庫母液中，將TN8-IX和TN12-I庫的大約100個隨機庫相等物（TN8-IX為大約5 X 10" pfu，而 TN12-I為大約1.4 X 1〇" pfu以及直線庫的大約1〇個隨機庫相等物（大約1 X 1〇丨丨pfu)分成等分，並以PBSt (帶有0.05% 吐溫-20的PBS)稀釋成大約4〇〇微升。在最後一次沖洗之後 ’從最初100微升等分的為了陰性選擇而製備的小珠（段落 1B)中吸出液體’在小珠中加入大約4〇0微升經過稀釋的庫母液°在室溫下培養所得的混合物大約1〇分鐘，並加以旋

O:\121\121929.D0C •127· 1336333 轉。使用磁鐵，吸出噬菌體上清液，並為了另外的陰性選擇步驟，加至第二個100微升的等分中。這樣子，進行5個陰性選擇步驟。 C. 使用Ang-2蛋白質塗覆之小珠的選擇在最後一次陰性選擇步驟（段落1B)之後，將噬菌體上清液加至Ang-2塗覆的小珠（段落1A)中。在室溫下培養該混合物1到2小時，並加以旋轉，容許嗟菌體與標把蛋白質結合。在拋棄上清液之後，以PBST沖洗小珠大約1〇次，接著以PBS沖洗2次。 D. 非-專一的洗脫在吸出最後的沖洗液體（段落2C)之後，在小珠中加入大約 1 毫升的 Min A鹽溶液（60 mM Κ2ΗΡ04，33 mM KH2P〇4 ，7.6 mM (NH4)S04和1.7 mM檸檬酸鈉）。直接將該小珠混合物加至濃縮的細菌試樣中進行感染（參見段落3A和3B)。 E. 已結合之嗤菌體的抗原（Ang-2)洗脫關於第2回合，在最後的沖洗步驟（段落2C)之後，藉著連續加入100微升1 pM ’ 0.1 nM和10 nM重組的Ang-2蛋白質（重組的人類血管生成素-2，R&D Systems，Inc. Minneapolis，Minnesota)，每種條件各培養3〇分鐘，從磁性小珠中洗脫出已結合的噬菌體。剩下的噬菌體以非·專一的方式洗脫（段落2D)。混合從1〇 nM和非-專一之洗脫中洗脫出的噬菌體，並使其接受第3回合的選擇（參見下文的段落4)。關於第3回合*在最後的沖洗步驟（段落2C)之後，藉著

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1336333 連續加入大約1 nM重組的Ang_2蛋白質和10 nM重組的 Ang-2蛋白質’每種條件各培養3 〇分鐘，從磁性小珠中洗脫出已結合的噬菌體。此外，在旋轉器上，利用1毫升100 的二乙胺溶液（Sigma，St· Louis, Missouri)洗脫嗤菌體 10分鐘。利用0·5毫升lMTris-HCl(pH7.5)中和含有噬菌體之二乙胺溶液的pH值。在最後一次以loo mM三乙胺溶液洗脫之後’藉著將小珠加至細菌中，洗脫出剩下的嗟菌體（段落2D)。 F.已結合之噬菌體的報告者（Tie_2)洗脫關於第2回合’在最後的沖洗步驟（段落2C)之後，藉著連續加入大約1〇〇微升1 pM，0.1 nM和10 nM重組的Tie-2 蛋白質（重組的人類Tie-2-Fc嵌合體，R&D Systems，Inc. Minneapolis，Minnesota)，每種條件各培養30分鐘，從磁性小珠中洗脫出已結合的噬菌體。剩下的噬菌體以非-專一的方式洗脫（段落2D)。混合從10 nM和非·專一之洗脫中洗脫出的噬菌體，並使其接受第3回合的選擇（參見下文的段落4)。關於第3回合，在最後的沖洗步驟（段落2C)之後，藉著連續加入大約1 nM重組的Ang-2蛋白質和1〇 nM重組的Tie-2蛋白質’每種條件各培養30分鐘，從磁性小珠中洗脫出已結合的嗤菌體。此外，在旋轉器上，利用1毫升1〇〇 mM 的三乙胺溶液（Sigma，St. Louis, Missouri)洗脫嗤菌體10分鐘。利用0.5毫升1 M Tris-HCl (pH 7.5)中和含有噬菌體之三乙胺溶液的pH值。在最後一次以100 mM三乙胺溶液洗脫之 O:\121\121929.DOC -129- 1336333 後，藉著將小珠加至細菌中，洗脫出剩下的噬菌體（段落 2D) » 3.擴大作用 A. 製備平舖的細胞在含有大約12.5微克/毫升四環素的1^培養基中，使新鮮的大腸桿菌（XI^ Blue MRF，）培養物生長至大約〇5的。針對每個淘洗條件，在冰上冷卻大約2〇毫升的該培養物，並離心之。將細菌小球再懸浮於大約丨毫升的Min A鹽溶液中》 B. 轉導作用將得自上述每個不同洗脫方法（段落2d、冗和2F)的混合物’分別加至濃縮的細菌試樣（段落3A)中，並在大約37<t 下培養大約15分鐘。在每種混合物中加入大約2毫升的 NZCYM培養基（2XNZCYM，50微克/毫升氨苄青黴素），並在大約37C下培養15分鐘。將所得的4毫升溶液平舖在含有大約50微克/毫升氨苄青黴素的大^^2(：¥]^瓊脂板上，並在37°C下培養過夜。 C. 收獲噬菌體使每種細菌/嗤菌體混合物在大的NZcym瓊脂板上生長過夜（段落3B)，隨後將其刮到大約35毫升的lb培養基中。以另外35毫升的LB培養基，進一步清洗瓊脂板。離心所得的在LB培養基中之細菌/噬菌體混合物，去掉細菌形成的小球。然後將大約5〇毫升的噬菌體上清液移至新的試管中 ’並加入大約12.5毫升的PEG溶液（20% PEG8000，3.5M乙

O:\121\121929.DOC •130- 1336333 酸銨）’在冰上培養2小時，佶#结触使巫痛體沉澱。將沉澱的噬菌體離心，並再懸浮於6毫井择益触$ a4

氅升巫01體再懸浮緩衝溶液（250 mM

NaCn，100 mM Tris pH 8，1 a, m P 8 1 mMEDTA)中。藉著離心去掉

剩下的細菌，進一步純化該唯鉑M 巫函體溶液，並藉著加入大約 Κ5毫升細G溶液，使㈣體沉澱兩次。在離心、步驟之後 ’將噬g體小球再懸浮於大約4〇〇微升的pBs中。使該溶液

接受最終㈣d去任何殘餘細g碎屑的溶液。使用標準溶菌斑形成測定，滴定所得的噬菌體製品。 4_另外的選擇和擴大作用

在第2回合中，使用得自第丨回合的擴大噬菌體製品（大約101G pfu)作為輸入噬菌體，來進行選擇和擴大步驟（段落 2和3)。至於Ang-2和Tie_2溶液’混合得自1〇 nN1和非·專一之洗脫的噬菌體’並針對第3回合的選擇擴大。再轉而使用得自第2回合的擴大噬菌體製品（大約109 pfu)作為輸入噬菌體，進行第3回合的選擇和擴大（段落2和3) ^在第3回合的洗脫步驟（段落2D、2E和2F)之後，平舖洗脫噬菌體的小溶離份’進行溶菌斑形成測定（段落3C)。挑選出個別的溶菌斑’並放在每孔含有1〇〇微升TE緩衝溶液的96孔微量滴定盤内。在4°C下培養這些主要培養盤過夜’容許噬菌體洗脫到TE缓衝溶液内。 5.選殖分析藉著嗟菌體ELISA和DNA定序，分析嗟菌體純種系。以得自這兩個測定的綜合結果為基礎來排列序列。

A.噬菌體ELISA

O:\121\121929.DOC • 131 -

1336333 使XL-l Blue MRF’的培養物生長，直到〇D6⑽達到大約 0.5為止。在96_孔微量滴定盤的各孔中，將該培養物分成大約30微升的等分。在各孔中加入大約10微升的洗脫噬菌體（段落4)，並容許在室溫下感染細菌大約丨5分鐘。在各孔中分別加入大約1〇〇微升，含有大約125微克/毫升四環素和大約50微克/毫升氨芊青黴素的lb培養基。然後在大約 37C下’振盪培養微量滴定盤過夜。在大約4它下，容許重組的Ang-2蛋白質（大約1微克/毫升，在PBS中）與96孔 Maxisorp培養盤（NUNC)結合過夜。以在PBS中大約2微克/ 笔升’將鏈徽鹵抗生物素蛋白塗覆在另一個Maxis orp盤上，作為對照組。在第二天時’拋棄在塗覆蛋白質之Maxisorp盤中的液體 ’並在大約4°C下’利用大約300微升的5%牛奶溶液過夜阻斷每個孔（或者在室溫下1小時）。然後拋棄牛奶溶液，並以PBST溶液沖洗各孔3次。在最後的沖洗步驟之後，在塗覆蛋白質之Maxisorp盤的各孔中，分別加入大約50微升 PBST-4%牛奶。將大約50微升、得自在96孔微量滴定盤中之各孔的過夜培養物移至Ang-2塗覆之培養盤，和對照組塗覆鏈黴菌抗生物素蛋白之培養盤的對應孔中。在室溫下，培養在每種培養盤中的100微升混合物大約1小時《拋棄得自Maxisorp盤的液體，並以PBST沖洗各孔大約3次。將 HRP-共概的抗-M13抗體（Amersham Pharmacia Biotech)稀釋成大約1:7,500，並將大約100微升的稀釋溶液加至 Maxisorp盤的各孔中，在室遥下培養大約1小時。再度拋 O:\121\121929.DOC -132- 1336333 棄液體，並以PBST沖洗各孔大約5次。然後將大約100微升的TMB受質（Sigma)加至各孔中，並利用大約50微升的 5N H2S〇4溶液中止該反應。在分光光度計（Molecular Devices)上讀取 OD450。 B.噬菌體純種系的定序針對每個噬菌體純種系，使用PCR製備定序模板。使用下列的寡核苷酸對來擴大大約500個核苷酸的片段。引子1: 5'-CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3'(序列識別：54號）弓1 子2 : 5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3,（序列識別：55號）為每個純種系製備下列的混合物：試劑體積(微升)/試管 dH20 26.25 50%甘油 10 10 X PCR緩衝溶液(無MgCl2) 5 25 mM MgCl2 4 10 mM dNTP混合物 1 ΙΟΟμΜ引子1 0.25 100 μΜ引子2 0.25 Taq聚合酶 0.25 在TE中之噬菌體(段落4) 3 終反應體積 50 關於 PCR，使用熱循環器（GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems)執行下列的程式：94°C 5分鐘；（94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒）x 30個回合；72°C 7分鐘；冷卻至 4°C。使用 QIAquick Multiwell PCR純化套組（Qiagen) O:\121\121929.DOC -133- 1336333 ，依據製造者的草案，純化得自每個反應的PCR產物。然後藉著使PCR反應混合物各大约10微升，與1微升染料（10 X BBXS瓊脂糖裝載染料）跑1%瓊脂糖凝膠，分析經過純化的PCR產物。然後使用ABI 377定序器（Perkin Elmer)，依據製造者建議的草案，定序剩下的產物。 6.序列排列和一致序列的判定 A. 序列排列與分析將從可變核甞酸序列（段落5B)中轉譯的肽序列，與 ELISA資料連貫。給與在塗覆Ang-2之孔中顯示出高OD450 值，且在塗覆鏈黴菌抗生物素蛋白之孔中顯示出低od450 值的純種系，較優先的排列。亦給與出現多次的序列較優先的排列。以這些標準為基礎，為了進一步為肽或肽體的分析，選擇候選的序列。 B. —致序列的判定從TN8-IX庫中產製三個不同種類的一致主題，如下： KRPCEEXWGGCXYX (序列識別:56號） KRPCEEXFGGCXYX (序列識別:57號） XXXCXDXYWYCXXX (序列識別:61 號） XXXCXDXYTYCXXX (序列識別:62號） XXXCXDXFWYCXXX (序列識別：63號） XXXCXDXFTYCXXX (序列識別：64號） XXXCXWDPWTCEXM (序列識別:58號）從TN12-I庫產製一個一致主題： WSXCAWFXGXXXXXCRRX (序列識別：59號） O:\121\121929.DOC -134- 1336333 針對所有的一致主題序列，藉著判定在每個位置中最常出現的胺基酸，獲得得自每個一致序列之加下標線的"核心胺基酸序列"。”X"意指任何天然存在的胺基酸。在TN8-IX和TN12-I庫中，與核心序列相鄰的兩個半胱胺酸是固定的胺基酸。在下文的表3中陳述確認出與Ang-2結合的肽。表3 : Ang-2結合肽

肽序列識別號序列 TN8-8 1 KRPCEEMWGGCNYD TN8-14 2 HQICKWDPWTCKHW TN8-Conl 3 KRPCEEIFGGCTYQ TN8-Con4 4 QEECEWDPWTCEHM TN12-9 5 FDYCEGVEDPFTFGCDNH LI 6 KFNPLDELEETLYEQFTFQQ C17 7 QYGCDGFLYGCMIN 實例4

建構編碼肽體的DNA 選擇有可能抑制Ang-2:Tie-2結合之經過修改的肽（參見表3)，用來建構融合蛋白質，其中每個肽的單體或每個肽的縱列二聚體（在單體單元之間有聯結子），在架構中與編碼聯結子，接著是人類IgGl之Fc區的DNA融合。藉著黏接成對的寡核甞酸（寡），產生編碼該肽，連同聯結子的多核甞酸雙股，建構每個經過修改的肽，將依據肽而包括5個甘胺酸殘基、8個甘胺酸殘基或1個離胺酸殘基；以Ndel至 Xhol片段之形式產生這些構築體。將這些雙股多核苷酸分子連接到含有人類Fc基因的載體（pAMG21-Fc N-終端，在下文中進一步說明）内，先前已經利用Ndel和Xhol將其消 O:\121\121929.DOC -135- 1336333 化過了。藉著電穿透作用，使用標準程序，將所得的連接混合物轉化至大腸桿菌品系2596細胞（GM221，在下文中進一步說明）内。針對產生重組蛋白質產物，並具有正確核甞酸序列之基因融合的能力，來篩選純種系。對每個經過修改的肽，選出單一的這類純種系（也就是Fc•肽融合產物）。建構pAMG21-Fc N-终端載趙pAMG21 表現質體？入熥021(八丁(：(：第98113號）係衍生自表現載體 PCFM1656 (ATCC 第 69576號），並在美國專利第 4,71〇,473 號中描述了表現載體系統，遵循在已發表之國際專利申請案W0 00/24782中描述的程序（參見其中實例2的部分，從第100至103頁，以及圖17A和17B)。

Fc N-終端載體使用大腸桿菌品系3788 ’ pAMG21 Tpo_Gly5 Fc單體作為模板，創造Fc N-終端載體。可在w〇 00/24782中找到選殖該品系之資訊（參見在本文中的實例2和圖1 〇)。設計 5TCR引子（在後文中進一步說明），移除在pAMG Tp〇 Gly5 中的Top肽序列’並以含有ApaU和Xhol位置的多聯結子取代它。使用品系3 7 8 8作為模板，利用延伸長聚合酶 (Expand Long Polymerase)進行PCR，使用下文序列識別： 8號的寡核苜酸作為5’引子，以及萬能的3,引子，下文的序列識別：9號。以凝膠純化所得的PCR產物，並以限制酵素 Ndel和 BsrGI消化。使用 Qiagen (chatsworth，CA)凝膠純化自旋管柱，以凝膠純化編碼感興趣之肽及其聯結子的多核甞酸和質體兩者。然後使用標準連接程序，連接質體和插入物，並將所得的連接混合物轉化到大勝桿菌細胞（品系2596)内。選擇單一的純種系，並進行DNA定序。確認 O:\121\121929.D0C •136· 1336333 正確的純種系，並用來作為在本文t描述的經過修改之肽的載體來源。 53丨子： ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCA AAAAAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA (序列識別：8號） 3’引子： GGTCATTACTGGACCGGATC (序列識別：9號）除了使這些經過修改的肽成為N-終端，與Fc融合（N-終端的肽體）之外，亦可使其中一些成為C-終端融合產物（C-終端的肽體）。在下文中描述用來進行C-終端融合的載體。建構Fc C-終端的載鳢使用大腸桿菌品系3728，pAMG21 Fc_Gly5_Tpo單體作為模板，產製經過修改之肽的Fc C-終端載體。可在WO 00/24782中找到選殖該品系的資訊（參見在本文中的實例2 和圖7)。設計3' PCR引子（序列識別：10號），移除Τρο肽序列，並以含有ApaLI和Xhol位置的多聯結子取代它。使用品系3728作為模板，利用延伸長聚合酶進行PCR，使用萬能的5'引子（序列識別：11號），以及上文提及的3’引子。以凝膠純化所得的PCR產物，並以限制酵素BsrGI和BamHI消化。經由Qiagen凝膠純化自旋管柱，以凝膠純化編碼每個感興趣之肽及其聯結子的質體和多核甞酸兩者。然後使用標準連接草案，連接質體和插入物，並將所得的連接混合物轉化至大腸桿菌（品系2596)的細胞内。選出單一的純種系，並進行DNA定序。確認正確的純種系，並用來作為在本文中描述的經過修改之肽的載體來源。 5'引子： •137-

O:\121\121929.DOC ^ 5 > 1336333 CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG (序列識別：10號） 3’引子： TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCT TTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC (序列識別：11 號） GM221 (#2596)。用來表現Fc-肽融合蛋白質的宿主品系 #2596，是修改而使其含有lux啟動基因，並在早期ebg區域含有感溫性λ阻遏物cI857s7，且在晚期ebg區域含有 lacIQ阻遏物的大腸桿菌K-12品系。這兩個阻遏物基因的出現，容許該宿主使用各式各樣的表現系統。ATCC將該品系命名為202174。實例5 肽體的產製在大腸桿菌中表現。在37°C下，使每個在大腸桿菌中之 pAMG21-Fc融合構築體的培養物生長在Terrific肉湯培養基中（參見Tartof和Hobbs，"使質體和黏接質體純種系生長的改良培養基（Improved media for growing plasmid and cosmid clones)", Bethesda Research Labs Focus，第 9冊，第12頁，1987，在前文中提及的Samb rook等人，參考）。在培養基中加入合成的自動誘導劑，N-(3-氧基己醯基）-DL-高絲胺酸内酯，至每毫升20毫微克（毫微克/毫升）之終濃度，完成從luxPR啟動基因中誘導基因產物的表現。在 3 7°C下培養該培養物另外6小時。然後藉著顯微鏡，針對包涵體的存在來檢查細菌培養物，並藉著離心收集。在經過誘導之培養基中觀察到折射的包涵體，表示Fc-融合在大腸桿菌中最有可能以不溶性的片段來產製。藉著再懸浮於含有10% β-魏基乙醇的Laemmli試樣緩衝溶液中，直接 O:\121\121929.DOC -138- 溶解細胞小球’然後藉著SDS-PAGE分析。在大多數的案例中，在SDS-P AGE凝膠上觀察以正考馬斯-染色之適當分子量的譜帶。純化。在水（1/10)中使用高壓均質化作用（以14,000磅/平方英吋通過兩次）打破細胞，並藉著離心（在J-6B離心機中以4000 RPM，1小時）收獲包涵體。以1/1〇之比例，將包涵體溶解於6 Μ麻V，50 mM Tris，10 mM DTT，pH 8.5 中 1小時。針對與Fc融合之直線肽，在2 Μ脲，50 mM Tris，160 mM精胺酸’ 2 mM半胱胺酸，pH 8.5中，將加溶混合物稀釋25倍。容許在4 °C下進行氧化作用2天，容許形成二硫_ 連接的化合物（也就是Fc-肽同二聚體）》至於與Fc融合的環狀肽，則依據相同的草案，並加入下列三個折疊條件：（i) 2 Μ脲，50 mM Tris，160 mM精胺酸，4 mM半胱胺酸，1 mM胱胺，pH 8.5 ; (2) 4 Μ脲，20%甘油，50 mM Tris， 160 mM精胺酸，2 mM半胱胺酸，pH 8·5 ;和（3) 4 Μ脲， 20%甘油’ 50 mM Tris，160 mM精胺酸，4 mM半胱胺酸 ’ 1 mM胱胺，PH 8.5。將再折疊的蛋白質對1.5 Μ脲，50 mM NaCl ’ 50 mM Tris，pH 9.0進行透析。利用醋酸將該混合物的pH值降至pH 5。藉著離心移除沉澱物，並依據每個融合產物的等電點，將上清液調整成pH 5至6.5。過濾蛋白質’並在4。匚下裝至以20 mM NaAc，50 mM NaCl，在對每個構築體判定之pH值下平衡的sp_瓊脂糖HP管柱中。使用20-管柱體積，範圍從5〇 mM NaC丨至500 mM NaCl之相同緩衝溶液的直線梯度，洗脫蛋白質。收集高峰並過濾之。在以下的表4中陳述使用以上之程序產製的肽體。

O:\121\121929.DOC •139· 1336333 表4 肽體肽體序列 L1(N) MGA〇KFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (序列識別：12號） LI (N) WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (序列熾別：丨3號） LI (N) 1KWT MKFNPLDELEETLYEQFTFOQGSGSATGGSGSTASSGS GSATHLEGGGGG-Fc (序列識别：I44t) 2xL] (N) MGAQKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGGKFNPL DELEETLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (序列識別：丨5號） 2xLl (N) WT MKFNPLDELEETLYEQFTFQQGGGGGGGKFNPLDELEE TLYEQFTFQQLEGGGGG-Fc (岸列識別：16统> Con4 (N) MGAQQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (岸列熾別：17號） Con4(N) 1K-WT MQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGSATH LEGGGGG-Fc (序列識別：18號） 2xCon4 (N) IK MGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASSGSGS ATHQEECEWDPWTCEHMLEGGGGG-Fc (序列埤別·· 19號） L1(C) M-Fc-GGGGGAOKFNPLDELEETLYEQFTFQQLE (序列識別：20號）

O:\121\121929.DOC 140- 1336333

LI (C) 1K M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELE ETLYEQFTFQQLE (序列褲別：21 號） 2xLl (C) M-Fc- GGGGGAQKFNPLDELEETLYEOFTFOOGGGGGGGGKF NPLDELEETLYEQFTFOOLE (序列識別：22tt) Con4 (C) M-Fc-GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMLE (序列識別：23ft) Con4(C) IK M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHQEECEWDP WTCEHMLE (岸列識別：24號） 2xCon4 (C) IK M-Fc- GGGGGAQQEECEWDPWTCEHMGSGSATGGSGSTASS GSGSATHQEECEWDPWTCEHMLE (序列識別·· 25ft) Con4-Ll (N) MGAQEECEWDPWTCEHMGGGGGGGGKFNPLDELEET LYEOFTFOOGSGSATGGSGSTASSGSGSATHLEGGGGG-Fc (序列識別：26號） Con4-Ll (C) M-Fc- GGGGGAQGSGSATGGSGSTASSGSGSATHKFNPLDELE etlyeqftfqqgggggqeecewdpwtcehmle (序列識別：27ft) TN-12-9 (N) MGAQ-FDYCEGVEDPFTFGCDNHLE-GGGGG-Fc (序列識別：28號） C17(N) MGAQ-QYGCDGFLYGCMINLE-GGGGG-Fc (序列識別：29ft) TN8-8 (N) MGAQ-KRPCEEMWGGCNYDLEGGGGG-Fc (序列識別：30號） TN8-14(N) MGAQ-HQICKWDPWTCKHWLEGGGGG-Fc (序列識別：31號） Coni (N) MGAQ-KRPCEEIFGGCTYQLEGGGGG-Fc (岸列識別：32¾) 在表4中，"Fc”意指人類Fc IgGl序列。欄位2陳述肽體的胺基酸序列。其Fc部分以”Fc”標示，並如同在下文中序列識別：60號中的陳述。應瞭解使用標記之處，例如"C〇n4" 或"Con-4"，這意指Con-4肽，但是在其上使用字尾的"C” 、"（C)"或"-C";或"N"、"（N)"或"-N” ’表示該分子為如同在本文中描述的肽體。在肽體名中的字尾"N"、"（N)”或 • 141 -

O:\121\121929.DOC 1336333 "-N"，表示Ang-2-結合肽（或肽們）是N-終端對Fc功能部位，而字尾"C"、"（C)"或”-C"，表示Ang-2-結合肽（或肽們）是 C-終端對Fc功能部位。此外，2xCon4 (C) 1K，如同在序列識別：25號中之定義，在本文中亦可以無"1K"之字尾表示。每個肽體之Fc部分的胺基酸序列如下（從胺基終端到羧基終端）：

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV

SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVL

HQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL

DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSPGK (序列識別：60號）在下文中陳述分別編碼相當於肽體序列識別：12-32號（在表4中）之肽體的DNA序列（序列識別：33-53號）：序列識別：33號

ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCT

GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGG

ACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGG

GACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT

CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA

AGACGCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGC

ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC

CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGC

AAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATC

GAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGT

GTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAG

CCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGA

GTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTC

CCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGT

GGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGAT

GCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTC

TCCGGGTAAATAATGGATCC (5 '> O:\121\121929.DOC -142- 1336333 序列識別：34號

ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA

GTTCACTTTCCAGCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA

CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT

TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC

CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA

GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA

GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA

GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA

AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA

TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG

CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC

CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC

AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA

CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG

CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC

TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA

ATAA 序列識別：35號

ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA

GTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCC

ACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGC

GGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTC

CTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC

CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTG

AGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT

GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACA

GCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGC

TGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCA

GCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGA

ACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAA

CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACAT

CGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGA

CCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAA

GCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCAT

GCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCC

TCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA

O:\121\121929.DOC 143 - 1336333 序列識別：36號

ATGGGTGCACAGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCT

GTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGG

TAAGTTCAACCCACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTT

CACTTTCCAGCAACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACA

CATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTT

TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCC

CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG

GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG

ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG

CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA

GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT

CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC

CCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC

TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA

ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC

TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC

AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT

CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

TAA 序列識別：37號

ATGAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACA

GTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCC

ACTGGATGAGCTGGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCA

ACTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCCACCTT

GCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCC

AAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATG

CGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG

GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGG

AGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC

TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC

AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAA

AGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGG

ATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCT

TCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCG

GAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC

TTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG

GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAC

TACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA O:\121\121929.DOC -144 1336333 序列識別：38號

ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA

ACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC

CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT

CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT

CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT

CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC

CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC

ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA

GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA

AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT

CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA

AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG

CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA 序列識別：39號

ATGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGG ATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCA GGCAGTGCGACTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCA CACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGT TTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA • GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA

GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCA GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACA AGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCA TCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAG CAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGC TCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAA ATAA O:\121\121929.DOC -145 1336333 序列識別：40號

ATGGGTGCACAGCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGA

ACACATGGGATCCGGTTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAG

CTCTGGTTCAGGCAGTGCGACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCC

ATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAA

CTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT

CAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG

GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACC

CTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATG

CCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG

GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAG

TACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAA

ACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACAC

CCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGAC

CTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA

GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGC

TGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACA

AGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATG

AGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG

GTAAATAA 序列識別：41號

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA

GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC

GCTGGACGAGCTGGAAGAGACTCTGTACGAACAGTTTACTTTTCAACA

GCTCGAGTAA O:\121\121929.DOC 146- 1336333 序列識別：42號

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA

GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC

TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC

GACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGA

ACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAA 序列識別：43號

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC acaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaAgaacca

GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACGA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGAAATTCAACCC

GCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCA

GGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAGTTCAACCCACTGGATGAGCT

GGAAGAGACTCTGTATGAACAGTTCACTTTCCAGCAACTCGAGTAA O:\121\121929.DOC -147- 1336333

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA

GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT

GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA 序列識別：45號

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTCM3ATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA

GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC

TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC

GACTCATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACA

TGCTCGAGTAA 148-

O:\121\121929.DOC 1336333 序列識別：46號

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC • CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGCAGGAAGAAT GCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGGGATCCGGTTCTGCTA CTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGCGCGACTC ATCAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTC GAGTAA 序列識別：47號

ATGGGTGCACAGGAAGAATGCGAATGGGACCCATGGACTTGCGAACA

CATGGGTGGTGGTGGTGGTGGCGGTGGTAAATTCAACCCGCTGGACGA

ACTGGAAGAAACTCTGTACGAACAGTTCACTTTCCAGCAGGGATCCGG

TTCTGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGT

GCGAGTCATCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGgGACAAAACTCACACATGT

CCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCT

TCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGG

TCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGT

TCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAG

CCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC

ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA

GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA

AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT

CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA

AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG

CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA O:\121\121929.DOC -149· 1336333 序列識別：48號

ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTG

GGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTC

ATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGC

CACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA

GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCA

CGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA

ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCC

CCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACC

ACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCA

GGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGC

CGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCA

CGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCT

CACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTC

CGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTC

CCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTGCACAGGGATCCGGTTC

TGCTACTGGTGGTTCCGGCTCCACCGCAAGCTCTGGTTCAGGCAGTGC

GACTCATAAATTCAACCCGCTGGACGAACTGGAAGAAACTCTGTACGA

ACAGTTCACTTTCCAGCAGGGTGGTGGCGGTGGTCAGGAAGAATGCGA

ATGGGACCCATGGACTTGCGAACACATGCTCGAGTAA 序列識別：49號

ATGGGTGCACAGTTCGACTACTGCGAAGGTGTTGAAGACCCGTTCACT

TTCGGTTGCGACAACCACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAAC

TCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTC

AGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGG

ACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCT

GAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC

AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGT

CAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTA

CAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAAC

CATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCC

TGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCT

GCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA

GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTG

GACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAG

AGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG

GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT

AAATAA 150-

O:\121\121929-DOC 1336333 序列識別：50號

ATGGGTGCACAGCAGTACGGTTGCGACGGTTTTCTGTACGGTTGCATG

ATCAACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC

ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTC

CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC

ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC

AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC

GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA

CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG

GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA

GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC

CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA

AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC

AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA 序列識別：51號

ATGGGTGCACAGAAACGCCCATGCGAAGAAATGTGGGGTGGTTGCAA

CTACGACCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC

CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT

CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT

CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT

CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC

CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC

ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA

GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA

AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT

CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA

AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG

CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA O:\121\121929.DOC 151 - 1336333 序列識別：52號

ATGGGTGCACAGCACCAGATCTGCAAATGGGACCCGTGGACCTGCAA

ACACTGGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTC

CACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTT

CCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGT

CACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTT

CAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC

CGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTC

ACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAA

GGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA

AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCAT

CCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCA

AAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGG

CAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA 序列識別：53號

ATGGGTGCACAGAAACGTCCATGCGAAGAAATCTTCGGTGGTTGCACC

TACCAGCTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACAAAACTCACACATGTCC

ACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTTTTCCTCTTC

CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC

ACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTC

AACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCC

GCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCA

CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAG

GTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA

GCCAAAGGGGAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC

CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA

AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC

AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC

GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGG

CAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCAC

AACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA O:\121\121929.DOC 152- 1336333 實例6 肽體測定 ELISA 測使用中和ELISA測試14個肽體，並使用親和力試3個肽體。在表5中陳述其結果》表5

Con4 (N) 1K-WT LI (N) 11 C17(N) 12-9 (N)

Coni (N) 8-14 (N) L1(C) 8-8 (N) 21 26 45 65 80 13 7.7. ^200 33 37 -700 無抑制作用無抑制作用無抑制作用 i 抑 iilFi 無抑制作用

陰性對照組肽體4883 無抑制作用無結合作用無抑制作用無結合作用無抑制作用無結合作用陰性對照組肽體4883的胺基酸序列如下（在Fc部分加下標線，聯結子為"GGGGG" ’且肽部分以粗體表示）： MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTrvvvn

VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRWSVLTVL

HODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEmSKAKGOPREPOVYTLPPS

RDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLD

SDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLS PGK-GGGGG-CTAGYHWNSDCECCRRN (序列識別：243號）應瞭解在本文中使用，•無抑制作用"一詞，並非企圖表示 O:\121\121929.DOC -153- 1336333 該化合物沒有抑制性質。在本文中使用的，,無抑制作詞，寧可意指那些化合物在使用中和Eus_定測試時，在本文I描述的條件下，顯示m嶋㈣更大的^。值，其為筛選這些化合物時的最高濃度。雖然對於以"無抑制作用"標示之分子，並未觀察到顯著的抑制性質，但應瞭解事實上可在不同賴定條件下，或在不同的測定中，證實那些分子的抑制性質。在較佳的具體實施例中，應瞭解本發明係關於在使用在本文中描述之測定時，具有抑制性質的肽體。使用親和力BIAcore測定測試兩個肽體（如同在實例2中描述的）。在下文表6中陳述其結果。表6 肽艘（Pb)對hAng-2和mAng-2的親和力 hAng-2 hAng-2 ----1 肽體 Κ〇(ηΜ) ka(l/Ms) k<, (1/s) K〇(nM) ka (1/Ms) ka (1/s) Pb LI (N) 3.1 2.9 x 103 9.1 x 1(T 0.42 5.6 x 103 2.3 x Con4 (N) 0.67 3.3 x 103 2.2 x 10*4 0.60 7.3 x 103 4.4 x 1031- TN12-9 (N) 8.2 1.2 x l〇5 l.Ox 10'J 0.32 7.2 x 105 2.3x10^ 實例7 全身性投與Ang-2肽艘的治療效力研究以每天1次的計畫，在腫瘤攻毒之後72小時，皮下投與 Ang-2肤體’ TN8-Con4-C。所使用之肤體的劑量為1〇〇〇、 200、40和8微克/老鼠/天。所有的動物均給與總共2〇個劑量。每週三次記錄腹瘤體積和體重。在研究結束時，犧牲動物’並收集其血清，藉著ELISA測量肽體的含量。從所有組別中收集腫瘤和名單中的正常組織。 O:\121U21929.DOC -154- 在圖1出示其結果。如同所見，在Ang-2肽體處理組和媒劑對照組之間，觀察到腫瘤生長上的顯著差異。與媒劑對照組相比較，所有四種劑量的Ang-2肽體均抑制腫瘤生長 (p<0.0001對媒劑對照組，使用重覆測量ANOVA)。相反的，在對照組中的腫瘤，以高很多的速率持續生長。利用肽體的處理，對於以上述劑量處理之動物的最後體重、器官重量或血液學參數，並無顯著的影響。實例8 1.建構Ang-2二級肽庫 A.電反應潛能的大腸桿菌細胞從 Stratagene (Stratagene Cloning Systems, La Jolla，CA) 購買Epicurian Coli® XLl-Blue MRF·電穿透反應潛能細胞 (Stratagene #200158)。 3. pCESl載體的修改使用延伸長模板PCR系統（Roche Diagnostics Corp·， Indianapolis，IN)進行 PCR，利用 1 微克 pCESl 載體 (TargetQuest Inc.)作為模板。PCR混合物體積為100微升，其含有lxPCR缓衝溶液，兩種引子：5·-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3·序列識別：244號）和 S'-GGTGGTGCGGCCGCACTCGAGACrGTTGAAAGTrGTITAGCAJ ( 序列識別：245號）各200 nM，200 nM dNTP和3單位（u)的 Tag DNA聚合酶。如下執行 TRIO-Thermoblock (Biometra) PCR系統：94°C 5分鐘；94°C 30秒、50°C 30秒、72〇c 45秒的30個回合；以及72°C 10分鐘；冷卻至4°C。 O:\121\121929.DOC -155 - 1336333 然後在1 %瓊脂糖凝膠上，跑P C R產物，並利用 QIAGEN自旋管柱（QIAGEN Inc.，Valencia，CA)，根據製造者的草案純化。利用5微升PCR產物，和兩種引子5'-CAAACGAATGGATCCTCATTAAAGCCAGA-3’（序列識別：246號）和 S’-AACACAAAAGTGCACAGGGTGGAGGTGGTGGTGCGGCCGCACTJ ( 序列識別：247號）各200 nM，在與上述相同的PCR條件下，進行第二個PCR反應。然後在37°C下，含有1χΝΕΒ2緩衝溶液、60單位ApaLI (New England Biolabs，Beverly，ΜΑ)、60單位 BamHI (New England Biolabs)的100微升反應中，分別消化PCR產物和原始的pCES 1載體1小時。然後使用QIAGEN自旋管柱，純化經過消化的DNA，並在室溫下，在含有lx連接緩衝溶液和40單位T4 DNA連接酶（New England Biolabs)的40微升反應中過夜，將其連接在一起。將載體轉移感染到大腸桿菌内，並在3 7°C下培養過夜。選出經過分離的單一菌落，然後使用QIAGEN自旋管柱純化質體。藉著DNA定序證實正確的插入物。

C.製備載體DNA 使用設定為2500伏特，25微法拉第和200歐姆的Gene Pulser II (BIO-RAD，Hercules，CA)，將 1微克經過修改的 pCESl載體DNA (得自上文段落1B)轉化至40微升電反應潛能的XL1-blue大腸桿菌（得自上文段落1A)内。然後立刻將經過轉化的細菌試樣移至含有960微升SOC (2%胰蛋白酶水解產生的酶，0.5%酵母菌萃取物，10 mM NaCl，2.5 ^ 5 > O:\121\121929.DOC •156- 1336333 mM KCl ’ 20 mM葡萄糖，10 mM MgS〇4，10 mM MgCl2) 的試管中，並容許該培養物在37°C下生長，並振盪1小時》然後將細胞散播在2xYTAGT (2xYT，含有1〇〇微克/毫升氨芊青黴素，12.5微克/毫升四環素和2%葡萄糖）瓊脂培養盤上，並在37°C下培養過夜。藉著定序證實單一的菌落，並用來接種2公升的2xYTAGT培養基，並在37°C下振盪過夜。利用QIAGEN質體Maxi套組，根據製造者的草案，純化質體載體DNA。

D. 消化載體DNA 在37°C下，在含有2xNEB緩衝溶液2, 300單位ApaLI和 300單位Xhol的5000微升反應中，總共消化大約2000微克的載體DNA (得自上文段落1C)過夜。在37°C下培養該限制消化反應過夜，並在預先-製造的0.8%瓊脂糖凝膠（Embi Tec，San Diego，CA)中分析之。然後從凝膠中切下直線化的載體DNA，並根據製造者的指示，以QIAquick凝膠萃取套組（QIAGEN Inc·)萃取。 E. 庫募核苷酸的製備以衍生自上述結果的序列為基礎，設計六個庫寡核苷酸 (1個固定的和5個麻醉的）。一個固定的庫寡核苷酸為： 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKNNKS ARTGGGATCCGTGGASCNNKNNKNNKNNKNNKNNKN NKCATT CTCTCGAGATCA-3·(庫 20號）（序列識別：248號）而兩個70%麻醉的庫寡核苷酸如下： 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKaaKcgKccKNNKga 0:\121\121929.D0C •157- 1336333

KgaKatKttKggKNNKacKtaKcaKNNKNNKNNKCATTCTC TCGAGATCA-3·(庫 27 號）(序列識別：249 號） 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3'(庫99號）(序列識別：250號）；小寫字母代表具有70%指定鹼基，其他三種核甞酸各 10%的混合物。另外3個91 %麻醉的庫寡核苷酸如下： 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKNNKNNKcaKgaKgaKTGCgaKtg KgaKccKtgKacKTGCgaKcaKatKNNKNNKNNKCATTCTCTCGAGA TCA-3’（庫94號）(序列識別：251號）； 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKttKgaKtaKNNKgaKggKgtKgaKgaKcc KttKacKttKggKNNKgaKaaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3' (庫25號）(序列識別：252號）；和 5'-CACAGTGCACAGGGTNNKaaKttKaaKccKctKgaKgaKctKgaKga KacKctKtaKgaKcaKttKacKttKcaKcaKNNKCATTCTCTCGAGATCA-3' (庫26號）(序列識別：253號）；關於以上的寡，熟諳此藝者應瞭解"N"表示在寡合成期間，相等地代表四個核甞酸（A、T、C和G)中的每一個，而” K"表示在寡合成期間，相等地代表核甞酸G和T。小寫字母代表具有91%指定鹼基，其他三種核甞酸各3%的混合物。在PCR中分別使用這些寡核甞酸作為模板。至於PCR反應，使用延伸高忠實性的PCR系統套組 (Roche Diagnostics Corp·)。在含有 InM庫寡核替酸， -158-

〇：\121\121929.DOC 1336333 1XPCR緩衝溶液，引子： 5'-CACAGTGCACAGGGT-3·(序列識別：254號）；和 5.-TGATCTCGAGAGAATG-3'(序列言我別：255號）；各 300 nM ; 200 μΜ dNTP ’ 1.5 mM MgCl2 和 350 單位延伸聚合酶的96孔50微升之PCR反應中，擴大每個庫寡。使用熱循環器（GeneAmp PCR System 9700, Applied 81〇3}^61118)執行下列的程式：94°〇 5分鐘；（94°C 30秒’ 52.5〇C 60 秒，72°C 30秒）x 25個回合；72°C 10 分鐘；冷卻至4°C。然後使用QIAquick PCR純化套組（QIAGEN Inc. 目錄#28104)，根據製造者的草案，移除自由的核甞酸。 F. 消化庫寡核甞酸在37°C下，在含有2xNEB緩衝溶液2，750單位ApaLI和 750單位Xhol的1200微升反應中，消化每個庫的PCR產物（段落1E)過夜。在預先-製造的3%瓊脂糖凝膠（Embi Tec)上分離經過消化的DNA。從凝膠上切下得自每個反應的感興趣DNA譜帶，並利用COSTAR自旋-X離心管濾紙，0.22微米的乙酸纖維素（Corning Inc·，目錄#8160)萃取。 G. 將載體與庫募核甞酸連接使450微升的連接反應在16°C下過夜，其含有按照1:5之莫耳比例的直線化載體（段落1D)和每個經過消化的庫pcr 產物（段落IF)，1 X NEB連接緩衝溶液和20,000單位的T4 DNA連接酶。在65 °C下培養該連接產物20分鐘，使T4 DNA連接酶失活，並在37°C下與100單位Notl再培養2小時 O:\121\121929.DOC -159- 1336333 ，將載體的自我連接減至最少。然後藉著標準酚/氯仿萃取作用（Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Maniatis 等人’第 3版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory Press，2000) ’純化連接產物’並再懸浮於120微升H20中。 H.電穿透轉化作用針對每個庫’進行12個電穿透反應。對於每個轉化作用 ’在0.2-公分的比色杯（BIO-RAD)中，混合1〇微升的連接載體DNA (段落iG)和3〇〇微升的xl1_BLUe MRF，細胞（段落1A)。藉著設定為25〇〇伏特、25微法拉第和2〇〇歐姆的 Gene Pulserll，脈衝所得的混合物。然後混合得自12個電穿透反應的轉化細菌，並移至含有26毫升SOC的燒瓶中，在37C下培養1小時。將細胞加至45〇毫升2 X γτ A G中，並使其在37C下振盈生長5小時。在4°C下，以4000 rpm離心該細胞1 5分鐘。然後將細胞小球再懸浮於12毫升的15%甘油/2xYT中，並儲存在_80°C下。這是庫的原始母液。滴定顯示庫的尺寸為5·〇χΐ〇9 (庫20號）、3·3χ101()(庫94號）、 4·7χ109 (庫 25號）、5.0χ109 (庫 26號）、3.0Χ109 (庫 27號），和4.2χ109(庫99號）個獨立的轉化物。 2.庫的擴大作用 Α·製造二級的庫母液從原始的庫細胞母液（得自上文的段落1Η)中，使用包括 10Χ過量之每個庫尺寸的足夠細胞，來接種2xYTAGT (帶有100微克/毫升氨苄青黴素、12.5微克/毫升四環素和2°/。葡萄糖的2ΥΤ)培養基，使得起始OD6〇0為0.1。容許培養物在 O:\121\121929.DOC •160· 1336333 37°C下生長’並加以振盪數小時，直到〇D6QQ=〇.5為止。從每個庫中取出十分之一的等分，並在37。〇下在不同的燒弃瓦中生長另外2小時。然後在4〇C下，使用Beckman JA-14 旋轉子，以4000 rpm離心10分鐘，並將細菌小球再懸浮於 7·〇毫升（每個庫）15%甘油/2xYT中，儲存在-80°C下。 B·噬菌體誘導將Ml 3K07協助者嗟菌體等分（Amersham Pharmacia Biotech)加至〇D6〇〇=〇.5之剩下的細菌培養物（得自上文的段落2A)中，至3x109 pfu/毫升之終濃度。容許該協助者噬菌體在37°C下感染細菌30分鐘，不需振盪，再慢慢地振盪3〇分鐘。在4 °C下，以5000 rpm離心該感染細胞15分鐘。將細胞小球再懸浮於相同體積（得自上文的段落2A)的 2xYTAK培養基（帶有1〇〇微克/毫升氨苄青黴素和4〇微克/毫升康黴素的2YT)中。容許在30 °C下發生嗟菌體質體的產製過仪’同時加以振盡。 C.收獲噬菌體在4°c下，以5000 rpm離心得自上文段落2B的細菌培養物15分鐘。然後將上清液移至新的瓶子中，並加入〇 2倍體積的20% PEG/2.5M NaC卜在冰上培養i小時，使噬菌體質體》儿澱。在4 C下，以10,〇〇〇 rpm離心已經沉澱的嗤菌體質體30分鐘，並小心地再懸浮於1〇〇毫升冰冷的？]58中。藉著在4°C下以4000 rpm離心1〇分鐘，去掉剩下的細胞，進一步純化喔菌體質體容液，並藉著加入〇.2倍體積的2〇0/〇 PEG/2.5M NaCM，使噬菌體質體沉澱。在代下，以1〇〇〇〇 O:\121\121929.DOC -161 - 1336333 rpm離心噬菌體質體30分鐘，並將噬菌體質體小球再懸浮於18毫升冰冷的PBS中。將6毫升60%甘油溶液加至噬菌體質體的溶液中’並儲存在_80。〇下。藉著標準程序 (Molecular Cloning，Maniatis等人，第3版）判定噬菌體質體的力價。 3.擇Ang-2結合噬菌體 A·將Ang-2固定在磁性小珠上以每100毫升得自製造者之小珠母液含2〇〇〇微克Ang_2蛋白質的濃度’將生物素基化的Ang-2 (得自上文的段落3 A) 固定在Dynabead M-280鏈黴菌抗生物素蛋白（DYNal， Lake Success，NY)上。在使用磁鐵將小珠吸引至試管的一邊’並吸掉液體之後，以磷酸缓衝之生理鹽水沖洗小珠兩次’並再懸浮於PBS中。按上述的濃度，將生物素基化的Ang-2蛋白質加至沖洗過的小珠中，並在室溫下培養並旋轉1小時》然後藉著加入BSA至2%之終濃度，阻斷塗覆Ang-2的小珠’並在4°C下培養過夜，並加以旋轉。然後在接受選擇程序之前’先以PBST (帶有0.05%吐溫_2〇的 PBS)沖洗所得的塗覆Ang-2之小珠兩次。 B.使用塗覆Ang-2之小珠來選擇利用1毫升含有2% BSA的PBS，阻斷大約1000·倍庫相等物噬菌體質體（得自上文的段落2C) 1小時。藉著將其加至空白小珠（與段落3A相同的小珠，但無塗覆Ang_2蛋白質）中’並在室溫下培養該混合物15分鐘，並加以旋轉，使經過阻斷的噬菌體質體試樣接受三個陰性選擇步驟。使用磁 O:\121\121929.DOC -162· 1336333 鐵吸出含有上清液的嗤菌體質體，並移至第二個含有空白小珠（與在上文段落3A中之描述相同的小珠，但其上無塗覆Ang-2蛋白質）的試管中’並在室溫下培養該混合物15分鐘，並加以旋轉。重覆該程序。使用磁鐵吸出含有上清液的噬菌體質體，並移至含有塗覆Ang-2蛋白質之小珠（得自段落3A)的新試管中，並在室溫下培養該混合物1小時，並加以旋轉。在拋棄上清液之後’以2%牛奶-PBS沖洗與噬菌體質體結合的小珠10次；以2% BSA-PBS沖洗10次；以PBST沖洗1〇次 ;並以PBS沖洗2次。容許在旋轉器上，以1毫升1 〇〇三乙胺溶液（Sigma，St. Louis，MO)洗脫該噬菌體質體1〇分鐘。藉著加入0‘5毫升11^1[1^-11<31(卩117.5)中和含有嗤菌體質體之溶液的pH值。使用所得的嗟菌體質體，在37。〇下感染10毫升新近生長的XL 1 - B lue MRF’細菌（〇D6〇〇大約0.5) 30分鐘’不需振盪’再慢慢地振盪3〇分鐘。然後將所有被

感染的XL 1 -BLUE MRF1細胞平舖在15x15公分.的2xYTAG 盤上，並在30°C下培養過夜。 C.誘導和收獲噬菌體將10毫升等分的2XYTAGT培養基加至培養盤（得自段落 3B)中，再懸浮XL1-BLUE MRF，細胞。將所有的XL1· BLUE MRF’細胞收集在試管中，並將250微升等分的這些細胞加至25毫升2XYTAGT中，使其在37。(：下生長，直到 OD600=0.5為止。加入M13K07協助者嗤菌體，至3 χ 1〇9 Pfu/毫升之終濃度’並在37它下培養3〇分鐘，不需振盪， O:\121\121929.DOC -163- 1336333 再慢慢地振盪30分鐘。在4°C下，以5000 rpm離心該細胞 10分鐘，並再懸浮於25毫升2xYTAK中。容許這些細菌在 30°C下生長過夜，並加以振盪。按照段落2C，收獲並純化經過誘導的噬菌體質體。 D. 第2回合選擇按照在段落3B至3C中概述的進行第2回合的選擇，除了以下的之外。使用得自段落3C之大約100-倍庫相等物噬菌體質體作為輸入噬菌體質體。將塗覆在Dynabead M-280鏈黴菌抗生物素蛋白上的生物素基化之Ang-2蛋白質的含量（段落3A)減少至20毫微克。然後以2%牛奶-PBS沖洗與噬菌體質體結合的小珠10次；以2% BSA-PBS沖洗10次；以 PBST沖洗10次，在此處最後的沖洗涉及在室溫下，在 PBST中培養60分鐘。以PBS沖洗小珠兩次。洗脫條件與第 1回合（段落3B)相同。 E. 第3回合選擇按照在段落3B至3C中概述的進行第3回合的選擇，除了以下的之外。使用得自段落3D之大約10-倍庫相等物噬菌體質體作為輸入噬菌體質體。使用大約20毫微克的生物素基化之Ang-2蛋白質（知自段洛3A) ’來塗覆Dynabead M· 280鏈徽菌抗生物素蛋白。以2%牛奶-PBS沖洗與嗟菌體質體結合的小珠10次；以2% BSA-PBS沖洗10次；以PBST沖洗10次，在此處最後的沖洗涉及在室溫下，在PBST中培養60分鐘。以PBS沖洗小珠兩次。洗脫條件與第1回合（段落3B)相同。 O:\121\121929.DOC -164- 1336333 F.第4回合選擇按照在段落3B至3C中概述的進行第4回合的選擇，除了以下的之外。使用得自段落3E之庫相等物噬菌體質體作為輸入噬菌體質體。對於庫25、26和27，將塗覆在Dynabead M-280鏈黴菌抗生物素蛋白上的生物素基化之Ang-2蛋白質的含量（段落3 A)減少至0.4毫微克。對於庫20和94，塗覆含量保持為第3回合的2毫微克。庫99不進行第4回合的選擇步驟。洗脫條件與第1回合（段落3B)相同。 4.選殖分析 A. 製備主要的培養盤挑選得自第2回合選擇的單一菌落，並接種在每孔含有 120微升2xYTAGT的96孔培養盤中。在30°C振盪器中，培養該96孔培養盤過夜。在每孔中加入40微升60%甘油，儲存在-80°C下。

B. 噬菌體質體ELISA 將得自主要培養盤的大約2微升等分的細胞（得自上文的段落4A)，接種在新鮮的Costar® 96孔培養盤（Corning incorporated，Corning, NY，目錄#9794)中，其每孔含 100 微升2xYTAGT，並使該新培養盤的細胞在37°C下生長，直到大約Ο D 6 〇。=0.5為止。將40微升含有M13K07協助者噬菌體（1.5 X 1013cfu/毫升 )的2xYTAGT加至各孔中，並在37°C下培養96孔培養盤30 分鐘，不需振盪，再慢慢地振盪30分鐘。在4 °C下，以 2000 rpm (Beckman CS-6R桌上型離心機）離心培養盤10分 O:\121\121929.DOC -165- 1336333 鐘。從孔中移除上清液，並使用每孔1 50微升2χΥΤΑΚ，再懸浮每個細胞小球。為了噬菌體質體表現，在30°C下培養該盤過夜。在4°C下，以1微克/毫升在lxPBS中，將人類Ang-2蛋白質塗覆在96孔Maxisorp培養盤（NUNC)上過夜。在第二天時，在4°C下，以2000 rpm離心過夜的細胞培養物1〇分鐘。將得自每孔的各10微升上清液移至新的、含有BSA/PBS 溶液的96孔培養盤中，以1:10稀釋上清液。在室溫下培養所得的混合物1小時，並加以振盪，以便阻斷噬菌體質體。在此時，在室溫下以每孔400微升2% BSA/PBS溶液阻斷塗覆Ang-2蛋白質的培養盤1小時，同時加以振盪。拋棄 BSA溶液，並以PBS溶液沖洗各孔3次。在最後一次的沖洗步驟之後，在塗覆Ang-2蛋白質之培養盤和對照組培養盤的各孔中，加入100微升經過阻斷的噬菌體質體溶液，並在室溫下培養1小時，並加以攪拌。拋棄液體’並以PBST 溶液沖洗各孔三次。以15,000之稀釋度，在塗覆Ang-2蛋白質和對照組培養盤的各孔中，加入1〇〇微升HRP-共軛之抗-M13 mAb (Amersham Pharmacia Biotech)，並在室溫下培養這些培養盤1小時，並加以攪拌。再度拋棄液體，並以PBST溶液沖洗各孔三次。在孔中加入100微升LumiGLO 化學發光受質（Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) ’ 並藉著Luminoskan Ascent DLRearly機器（Labsystems，Franklin，MA)讀取各孔。 C.噬菌體纯種系的定序 O:\121\121929.DOC -166 - 1336333 使用1微升得自主要培養盤（段落4A)之各孔的細菌作為模板。每個PCR混合物的體積為50微升，其含有1 X PCR緩衝溶液、兩個引子：

5，-GTTAGCTCACTCATTAGGCAC-3'(序列識另|J : 256號）和 5，-GTACCGTAACACTGAGTTTCG-3'(序列識別：257號）；各 300 nM ; 200uM dNTP，2mM MgCl2 和 2.5 單位 taq DNA 聚合酶（Roche Molecular Biochemicals)。使用 GeneAmp PCR 系統 9700 (Applied Biosystems)，執行下列的程序：94°C 5分鐘；（94°C 45 秒，55 °C 45 秒，72°C 90秒）的40個回合；72 °C 10分鐘；冷卻至4 °C。利用 QIAquick 96 PCR純化套組（QIAGEN Inc.)，根據製造者的指示，純化 PCR產物。利用引子 5'-TTACACTTTATGCTTCCG-3'(序列識別：25 8 號），使用 ABI 3 770定序器（Perkin Elmer)，根據製造者的指示，定出所有經過純化之PCR產物的序列。 5.序列排列將已經從核苷酸序列轉譯的肽序列（得自上文的段落4C) ，與ELISA資料連貫起來。認為在塗覆Ang-2之孔中顯示出高OD讀數，並在塗覆BSA之孔中顯示出低OD讀數的純種系是較重要的。亦認為出現多次的序列是重要的。從庫 20中選出24個肽序列，從庫94中選出26個肽序列，從庫25 中選出7個肽序列，從庫26中選出18個肽序列，從庫27中選出6個肽序列，並從庫99中選出4個肽序列，進行進一步的分析和肽體產製。此外，亦從庫20和94中推衍出11個一 O:\121\121929.DOC -167- 1336333 致序列，從庫26和99中推衍出3個一致序列，並從庫25中推衍出2個一致序列，用來產製肽體。使用在本文之實例 10中描述的中和ELISA草案，來評估表7中的肽體。在表7 中出示該結果。表7

Co4衍生之親和力-成熟的Pbs hAng-2:Tie2 IC5〇 (nM) 肽體序列(序列識別號） C〇n4-44 (C) 0.09 M-Fc-GGGGGAQ-PIRQEECDWDPWTCEHMWEV-LE (序列識別：259號） Con4-40 (C) 0.10 M-Fc-GGGGGAQ-TNIQEECEWDPWTCDHMPGK-LE (序列識別：260號） Con4-4 (C) 0.12 M-Fc-GGGGGAQ- WYEQDACEWDPWTCEHMAEV-LE (序列識別：261號） Con4-31 (C) 0.16 M-Fc-GGGGGAQ-MRLQEVCEWDPWTCEHMENV-LE (序列識別：262號） Con4-C5 (C) 0.16 M-Fc-GGGGGAQ-AATQEECEWDPWTCEHMPRS-LE (序列識別：263號） Con4-42 (C) 0.17 M-Fc-GGGGGAQ-LRHQEGCEWDPWTCEHMFDW-LE (序列識別：264號） O:\121\121929.DOC 168- 1336333

Con4-35 (C) 0.18 M-Fc-GGGGGAQ-VPRQKDCEWDPWTCEHMYVG-LE (序列議別：265«) Con4-43 (C) 0.18 M-Fc-GGGGGAQ-SISHEECEWDPWTCEHMQVG-LE (序列識別：266¾) Con4-49 (C) 0.19 M-Fc-GGGGGAQ- WAAQEECEWDPWTCEHMGRM-LE (序列識別：267號） Con4-27 (C) 0.22 M-Fc-GGGGGAQ-TWPQDKCEWDPWTCEHMGST-LE (序列識別：268號） Con4-48 (C) 0.26 M-Fc-GGGGGAQ-GHSQEECGWDPWTCEHMGTS-LE (序列識別：269號） Con4-46 (C) 0.26 M-Fc-GGGGGAQ-QHWQEECEWDPWTCDHMPSK-LE (序列識別：270號） Con4-41 (C) 0.26 M-Fc-GGGGGAQ-NVRQEKCEWDPWTCEHMPVR-LE (岸列議別：271號） Con4-36 (C) 0.28 M-Fc-GGGGGAQ-KSGOVECNWDPWTCEHMPRN-LE (序列議別：272«) Con4-34 (C) 0.28 M-Fc-GGGGGAQ- VKTQEHCDWDPWTCEHMREW-LE (序列識別：273號） Con4-28 (C) 0.30 M-Fc-GGGGGAQ- AWGQEGCDWDPWTCEHMLPM-LE (序列識別：274號） Con4-39 (C) 0.30 M-Fc-GGGGGAQ-PVNQEDCEWDPWTCEHMPPM-LE (序列識別：275號） Con4-25 (C) 0.31 M-F c-GGGGGAQ-RAPQEDCEWDPWTCAHMDIK-LE (序列識別· 276號）

O:\121\121929.DOC -169- 1336333

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Con4-50 (C) 0.38 M-Fc-GGGGGAQ-HGQNMECEWDPWTCEHMFRY-LE (序列識別：277Sfc) Con4-38 (C) 0.40 M-Fc-GGGGGAQ-PRLQEECVWDPWTCEHMPLR-LE (序列識別：278统） Con4-29 (C) 0.41 M-Fc-GGGGGAQ-RTTOEKCEWDPWTCEHMESQ-LE (序列識別：279號） Con4-47 (C) 0.44 M-Fc-GGGGGAQ-QTSQEDCVWDPWTCDHMVSS-LE (序列識別：280號） Con4-20 (C) 0.48 M-Fc-GGGGGAQ-QVIGRPCEWDPWTCEHLEGL-LE (序列識別：281 St) Con4-45 (C) 0.48 M-Fc-GGGGGAQ- WA〇〇EECAWDPWTCDHMVGL-LE (序列識別：2M號） Con4-37 (C) 0.49 M-Fc-GGGGGAQ-T PGOEDCEWDPWTCEHMVRS-LE (序列識別：283ttJ Con4-33 (C) 0.52 M-Fc-GGGGGAQ-PMNQVECDWDPWTCEHMPRS-LE (序列識別：2845fc) AC2-Con4 (C) 0.52 M-Fc-GGGGGAQ-FGWSHGCEWDPWTCEHMGST-LE (序列議別：285號） Con4-32 (C) 0.75 M-F c-GGGGGAQ-KSTQDDCDWDPWTCEHMVGP-LE (序列識別：286ft) Con4-17(C) 0.96 M-Fc-GGGGGAQ-GPRISTCQWDPWTCEHMDQL-LE (序列識別：2875t) Con4-8 (C) 1.20 M-F c-GGGGG AQ-STIGDMCEWDPWTCAHMQVD-LE (序列識別：288號） AC4-Con4 (C) 1.54 M-F c-GGGGG AQ-VLGGOGCEWDPWTCRLLQGW-LE (序列織別：289ft) Con4-l (C) 2.47 M-F c-GGGGG AQ-VLGGQGCQWDPWTCSHLEDG-LE (序列議別：290¾) Con4-Cl (C) 2.75 M-Fc-GGGGGAQ- TTIGSMCEWDPWTCAHMQGG-LE •170- ς 1336333

(吃列識別：291號） Con4-21 (C) 3.21 M-Fc-GGGGGAQ-TKGKSVCQWDPWTCSHMQSG-LE (序列識別：292號） Con4-C2 (C) 3.75 M-Fc-GGGGGAQ-TTIGSMCQWDPWTCAHMQGG-LE (序列議別：293键>) Con4-18(C) 4.80 M-Fc-GGGGGAQ- WVNEVVCEWDPWTCNHWDTP-LE (序列識別：294«;) Con4-19(C) 5.76 · M-Fc-GGGGGAQ- VVQVGMCQWDPWTCKHMRLQ-LE (序列織別：295號） Con4-16 (C) 6.94 M-Fc-GGGGGAQ-AVGSQTCEWDPWTCAHLVEV-LE (库列識別：296號） Con4-ll (C) 9.70 M-Fc-GGGGGAQ-QGMKMFCEWDPWTCAHIVYR-LE (片列識別：297號） Con4-C4 (C) 9.80 M-F c-GGGGG AQ-TTIGSMCQWDPWTCEHMQGG-LE (序列識別：298¾) Con4-23 (C) 9.88 M-Fc-GGGGGAQ-TSQRVGCEWDPWTCQHLTYT-LE (序列識別：299») Con4-15 (C) 15.00 M-Fc-GGGGGAQ-QWSWPPCEWDPWTCQTVWPS-LE (序列議別：300¾) Con4-9 (C) 20.11 M-Fc-GGGGGAQ-GTSPSFCQWDPWTCSHMVQG-LE (序列識別：30丨號） Con4-10 (C) 86.61 M-Fc-GGGGGAQ· TQGLHQCEWDPWTCKVLWPS-LE (序列識別：302號> Con4-22 (C) 150.00 M-Fc-GGGGGAQ- VWRSQVCQWDPWTCNLGGDW-LE (序列識別：303¾ Con4-3 (C) 281.50 M-Fc-GGGGGAQ-DKILEECOWDPWTCQFFYGA-LE (序列識別：304¾) O:\121\121929.DOC 171 - 1336333

Con4-5 (C) 無抑制作巧 M-Fc-GGGGGAQ-ATFARQCQWDPWTCALGGNW-LE (序列識別：305號） Con4-30 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ· GPAQEECEWDPWTCEPLPLM-LE (序列識別：306ifc) Con4-26 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ- RPEDMCSQWDPWTWHLQGYC-LE (專列識別：307號） Con4-7 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ- LWQLAVC〇WDP〇TCDHMGAL-LE (终列識別：308號) Con4-12 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ-TOLVSLCEWDPWTCRLLDGW-LE (序列識別：309號） Con4-13 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ- MGGAGRCEWDPWTCQLLQGW-LE (序列識別：310號） Con4-14 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ-MFLPNECQWDPWTCSNLPEA-LE (岸列識別：31丨號> Con4-2 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ-FGWSHGCEWDPWTCRLLQGW-LE (序列識別：312號） Con4-6 (C) 今抑制作巧. M-Fc-GGGGGAQ-WPQTEGCQWDPWTCRLLHGW-LE (房列識別：313¾) Con4-24 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ- PDTRQGCQWDPWTCRLYGMW-LE (序列識別：314统） ACl-Con4(C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ- · TWPODKCEWDPWTCRLLQGW-LE (序列識別：315tt) AC3-Con4 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ-DKILEECEWDPWTCRLLQGW-LE (序列識別：316號） AC5-Con4 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ-AATQEECEWDPWTCRLLQGW-LE (序列識別：317號） O:\121\121929.DOC •172· 1336333

L1衍生之親和力-成熟的Pbs hAng-2:Tie2 IC5〇(nM) 肽體序列（序列識別號：） L1-7CN) 0.03 MGAQ- TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG- LEGGGGG-Fc (序列識別：318ft) AC6-L1 (N) 0.03 MGAQ- TNYKPLDELDATLYEHWILQHS LEGGGGG-Fc (序列識別：319號） Ll-15 (N) 0.04 MGAQ- QKYQPLDELDKTLYDQFMLQQG LEGGGGG-Fc (序列識別：320號） L1-2(N) 0.04 MGAQ-LNFTPLDELEQTLYEQWTLQQS LEGGGGG-Fc (序列識別：321號） L1-10(N) 0.05 MGAQ- QKPQPLDELEQTLYEQFMLQQA LEGGGGG-Fc (岸列識別：322St) Ll-13 (N) 0.05 MGAQ- QEYEPLDELDETLYNQWMFHQR LEGGGGG-Fc (房列識別：323號） LI-5 (N) 0.05 MGAQ-VKYKPLDELDEILYEQQTFQER LEGGGGG-Fc (岸列識別：324% L1-C2 (N) 0.05 MGAQ- TKFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (序列識別：325號） L1-C3 CN) 0.06 MGAQ- TNFQPLDELDQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (序列識別：326St) Ll-11 (N) 0.07 MGAQ- QNFKPMDELEDTLYKQFLFQHS LEGGGGG-Fc (序列識別：327號） O:\121\121929.DOC 173· 1336333

L1-17(N) 0.08 MGAQ- VKYKPLDELDEWLYHQFTLHHQ LEGGGGG-Fc (序列識別：328¾) L1-12(N) 0.08 MGAQ- YKFTPLDDLEQTLYEQWTLQHV LEGGGGG-Fc (序列識別：3294t) Ll-1 (N) 0.08 MGAQ-QNYKPLDELDATLYEHFIFHYT LEGGGGG-Fc (房列谁別：330號） LI-4 (N) 0.08 MGAQ- VKFKPLDALEQTLYEHWMFQQA LEGGGGG-Fc (序列識別：331號） Ll-20 (N) 0.09 MGAQ- EDYMPLDALDAQLYEQFILLHG LEGGGGG-Fc (序列識別：332號） LI-22 (N) 0.09 MGAQ- YKFNPMDELEQTLYEEFLFQHA LEGGGGG-Fc (序列識別：333號） L1-14(N) 0.11 MGAQ- SNFMPLDELEQTLYEQFMLQHQ LEGGGGG-Fc (序列識別：334ft) L1-16CN) 0.11 MGAQ- QKFQPLDELEETLYKQWTLQQR LEGGGGG-Fc (序列識別：335ft) L1-18(N) 0.16 MGAQ-QKFMPLDELDEILYEQFMFQQS LEGGGGG-Fc (序列識別：3365fc) Ll-3 (N) 0.16 MGAQ- TKFNPLDELEQTLYEQWTLQHQ LEGGGGG-Fc (序列儎別：337號） Ll-21 (N) 0.17 MGAQ- HTFQPLDELEETLYYQWLYDQL LEGGGGG-Fc (序列識別：338號） O:\121\121929.DOC •174· 1336333

Ll-Cl (N) 0.56 MGAQ- QKFKPLDELEQTLYEQWTLQQR LEGGGGG-Fc (序列識別：339號） Ll-19 (N) 1.26 MGAQ- QTFQPLDDLEEYLYEQWIRRYH LEGGGGG-Fc (序列識別：340號） Ll-9 (N) 1.62 MGAQ- SKFKPLDELEQTLYEQWTLQHA LEGGGGG-Fc (序列識別：341號) Coni衍生之親和力·成熟的Pbs hAng-2:Tie2 IC5〇 (nM) 肽體序列（序列識別號：） Con 1-4 (C) 1.68 M-Fc-GGGGGAQ-SGQLRPCEEIFGCGTQNLAL-LE (岸列識別：342號） Conl-1(C) 3.08 M-Fc-GGGGGAQ- AGGMRPYDGMLGWPNYDVQA-LE (序列議別：343tt) Coni-6(C) 8.60 M-Fc-GGGGGAQ-GODLRPCEDMFGCGTKDWYG-LE (序列識別：344號） Con 1-3 (C) 16.42 M-Fc-GGGGGAQ-APGQRPYDGMLGWPTYQRIV-LE (序列識別：345») Coni-2(C) 無抑制作JL M-Fc-GGGGGAQ-QTWDDPCMHILGPVTWRRCI-LE (序列識別：346tt) Coni-5 (C) 無抑制作用 M-Fc-GGGGGAQ-FGDKRPLECMFGGPIQLCPR-LE (序列識別：347號) 親代:Coni (C) 26.00 M-Fc-GGGGGAQ-KRPCEEIFGGCTYQ- LE (序列識別：348號） O:\i21U21929.DOC 175- < 5 12-9衍生之親和力-成熟的Pbs hAng>2:Tie2 IC5〇(nM) 肽體序列（序列識別號：） 12-9-3 CC) 0.81 M-Fc-GGGGGAQ-LQEWCEGVEDPFTFGCEKQR-LE (序列識別：349ft) 12-9-7 CC) 0.93 M-Fc-GGGGGAQ-MLDYCEGMDDPFTFGCDKQM-LE (岸列識別：350Jt) 12-9-6 (C) 0.95 M-Fc-GGGGGAQ-HOEYCEGMEDPFTFGCEYQG-LE (4列識別：351和 12-9-C2 (C) 1.41 M-Fc-GGGGGAQ-LODYCEGVEDPFTFGCENQR-LE (序列識別：352ft) 12-9-5 (C) 1.56 M-Fc-GGGGGAQ-LLDYCEGVQDPFTFGCENLD-LE (序列識別：353it) 12-9-1 (C) 1.84 M-Fc-GGGGGAQ-GFEYCDGMEDPFTFGCDKQT-LE (岸列識別：354號〉 12-9-4(0 2.05 M-Fc-GGGGGAQ-AODYCEGMEDPFTFGCEMQK-LE (寿列識別：355ft) 12-9-C1' (C) 2.68 M-Fc-GGGGGAQ-LODYCHGVEDPFTFGCEKQR-LE (序列識別：356ft) 12-9-2 CC) 8.42 M-Fc-GGGGGAQ-KLEYCDGMEDPFTQGCDNQS-LE (序列識別：357St) 親代：12-9 (C) 15.00 M-Fc-GGGGGAQ- · FDYCEGVEDPFTFGCDNH-LE (序列識別：358就）實例9 測試六個抗- Ang2肽體之試樣，在BIAcore上與huAng2 (R&D Systems，BNO12103A)結合的活性。根據標準胺-偶聯草案（BIAcore Inc.)，將蛋白質G固定在CM5晶片上，然後將肽體注射到蛋白質G表面上進行捕捉（RL約100 Ru) ° 欲測試在hAng2和捕捉肽體之間的結合，將〇·3 nM至40 riM 的huAng2注射到捕捉肽體的表面上，並使用ΒΙΑ評估3.0 O:\121\121929.DOC •176· 1336333 (BIAcore Inc.)分析結合感應器圖。表8概述該實驗的結果。表8 肽體批號 KD(M) ka (1/Ms) kd (1/s) C〇n4-44 (C) 011702 2.1E-10 2.9E+05 5.9E-05 Ll-7 (N) 022102 2.4E-10 3.7E+05 8.7E-05 L1-10(N) 021302 7.7E-10 1.5E+05 1.1E-04 Ll-21 (N) 021802 2.4E-10 5.6E+05 1.4E-04 Con4 (C) 33456-77 3.8E-10 5.3E+05 2.0E-04 2xCon4 (C) IK 092501 3.4E-10 4.8E+05 1.6E-04 實例10

中和ELISA 以DMEM/50微克/毫升BSA如下稀釋人類、老鼠、犬和大鼠Ang-2，以及人類和老鼠Ang-Ι的調理培養基：hAng-2-1:64稀釋；mAng-2-l:64稀釋；大鼠Ang-2-不稀釋；犬 Ang-2-l:32 稀釋；hAng-l-l:4 稀釋；和 mAng-l-l:4 稀釋。藉著其在50%可達成之最大結合時（也就是高原期），與1 nM hTie2-Fc (以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分僅含有該分子之可溶的細胞外部分；R&D Systems，目錄第3 13-TI號）結合的能力，來判定這些調理培養基每一個的稀釋程度。以100微升經過稀釋的調理培養基塗覆微量滴定盤。關於Ang-2中和ELISA，以含有大約1% BSA和大約1 nM Tie-2 (以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部分僅含有該分子之可溶的細胞外部分；R&D Systems，目錄第313-TI號）的 PBS溶液4-倍稀釋，從62.5 nM至0.015 pM，滴定候選的抗- Ang-2肽體。至於Ang-2中和ELISA，以含有大約1% BSA和大約1 nM Tie-2 (以Tie-2-Fc分子提供，其中Tie-2部 O:\121\121929.DOC -177- 1336333 分僅含有該分子之可溶的細胞外部分；R&D Systems，目錄第313-TI號）的PBS溶液4-倍稀釋，從1000 nM至0.2 pM ，滴定候選的抗-Ang-2肽體。在各孔中加入大約100微升肽體/Tie-2溶液之後，在室溫下培養該盤過夜，然後以含有大約1%吐溫-20的PBS沖洗5 次。在沖洗之後，加入每孔大約100微升的抗-Tie-2抗體 (Pharmingen Inc.，目錄#557039)至大約每毫升1微克之終濃度，並在室溫下培養該盤大約1小時。接著，以在含有大約1% BSA之PBS中1:10,000的稀釋度，加入每孔大約 100微升的山羊抗-老鼠- IgG-HRP (Pierce Chemical Co.，目錄#31432)。在室溫下培養該盤大約1小時，隨後以含有大約0.1%吐溫-20的PBS沖洗5次。然後加入每孔大約100微升的TMB溶液（SIGMA，目錄#T8665)，並容許藍色顯現。然後在分光光度計的370毫微米處，讀取吸光度。在下文表9中陳述其結果。表9 肽體-調節之血管生成素：Tie2交互作用的中和作用 hAng-2 mAng-2 rAng-2 cAng-2 hAng-1 mAng-2 肽體 IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) IC5〇 (nM) 2xCon4 (C) 0.026 0.035 0.024 0.047 3.0 3.2 Con4(C) 0.197 0.298 0.236 0.540 200 300 Con4-44 (C) 0.08 0.16 0.22 —— 43 — Con4-40 (C) 0.20 0.27 0.35 —— > 1000 — Ll-7 (N) 0.046 0.063 0.035 0.108 > 1000 > 1000 Ll-21 (N) 0.179 0.249 0.204 0.608 > 1000 > 1000 L1-10(N) 0.06 0.06 0.06 — > 1000 — O:\121\121929.DOC -178- 1336333 實例11 pk研究研究設計將重20-30克的雄性CD-1老鼠隨機分到每個肽體處理組 (2xCon4-C，L1-7-N和Ll_21-N)内。動物接受50微克肽體的單一 IV團塊0=38/組）或單一 SC投藥（n=34/組）。關於IV 和SC投藥’分別經由尾靜脈和在肩膀皮膚下進行注射。血液採樣和分析方法針對每個抗-Ang2肽體濃度測量之預定劑量，並在％和 IV組的投藥後 1、2、4、8、16、24、48、72 ' 96、120、 144、168、216、264、3 12和336小時，收集血液試樣。對於IV組，在投藥後5和30分鐘時收集額外的試樣。每個時間點對兩隻動物採血，並在採樣後犧牲動物。從心臟穿刺 ’將血液（大約〇·50毫升）收集至聚丙烯micr〇tainer@血清分離管中。將試樣放在冰上大約20分鐘，或直到發生凝塊形成為止。藉者在2-8C下離心大約1〇分鐘，從血液試樣中分離血清，並儲存在大約_7(rc下，直到進行測定為止。使用經過校準、具有100毫微克/毫升之定量下限（ll〇q)的時間分辨螢光（TRF)測定，來測量試樣。以重組的老鼠 Ang-2蛋白質塗覆NUNC flu〇r〇Maxis〇rp微量滴定盤。然後利用蛋白質溶液阻斷該盤，以便減少非專一性的結合。在老鼠血清測定緩衝溶液中，製備標準物、品質控制組 ^未知試樣，並吸移至微量較盤的孔中。肽體與⑽固疋之Ang-2專一地結合。在沖洗掉任何未結合的受質

O:\121\121929.DOC -179- 1336333 (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)之後，在孔中加入生物素基化的山羊抗-人類IgG (H+L)單株抗體（jackson ImmunoRe search Laboratories Inc，）。在移除任何未結合之生物素基化單株抗體的沖洗步驟之後，在孔中加入销標示之鏈黴菌抗生物素蛋白。在沖洗掉未結合的鏈黴菌抗生物素蛋白銪之後，利用將酸性溶液吸移到各孔中，使已結合的銪從鏈黴菌抗生物素蛋白中釋放出來。產生螢光信號，並在Wallac's螢光讀取器中讀取。在老鼠血清中分析抗_ Ang-2肽體的測定範圍是0.078-5微克/毫升。藥物動力學分析使用 WinNonlin Professional (3.3 版，Pharsight Corp·，

Mountain View，CA)，使每組的綜合平均濃度_時間數據接受無隔間的分析。PK分析所使用的票面採樣時間，在票面時間的10%内收集試樣。在PK分析之前，將所有低於 LLOQ的濃度值言史定為〇。估計下歹丨j的ρκ參數： •以twflnpVKe#算終點半衰期，其中^為經由終點對數-線性蛻變期的線性回歸，來評估的一級終點速率常數。 •使用線性/對數梯形方法’從時間〇至最後，最後可定量之濃度的時間（C,ast)，來評估在企清濃度_時間曲線下的面積（AUC(().last))。 •以相對應之八1；(：(()七叫和預測Cust/ke|值的總和，來評估在從時間〇至無限大之曲線下的面積（AUC(〇 c〇)):

O:\121\121929.DOC •180· 1336333 AUC(〇.00) = AUC(〇-last)+ 預測的 CUst kel •如下計算在SC投藥之後的絕對生物利用性（F): F= + ^C(〇-^)sc χ 1〇〇 AUCn〇〇、τν 在圖2中陳述其結果。實例12 在研究第0天’以lxl〇7個A431細胞皮下注射雌性的裸鼠。在第3天’以200微克/老鼠/天之劑量，皮下投與Ang-2肽體2xC〇n4-C。以規律的間隔記錄腫瘤體積和體重，如同圖中所示。在Ang-2肽體-處理組對媒劑對照組和對照組肽體之間’觀察到腫瘤生長的明顯差異（p〈〇.〇〇〇丨對每個對照組 ’使用重覆測量ANOVA ’與Scheffe's post hoc檢定）。利用該肽體的處理’對體重沒有顯著的影響。在圖3中陳述其結果。實例13 A431在活體外的生長曲線以每孔2000個細胞，在200微升補充有1〇%胎牛血清 (FBS)之DMEM中，將A431細胞播種在96孔的組織培養盤上。在播種之後’對培養基抽氣丨6小時。然後將下列的物質加回孔中，並建立一式三份：每孔1〇〇微升DMEM，1〇% FBS ’ 1毫克/毫升陰性對照組肽體4883，或肽體TN8 C〇n4 。在5個培養盤上重覆相同的組合。在處理後24、48、72 、96和120小時，對得自一個培養盤的培養基抽氣。然後

O:\121\121929.DOC •181- 在各孔中加入100微升10〇/〇三氯乙酸（TCA)，然後將培養盤儲存在4它下。收集所有的培養盤，此時最後一個培養盤已經在10% TCA中至少4小時。甩乾i 〇% TCA，並以自來水冲洗各孔5次。然後在室溫下，以i 〇〇微升在i %乙酸 (Sigma A-6283)中之〇.4%硫若丹明 B (Sigma s_9〇12)，將細胞染色10分鐘，並以1%乙酸沖洗5次。然後風乾培養盤。在旋轉振盪器上，利用300微升2〇 mM未緩衝之THs (pH>10)加溶染料2小時。然後在微量滴定盤讀取器54〇毫微米處，讀取光密度（OD)。在圖4中陳述其結果。實例14 在研九第0天，以2x 10個C〇1〇-205細胞加Matrigel (2:1) 皮下注射雌性裸鼠。在第3天，以14微克/老鼠之劑量，一週兩次皮下投與Ang-2肽體L1-7-N、L1-21-N、Con4-C和 2xCon4-C。一週三次投與抗-八％·]抗體，Ab536，47微克/ 老鼠’作為陽性對照組。按照規律的間隔，記錄腫瘤體積和體重。在每一種Ang-2肽體處理組對媒劑對照組和對照組肤體之間，觀察到腫瘤生長的顯著差異（p<〇〇〇〇1對每種對照組 ’使用重覆測量ANOVA，與Scheffe，s post hoc檢定）。利用這些肽體的處理，對體重沒有顯著的影響（結果未顯示）。在圖5中陳述其結果。實例15 在研究第0天，以2χ106個c〇1〇_2〇5細胞加Matrigei (2… 皮下'主射雌性裸鼠。在第3天，以14、2.8和0.56微克/老鼠

〇:\121W21929.D〇C 1336333 之劑量’一週兩次皮下投與Ang-2肽體2xCon4-C。按照所示的規律間隔，記錄腫瘤體積和體重。在兩種較高劑量之 Ang-2肽體處理組對媒劑對照組和對照組肽體之間，觀察到腫瘤生長的顯著差異（中間劑量的p=〇〇〇3，而高劑量的 ρ<0·0001 ’ 使用重覆測量 ANOVA，與 Scheffe's post hoc檢定）。利用這些肽體的處理，對體重沒有顯著的影響。破折線代表組別之總η值’從10隻減少至9隻老鼠，歸因於一隻老鼠不明原因地死亡。在圖6中陳述其結果。實例16 抗-Ang-2肽體對Colo-205異種移植之腫瘤在研九弟0天’以2x10個Colo-205細胞加Matrige 1 (2:1) 皮下注射雌性裸鼠。在第3天’以35〇微克/天之劑量，皮下投與Ang-2肽體2xCon4-C或對照組肽體。在第14天（尺寸-配合對照組）或第18天（時間-配合對照組），收獲得自以對照組肤體處理之組別的腫瘤（如同在表5中描述的）β然後在第18天，收獲得自2xCon4(C)的腫瘤按照所示的規律間 1¾ ’ 5己錄腫瘤體積。在時間-配合對照組和2xc〇n4-C處理組之間’觀察到腫瘤生長的顯著差異（p=〇〇154，藉著重覆測量AN0VA ’與Scheffe’s post hoc檢定）。利用這些肽體的處理，對體重沒有顯著的影響。將為了影像分析準備的腫瘤從頂部分切為二，並將一半猛然冷束於 OCT (Sakura Finetek USA Inc.，Torrance，CA) 中。使用帶有作為色原之DAB的2微克/毫升之抗-老鼠 CD31 (目錄 #553370，BD PharMingen，San Diego, CA)，以 O.M21\121929.DOC -183 - 1336333 免疫組織化學之方式染色冷凍-切片。以20X物鏡放大率，拍攝腫瘤切片的數位照片。捕捉每個腫瘤的四個"包圍點" 領域’每種處理組有1〇個腫瘤。對於在影像内被〇〇31染色之血管的門棰’使用MetaMorph (Universal Imaging Corporation，Downington，PA)影像分析系統。以在每個領域内的總腫瘤組織之比例，表現CD3 1陽性染色的面積。在圖7中陳述其結果。實例17 在研究第0天，以2χ1〇6個Colo-205細胞加Matrigel (2:1) 皮下注射雌性裸鼠。從研究第3、1〇或15天開始，以35〇微克/老鼠’皮下，一週兩次的Ang-2肽體2xCon4-C，或以相等的對照組肽體處理。按照規律的間隔，記錄腫瘤體積和體重。在所有的Ang-2肽體處理組對媒劑對照組之間，觀察到腫瘤生長的顯著差異（第15天組，p = 〇〇89，而第3和第 10天組’ p<0.0001，使用重覆測量ANOVA，與Scheffe's post hoc檢定）》利用這些肽體的處理，對體重沒有顯著的影響。在圖8中陳述其結果（未顯示體重）。實例18 在A43 1和Colo-205異種移植的模式中，使用以47微克/ 雕性裸鼠之劑堇的抗體Ab536，一週三次腹腔内投與，或按照在不同的長期研究（>10週投藥）中之多次投藥時間表 ’給與肽體2xCon4(C)，獲得完全反應（CR)率的概要。在本文中使用的CR，意指在治療之後，其中沒有剩下可測量之腫瘤的成果。在圖9中陳述其結果。 O:\121\121929.DOC -184- 1336333 實例19 a) 在C〇1〇-205腫瘤模式中，混合pb與剋癌易在研究第0天’以2xl〇6個Colo-205細胞加Matrigel (2:1) 皮下注射雌性裸鼠。在研究第14天，開始以a) 35〇微克/老鼠’皮下，一週兩次的Ang-2肽體2xCon4-C，b) 20毫克/公斤’一週三次，腹腔内的剋癌易，或c)兩者混合處理。按照規律的間隔，記錄腫瘤體積和體重。在所有的處理組對媒劑對照組之間’觀察到腫瘤生長的顯著差異（p<〇〇〇〇1 ’使用重覆測量ANOVA，與Scheffe's post hoc檢定）。此外’混合治療組與任一個單一治療劑有顯著的差異 (p<0.0001對2xCon4-C，且p = 〇.〇122對剋癌易）。破折線代表組別之總η值，從1〇隻減少至9隻老鼠，歸因於一隻老鼠不明原因地死亡。利用這些肽體的處理，對體重沒有顯著的影響。在圖l〇a中陳述其結果。

b) 在Colo-205腫瘤模式中，混合Pb與5-FU 在研究第0天，以2xl06個Colo-205細胞加Matrigel (2:1) 皮下注射雌性裸鼠。在研究第14天，開始以a) 35〇微克/老鼠’皮下’一週兩次的Ang-2肽體2xCon4-C，b) 50毫克/公斤，一週5次，腹腔内的5-FU，或c)兩者混合處理。按照所示的規律間隔，記錄腫瘤體積和體重。在所有的處理組對媒劑對照組之間，觀察到腫瘤生長的顯著差異（p<〇.〇〇〇1，使用重覆測量AN0VA，與Scheffe's post hoc檢定）。此外，混合治療組與任一個單一治療劑有顯著的差異（p=〇.〇375 對 2xCon4-C，且 ρ=0·0453 對 5-FU)。 O:\121\121929.DOC -185- 1336333 在5-FU處理組（在研究第2〇天時18%)和混合治療組（在研究第20天時16%)中，觀察到體重的暫時降低，隨後完全恢復體重。在圖10b中陳述其結果。實例20 佐劑關節炎模式在12-小時亮/暗循環的環境控制室（溫度23±2t，相對濕度 50 ±20%)中，將雄性Lewis 大鼠（120-130 克，charles

River，Wilmington ΜΑ)飼養在兩個分別以濾紙加蓋的籠子中。傲食動物市售的嚆齒動物食物（配方864〇; Tek Lab， Madison，WI) ’並可無限制地收到濾紙_純化的自來水。飼糧中鈣和磷的含量分別為1.2。/〇和1 .〇%。藉著在尾根部’皮内單次注射懸浮於〇〇5毫升石蠛油 (Crescent Chemical Co·，Hauppauge，ΝΥ)中之 0.5 毫克熱-殺死的結核桿菌 H37Ra (Difco Laboratories, Detroit, MI)，誘導佐劑關節炎。在第9天時，出現藉由後腳掌腫脹和行走困難所代表的關節炎之臨床症狀。除了 2xC〇n4(c)處理組（從免疫後第1天起處理）之外，在免疫後第9天開始，給與每曰皮下注射的處理（在關節炎發作之前），並持續到第i 8 天。佐劑關節炎的臨床監視在臨床上藉著間歇地測量後腳掌體積，使用根據由

Feige等人，Cellular Molec. Life Sci., 57:1457-1470 (2000) 描述之方法的水體積描記法，來評估炎症的進行。以在曲線下之面積（AUC)為基礎，使用根據下式的梯形規則，來 O:\121\121929.DOC -186· 計算腳掌炎症的抑制作用： [1-{(經過處理的AdA)-正常值)/(未經處理之AdA_正常值）}]χ1〇〇此外，在9-天的治療攝生法期間内，每天判定總體重，作為補充的終點，因為在關節炎模式中，體重喪失已經顯不關節炎症的平行進行。在第18天時，在c〇2下犧牲動物。在驗屍時（免疫後第18天），檢查骨礦物質密度（BMD)的喪失。在軟毛分界處（正好在足騍（後腳踝）附近）移除後腳掌’浸泡在70%乙醇中’然後以水平方向使用扇形光束χ_ 射線光密度計（QDR-4500A型；Hologic，Waltham，ΜΑ)掃描。參見Feige等人，在前。在掃描之後，放好中心位置在跟骨（calcaneus)的長方形盒子（29x25毫米），以便描繪出待分析之位置的輪廓，並以有專利的演算法（H〇1〇gic軟體）計算骨面積、骨礦物質内含量和骨礦物質密度。所有的結果均以平均值土標準差來表示。使用〇〇5iP值 ’描述在組別之間的顯著差異。使用市售的統計軟體 (StatSoft 3.0 版；StatSoft，Tulsa，OK)，對臨床數據（連續變數）進行 Kruskal-Wallis AN0VA 和 Mann-Whitney U.檢定。分別在圖11 a、11 b和11 c中陳述其結果。實例21 角膜血管生成模式在大鼠中C〇n4(C)對VEGF-誘導之血管生成的影響在大鼠的血管生成之角膜模式中，評估Ang-2肽體 Con4(Cp藉著將VEGF-(或BSA對照組）浸泡的尼龍圓盤植入角膜基質内，誘導血管生成作用（n=8/組）。藉著皮下注 0:\121\121929.D0C -187- 1336333

射投與⑽(Μ毫克/大鼠/天的肤體侧㈤心持續了天。另兩組動物則以相同劑量的陰性對照組肽體4嶋理。所有組別均以單-負荷劑量的3〇或〇3毫克進行前處理，其為維持劑量10或(M毫克的3倍（參見圖式）。在處理7天之後’從每個大鼠角膜的數位照片中，判定兩個血管終點 :在圓盤與角膜鞏膜連結部之間的中點處交又的血管數目’以及血管面積。以TN8c〇N4_c處理，以劑量-依賴性的方式，明顯地抑制了 VEGF_誘導的血管生成作用 (P<0.04)，，而以對照組肽體處理，對任—終點均無顯著影響。以接受處理之動物的體重為基礎，並沒有明顯毒性的證據。在圖12中陳述其結果。實例22 抗原決定位作囷

將全長（胺基酸1-495)、N-終端（胺基酸丨-以句和^終端（胺基酸255-495)的人類Ang-2 (hAng-2)蛋白質，選殖到帶有C-終端6xHis標籤之CMV推動的哺乳動物表現載體内。暫時性地在293T細胞中表現三個所得的構築體，加載體對照組。然後從經過轉移感染的細胞中，收集調理培養基，並藉著抗-6xhis ELIS A和西方墨點法，評估在培養基中 Ang-2的表現程度。經由ELISA，根據下列的草案，藉著其與三種版本之人類hAng-2結合的能力，判定抗- Ang-2抗體和肽體的結合抗原決定位：以100微升調理培養基塗覆高-結合之96-孔測定盤的各孔，並在37 °C下培養1小時。吸出調理培養基，並

O:\121\121929.DOC •188·

1336333 在室溫下，以每孔200微升在PBS中的5% BSA阻斷該盤1小時。然後吸出阻斷溶液。以1微克/毫升（在在PBS中之1% BSA中），加入每孔100微升抗體、肽體或Tie2-Fc，並在室溫下培養1小時。以200微升在PBS中的0.1%吐溫沖洗該孔 4次。每孔加入1〇〇微升HRP-共軛的山羊抗-人類IgG或山羊抗-老鼠IgG，並在室溫下培養45分鐘》然後以200微升在 PBS中的〇. 1 %吐溫沖洗該孔4次。然後每孔加入1 〇〇微升 TMB受質。在370毫微米處讀取O.D.值。分別在圖13a、圖13b和圖13c中陳述其結果》實例23 因為在BiaCore測定中有某些敏感性的限制，亦使用 Sepidyne KinExA測定來評估結合親和力。在 KinExA (Sapidyne，Boise，ID)上測試 2xCON4-C (Pb5714)與huAng-2的結合作用。預先以huAng-2塗覆 Reacti-Gel 6x 小珠（Pierce，Rockford，IL)，並以BSAP且斷。在跑過塗覆huAng-2的小珠之前，先將10 pM和30 pM的 2xCON4-C試樣與各種濃度（0.3 pM-3 nM)的huAng-2—起在室溫下培養8小時。藉著螢光（Cy5)標示之山羊抗-人類-Fc 抗體（Jackson Immuno Research, West Grove, PA)，定量與小珠結合之肽體的量。結合信號與平衡時自由肽體的濃度成比例。使用雙-曲線單一-位置均一結合模式（KinExTM軟體），從競爭性曲線的非線性回歸中獲得解離平衡常數（KD) »然後判定KD為大約2 pM的2xCON4-C與HuAng-2結合。 O:\121\121929.DOC -189- < 5 > 1336333 如同在圖14中所示的，使用KinExA測定，顯示肽體 2xCon4對hAng-2具有大約2 pM之親和力。實例24 聚乙二醇化的肽以43 1 ABI合成器’使用標準偶聯草案以及雙重偶聯，從殘基14(met)至N-終端殘基l(Cys)(從N-終端至C-終端編號），合成L1-7肽。 L1-7狀與甲氧基-聚（乙二醇）-順丁烯二醢亞胺的共軛作用 ;分子量：5KDa ;稱為”mPEG5K-(Ll-7肽），，利用13.5毫克曱氧基-聚（乙二醇）-順丁烯二醯亞胺（分子量=5KDa ; Shearwater Corp.)(0.27毫升在緩衝溶液1中的 50.0毫克/毫升溶液），處理在400微升緩衝溶液1 (2〇酸鹽，5 mM EDTA ’ pH 6.5)中之0.8毫克L1-7肽的溶液。在4 °C下培養該反應混合物過夜，然後以1 6毫升緩衝溶液 A (20 mM Tris 鹽酸鹽，pH 7.2)稀釋，並在 Slide_A_Lyzer 卡匣（3500 MWCO, Pierce)中，對相同的緩衝溶液透析。藉著離子父換層析法，在1.0毫升HiTrap Q瓊脂糖HP管柱 (Amersham Biosciences Corp.)上，純化經過透析的反應混合物。經由從100%緩衝溶液八至100%緩衝溶液3 (緩衝溶液A+0.5 M NaCl)的梯度，超過40份管柱體積，在兩個i 〇毫升的溶離份中洗脫出產物高峰。利用Mier〇sep 1K離心裝置（Pall Life Sciences)，將混合的產物溶離份濃縮至25〇微升’含有0.23毫克蛋白質/毫升。 L1-7肽與i，u-雙-順丁烯二醢亞胺基四乙二醇的共軛作用 O:\121\121929.DOC •190- ;稱為 ’’PE04 (L1-7肽）2Π 以0.03 75毫克的1，11-雙-順丁烯二醯亞胺基四乙二醇 (Pierce)(0.3 75毫升在緩衝溶液1中的0.1毫克/毫升溶液），處理在500微升緩衝溶液1 (20 mM磷酸鹽，5 mM EDTA， pH 6.5)中之1.0毫克L1-7肽的溶液。在4°C下培養該反應混合物3.33小時，然後在81丨(16-人-1^761*卡匣（3500 ]^1^(：〇, Pierce)中，對緩衝溶液A (20 mM Tris鹽酸鹽，pH 7.2)透析。藉著離子交換層析法，在1.0毫升HiTrap Q瓊脂糖HP 管柱（Amersham Biosciences Corp.)上，純化經過透析的反應混合物。經由從100%緩衝溶液A至100%緩衝溶液B (緩衝溶液A+0.5 M NaCl)的梯度，超過40份管柱體積，在三個1.0毫升的溶離份中洗脫出二聚體的產物高峰◎利用 Microsep 1K離心裝置（Pall Life Sciences)，將混合的產物溶離份濃縮至550微升，含有0.12毫克蛋白質/毫升。 L1-7肽與聚（乙二醇）-雙-順丁烯二醯亞胺的共軛作用；分子量：3.4KDa ;稱為，’PEG3.4K (L1-7肽）2” 以1.125毫克的聚（乙二醇）-雙-順丁烯二醯亞胺（分子量 =3·4 KDa，Shearwater Corp.)(0.563 毫升在緩衝溶液1 中的 2.0毫克/毫升溶液），處理在1.5毫升緩衝溶液1 (20 mM磷酸鹽，5mMEDTA，pH6.5)中之3·0毫克Ll-7肽的溶液。在4°C下培養該反應混合物過夜，然後在Slide-A-Lyzer卡匣（3500 MWCO，Pierce)中，對緩衝溶液 A (20 mM Tris 鹽酸鹽，pH 7.2)透析。藉著離子交換層析法，在5.0毫升 HiTrap Q瓊脂糖HP管柱（Amersham Biosciences Corp.)上， O:\121\121929.DOC • 191 - 1336333 純化經過透析的反應混合物。經由從100%緩衝溶液A至 100%緩衝溶液B (緩衝溶液A+0.5 M NaCl)的梯度，超過40 份管柱體積，在三個3.0毫升的溶離份中洗脫出產物高峰。利用兩個 Microsep 1K離心裝置（Pall Life Sciences)，將混合的產物溶離份濃縮至850微升，含有0.24毫克蛋白質/ 毫升。 MALDI-TOF質譜分析的結果如下：試樣編號身分 MS實驗值 MS觀察值 1 L 1-7(未PEG化的肽） 3,545 3,538.7 2 mPEG5K-(Ll-7 肽） 8,500 8,851 3 PE04(Ll-7 肽)2 7,443 7,446.29 4 PEG3.4K(LH)2 10,550 10,552 6,882.61 3,550.13 應瞭解PEG3.4K(L卜7肽）和PE04(Ll-7肽）的下標V，代表每個聚合物鏈有兩個肽，位在聚合物的兩端。 IC5〇的判定藉著如同在實例2中描述之中和ELISA，判定自由的L1-7和PEG化的肽，對hAng-2:hTie2-Fc交互作用之抑制作用的IC50。關於中和ELISA，按照在實例2中關於親和力 ELISA的描述，製備已結合人類Ang-2多肽的微量滴定盤。滴定候選的抗-Ang-2之PEG化的L 1-7和自由肽，從1000 nM至0.2 pM，以含有大約1% BSA和大約1 nM Tie-2 (以 Tie-2-Fc分子的形式提供，其中Tie-2部分僅含有該分子的可溶性細胞外部外分；R&D Systems，目錄第313-TI號）的 PBS溶液4-倍稀釋。在每孔中加入大約100微升抗體/Tie-2 O:\121\121929.DOC -192- 1336333 溶液之後，在室溫下培養該盤過夜，然後以含有大約〇. 1 % 吐溫-20的PBS沖洗5次。在沖洗之後，加入大約100微升/ 孔的抗-Tie-2抗體（Pharmingen Inc.，目錄#557039)，至大約1微克/毫升的終濃度，並在室溫下培養該盤大約1小時。接下來，以利用含有大約1% BSA之PBS的1:10,000稀釋，加入大約100微升/孔的山羊抗-老鼠-IgG-HPR (Pierce Chemical Co.，目錄#31432)。在室溫下培養該盤大約1小時，隨後以含有大約0.1%吐溫-20的PBS沖洗5次。然後加入大約100微升/孔的TMB受質（上述），並容許顏色展現。然後在分光光度計370毫微米處，讀取吸光度。 L1-7肽（C-GGGGG-AQ-TNFMPMDDLEQRLYEQFILQQG-LE)(序列識別： 359號）包括：與PEG偶聯的N-終端半胱胺酸；以及5Gly聯結子。AQ和LE側面序列兩者均出現在原始的噬菌體純種系和該肽體中。hAng-2:Tie2抑制IC50結果如下：肽 IC5〇 (nM) L1-7 肽 0.49 mPEG5K-(Ll-7 肽） 11.7 PE04(Ll-7 肽)2 0.064 PEG3.4K(Ll-7 肽)2 0.058 【圖式簡單說明】圖1敘述在利用本發明之肽體TN8-Con4-C，或以磷酸緩衝之生理鹽水（PBS)處理的帶有A-431腫瘤之小鼠中，腫瘤體積（y_韩）對時間（X-軸）的圖。在實例中描述其細節。

圖2敘述在以50微克劑量之2xCon4-C、L1-7-N或L1-21-N O:\121\121929.DOC -193- 1336333 肽體處理的野外型老鼠中’肽體濃度（y_轴）對投藥後時間 (X-軸）的圖。在實例中描述其細節。圖3敘述在利用根據本發明之肽體2xCon4-C，或以磷酸缓衝之生理鹽水（PBS) ’或對照組肽體處理的帶有A43 1腫瘤之小鼠中’腫瘤體積（y_軸）對時間（乂_轴）的圖。在實例中描述其細節。圖4敘述代表以根據本發明之肽體c〇n4_c、對照組肽體處理’或未處理的經過培養之A43i細胞，在活體外生長的圖。在實例中描述其細節。圖5敘述在利用根據本發明之肽體c〇n4-C、肽體L1-7-N 、肽體L1-21-N，或肽體2xC〇n4-C，或以填酸緩衝之生理鹽水（PBS) '抗-Ang-2抗體（Ab536)，或Fc處理的C〇1〇205腫瘤細胞中，腫瘤體積（y_軸）對時間（X—轴）的圖。在實例中描述其細節。圖ό敘述在利用各種劑量之根據本發明的肽體2xC〇n4_c ’或以填酸緩衝之生理鹽水（PBS)或Fc處理的帶有C〇1〇205 異種移植腫瘤的小鼠中’腫瘤體積（y_軸）對時間（χ_軸）的圖。在實例中描述其細節》圖7敘述在利用根據本發明之肽體2xc〇n4-C，或以對照組肽體處理的帶有C〇1〇205異種移植腫瘤的小鼠中，腫瘤體積（y-轴）對時間（X-軸）的圖。圖7亦敘述這些肽體的CD31 染色面積/總腫瘤面積的圖。在實例中描述其細節。圖8敘述在利用根據本發明之肽或以碳酸緩衝之生理鹽水（PBS)，或對照組肽體處理的帶有c〇1〇2〇5 O:\121\121929JDOC -194. 1336333 異種移植腫瘤的小鼠中，腫瘤體積（y_轴）對時間（x_軸）的圖。在實例中描述其細節。該圖顯示抗_Ang_2肽體能夠抑制 C〇1〇205腫瘤生長，不考慮何時開始投藥。圖9敘述在A431和Colo-205異種移植模式兩者中，在雌性裸鼠中’使用抗體Ab536或利用肽體2xCon4-C所獲得之完全反應（CR)速率的概要。在實例中描述其細節。圖10A敘述在利用根據本發明之肽體2xC〇n4_c，或 2xCon4-C與对癌易的組合’或以填酸緩衝之生理鹽水 (PBS) ’或以PBS加勉癌易處理的帶有c〇l〇205異種移植腫瘤的小鼠中，腫瘤體積（y-軸）對時間（x_軸）的圖。在實例中描述其細節。圖10B敘述在利用根據本發明之肽體2xC〇n4c，或 2xCon4-C與5-FU的組合，或以磷酸緩衝之生理鹽水（pbs) ，或以PBS加5-FU處理的帶有C〇1〇205異種移植腫瘤的小鼠中，腫瘤體積（y-軸）對時間（X-軸）的圖。在實例中描述其細節。圖11A敘述在佐劑引起之關節炎模式中，在以根據本發明之肽體2xCon4-C，或磷酸緩衝之生理鹽水（PBS)，或以對照組肽體’或正常或關節炎對照組處理的大鼠中，腳掌腫脹程度（AUC±SE)的圖。在實例中描述其細節。圖11B敘述在佐劑引起之關節炎模式中，在以根據本發明之肽體2xCon4-C，或磷酸緩衝之生理鹽水（pBs)，或以對照組肽體’或正常或關節炎對照組處理的大鼠中，腳掌骨礦物質密度（BMD)的圖。在實例中描述其細節。

O:\121V121929.DOC -195-

1336333 圖lie敘述在佐劑-引起之關節炎模式中，在以根據本發明之狀體2xCon4-C，或麟酸緩衝之生理鹽水（pbs),或以對照組肽體’或正常或關節炎對照組處理的大鼠中，體重變化的圖。在實例中描述其細節。圖12敘述兩個在大鼠中，敘述抑制VEGF_引起之角膜血管生成作用的圖。第一個圖敘述在以牛血清白蛋白 (BSA)、VEGF加磷酸緩衝之生理鹽水（PBS)，或VEGF加本發明之肽體Con4-C處理的大鼠中，測量到的血管數目。第二個圖敛述在以BSA、VEGF加麟酸緩衝之生理鹽水（pb s) ，或VEGF加本發明之肽體Con4-C處理之大鼠中的赢管面積（平方毫米）。在實例中描述其細節。圖13A、13B和13C敘述全長的人類Ang-2 (hAng-2)，分別對hAng-2的N-終端’以及對hAng-2的C-終端，根據本發明之肽體TN8-Con4-C、L1-7-N和12-9-3-C，以及對照組肽體Tie2-Fc、C2B8或5B12的抗原決定位作圖資料（〇.d.370) 。在實例中描述其細節。圖14敘述根據本發明之2xCon-4-C肽體的結合親和力 (KD)，使用Sapidyne KinExA測定。在實例中描述其細節。 O:\121\121929.DOC 196· 1336333 序列一覽表 <110> AMGEN INC. <120>人類血管生成素-2的專一結合劑

<130> A-810A <140>尚未指派 <141> 2002-10-11 <150> US (尚未指派） <151> 2002-09-27 <150> US 60/328,624 <151> 2001-10-11 <160> 359 <170>PatentIN 版本 3.1

<210> 1 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> Ang-2結合肽

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 1

Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn Tyr Asp 15 10 <210> 2 <211> 14 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> Ang-2結合肽 <400> 2

His Gin lie Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Trp 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 '<220> <223> Ang-2結合多肽 <400> 3

Lys Arg Pro Cys Glu Glu lie Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gin 1 5 10 <210> 4 <211> 14 <212> 蛋白質 <213〉人造的序列 O:\121\121929.DOC -2 - <220>1336333 <223> Ang-2結合多肤 <400> 4

Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met 15 10 <210> 5 <211> 18 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> Ang-2結合多肽 <400> 5

Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp 1 5 10 15

Asn His m <210> 6 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> Ang-2結合多肽 <400> 6

Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe 15 10 15

Thr Phe Gin Gin 20

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 7 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> Ang-2結合肽 <400> 7

Gin Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met lie Asn 15 10

<210> 8 <211> 67

<212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>寡核钵酸 <400> 8 60 67 acaaacaaac atatgggtgc acagaaagcg gccgcaaaaa aactcgaggg tggaggcggt ggggaca <210〉 9 <211> 20

<212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 寡核芸酸 4-

O:\I21\121929.DOC 1336333 <400> 9 ggtcattact ggaccggatc <210> 10 <211> 25

<212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>寡核替酸 <400> 10

cgtacaggtt tacgcaagaa aatgg <210> 11 <211> 66

<212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 寡核贫酸 <400> 11 tttgttggat ccattactcg agtttttttg cggccgcttt ctgtgcacca ccacctccac ctttac <210> 12 <211> 32 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肚體

〇：\121\121929.DOC 1336333 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (32). . (32) <223> Xaa - Fc <400> 12

Met Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu 15 10 15

Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 30

<210> 13 <211> 29 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (29)..(29) <223> Xaa = Fc

<400> 13

Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 14

O:\121\121929.DOC 6- 1336333 <211> 51 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (51)..(51)

<223> Xaa = Fc <400> 14

Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr' Glu Gin 15 10 15

Phe Thr Phe Gin Gin Gly Ser Gly Sex Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser 20 25 30

Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly 35 40 45

Gly Gly Xaa 50

<210> 15 <211> 60 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的狀禮 <220>

O:\121\121929.DOC 1336333 <22i> misc_特徵 <222> (60)..(60) <223> Xaa = Fc <400> 15

Met Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu 1 5 10 15

Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe 35 40 45

Thr Phe Gin Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 50 55 60 <210> 16 <211> 56 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220>

<223> 能夠與Ang-2結合的肽雜 <220> <221> misc_特徵 <222> (56)..(56) <223> Xaa = Fc <400> 16

Met Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

O:\121\121929.DOC 1336333

Phe Thr Phe Gin Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro 20 25 30

Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin 35 40 45

Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 50 55 <210> .17 <211> 26 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (26)..(26) <223> Xaa = Fc <400> 17

Met Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu 15 10 15

His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 18 <211> 45 <212> 蛋白質 <213>人造的序对 -9-

0:\121\121929.D0C 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc 一特徵 <222> (45).. (45) <223> Xaa — Fc <400> 18

Met Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly 15 10 15

Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser 20 25 30

Gly Ser Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 35 40 45 <210> 19 <211〉 62 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> inisc_特徵 <222> (62)..(62) <223> Xaa = Fc <400> 19

Met Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu 1 5 10 15 -10·

O:\121\121929.DOC 1336333

His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser 20 25 30

Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro 35 .40 45

Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 50 55 60 <210> 20 <211> 31

<212>蛋白質 Ul3>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> mjsc 一特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 20

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu 15 10 15

Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu 20 25 30 <210> 21 <211> 53 <212>蛋白質 <213>人造的序列

O:\121\121929.DOC ·11· 1336333 <220> <223〉能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2) . .(2) <223> Xaa 53 Fc <400> 21

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly 15 10 15

Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Lys 20 25 30

Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr 35 40 45

Phe Gin Gin Leu Glu 50 <210> 22 <211> 59

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc -12-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 22

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu 15 10 15

Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Gly'Gly Gly 20 25 30

Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr 35 40 45

Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Leu Glu 50 55

<210> 23 <211> 25 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc—特徵 <222> (2)..(2)

<223> Xaa = Fc <400> 23

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp 15 10 15

Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu 20 25 <210> 24 -13-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 47 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (2).. (2)

<223> Xaa = Fc <400> 24

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly 15 10 15

Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin 20 25 30

Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu 35 40 45 <210> 25 <211> 61 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> <220> 能夠與Ang-2結合的肽體 <221> misc_特徵 <222> (2) .. (2)

•14·

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> Xaa = Fc <400〉 25

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp 1 5 10 15

Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly Gly Ser 20 25 30

Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Gin Glu Glu 35 40 45

Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Glu 50 55 60 <210> 26 <211〉 75 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵

<222> (75).. (75) <223> Xaa - Fc <400> 26

Met Gly Ala Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu 20 25 30 -15-

O:\121\121929.DOC 1336333

Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr Phe Gin Gin Gly Ser Gly 35 40 45

Ser Ala Thr Gly Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser 50 55 60

Ala Thr His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 65 70 75 <210> 27 <211> 72

<212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> {2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 27

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Ser Gly Ser Ala Thr Gly 15 10 15

Gly Ser Gly Ser Thr Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr His Lys 20 25 30

Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Glu Gin Phe Thr 35 40 45

Phe Gin Gin Gly Gly Gly Gly Gly Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro 50 55 60

Trp Thr Cys Glu His' Met Leu Glu 65 70 -16-

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 28 30 蛋白質人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<22i> misc—特歡 <222> (30)..(30) <223> Xaa — Fc <400> 28

Met Gly Ala Gin Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr 1 5 10 15

Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 30 <210> 29

<211> <212> <213> <211> 26 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc 特徵 — <222> (26)…（26)

O:\121\121929.DOC -17- 1336333 <223> Xaa * Fc <400> 29

Met Gly Ala Gin Gin Tyr Gly Cys Asp Gly Phe Leu Tyr Gly Cys Met 1.5 10 - Ί5 lie Asn Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 30

<211> 26 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (26) . . (26) <223> Xaa = Fc

<400> 30

Met Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu Met Trp Gly Gly Cys Asn 15 10 15

Tyr Asp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 31 <211> 26 <212>蛋白質 <213>人造的序列

O:\121\121929.DOC •18- 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 ·， <222> (26)..(26) <223> Xaa = Fc <400〉 31

Met Gly Ala Gin His Gin lie Cys Lys Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys 15 10 15

His Trp Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 32 <211> 26 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (26)._(26) <223> Xaa = Fc <400> 32

Met Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu lie Phe Gly Gly Cys Thr 15 10 15 •19-

O:\121\121929.DOC 1336333

Tyr Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Xaa 20 25 <210> 33 <211> 784

<212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA

<400> 33 atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc 60 actttccagc agctcgaggg tggaggcggt ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc 120 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac 180 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc ecatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 240 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 300 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 360 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 420 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 480 accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 540 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 600 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 660 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 720 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaataatgg 780 atcc 784 <210> 34 <211> 768

<212> DNA <213>人造的序列

O:\121\121929.DOC -20- 60 <220>1336333

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肚嬗的DNA <400> 34 atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag t » cagctcgagg gtggaggcgg tggggacaaa actcacacat gtccaccttg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agttttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaataa <210> 35 <211> 834

<212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 35 atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag cagggatccg gttctgctac tggtggttcc ggctccaccg caagctctgg ttcaggcagt gcgactcatc tcgagggtgg aggcggtggg gacaaaactc acacatgtcc accttgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtt ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 768

60 120 180 240

O:\121\121929.DOC •21 - r ς > 3001336333

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa ataa <210> 36 <211> 861 <212> DNA <213>人造的序列 360 420 480 540 600 660 720 780 834

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽碰的DNA <400> 36 atgggtgcac agaaattcaa cccgctggac gaactggaag aaactctgta cgaacagttc actttccagc agggtggtgg tggtggtggc ggtggtaagt tcaacccact ggatgagctg gaagagactc tgtatgaaca gttcactttc cagcaactcg agggtggagg cggtggggac aaaactcaca catgtccacc ttgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagttttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca gtggaggtgc ataatgccaa gtggtcagcg tcctcaccgt aaggtctcca acaaagccct cagccccgag aaccacaggt cgaagaccct gaggtcaagt gacaaagccg cgggaggagc cctgcaccag gactggctga cccagccccc atcgagaaaa gtacaccctg cccccatccc tcaactggta cgtggacggc agtacaacag cacgtaccgt atggcaagga gtacaagtgc ccatctccaa agccaaaggg gggatgagct gaccaagaac 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600

O:\121\121929.DOC -22· 1336333 caggtcagcc gagagcaatg ggctccttct gtcttctcat tccctgtctc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacat.cgc cgtggagtgg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc cgggtaaata a 660 720 780 840 861 <210> 37 <211> 849 <212> DNA <213> 人造的序列

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 3Ί atgaaattca acccgctgga cgaactggaa gaaactctgt acgaacagtt cactttccag cagggtggtg gtggtggcgg tggtaagttc aacccactgg atgagctgga agagactctg tatgaacagt tcactttcca gcaactcgag ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 640

O:\121\121929.DOC -23- 849 1336333 <210> 38 <211> 759

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA *—-·— 一 — <400> 38 atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgctcgag 60 ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120 gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759 <210> 39 <211> 816 <212> DNA <213> 人造的序列 <220>

O:\121\121929.DOC •24- 601336333

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 39 atgcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg acttgcgaac acatgggatc cggttctgct actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca tct6g,agggt ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaacf accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaataa <210> 40 <211> 867

<212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 40 atgggtgcac agcaggaaga atgcgaatgg gacccatgga cttgcgaaca catgggatcc ggttctgcta ctggtggttc cggctccacc gcaagctctg gttcaggcag tgcgactcat caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tgctcgaggg tggaggcggt ggggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc

O:\121\121929.DOC 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 816 60 120 180 240 -25- 300 1336333 acatgcgtgg gacggcgtgg taccgtgtgg aagtgcaagg aaagggcagc aagaaccagg gagtgggaga tccgacggct gggaacgtct agcctctccc tggtggacgt aggtgcataa tcagcgtcct tc^ccaacaa cccgagaacc tcagcctgac gcaatgggca ccttcttcct tctcatgctc tgtctccggg gagccacgaa tgccaagaca caccgtcctg agccctccca acaggtgtac ctgcctggtc gccggagaac ctacagcaag cgtgatgcat taaataa gaccctgagg aagccgcggg caccaggact gcccccatcg accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg gaggctctgc tcaagttcaa aggagcagta ggctgaatgg agaaaaccat catcccggga atcccagcga ccacgcctcc acaagagcag acaaccacta ctggtacgtg caacagcacg caaggagtac ctccaaagcc tgagctgacc catcgccgtg cgtgctggac gtggcagcag cacgcagaag 360 420 480 540 600 660 720 780 840 867

<210> 41 <211> 774

<212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽«的DN A <400> 41 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg aaagggcagc aagaaccagg gagtgggaga tccgacggct tctccaacaa cccgagaacc tcagcctgac gcaatgggca ccttcttcct agccctccca acaggtgtac ctgcctggtc gccggagaac ctacagcaag gcccccatcg accctgcccc aaaggcttct aactacaaga ctcaccgtgg agaaaaccat catcccggga atcccagcga ccacgcctcc acaagagcag ctccaaagcc tgagctgacc catcgccgtg cgtgctggac gtggcagcag 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 -26-

O:\121\121929.DOC 1336333 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctct^c acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt caacccgctg 720 gacgagctgg aagagactct gtacgaacag tttacttttc aacagctcga gtaa 774 <210> 42 <211> 840

<212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223> 编碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 42 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct 720 actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac 780 ccgctggacg aactggaaga aactctgtac gaacagttca ctttccagca actcgagtaa 840 <210> 43 <211> 858

27·

O:\121\121929.DOC 1336333

<212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA

<400〉 43 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg ggga ccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccct gaggte 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caac agcacgr 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caag gagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctcc aaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 4Θ0 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cg-tg ctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gt ggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagaaatt ca aceccgctg 720 gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag ttcactttcc agcagggtgg tggt«ggtggt 780 ggcggtggta agttcaaccc actggatgag ctggaagaga ctctgtatga acagttcact 840 ttccagcaac tcgagtaa 858 <210> 44 <211> 756

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA • 28 -

O:\121\121929.DOC 601336333

<4〇0> 44 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa tgggacccat ggacttgcga acacatgctc gagtaa <210> 45 <211> 822 <212> DNA <213>人造的序列 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 756

<220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 45 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 60 120 180 240 300 360

O:\121\121929.DOC -29- 420 4801336333 aagaaccagg tcagcctgac gagtgggaga gcaatgggca tccgacggct ccttcttcct gggaacgtct tctcatgctc agcctctccc tgtctccggg actggtggtt ccggctccac tgcgaatggg acccatggac <210> 46 <211> 864

<212> DNA <213>人造的序列 ctgcctggtc aaaggcttct gccggagaac aactacaaga ctacagcaag ctcaccgtgg cgtgatgcat gaggctctgc taaaggtgga ggtggtggtg cgcaagctct ggttcaggca ttgcgaacac atgctcgagt atcccagcga catcgccgtg ccacgcctcc cgtgctggac acaagagcag gtggcagcag acaaccacta cacgcagaag cacagggatc cggttctgct gtgcgactca tcaggaagaa aa 540 600 660 720 780 822 <220>

<223> 编碼能夠與Ang-2结合之肽髗的DNA <400> 46 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagcagga agaatgcgaa tgggacccat ggacttgcga acacatggga tccggttctg ctactggtgg ttccggctcc

O:\121\121929.DOC 30- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 1336333 accgcaagct ctggttcagg cagcgcgact catcaggaag aatgcgaatg ggacccatgg 840 acttgcgaac acatgctcga gtaa 864 <210> 47 _· <211> 906 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽嫌的DN A <400> 47

atgggtgcac aggaagaatg cgaatgggac ccatggactt gcgaacacat gggtggtggt 60 ggtggtggcg gtggtaaatt caacccgctg gacgaactgg aagaaactct gtacgaacag 120 ttcactttcc agcagggatc cggttctgct actggtggtt ccggctccac cgcaagctct 180 ggttcaggca gtgcgactca tctcgagggt ggaggcggtg gggacaaaac tcacacatgt 240 ccaccttgcc cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag ttttcctctt ccccccaaaa 300 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 360 agccacgaag accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 420 gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc 480 accgtcctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 540 gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca 600 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc 660

tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 720 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc 780 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 840 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt 900 aaataa 906 <210> 48 •31 ·

0:\121\121929.D0C 1336333 <211> 897 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DN A <400> 48 atggacaaaa ctcacacatg tccaccttgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 60 gttttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 120 acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 180 gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagtd caacagcacg 240 taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 300 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 360 aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 420 aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 480 gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 540 tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 600 gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 660 agcctctccc tgtctccggg taaaggtgga ggtggtggtg cacagggatc cggttctgct 720 actggtggtt ccggctccac cgcaagctct ggttcaggca gtgcgactca taaattcaac 780 ccgctggacg aactggaaga aactctgtac gaacagttca ctttccagca gggtggtggc 840 ggtggtcagg aagaatgcga atgggaccca tggacttgcg aacacatgct cgagtaa 897 <210> 49 <211> 771 <212> DNA <213> 人造的序列 <220>

•32·

O:\12I\I21929.DOC 601336333

<223> 编碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 49 atgggtgcac agttcgacta ctgcgaaggt gttgaagacc cgttcacttt cggttgcgac aaccacctcg agggtggagg cggtggggac aaaactcaca catgtccacc ttgcCcagca cctgaactcc tggggggacc gtcagttttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a <210> 50 <211> 759 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>編瑪能夠與Ang-2結合之肽tt的DNA <400> 50 atgggtgcac agcagtacgg ttgcgacggt tttctgtacg gttgcatgat caacctcgag ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 120 180 240 300 360 420 4S0 540 600 660 720 771 60 120 180 240 300 360

O:\12I\I21929.DOC 33· 1336333 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tgcfagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759 <210> 51 <211> 759

<212> DNA

<213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 51 atgggtgcac agaaacgccc atgcgaagaa atgtggggtg gttgcaacta cgacctcgag 60 ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120 gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759

34-

O:\121\121929.DOC 1336333

<210> 52 <211> 759

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之狀體的DNA <400〉 52 atgggtgcac agcaccagat ctgcaaatgg gacccgtgga cctgcaaaca ctggctcgag ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg gggggaccgt cagttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa <210> 53 <211> 759

<212〉 DNA <213>人造的序列 <220>

0:U21\121929.D0C -35- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 759 1336333

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽體的DNA <400> 53 atgggtgcac agaaacgtcc atgcgaagaa atcttcggtg gttgcaccta ccagctcgag 60 ggtggaggcg gtggggacaa aactcacaca tgtccacctt gcccagcacc tgaactcctg 120 gggggaccgt ca^ttttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 180 acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 240 aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 300 tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 360 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 420 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 480 gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 540 gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 600 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 660 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 720 tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataa 759

<210> 54 <211> 25

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223> 寡核芬酸 <400> 54 cggcgcaact atcggtatca agctg 25 <210> 55

<211> 26 <212> DNA <213>人造的序列

O:\121\12I929.DOC 1336333 <220> <223>寡核坫酸 <400> 55 catgtaccgt aacactgagt ttcgtc <210> 56 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> φ <223>&TN8-IX庫中產製的一致主題 <220> <221> misc_特徵 <222> (7, 12和）..（14) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400> 56

Lys Arg Pro Cys Glu Glu Xaa Trp Gly Gly Cys Xaa Tyr Xaa 1 5 10

<210> 57 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> &TN8-IX庫中產·製的一致主題 <220> -37-

O:\121\121929.DOC 1336333 <221> misc_特徵 <222> (7, 12和）..（14) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400> 57

Lys Arg Pro Cys Glu Glu Xaa Phe Gly Gly Cys Xaa Tyr Xaa 15 10 <210> 58 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> &TN8-IX庫中產製的一致主題 <220> <22 1> misc_特徵 <222> (1，2, 3, 5和）..（13) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400> 58

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu Xaa Met 1 5 <210> 59 <211> 18 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> -38 -

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> &ΤΝ 12-1庫中產製的一致主題 <220> <221> misc_特微 <222>(3, 8, 10-14 和）..（18) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400〉59

Trp Ser Xaa Cys Ala Trp Phe Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg 15 10 15

Arg Xaa

<210> 60 <211> 227 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 人類 Fc IgGl <400> 60

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 15 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 · 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 39·

O:\121\121929.DOC 1336333

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie 100 105 110

Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser 130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220

Pro Gly Lys 225

<210> 61 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> &TN8-IX庫中產製的一致主題 40-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220〉 <221〉misc_特徵 <222>(1-3,5,7，12，13和）..（14) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400> 61

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa 15 10

<210> 62 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>從TN8-IX庫中產製的一致主題 <220> <221 > misc_特徵 <222> (1-3, 5, 7, 12, 13和）..（14) <223〉Xaa意指任何天然存在的胺基酸。

<400> 62

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Tyr Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 63 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 O:\121\121929.DOC •41 - 1336333 <220> <223〉從TN8-IX庫中產製的一致主題 <220> <22 1> misc_特徵 <222> (1-3, 5, 7, 12, 13和）"（14) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400> 63

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Phe Trp Tyr Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 l〇 <210> 64 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>從TN8-IX庫中產製的一致主題 <220>

<221> misc_特徵 <222> (1-3, 5, 7, 12, 13和）..（14) <223> Xaa意指任何天然存在的胺基酸。 <400> 64

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Asp Xaa Phe Thr Tyr Cys Xaa Xaa Xaa 15 10 <210> 65 <211> 5 -42-

O:\121\121929.DOC 1336333 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 65

Trp Asp Pro Trp Thr 1 5

<210> 66 <211> 6 <212>蛋白質 <21 3>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 66

Trp Asp Pro Trp Thr Cys 1 5

<210> 67 <211> 7 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <220> <22 1> misc_特徵 <222> (2)..(2)

O:\121\121929.DOC -43 - 1336333 <223> Xaa是酸性或中性極性的胺基酸殘基 <400> 67

Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr 1 5 * <210> 68 <211> 8 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <220> <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa是酸性或中性極性的胺基酸殘基 <400> 68

Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys 1 5 <210> 69 <211> 14 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉能夠與Ang-2結合的多肽 <220> -44-

O:\121\121929.DOC 1336333 <221> misc_特徵 <222> (1，2和）..(3) <223> Xaa分別為胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (5)..(5) <223>Xaa為胺基酸殘基。

<220> <221> misc_特徵 <222> (12)..(12) <223> Xaa缺少或為胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (13)..(13) <223> Xaa缺少或為中性疏水性、中性極性的、或鹼性的胺基酸殘基。

<220> <221> misc_特徵 <222> (14)..(14) <223> Xaa為中性疏水性或中性極性的胺基酸殘基。 <400> 69

Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Xaa Xaa Xaa 1 5 l〇 O:\121\121929.DOC -45 - 1336333 <210> 70 <211> 20 <212〉蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <220>

<221 > misc_特徵 <222> (1 和）..（15) <223> Xaa缺少或為胺基酸殘基。 <220> <221 > misc_特徵 <222> (2和）__(16) <223> Xaa缺少或為中性疏水性、中性極性的，或鹼性的胺基酸殘基。 <220〉

<221 > misc_特徵 <222>(3-6, 18, 19 和）..(20) <223> Xaa分別缺少或為胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (8)..(8) <223>Xaa為胺基酸殘基。 O:\121\121929.DOC -46- 1336333 <220> <22 1> misc_特徵 <222> (17)..(17) <223> Xaa缺少或為中性疏水性、中性極性的胺基酸殘基。 <400> 70

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Trp Asp Pro Trp Thr Cys Xaa Xaa 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 71 <211〉10 <212>蛋白質 <213〉人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <200>

<221>misc 特徵 <222> (2)..(2) <223〉Xaa為中性疏水性的胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (4)..(4) <223>Xaa 為 a，A，D,或Εβ O:\121\121929.DOC -47- 1336333 <220> <221 > misc_特徵 <222> (6)..(6) <223>Xaa為酸性胺基酸殘基》 <220> <221 > misc_特徵 <222> (7)..(7) <223> Xaa為胺基酸殘基》

<220> <221> misc_特徵 <222> (8)..(8) <223> Xaa為中性疏水性、中性極性或鹼性的胺基酸殘基。 <400> 71

Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tvr 1 5 l〇

<210> 72 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223〉能夠與Ang-2結合的多肽 <220> <22 1 > misc 特徵 O:\121\121929.DOC -48- 1336333 <222> (1，4和）..(20) <223> Xaa缺少或為胺基酸殘基。 <220> <221>misc_ 特徵 ' <222> (2, 15, 16和）..(21) <223> Xaa缺少或為中性極性的、酸性或鹼性的胺基酸殘基。 <220>

<221> misc_特徵 <222> (3, 17和）..（18) <223> Xaa缺少，或為中性疏水性、或中性極性的胺基酸殘基。 <220> <22 1> misc 特徵 <222> (6)..(6) <223>Xaa為中性疏水性的胺基酸殘基。

<220> <221> misc_特徵 <222> (8)..(8) <223> Xaa為 a A, D，或 E。 <220> <22 1> misc_特徵 <222> (10)..(10) O:\121\121929.DOC -49- 1336333 <223> Xaa為酸性的胺基酸殘基。 <220> <22 1> misc_特徵 <222> (11)..(11) <223>Xaa為胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 # <222〉（12)..(12) <223> Xaa為中性疏水性、中性極性或鹼性的胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (19和）..(22) <223> Xaa缺少或中性疏水性、中性極性或鹼性的胺基酸殘基。 <400> 72

Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Leu Tyr Xaa Xaa 1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20

<210> 73 <211> 8 <212>蛋白質 <213>人造的序歹丨J O:\121\121929.DOC -50- 1336333 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <220> <221> misc_待徵 <222> (3)..(3) <223> Xaa為中性極性的胺基酸殘基。 <220> <22 1 > misc_特徵 <222> (4)..(4) <223>Xaa為酸性胺基酸殘基》

<220> <221 > misc_特徵 <222> (5)..(5) <223> Xaa為中性極性或酸性的胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (6和）..(7) <223> Xaa為中性疏水性的胺基酸殘基。

<400> 73

Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly 1 5 <210> 74 <211> 20 <212>蛋白質 51-

O:\121\121929.DOC 1336333 <213〉人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <220> <221〉misc_特徵 <222>(1，2, 4, 13, 14, 19 和）··（20) <223> Xaa為中性疏水性或中性極性的胺基酸殘基。 <220>

<221 > misc_特徵 <222> (3, 9和）..（17) <223> Xaa為中性極性或酸性的胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222>(7, 15和）..（16) <223> Xaa為中性極性的胺基酸殘基。 <220>

<22 1 > misc_特徵 <222> (8)..(8) <223>Xaa為酸性的胺基酸殘基。 <220> <221〉misc_特徵 <222> (10和）..（11) 52-

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> Xaa為中性疏水性的胺基酸殘基》 <220> <221 > misc_特徵 <222> (18)..(18) <223> Xaa為中性疏水性或鹼性的胺基酸殘基。 <400> 74

Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 75 <211> 13 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>盛夠與Ang-2結合的多肽 <220> φ <221>misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa為酸性的胺基酸殘基。 <220> <221 > misc_特徵 <222> (4)..(4) <223> Xaa為中性疏水性的胺基酸殘基。 O:\121\121929.DOC •53 · 1336333 <220> <221 > misc_特徵 <222> (5)..(5) <223> Xaa為 E，D，或 Q。 <220> <221> misc_特徵 <222> (10)..(10) <223> Xaa為中性疏水性或中性極性的胺基酸殘基。

<220> <221> misc_特徵 <222> (13)..(13) <223> Xaa為酸性的殘基。 <400> 75

Cys Xaa Gly Xaa Xaa Asp Pro Phe Thr Xaa Gly Cys Xaa 1 5 l〇

<210> 76 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 76

Pro lie Arg Gin Glu Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15 O:\121\121929.DOC -54- 1336333

Met Trp Glu Val 20 <210> 77 <211> 20 · <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽

<400> 77

Thr Asn lie Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 15 10 15

Met Pro Gly Lys 20 <210〉 78 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 78

Trp Tyr Glu Gin Asp Ala Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Ala Glu Val 20 <210> 79 -55-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> ' <223>能狗與Ang-2結合的多肽 <400> 79

Asn Arg Leu Gin Glu Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Glu Asn Val 20 <210> 80 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 80

Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Pro Arg Ser 20 <210> 81 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 -56-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 81

Leu Arg His Gin Glu Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1.5 10 15

Met Phe Asp Trp .20

<210> 82 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 82

Val Pro Arg Gin Lys Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Tyr Val Gly 20 <210> 83

<211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 83

Ser lie Ser His Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

O:\121\121929.DOC •57· 1336333

Met Gin Val Gly 20 <210> 84 <211> 20 I <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 84

Trp Ala Ala Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Gly Arg Met 20 <210> 85 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 85

Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Gly Ser Thr 20 <210> 86 •58·

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 ·· <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 86

Gly His Ser Gin Glu Glu Cys Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Gly Thr Ser 20 <210> 87 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 87

Gin His Trp Gin Glu Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 1 5 10 . 15

Met Pro Ser Lys 20 <210> 88 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 59-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 88

Asn Val Arg Gin Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Pro Val Arg 20 <210> 89

<211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 89

Lys Ser Giy Gin Val Glu Cys Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Pro Arg Asn 20 <210> 90

<211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 90

Val Lys Thr Gin Glu His Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15 60·

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Arg Glu Trp 20 <210> 91 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 91

Ala Trp Gly Gin Glu Gly Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 l〇 15

Met Leu Pro Met 20 <210> 92 <211> 20 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 92

Pro Val Asn Gin Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Pro Pro Met 20 <210> 93 •61-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> 1 <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 93

Arg Ala Pro Gin Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 1 5 10 15

Met Asp lie Lys 20 <210> 94 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多衅_________ <400> 94

His Gly Gin Asn Met Glu Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Phe Arg Tyr 20 <210> 95 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列

O:\121\121929.DOC -62- r S ·> 1336333 <220> * <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 95

Pro Arg Leu Gin Glu Glu Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Pro Leu Arg 20 <210> 96

<211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肚· - -—-—· - <400> 96

Arg Thr Thr Gin Glu Lys Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15

Met Glu Ser Gin 20

<210> 97 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 97

Gin Thr Ser Gin Glu Asp Cys Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 15 10 15 -63-

〇：U2m21929.DOC 1336333

Met Val Ser Ser 20 <210> 98 <211> 20 ·_ <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽

<40〇> 98

Gin Val lie Gly Arg Pro Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Leu Glu Gly Leu 20 <210> 99 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220〉 <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 99

Trp Ala Gin Gin Glu Glu Cys Ala Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His 1 5 10 15

Met Val Gly Leu 20 <210> 100 -64 *

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> ? <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 100

Leu Pro Gly Gin Glu Asp Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Val Arg Ser 20 <210> 101 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 101

Pro Met Asn Gin Val Glu Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Pro Arg Ser 20 <210> 102 <211> 20 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 65-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肚· ^ <400> 102

Phe Gly Trp Ser His Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys* Glu His 1,5 10 15

Met Gly Ser Thr 20 <210〉 103

<211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 103

Lys Ser Thr Gin Asp Asp Cys Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Val Gly Pro 20

<210> 104 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 104

Gly Pro Arg He Ser Thr Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 1 5 10 15 -66·

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Asp Gin Leu 20 <210> 105 <211> 20 . <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>能夠與Ang-2結合的多肽

<400> 105

Ser Thr lie Gly Asp Met Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 1 5 l〇 15

Met Gin Val Asp 20 <210> 106 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 106

Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu 15 10 15

Leu Gin Gly Trp 20 <210> 107 •67·

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 20 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> ' <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 107

Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 1 5 .. 10 15

Leu Glu Asp Gly 20 <210> 108 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 108

Thr Thr lie Gly Ser Met Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15

Met Gin Gly Gly 20 <210> 109 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 68-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 109

Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 1 , 5 10 '-15

Met Gin Ser Gly 20

<210> 110 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肤 <400> 110

Thr Thr lie Gly Ser Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 1 5 10 15

Met Gin Gly Gly 20

<210> 111 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 111

Trp Val Asn Glu Val Val Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn His 15 10 15

O:\121\121929.DOC 1336333

Trp Asp Thr Pro 20 <210> 112 <211> 20 ' <212>蛋白質 *<213> 人造的序列 <220> •I <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 112

Val Val Gin Val Gly Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His 15 10 15

Met Arg Leu Gin 20 <210> 113 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 113

Ala Val Gly Ser Gin Thr Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15

Leu Val Glu Val , 20 <210> 114 -70-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 20 --- <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 114

Gin Gly Met Lys Met Phe Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His 15 10 15

lie Val Tyr Arg 20 <210> 115 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang·2結合的多咕 . <400> 115

Thr Thr lie Gly Ser Met Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His 15 10 15

Met Gin Gly Gly 20 <210> 116 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

O:\121\121929.DOC •71 · 1336333 <220> <223>能灼與Ang-2結合的多肽 <400> 116

Thr Ser Gin Arg Val Gly Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin His 1.5 10 15

Leu Thr Tyr Thr 20 <210> 117 <211> 20

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <_> 117

Gin Trp Ser Trp Pro Pro Cys Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Thr 1 5 10 15

Val Trp Pro Ser 20

<210> 118 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能狗與Ang-2結合的多肽 <400> 118

Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His 15 10 15 72-

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Val Gin Gly 20 <210> 119 <211> 22 ' <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> :<223>能夠與Ang-2結合的多肽

<400> 119

Gin Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu His 15 10 15

Phe lie Phe His Tyr Thr 20 <210> 120 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 120

Leu Asn Phe Thr Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Trp Thr Leu Gin Gin Ser 20 <210> 121 -73-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> ^ <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <_> 121

Thr Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Trp Thr Leu Gin His Gin 20 <210> 122 <211> 22 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能狗與Ang-2結合的多肽 <400> 122

Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu His 1 5 10 15

Trp Met Phe Gin Gin Ala 20 <210〉 123 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -74-

O:\121\121929.DOC 1336333

<220> <223>能夠與Ang-2結合的多狀 <400> 123 Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu lie Leu Tyr 1 5 10 Gin Thr Phe Gin Glu Arg 20 <210> 124 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列

Glu Gin 15

<220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 124 Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp L.eu Glu Gin Arg Leu Tyr 1 5 10 Phe lie Leu Gin Gin Gly 20 <210> 125 <211> 22 <212>蛋白質 <213>· 人造的序列

Glu Gin 15 <220><223> 能夠與Ang-2結合的多li <400> 125 Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr 1 5 10

Glu Gin 15

O:\121\121929.DOC 1336333

Trp Thr Leu Gin His Ala 20 <210〉 126 <211> 22 ' <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽

<400> 126

Gin Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Phe Met Leu Gin Gin Ala 20 <210> 127 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 127

Gin Asn Phe Lys Pro Met Asp Glu Leu Glu Asp Thr Leu Tyr Lys Gin 1 5 10 15

Phe Leu Phe Gin His Ser 20 <210> 128 -76-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> ’ <223>能夠與Ang-2結合的多肤 <400> 128

Tyr Lys Phe Thr Pro Leu Asp Asp Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 1 5 ...10 15

Trp Thr Leu Gin His Val 20 <210> 129 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肢 <400> 129

Gin Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr Leu Tyr Asn Gin 15 10 15

Trp Met Phe His Gin Arg 20 <210> 130 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 77-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多狀 <400> 130

Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 "15 «

Phe Met Leu Gin His Gin 20 <210> 131

<211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 131

Gin Lys Tyr Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Lys Thr Leu Tyr Asp Gin 15 10 15

Phe Met Leu Gin Gin Gly 20 <210> 132

<211> 22 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 132

Gin Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr Leu Tyr Lys Gin 1 5 10 15 • 78 -

O:\121\121929.DOC 1336333

Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <210> 133 <211> 22 * <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <；223> 能夠與Ang-2結合的多肽

<400> 133

Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Trp Leu Tyr His Gin 15 10 15

Phe Thr Leu His His Gin 20 <210> 134 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 134

Gin Lys Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu lie Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Phe Met Phe Gin Gin Ser 20 <210> 135 79-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 22 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 -. 〆 <220> * <223>能夠與Ang-2結合的多肽 - <400> 135

Gin Thr Phe Gin Pro Leu Asp Asp Leu Glu Glu Tyr Leu Tyr Glu Gin 1 5 10 15

Trp lie Arg Arg Tyr His 20 <210> 136 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 136

Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gin Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Phe lie Leu Leu His Gly 20 <210> 137 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 137

His Thr Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thj Leu Tyr Tyr Gin 15 10 15

Trp Leu Tyr Asp Gin Leu 20 <210> 138

<211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列’ <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 138

Tyr Lys Phe Asn Pro Met Asp Glu Leu Glu Gin Thjr Leu Tyr Glu Glu 15 10 15

Phe Leu Phe Gin His Ala 20 <210> 139

<211〉 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 139

Thr Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu His 15 10 15 -81-

O:\121\121929.DOC 1336333

Trp lie Leu Gin His Ser 20 <210> 140 <211> 22 ’ <212>蛋白質 <213>人造的序列； <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <_> 140

Gin Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <210> 141 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 141

Thr Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <210> 142 82-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 22 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> ' <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 142

Thr Asn Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr Leu Tyr Glu Gin 15 10 15

Trp Thr Leu Gin Gin Arg 20 <210> 143 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造·的序列、‘ <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 143

Ala Gly Gly Met Arg Pro Tyr Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Asn Tyr 15 10 15

Asp Val Gin Ala 20 <210> 144 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列. .83 -

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 144

Gin Thr Trp Asp Asp Pro Cys Met His lie Leu Gly Pro Val Thr Trp 1,5 10 15

Arg Arg Cys lie 20 <210> 145

<211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 145

Ala Pro Gly Gin Arg Pro Tyr Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr 1 5 10 . 15

Gin Arg lie Val 20

<210> 146 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肤 <400> 146

Ser Gly Gin Leu Arg Pro Cys Glu Glu lie Phe Gly Cys Gly Thr Gin 15 10 15 • 84·

O:\121\121929.DOC 1336333

Asn Leu Ala Leu 20 <210> 147 <211> 20 ' <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220〉 <223>能夠與Ang-2結合的多肽

<400> 147

Phe Gly Asp Lys Arg Pro Leu Glu Cys Met Phe Gly Gly Pro lie Gin 15 10 15

Leu Cys Pro Arg 20 <210> 148 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 148

Gly Gin Asp Leu Arg Pro Cys Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys 1 5 10 15

Asp Trp Tyr Gly 20 <210> 149 85-

O:\121\121929DOC 1336333 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 149

Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15

Asp Lys Gin Thr 20 <210> 150 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 150

Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Gin Gly Cys 15 10 15

Asp Asn Gin Ser 20 <210> 151 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 86-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 151

Leu Gin Glu Trp Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 1 5 10 15

Glu Lys Gin Arg 20 <210> 152

<211> 20 <212> 蛋白質 <2!3> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <_> 152

Ala Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 1 5 10 15

Glu Met Gin Lys 20

<210> 153 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多狀 <400> 153

Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Val Gin Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15 87-

O:\121\121929.DOC 1336333

Glu Asn Leu Asp 20 <210> 154 <211> 20 、 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多妝

<'4 00> 154

His Gin Glu Tyr Cys Glu Gly Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15

Glu Tyr Gin Gly 20 <210> 155 <211〉 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 155

Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly Met Asp Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 1 5 10 15

Asp Lys Gin Met 20 <210> 156

O:\121\121929.DOC 88- 1336333 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> * <223>能狗與Ang-2結合的多肤 <400> 156

Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 1 5 10 15

Glu Asn Gin Arg 20 <210> 157 <211> 20 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 157

Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys 15 10 15

Glu Lys Gin Arg 20 <210> 158 <211> 20 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -89-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223〉能夠與Ang-2結合的多肽 <220> <221> misc_特徵 <222> (1)..(1) <223> Xaa缺少或是中性疏水性、中性極性或鹼性的胺基酸殘基。 <220> <221>misc 特徵

<222> (2, 4, 14)..(19) <223> Xaa中性疏水性或中性極性的胺基酸殘基》 <220> <221> misc_特徵 <222〉（3, 6)..(17) <223> Xaa為酸性的胺基酸殘基。 <220>

<221> misc_特徵 <222> (8)..(8) <223> Xaa為中性疏水性的胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (9)..(9) <223> Xaa為 E，D，或 Q ° O:\121\121929.DOC -90- 1336333 <220> <221> misc_特徵 <222> (18)..(18) <223> Xaa為中性疏水性、中性極性或鹼性的胺基酸殘基。 <220> <221> misc_特徵 <222> (20)..(20) <223> Xaa缺少或是胺基酸殘基。

<400> 158

Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Gly Xaa Xaa Asp Pro Phe Thr Xaa Gly Cys 15 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa 20 <210> 159 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列

<220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 159 ccg.atccgtc aggaagaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gtgggaagtt

<210> 160 <211> 60 <212> DNA O:\121\121929.DOC •91 · 1336333 <213>人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA ’ <400> 160 accaacatcc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgggtaaa

<210> 161 <211> 60 <212> DNA

<213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <_> 161 tggtacgaac aggacgcttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggctgaagtt <210> 162 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列

<220>

<223> 编碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 162 aaccgtctgc aggaagtttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaaaacgtt <210> 163 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 O:\121\121929.DOC •92· <220>1336333

<223>編瑪能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 163 gctgctaccc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc 60 <210> 164

<211> 60 <212> DNA

<213>人造的專列 <220>

<223>編碼能夠與Aiig-2結合之肽的DNA <400> 164 ctgcgtcacc aggaaggttg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttcgactgg 60 <210> 165 <211> 60

<212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 165 gttccgcgtc agaaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gtacgttggt 60 <210> 166 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列

0:\121\121929.D0C •93· 1336333 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 166 tgggctgctc aggaagaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggtcgtatg 60 <210> 167 ’

<211> 60 <212> DNA

<213> .人造的序列 <220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA : <400> 167 acttggccgc aggacaaatg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctact· 60 <210> 168 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 168 ggtcactccc aggaagaatg cggttgggac ccgtggacct gcgaacacat gggtacgtcc 60 <210> 169 <211> 60 <212> DNA <2l3>人造的序列 <220> •94·

0:\121\121929.D0C 1336333

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 169 cagcactggc aggaagaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaccacat gccgtccaaa 60 <210> 170 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 170 aacgttcgtc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccggttcgt 60 <210> 171 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 171 aaatccggtc aggttgaatg caactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgtaac 60 <210> 172 <211> 60

<212〉 DNA <213> 人造的序列 <220>

<223>編竭能夠與Ang-2結合之肽的DNA •95·

O:\121\121929.DOC 1336333 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 174 ccggttaacc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgccgatg

<400> 172 gttaaaaccc aggaacactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat <210> 173 <211> 60 <212> DNA ( <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 173 gcttggggtc aggaaggttg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat <210> 174 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <210> 175 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 175 cgtgctccgc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat ggacatcaaa -96-

O:\121\I21929.DOC 1336333 <210> 176 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> Π6 cacggtcaga acatggaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat gttccgttac

<210> 177 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編瑪能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 177 ccgcgtctgc aggaagaatg cgtttgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgctgcgt <210> 178

<211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編瑪能夠與Ang-2結合之肚的DNA <400> 178 cgtaccaccc aggaaaaatg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaatcccag -97-

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 179 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 179 cagacctccc aggaagact-ig cgtttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggtttcctcc 60

<210> 180 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 180 caggttatcg gtcgtccgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacct ggaaggtctg 60 <210> 181 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223> •編碼能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 181 tgggctcagc aggaagaatg cgcttgggac ccgtggacct gcgaccacat ggttggtctg 60 <210> 182 • 98 *

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能巧結合之肽的DNA <400> 182 ctgccgggtc aggaagactg cgaatgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttcgttcc

<210> 183 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 183 ccgatgaacc aggttgaatg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat gccgcgttcc <210> 184 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼辱夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 184 ttcggttggt ctcacggttg cgaatgggat ccgtggactt gcgaacacat gggttctacc <210> 185 <211> 60

O:\121\121929.DOC -99- 1336333 <212〉 DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 185 aaatccaccc aggacgactg cgactgggac ccgtggacct gcgaacacat ggttggtccg <210> 186 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DN A _____ <400> 186 ggtccgcgta tctccacctg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat ggaccagctg <210> 187 <211> 60 <212〉 DNA <213> 人造的序列 <220> <223> <400> 編瑪能夠與Ang-2結合之狀的DN A 187 · ------ - tccaccatcg gtgacatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcaggttgac

<210> 188 <211> 60 <212> DNA O:\121\121929.DOC -100- 1336333 <213>人造的序列 <220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DN A 、 ^ ~ •一·— <400> 188 gttctgggtg gtcagggttg cgaatgggac ccgtggacct gccgtctgct gcagggttgg <210> 189

<211> 60 <212> DNA

.<213>人造的序列 <220>

<223>编碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 189 gttctgggtg gtcagggttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacct ggaagacggt <210> 190 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DN今______ <400> 190 accaccatcg gttccatgtg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt <210> 191 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 O:\121\121929.DOC -101- 1336333 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 191 accaaaggta aatccgtttg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat gcagtccggt 60 <210> 192

<211> 60 <212> DNA

<213>人造的序列 <220>

<223> 編瑪能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 192 "" 60 accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgctcacat gcagggtggt <210> 193 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

# <223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 193 tgggttaacg aagttgtttg cgaatgggac ccgtggacct gcaaccactg ggacaccccg 60 <210> 194 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 •102·

O:\121\121929.DOC 1336333 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 194 gttgttcagg ttggtatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcaaacacat gcgtctgcag <210> 195 '

<211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 19S —..... … gctgttggtt cccagacctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacct ggttgaagtt <210> 196

<211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA

<400> 196 cagggtatga aaatgttctg cgaatgggac ccgtggacct gcgctcacat cgtttaccgt <210> 197 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> •103·

O:\121\121929.DOC 1336333

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 197 accaccatcg gttccatgtg ccagtgggac ccgtggacct gcgaacacat gcagggtggt 60 <210> 198 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2结合之肽的DNA <400> 198 acctcccagc gtgttggttg cgaatgggac ccgtggacct gccagcacct gacctacacc 60 <210> 199 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>編碼能夠與_Anj-2結合之肽的DN A .......... <400> 199

cagtggtcct ggccgccgtg cgaatgggac ccgtggacct gccagaccgt ttggccgtcc 60 <210> 200 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2结合之肽的DNA •104-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 200 ggtacctccc cgtccttctg ccagtgggac ccgtggacct gctcccacat ggttcagggt 60

<210> 201 <211> 42 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之欣的DNA <400> 201 caggaagaat gcgaatggga cccatggact tgcgaacaca tg 42 <210> 202 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA__ <400> 202 cagaactaca aaccgctgga cgaactggac gctaccctgt acgaacactt catcttccac tacacc <210> 203 <211> 66 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA 60 66

O:\121\121929.DOC -105 - 601336333 <400> 203 ctgaacttca ccccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag

cagtcc <210> 204 * * <211> 66 , <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠多Ang-2結合之肽的DNA <400> 204 accaaattca acccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag caccag <210> 205 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 205 gttaaattca aaccgctgga cgctctggaa cagaccctgt acgaacactg gatgttccag caggct <210> 206 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 66 60 66 60 66

O:\121\121929.DOC •106- s <220> 1336333

<223>編瑪能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 206 gttaaataca aaccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagca gaccttccag 60 gaacgt • 66 <210〉 207 <211〉 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang_2結合之肽的DNA <400> 207 accaacttca tgccgatgga cgacctggaa cagcgtctgt acgaacagtt catcctgcag . 60 cagggt 66 <210> 208 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400〉 208 tccaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag 60 cacgct 66 <210> 209 <211> 66 <212> DNA

O:\121\121929.DOC -107· 1336333 <213>人造的序列

<220> <223> 编碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA ·- <400> 209 ' cagaaattcc agccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtt catgctgcag caggct <210> 210 <211> 66 <212> DNA <213>人造的序列 60 66

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA .. —- · <400> 210 cagaacttca aaccgatgga cgaattggaa gacaccctgt acaaacagtt cctgttccag cactcc <210> 211 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 211 tacaaattca ccccgctgga cgacctggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag cacgtt <210> 212 60 66 60

O:\121\121929.DOC •108- 66 1336333

<211> 65

<212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肚的DN$ <400> 212 aggaatacga accgctggac gaactggacg aaaccctgta caaccagtgg atgttccacc 60 agcgt 65 <210> 213 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <_> 213 tccaacttca- tgccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtt catgctgcag 60 caccag 66 <210> 214 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 214 cagaaatacc agccgctgga cgaactggac aaaaccctgt acgatcagtt catgctgcag 60 cagggt 66

O:\121\121929.DOC -109- 1336333

<210> 215 <211> 66 <212> DNA <213>人造的序列 . <220> <223>編瑪能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 215 cagaaattcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt acaaacagtg gaccctgcag cagcgt <210> 216 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 60 66 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 216 gttaaataca aaccgctgga cgaactggac gaatggctgt accaccagtt caccctgcac

caccag <210> 217 <211> 67 <212> DNA <213> 人造的序列 60 66

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA

O:\121\121929.DOC -110· 601336333

<400> 217 cagaaattca tgccgctgga cgaactggac gaaatcctgt acgaacagtt catgttccag cagtccc<210> 218 <211> 66 <212> DNA<213>人造的序列 <220><223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA<400> 218 cagaccttcc agccgctgga cgacctggaa gaatacttgt acgaacagtg gatccgtcgt taccac 67 60 66 <210> 219 <211> 66<212> DNA<213>人造的序列

<220><223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA<400> 219 gaagactaca tgccgctgga cgctctggac gctcagctgt acgaacagtt catcctgctg cacggt <210> 220 <21l> 66 <212〉 DNA <213〉人造的序列 60 66

O:\121\121929.DOC • 111- 1336333

<220>

<223>編瑪能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 220 cacaccttcc agccgctgga cgaactggaa gaaaccctgt actaccagtg gctgtacgac 60

cagctg -- 66 <210> 221 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 221 tacaaattca acccgatgga cgaactggaa cagaccctgt acgaagaatt cctgttccag 60 cacgct 66 <210> 222 <211> 66 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 222 accaactaca aaccgctgga cgaactggac gctaccctgt acgaacactg gatcctgcag 60 cactcc 66 <210> 223 <211> 66 <212> DNA •112·

O:\121\121929.DOC 1336333 .<213> 人造的序列

<220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA . <400> 223 cagaaattca aaccgctgga cgaactggaa cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag cagcgt <210> 224 <211> 66 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 224 accaaattcc agccgctgga cgaactggac cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag cagcgt <210> 225 <211> 66 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>編碼能夠與Ang-2結合之肚:的DNA <400> 225 accaacttcc agccgctgga cgaactggac cagaccctgt acgaacagtg gaccctgcag cagcgt <210〉 226 60 66 60 66 60

O:\121\121929.DOC -113· 66 1336333 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DN A <400> 226 aaattcaacc cgctggacga gctggaagag actctgtacg aacagtttac ttttcaacag 60 <210> 227

<211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之欣的DNA <400> 227 gctggtggta tgcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgaactacga cgttcaggct 60

<210> 228 <211> 60 <212> DNA

<213> 人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 228 cagacttggg acgatccgtg catgcacatt ctgggtccgg ttacttggcg tcgttgcatc 60 <210> 229 <211> 60 114-

O:\121\121929.DOC 1336333

<212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的 <400> 229 gctccgggtc agcgtccgta cgacggtatg ctgggttggc cgacctacca gcgtatcgtt 60 <210> 230 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang_2結合之肽的DNA <400> 230 tccggtcagc tgcgtccgtg cgaagaaatc ttcggttgcg gtacccagaa cctggctctg 60 <210> i 231 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 231 ttcggtgaca aacgtccgct ggaatgcatg ttcggtggtc cgatccagct gtgcccgcgt 60 <210> 232 <211> 60 <212> DNA

O:\121\121929.DOC • 115- 1336333 <213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 232 ggtcaggacc tgcgtccgtg cgaagacatg ttcggttgcg gtaccaaaga ctggtacggt 60 <210> 233 <211> 60

<212> DNA

<213> 人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 233 ggtttcgaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga caaacagacc 60 <210> 234 $

<211> 60 <212> DNA <213>人造的序列

<220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 234 aaactggaat actgcgacgg tatggaagac ccgttcaccc agggttgcga caaccagtcc 60 <210> 235

<211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 -116-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 235 ctgcaggaat ggtgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt <210> 236 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列

<220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 236 gctcaggact actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga aatgcagaaa <210> 237 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 237 ctgctggact actgcgaagg tgttcaggac ccgttcacct tcggttgcga a'aacctggac <210> 238 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 -117·

O:\121\121929.DOC <220>1336333

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 238 caccaggaat actgcgaagg tatggaagac ccgttcacct tcggttgcga ataccagggt <210> 239 <211> 60 <212> DNA <213>人造的序列

<220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 239 atgctggact actgcgaagg tatggacgac ccgttcacct tcggttgcga caaacagatg <210> 240 <211> 60

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223> 編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA

<400> 240 ctgcaggact actgcgaagg tgttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaccagcgt <210> 241 <211> 60 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> O:\121\121929.DOC •118· 1336333

<223> .编碼能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 241 ctgcaggact actgcgaagg tcrttgaagac ccgttcacct tcggttgcga aaaacagcgt 60 <210> 242 <211> 54 '

<212> DNA <213>人造的序列 <220>

<223>編碼能夠與Ang-2結合之肽的DNA <400> 242 ttcgactact gcgaaggtgt tgaagacccg ttcactttcg gctgtgataa ccac 54 <210> 243 <211> 250 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223> 編瑪能夠與Ang-2結合之肤的DNA <400> 243

Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 15 10 15.

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 20 25 30

Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 35 40 45

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 5*5 60 -119-

O:\121\121929.DOC 1336333

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr 65 70 75 80

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn 85 90 95 « Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 100 105 110 lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin 115 120 125

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val 130 135 140

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val 145 150 155 160

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr. Thr Pro 165 170 175

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220

Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gly Tyr His Trp 225 230 235 240

Asn Ser Asp Cys Glu Cys Cys Arg Arg Asn 245 250 <210> 244 <211> 29

<212> DNA <213>人造的序列

〇;\121\121929.DOC 120- <220>1336333 <223> 寡核苷酸 <400> 244 caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga <210> 245 <211> 42 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 寡核甞酸 <400> 245 ggtggtgcgg ccgcactcga gactgttgaa agttgtttag ca <210> 246 <211〉 29 <212> DNA <213> 人造的序列 <220> <223> 寡核钵酸 <400> 246 caaacgaatg gatcctcatt aaagccaga

<210> 247 <211> 43 <212> DNA <2U>人造的序列 121 -

O:\121\121929.DOC <220>1336333 <223> 寡核钵酸 <400> 247 aacacaaaag tgcacagggt ggaggtggtg gtgcggccgc act <210> 248 <211> 91 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223> 寡核钵酸 <400> 248

Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 15 10 15

Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn 20 25 30

Lys Asn Asn Lys Ser Ala Arg Thr Gly Gly Gly Ala Thr Cys Cys Gly 35 40 45

Thr Gly Gly Ala Ser Cys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn 50 55 60

Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys 65 70 75 80

Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala 85 90 <210> 249 <211> 91 <212>蛋白質 <n3>人造的序列 122-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223>寡核荅酸 <400> 249

Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 15 10 15

Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Ala Ala Lys Cys Gly Lys Cys Cys 20 25 30

Lys Asn Asn Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Ala Thr Lys Thr Thr Lys 35 40 45

Gly Gly Lys Gly Gly Lys Asn Asn Lys Ala Cys Lys Thr Ala Lys Cys 50 55 60

Ala Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys 65 70 75 80

Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala 85 90 <210> 250 <211> 95 <212> 蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>寡核甞酸 <400> 250

Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr. Asn 15 10 15

Asn Lys Ala Ala Lys Thr Thr Lys Ala Ala Lys Cys Cys Lys Cys Thr 20 25 30 123-

O:\121\121929.DOC 1336333

Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys 35 40 45

Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr 50 55 60

Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn 65 70 75 80

Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85 90 95 <210> 251

<211> 91 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 寡核甞酸 <400> 251

Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 1 5 10 - 15

Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Lys Gly Ala Lys Gly Ala 20 25 - 30

Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Thr Gly Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys 35 40 45

Thr Gly Lys Ala Cys Lys Thr Gly Cys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Ala 50 55 60

Thr Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys 65 70 75 80

Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala 85 . 90 124-

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 252 <211> 89 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>寡核甞酸 <400> 252

Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 1 5 10 15

Asn Lys Thr Thr Lys Gly Ala Lys Thr Ala Lys Asn Asn Lys Gly Ala 20 25 30

Lys Gly Gly Lys Gly Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Cys Lys 35 40 45

Thr Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Gly Gly Lys Asn Asn Lys Gly 50 55 60

Ala Lys Ala Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn Lys Cys Ala Thr Thr Cys 65 70 75 80

Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85

<210> 253 <211> 95 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 寡核甞酸 <400> 253 -125

O:\121\121929.DOC 1336333

Cys Ala Cys Ala Gly Thr Gly Cys Ala Cys Ala Gly Gly Gly Thr Asn 15 10 15

Asn Lys Ala Ala Lys Thr Thr Lys Ala Ala Lys Cys Cys Lys Cys Thr 20 25 30

Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys Cys Thr Lys Gly Ala Lys Gly Ala Lys 35 40 45

Ala Cys Lys Cys Thr Lys Thr Ala Lys Gly Ala Lys Cys Ala Lys Thr 50 55 60

Thr Lys Ala Cys Lys Thr Thr Lys Cys Ala Lys Cys Ala Lys Asn Asn 65 70 75 80

Lys Cys Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Ala Thr 85 90 95 <210> 254 <211> 15

<212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>寡核钵酸 <400> 254

cacagtgcac agggt <210> 255

<211> 16 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 寡核甞酸 126-

O:\121\121929.DOC 161336333

<400> 255 tgatctcgag agaatg <210> 256 <211> 21 <212> DNA ' <213>人造的序列 <220> <223> 寡核甞酸 <_> 256 gttagctcac tcattaggca c <210> 257 <211> 21 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223> 寡核芬酸 <400> 257 gtaccgtaac actgagtttc g <210> 258 <211> 18 <212> DNA <213>人造的序列 <220> <223>寡核：y：酸 <400> 258 ttacacttta tgcttccg 21 21

O:\121\121929.DOC -127· 18 1336333 <210> 259 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 ’ <220> <223>能夠與Ang-2結合的狀體 <220>

<221> misc—特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 259

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro lie Arg Gin Glu Glu Cys 15 10 15

Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Trp Glu Val Leu Glu 20 25 30 <210> 260 <211> 31

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc 特徵 <222> (2)..(2) -128-

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> Xaa = Fc <400> 260

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Asn lie Gin Glu Glu Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Gly Lys Leu Glu 20. 25 30 <210> 261 <211> 31

<212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221〉 misc· _特徵 <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc <400> 261

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Tyr Glu Gin Asp Ala Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Ala Glu Val Leu Glu 20 25 30 <210> 262 <211> 31 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 -129·

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asn Arg Leu Gin Glu Val Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Glu Asn Val Leu Glu 20 25 30 <210> 263 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 262 <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc. _特徵 <222> (2)· · (2) <223> Xaa * Fc <400> 263

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys 1 5 10 15 •130·

O:\121\121929.D0C 1336333

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 264 <211> 31 <212> PRT <213>蛋白質人造的序列 <220> <223>

<22〇> 能夠與Ang-2結合的肽體 <221> <222> misc_ 特微 <223> X33 = F c <400> 264

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Arg His Gin Glu Gly Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Asp Trp Leu Glu 20 25 30

<210> 265 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc 特徵 -131 -

O:\121\121929.DOC 1336333 <222> (2). .(2) <223> Xaa =3 Fc <400> 265

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Pro Arg Gin Lys Asp Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Tyr Val Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 266 <211〉 31 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220〉 <221> misc_特徵 <222> (2).,(2) <223> Xaa * Fc • <400> 266

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser He Ser His Glu Glu Cys 1 5 i〇 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gin Val Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 267 <211> 31 蛋白質

O:\121\121929.DOC 1336333 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222〉 ¢2) . .(2) <223> Xaa = Fc

<400> 267

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Ala Ala Gin Glu Glu Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Arg Met Leu Glu 20 25 30 <210> 268 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc^特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 268

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys 1 5 10 15 -133-

O:\121\121929.DOC 1336333

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu 20 25 30 <210> 269 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體

<220> <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 269

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly His Ser Gin Glu Giu Cys 15 10 15

Gly Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Thr Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 270

<211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽技 <220> -134·

O:\121\121929.DOC 1336333 <22i> misc_特敬 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 270

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin His Trp Gin Glu Glu Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Pro Ser Lys Leu Glu 20 25 30

<210> 271 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc

<400> 271

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asn Val Arg Gin Glu Lys Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Val Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 272 <211> 31 •135·

O:\121\121929.DOC 1336333 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220〉 <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (2)·· (2) <223> Xaa = Fc

<400> 272

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Ser Gly Gin Val Glu Cys 15 10 15

Asn Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Asn Leu Glu 20 25 30 <210> 273 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc#特徵 <222> (2). . (2) <223> Xaa = Fc <400> 273 • 136·

O:\12m21929.DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Lys Thr Gin Glu His Cys 15 10 15

Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Arg Glu Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 274 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc^特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 274

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Trp Gly Gin Glu Gly Cys 1 5 10 15

Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Leu Pro Met Leu Glu 20 25 30

<210> 275 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2蛣合的肽體 -137-

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Val Asn Gin Glu Asp Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Pro Met Leu Glu 20 25 30

<210> 276 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2). . (2)

<220> <221> misc _特徵 <222> (2),. (2) <223> Xaa ** Fc <400> 275 <223> Xaa = Fc <400> 276

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Ala Pro Gin Glu Asp Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Asp He Lys Leu Glu 20 25 30 <210> 277 138-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (2).. (2)

<223> Xaa = Fc <400> 277

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin His Gly Gin Asn Met Glu Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Phe Arg Tyr Leu Glu 20 25 30 <210> 278 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc一特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc -139-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 278

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Arg Leu Gin Glu Glu Cys 15 10 15

Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Leu Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 279 <211> 31 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 279

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Thr Thr Gin Glu Lys Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Glu Ser Gin Leu Glu 20 25 30 <210> 280 <211〉 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> •140-

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 280

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Thr Ser Gin Glu Asp Cys 15 10 15

Val Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Ser Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 281 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc _特徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 281

Met Xs3 Gly Gly Gly Gly Gly Ale Gin Gin Val lie Gly Arg Pro Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Leu Glu Gly Leu Leu Glu 20 25 30 -141-

O:\121\121929.D0C 1336333 <210> 282 <211〉 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<221> 〇^8<:_特徵 <222> (2)·.(2) <223> Xaa = Fc <_> 282

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Ala Gin Gin Glu Glu Cys 15 10 15 .

Ala Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asp His Met Val Gly Leu Leu Glu 20 25 30 <210> 283 <211> 31

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特敬 <222> (2) . . (2) <223> Xaa = Fc -142-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 283

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Pro Gly Gin Glu Asp Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Val Arg S.er Leu Glu 20 25 30 <210> 284 <211> 31

<212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 284

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Met Asn Gin Val Glu Cys 15 10 15

Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Pro Arg Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 285 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 143-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc^ 特微 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 285

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Trp Ser His Gly Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gly Ser Thr Leu Glu 20 25 30 <210> 286 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 286

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Ser Thr Gin Asp Asp Cys 15 10 15

Asp Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Val Gly Pro Leu Glu 20 25 30 -144-

O:\121\121929-DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Pro Arg lie Ser Thr Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Asp Gin Leu Leu Glu 20 25 30 <210> 288 <211> 31

<210> 287 <211> 31 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> <220> 能夠與Ang-2結合的肽體 <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 287 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (2)..(2} -145-

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> Xaa = Fc <400> 288

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Thr lie Gly Asp Met Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Val Asp Leu Glu 20 25 30 <210> 289 <211> 31

<212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc _特徵 <222> (2) . · (2) <223> Xaa = Fc <400> 289

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 290 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 -146-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 290

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Leu Gly Gly Gin Gly Cys

1 5 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Leu Glu Asp Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 291 <211> 31 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220〉 <223> <220> 能夠與Ang-2結合的肽體 <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 291

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr lie Gly Ser Met Cys 15 10 15 -147-

O:\121\121929.DOC 1336333

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Gly Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 292 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> mjsc—特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa - Fc <400> 292

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Lys Gly Lys Ser Val Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Gin Ser Gly Leu Glu 20 25 30

<210> 293 <211> 31 <212>蛋白質 <n3> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc 特徵 -148-

O:\121\121929.DOC 1336333 <222> (2)..(2) <223〉 Xaa = Fc <400> 293

Met Xaa Gly Giy Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr lie Gly Ser Met Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Met Gin Gly Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 294 <211> 31

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa « Fc

<400> 294

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Val Asn Glu Val Val Cys 1 5 10 . 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn His Trp Asp Thr Pro Leu Glu 20 25 30 <210> 295 <211> 31 <212>蛋白質 -149-

O:\121\121929.DOC 1336333 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc

<400> 295

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Val Gin Val Gly Met Cys 1 5 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys His Met Arg Leu Gin Leu Glu 20 25 30 <210> 296 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220〉 <221> misc_ 特徵一 <222> (2)..(2> <223> Xaa = Fc <400> 296

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Val Gly Ser Gin Thr Cys 15 10 15 -150-

O:\121\i21929.DOC 1336333

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His Leu Val Glu Val Leu Glu 20 25 30 <210> 297 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體

<220> <221〉 misc j争徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa *= Fc <400> 297

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Gly Met Lys Met Phe 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala His lie Val Tyr Arg Leu Glu 20 25 30

<210> 298 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽tt <220> • 151 -

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Thr lie Gly Ser Met Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu His Met Gin Gly Gly Leu Glu 20 25 30

<210> 299 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特歡 <222> (2)..(2)

<221> misc_特徵 <222> (2). . (2) <223> Xaa =Fc <400> 298 • <223> Xaa - Fc <400> 299

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Ser Gin Arg Val Gly Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin His Leu Thr Tyr Thr Leu Glu 20 25 30 <210> 300' <211> 31 -152-

O:\121\121929.DOC 1336333 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc· _特徵 <222> (2)·.(2) <223> Xaa = Fc

<400> 300

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Trp Ser Trp Pro Pro Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Thr Val Trp Pro Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 301 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc一 _特徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 301 -153-

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Thr Ser Pro Ser Phe Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser His Met Val Gin Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 302 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa * Fc <400> 302

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Gin Gly Leu His Gin Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Lys Val Leu Trp Pro Ser Leu Glu 20 25 30 <210> 303 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220〉 <223>能夠與Ang-2結合的肽想 -154-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <221> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 303

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Val Trp Arg Ser Gin Val Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Asn Leu Gly Gly Asp Trp Leu Glu 20 25 30

<210> 304 <211> 31

<212> PRT <213> 蛋白質人造的序列 <220> <223> <22〇>能夠與Ang·2結合的肽嫌 <221> misc_特徵

<223> Xaa = Fc <400> 304

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asp Lys lie Leu Glu Glu Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Phe Phe Tyr Gly Ala Leu Glu 20 25 30 <210> 305 155-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 31 •·-....... <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (2),.(2)

<223> Xaa = Fc <400> 305

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Thr Phe Ala Arg Gin Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ala Leu Gly Gly Asn Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 306 <211> 31

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222〉 (2) .. (2) <223> Xaa = Fc 156-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 306

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Pro Ala Gin Glu Glu Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Glu Pro Leu Pro Leu Met Leu Glu 20 25 30 <210> 307 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc Jf争徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 307

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Arg Pro Glu Asp Met Cys Ser 1 5 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Trp His Leu Gin Gly Tyr Cys Leu Glu 20 25 30 <210> 308 <211〉 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> -157-

0:\121\121929.D0C 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Trp Gin Leu Ala Val Cys 15 l〇 15

Gin Trp Asp Pro Gin Thr Cys Asp His Met Gly Ala Leu Leu Glu 20 25 30 <210> 309 <211> 31 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> <220> 能夠與Ang-2結合的肽體 <221〉 misc_特徵 <222> (2)..(2) <223〉 Xaa = Fc <400> 309

<223> 能夠與Ang-2結合的肽饉 <220> <221> misc_特敬 <222> 12)..12) <223> Xaa = Fc <400> 308

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Gin Leu Val Ser Leu Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Asp Gly Trp Leu Glu 20 25 30 .158·

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 310 <211> 31 <212> 蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<22i> misc_ 特徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <_> 310

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Gly Gly Ala Gly Arg Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Gin Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 311 <211〉 31

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc 159-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 311

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Phe Leu Pro Asn Glu Cys 1 5 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Ser Asn Leu Pro Glu Ala Leu Glu 20 25 30 <210> 312 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 312

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Trp Ser His Gly Cys 15 l〇 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 313 <211> 31 <212>蛋白質 <n3>人造的序列

O:\121\121929.DOC -160- 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肚雅 <220> <22i> misc__ 特徵 <222〉 (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 313

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Trp Pro Gin Thr Glu Gly Cys 15 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu His Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 314 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽雜 <220>

<22i> misc 一特徵 <222> (2). *(2) <223> Xaa = Fc <400> 314

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Pro Asp Thr Arg Gin Gly Cys 1 5 10 15

Gin Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Tyr Gly Met Trp Leu Glu 20 25 30 -161 -

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 315 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<221> misc_ 特徵 <222> ⑵.·（2) <223> Xaa = Fc <400> 315

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Trp Pro Gin Asp Lys Cys 15 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 316 <211> 31

<212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (2)..(2) 162-

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> Xaa = Fc <400> 316

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Asp Lys lie Leu Glu Glu Cys 1 5 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 317 <211> 31

<fl2> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 317

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Ala Thr Gin Glu Glu Cys 1 5 ' 10 15

Glu Trp Asp Pro Trp Thr Cys Arg Leu Leu Gin Gly Trp Leu Glu 20 25 30 <210> 318 <2X1> 34 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 -163-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (34) .. (34) <223> Xaa = Fc <400> 318

Met Gly Ala Gin Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp Leu Glu Gin Arg 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Phe lie Leu Gin Gin Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 319 <211> 34 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220>

<223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (34).. (34) . <223> Xaa ^ Fc <400> 319 -164-

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Gly Ala Gin Thr Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu His Trp lie Leu Gin His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly XdS <210> 320 <211> 34

<212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34) .. (34) <223〉 Xaa = Fc <400> 320

Met Gly Ala Gin Gin Lys Tyr Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Lys Thr 1 5 10 15

Leu Tyr Asp Gin Phe Met Leu Gin Gin Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 321 <211> 34 <212>蛋白質 •165-

O:\121\121929.DOC 1336333 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc# 特徵 <222> (34) . . (34) <223> X33 — F c

<400> 321

Met Gly Ala Gin Leu Asn Phe Thr Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30 ；

Gly Xaa <210> 322 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc—特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa - Fc • 166 ·

OA121\121929.DOC 1336333 <40〇> 322

Met Gly Ala Gin Gin Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Phe Met Leu Gin Gin Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 323 <211> 34 <212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> <220> 能夠與Ang-2結合的肽體 <221> misc_特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 323

Met Gly Ala Gin Gin Glu Tyr Glu Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Thr 15 10 15

Leu Tyr Asn Gin Trp Met Phe His Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 324 <2X1> 34 • 167·

O:\121\121929DOC 1336333 蛋白_質~ <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 · <220> <221〉misc _特徵 <222> (34). . (34) <223> Xaa = Fc

<400> 324

Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu lie 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Gin Thr Phe Gin Glu Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 325 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (34),.(34) <223> Xaa = Fc 168-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 325

Met Gly Ala Gin Thr Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 326 <211> 34

<212> 蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc

<400> 326

Met Gly Ala Gin Thr Asn Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Asp Gin Thr 1 5 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 327 169-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 34 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> -<223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc 特徵 <222> (34)..(34)

<223> Xaa = Fc <220> <221> ，misc_ 特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 327

Met Gly Ala Gin Gin Asn Phe Lys Pro Met Asp Glu Leu Glu Asp Thr 15 10 15

Leu Tyr Lys Gin Phe Leu Phe Gin His Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 328 <211> 34 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 -170·

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽艟 <220> <22i> misc_ 特徵 t <222> (34)·.{34) <223> Xaa = Fc <400> 328

Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu Trp 1 5 l〇 15

Leu Tyr His Gin Phe Thr Leu His His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 329 <211> 34 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220>

<223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 329

Met Gly Ala Gin Tyr Lys Phe Thr Pro Leu Asp Asp Leu Glu Gin Thr 1 5 10 15 -171 -

O:\121\121929.DOC 1336333

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Val Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 330 <211> 34 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_ 特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 330

Met Gly Ala Gin Gin Asn Tyr Lys Pro Leu Asp Glu Leu Asp Ala Thr 1 5 10 15

Leu Tyr Glu His Phe lie Phe His Tyr Thr Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 331 <211> 34 <212>蛋白質 <213>人造的序列 • 172·

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34).·(34) <223> Xaa = Fc <_> 331

Met Gly Ala Gin Val Lys Phe Lys Pro Leu Asp Ala Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu His Trp Met Phe Gin Gin Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 332 <211> 34 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang_2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222〉 (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 332 -173 -

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Gly Ala Gin Glu Asp Tyr Met Pro Leu Asp Ala Leu Asp Ala Gin 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Phe lie Leu Leu His Gly Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 333 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc <400> 333

Met Gly Ala Gin Tyr Lys Phe Asn Pro Met Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Glu Phe Leu Phe Gin His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 334 <211> 34 <212>蛋白質 -174-

O:\I21U21929.DOC 1336333 <213> 人造的序列 . <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34).. (34)

Xd.3 = F* c

<400> 334

Met Gly Ala Gin Ser Asn Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Phe Met Leu Gin His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 335 <211> 34

<212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220〉 <22i> misc_ 特徵 <222> (34)..(34) <223> Xaa = Fc 175,

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 335

Met Gly Ala Gin Gin Lys Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr 15 10 15

Leu Tyr Lys Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 2Q 25 30

Gly Xaa <210> 336 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (34) ..(34 ) <2 2 3> Xes = Fc <400> 336

Met Gly Ala Gin Gin Lys Phe Met Pro Leu Asp Glu Leu Asp Glu lie 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Phe Met Phe Gin Gin Ser Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 337 <211> 34 -176·

〇：\121U21929.DOC 1336333 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223〉能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34) . . (34)

<223> Xaa = Fc <400> 337

Met Gly Ala Gin Thr Lys Phe Asn Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Gin Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 338 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34).. (34) <223> Xaa * Fc -177·

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 338

Met Gly Ala Gin His Thr Phe Gin Pro Leu Asp Glu Leu Glu Glu Thr 1 5 10 15

Leu Tyr Tyr Gin Trp Leu Tyr Asp Gin LeQ Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 339 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang_2結合的肽雜 <220> <221> misc_特徵 <222> (34)..(34} <223> Xaa = Fc <400> 339

Met Gly Ala Gin Gin Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin Gin Arg Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa <210〉 340 178-

O:\121\121929.DOC 1336333 <211> 34 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (34).·(34)

<223> Xaa = Fc <400> 340

Met Gly Ala Gin Gin Thr Phe Gin Pro Leu Asp Asp Leu Glu Glu Tyr 15 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp lie Arg Arg Tyr His Leu Glu Gly Gly Giy Gly 20 25 30

Gly Xaa <210> 341 <211> 34

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc一特徵 <222> ¢34)..(34) 179-

O:\121\121929.DOC 1336333 <223> Xaa * Fc <400> 341

Met Gly Ala Gin Ser Lys Phe Lys Pro Leu Asp Glu Leu Glu Gin Thr 1 5 10 15

Leu Tyr Glu Gin Trp Thr Leu Gin His Ala Leu Glu Gly Gly Gly Gly 20 25 30

Gly Xaa

<210> 342 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特徵 <222> (2)., (2) <223> Xaa « Fc <400> 342

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ser Gly Gin Leu Arg Pro Cys 15 10 15

Glu Glu lie Phe Gly Cys Gly Thr Gin Asn Leu Ala Leu Leu Glu 20 25 30 <210> 343 <211> 31 180-

O:\121\121929.DOC 1336333 <212> 蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特微 <222> ⑵.·（2) <223> Xaa = Fc

<400> 343

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Gly Gly Met Arg Pro Tyr 15 10 15

Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Asn Tyr Asp Val Gin Ala Leu Glu 20 25 30 <210> 344 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc _特徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 344 -181 -

O:\121\121929.DOC 1336333

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Gin Asp Leu Arg Pro Cys 15 10 15

Glu Asp Met Phe Gly Cys Gly Thr Lys Asp Trp Tyr Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 345 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc^ 特徵 <222> ⑵..（2) <223> Xaa = Fc <400> 345

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Pro Gly Gin Arg Pro Tyr 1 5 10 15

Asp Gly Met Leu Gly Trp Pro Thr Tyr Gin Arg lie Val Leu Glu 20 25 30 <210> 346 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 -182-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <22i> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 346

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gin Thr Trp Asp Asp Pro Cys 15 10 15

Met His He Leu Gly Pro Val Thr Trp Arg Arg Cys lie Leu Glu 20 25 30

<210〉 347 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2)..(2)

<223> Xaa = Fc <400> 347

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Gly Asp Lys Arg Pro Leu 15 10 15

Glu Cys Met Phe Gly Gly Pro He Gin Leu Cys Pro Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 348 -183-

0:\121\121929.D0C 1336333 <211> 25 . · · ·· , · · <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc一特徵 <222> (2)..(2)

<223> Xaa = Fc <400> 348

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Arg Pro Cys Glu Glu lie 1 5 10 15

Phe Gly Gly Cys Thr Tyr Gin Leu Glu 20 25 <210> 349 <211> 31

<212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2) .. (2) <223> Xaa = Fc •184-

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 349

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Glu Trp Cys Glu Gly 1. 5 10 15

Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gin Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 350 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列

<220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽趙 <220> <221> misc _特徵 <222> (2).. (2) <223> Xaa = Fc <400> 350

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Met Leu Asp Tyr Cys Glu Gly 1 5 10 15

Met Asp Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Lys Gin Met Leu Glu 20 25 30 <210> 351 <211> 蛋白質 <212> 人造的序列 <213> Artificial Sequence <220>

O:\121M21929.DOC -185- 1336333 <223> 能夠舆Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_ 特徵 <222> (2).·(2) <223> Xaa == Fc <400> 351

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin His Gin Glu Tyr Cys Glu Gly 1 5 10 15

Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Tyr Gin Gly Leu Glu 20 25 30 <210> 352 <211> 31 <212>蛋白質 <213> 人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<22i> misc_ 特徵 <222> (2).. {2) <223> Xaa = Fc <400> 352

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly 15 10 15

Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Gin Arg Leu Glu 20 25 30 -186·

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 353 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220>

<22i> misc_特徵 <222> (2).· (2) <223> Xaa = Fc <400> 353

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Leu Asp Tyr Cys Glu Gly 15 10 :15

Val Gin Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Asn Leu Asp Leu Glu 20 25 30 <210> 354 <211> 31

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc一特微 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc • 187·

O:\121\121929.DOC 1336333 <400> 354

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Gly Phe Glu Tyr Cys Asp Gly 15 10 15

Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Lys Gin Thr Leu Glu 20 25 30 <210> 355 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列

<220> <223>能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <22i> misc_特徵 <222> (2)..(2) <223> Xaa = Fc <400> 355

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Ala Gin Asp Tyr Cys Glu Gly 15 10 15

Met Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Met Gin Lys Leu Glu 20 25 30 <210〉 356 <211> 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 -188-

O:\121\121929.DOC 1336333 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc特敬 <222> (2)..(2) <223> Xaa ^ Fc <400> 356

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Leu Gin Asp Tyr Cys Glu Gly 15 10 15

Val Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Glu Lys Gin Arg Leu Glu 20 25 30 <210> 357 <211〉 31 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223>能夠與Ang-2結合的狀禮 <220>

<22i> misc_ 特徵 <222> (2)_·(2) <223> Xaa * Fc <400> 357

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Lys Leu Glu Tyr Cys Asp Gly 15 10 15

Met Glu Asp Pro Phe Thr Gin Gly Cys Asp Asn Gin Ser Leu Glu 20 25 30 189-

O:\121\121929.DOC 1336333 <210> 358 <211〉 29 <212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的肽體 <220> <221> misc_特歡 <222> (2)..(2)

<223> Xaa = Fc <400> 358

Met Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Phe Asp Tyr Cys Glu Gly Val 15 10 15

Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Cys Asp Asn His Leu Glu 20 25 <210> 359 <211> 32

<212>蛋白質 <213>人造的序列 <220> <223> 能夠與Ang-2結合的多肽 <400> 359

Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gin Thr Asn Phe Met Pro Met Asp Asp 1 5 10 15

Leu Glu Gin Arg Leu Tyr Glu Gin Phe lie Leu Gin Gin Gly Leu Glu 2〇 25 30 -190·

0:\121\121929.D0C

Claims

1336333 —— 第 0961298< 4J|專中文申請專和

10月）

1. 一種能夠與Ang-2結合的多肽，其包括下式的胺基酸序列： a^YCa^DPWTCaW14 (序列識別：69號）其中·’ a1為V、I、P、W、G、S、Q、N、E、K、R或H; a2為V、P、M、G、S、Q、D、E、K、R4H; a3為A、V、P、M、F、T、G、D、E、K4H; a5 為 A、V、G、Q、N、D 或 E ; a12為 S、Q、N、D、E、K或 R ; a13為L、T或H ;且 a14為 V、L、I、W或 M ; 或其在生理學上可接受的鹽類；其限制條件為該多肽不包括至少一個選自由序列識別 :2、序列識別：4號和序列識別：76號至序列識別：11 8號所組成之群的胺基酸序列。 2. 根據請求項1之多肽，其中： a1為 Q ; a2 為 E ; a3 為 E ; a5為D或E ; a12為D或E ; a13為Η ;且 121929*991028.doc 1336333 a14為 Μ ; 或其在生理學上可接受的鹽類。 3. —種能夠與Ang-2結合的多肽，其包括下式的胺基酸序列 b1b2b3b4b5b6Cb8WDPWTCb15b16b17b18b19b20 (序列識別：70號）其中： b1 不存在或為A、V、L、P、W、F、T、G、S、Q、N、 K、R或 Η ; b2 不存在或為A、V、L、I、P、W、M、T、G、S、Y、 N、K、R或 Η ; b3 不存在或為A、L、I、P、W、M、T、G、S、Q、N、 E、R或 Η ; b4 為 V、I、P、W、G、S、Q、N、E、K、R或 Η ; b5為V、P、M、G、S、Q、D、E、K、R4H; b8為 A、V、G、Q、N、D 或 E ; b15為 S、Q、N、D、E、K或 R ; b16為 L、T或 H ; b17為 V、L、I、W或 M ; 1)18不存在或為八、¥、1^、？、1^、？、丁、0、丫、（5、0、 E或R ; 1519不存在或為乂、！^、1、？、丁、0、8、丫、（5、：^、0、 E或R ;且 121929-991028.doc 1336333 b20 不存在或為V、L、P、W、M、T、G、S、Y、Q、N ' D、K或 R ; 或其在生理學上可接受的鹽類；其限制條件為該多肽不包括至少一個選自由序列識別 :2、序列識別：4號和序列識別：76號至序列識別：11 8號所組成之群的胺基酸序列。 4. 根據請求項3之多肽，其中： b1不存在或為P或T ; b2不存在或為I或N ; b3不存在或為R或I ; b4為 Q ; b5為 E ; b6為 E ; b8為D或E ; b15為D或E ; b16為 Η ; b17為 Μ ; b18不存在或為W或Ρ ; b19不存在或為G或Ε ;且 b2()不存在或為V或Κ ; 或其在生理學上可接受的鹽類。 5. —種融合多肤，其包括至少一個根據請求項1至4中任一項的多肽和媒介體，其中該融合多肽能夠與Ang-2結合，或其在生理學上可接受的鹽類。 121929-991028.doc 1336333 6. 根據請求項5之融合多肽，其中該媒介體為至少一個者：Fc功能部位、聚乙二醇、脂質、膽固醇基團、化合物和寡醣。 7. 根據請求項丨至4中任一項之多肽，其為環狀的。 8. —種根據請求項丨至4中任一項之多肽的二聚體或多下列碳水聚體 9. 一種組合物其中：其具有下式或其多聚體： (Xl)a-FJ-(X2)b , F1為媒介； X1和X2分別獨立選自 -(L^c-P1 ；<^])c-Pl-(L2)d.V2 ; •(LVP丨〇Μανρ3 ;和 -(L )c-P，-(L2)d-P2.(L3)e_p3_(L4)f p4 . 其中-或多個Pi、P'p3和p4分別獨立包括選自由所組成之群的多肽： (a)胺基酸序列 a a2a3Ca5WDPWTCa12a13 69號），其中： aM(序列識下列別： a1為 V、、P W、G、S、Q、N、E'K、 a2 為 V、P、Μ、〇、 S、Q、D、E、K、R或 Η; a、A、V、P、M、F、T、G、D、E、K或 Η; 〆為 Α、V、G、Q、Ν、D或 Ε ; a丨2為 S、Q、N、d、e、K^R; 121929-991028.doc -4- 1336333 a13為L、T或Η ;且 a14為 V、L、I、W或 Μ ; 或其在生理學上可接受的鹽類；和 (b)胺基酸序列 b2Q(序列識別：70號），其中： b1不存在或為A、V、L、P、W、F、T、G、S、Q、 N、K、R或 Η ;

b2 不存在或為A、V、L、I、P、W、M、T、G、S、 Y、N、K、R或 Η ; b3 不存在或為A、L、I、P、W、M、T、G、S、Q、 N、E、R或 Η ; b4為V、I、P、W、G'S、Q、N、E、K、R4H; b5為乂、？、]^、0、3、（5、0、£、1：、11或11; b6為入、¥、？、^4、卩、丁、0、0、£、1<：或^1; b8為 A、V、G、Q、N、D 或 E ;

b15為 S、Q、N、D、E、K或 R ; b16為 L、T或 Η ; b17為 V、L、I、W或 Μ ; b18不存在或為Α、V、L、P、W、F、T、G、Y、Q 、D ' E或 R ; b19不存在或為V、L、I、P、T、G、S、Y、Q、N、 D、E或R ;且 b20 不存在或為V、L、P、W、M、T、G、S、Y、Q 、N、D、K或 R ; 121929-991028.doc 1336333 或其在生理學上可接受的鹽類；其限制條件為—或夕個P1、P2、P3和P4不包括選自由序列識別：2、序= 識別：4號和序列識別：76號至序列識別：ιΐ8號= 組成之群的多肽；〜 L1、L2、L3和L4分別獨立為聯結子；且其限制條件為a和b a、b、c、d、e和f分別獨立為〇或j，之中至少有一個是1 ; 或其在生理學上可接受的鹽類。 1 〇.根據請求項9之组合物，其具有下式： X^F1 或 F]-X2 或其在生理學上可接受的鹽類。 U ·根據請求項9之組合物，其具有下式： F!-(L 丨)C-P 丨或其在生理學上可接受的鹽類。根據請求項9之組合物，其具有下式： F】-(LVpi-(L2)d-P2 或其在生理學上可接受的鹽類。 13·根據請求項9之組合物，其具有下式：斗' PL(l1)c-F 丨-(L2)d-p2 ，其在生理學上可接受的鹽類。 :54::求項9之組合物’其”如功能部位或其片段。據㈣求項9之組合物，其中F丨包括序列識別W之胺 121929-991028.doc 基酸序歹|J。 —種多核;y：酸，其係編碼根據請求項丨至彳中任一項之夕肽。、夕 17. —種表現載體，其包括根據請求項16之多核苷酸。 18'種佰主細胞，其包括根據請求項1 7之表現載體。 19.根據明求項18之宿主細胞其中該細胞為原核生物細胞。 0.根據明求項19之宿主細胞，其中該細胞為大腸桿菌細胞。鲁21.根據凊求項18之宿主細胞，其中該細胞為真核生物細胞。種醤藥組合物’其包括有效含量的根據請求項1至4中任一項之多肽，以及在藥學上可接受的載劑。 23. 一種根據請求項5或6之融合多肽之用途，其係用於製備在甫礼動物中抑制不想要之血管生成作用之藥物。種根據叫求項9至15中任一項之组合物之用途其係用於製備在哺乳動物中抑制不想要之血管生成作用之藥物 25. 26. 27. 28. 29.

種根據°月求項5或6之融合多肽之用途，其係用於製備在個體中治療血管生成作用之藥物。種根據D月求項9至15中任—項之組合物之用途，其係用於製備在個體中+底a & i ^ , M甲/〇療血官生成作用之藥物。種根據°月求項5或6之融合多肽之用途，其係、用於製備在哺乳動物中調節血管生成作用之藥物。種根據β求項9至15中任—項之組合物之用途，其係用於製備在哺乳動物中調節血管生成作用之藥物。 —種根據請求項5或6之融合多肽之用途，其係用於製備 121929-99 丨〇28.doc 在哺乳動物中抑制其特徵為不想要的血管生成作用之腫瘤生長之藥物。 30. -種根據請求項9至15中任一項之組合物之料其係用於製備在錢動物中抑制其特徵為不想要的血管生成作用之腫瘤生長之藥物。 1 ·種根據明求項5或6之融合多肽之用途，其係用於製備與化學治療劑併用以在哺乳動物令治療癌症之藥物。玟-種根據請求項9至15中任—項之組合物之用$，其係用於製備與化學治療劑併用以在哺乳動物中治療癌症之藥物。 ’、 33.根據請求項31戎田、公次32之用途，其令該化學治療劑為5-FU、 CPT-11和剋癌易之至少其中一種。从一種根據請求項5或6之融合多肽之用途，其係用於㈣在哺乳動物中調節至少一種血管通透性或血浆漏出之藥物 35. 一種根據請求項9至15中任一項之组合物之用㊣， :製備在哺乳動物中調節至少-種-管通透性或IS 出之藥物。 X果/爲 36. : = =ΪΓ或6之融合多肽之用途’其係用於製備 /〇療至少一種下列疾病之藥物‘·眼睛的新生血f疾病、肥胖、血管 , 硬化、S ^胞瘤、血f瘤、動脈粥樣人’正：矢病、炎症病症、動脈粥樣硬化、子異位症、贅生物的疾病、與骨絡有g的、 37. 一種根據請求項95 / X干皮癬。項至15中任一項之組合物之用途，1择用於裏備在哺乳動物中一，、 H 種下列疾病之藥物·.眼 J2J929-99I028.doc 1336333 睛的新生血管疾病、肥胖、血管母細胞瘤、血管瘤、動脈粥樣硬化、炎症疾病、炎症病症、動脈粥樣硬化、子宮内膜異位症、贅生物的疾病、與骨骼有關的疾病或牛皮癣。 38· —種能夠與Ang_2結合的多肽，該多肽包括序列識別： 25號的胺基酸序列或其在生理學上可接受的鹽類，其中在序列識別：25號中，Fc的胺基酸序列為序列識別： 60號。參39.根據請求項38之多肽，其中該多肽係由序列識別：25 號的胺基酸序列或其在生理學上可接受的鹽類所組成。 40. —種多核苷酸，其係編碼根據請求項38或39之多肽。 41 ·根據請求項40之多核苷酸，其係如序列識別：46號所示。 42_ —種表現載體，其包括根據請求項4〇或41之多核甞酸。 43 . —種伤主細胞，其包括根據請求項42之表現載體。 • 44.根據請求項43之宿主細胞，其中該細胞為原核生物細胞。 45.根據請求項44之宿主細胞，其中該細胞為大腸桿菌細胞。 46·根據請求項43之宿主細胞，其中該細胞為真核生物細胞。 47. —種醫藥組合物，其包括有效含量的根據請求項w或39 之多肽’以及在藥學上可接受的載劑。 48· -種根據請求項38或39之多肽之用途，其係用於製備在哺乳動物中抑制血管生成作用之藥物。 49. -種根據請求項38或39之多肽之用途，其係用於製備在個體中治療血管生成作用之藥物。 121929-991028.doc 1336333 5〇· 一種根據請求項38或39之多肽之用途，其係用於製備在哺乳動物中調節血管生成作用之藥物。 51. 一種根據請求項38或39之多肽之魏，其係用於製備在哺乳動物中抑制其特徵為不想要的血管生成作用之腫瘤生長之藥物。 52· 一種根據請求項38或39之多肽之料，其係用於製備與化學治療劑併用以在哺乳動物中治療癌症之藥物。 53·根據請求項52之用途，其中該化學治療劑為5刊、πτ-ί 1 和剋癌易之至少其中一種。 54. 55. 一種根據請求項38或39之多肽之用途，其係用於製傭在哺乳動物中調節至少-種血管通透性或血_出之藥物。一種根據請求項38或39之多肽之用途，其係用於製備在哺乳動物中治療至少一種下列疾病庆炳之樂物.眼睛的新生血管疾病、血管瘤、炎症疾病、慢性炎症病症、子宮内膜異位症、贅生物的疾病、與骨路有關的疾病或牛皮癖 56. 根據請求項55之用途，其中該炎症疾病為關節炎。 57. -種能夠與Ang_2結合的多肽’該多肽包括序列識別： 25號的胺基酸序列，具有至少— 個下列者：最多4個胺基酸取代、最多1個插入或最多—個 1回删除’其中該多肽具有至少一個取代、插入或刪除。 58. 根據請求項57之多肽，其中該多肿6 β 夕狀包括具有丨或2個胺基酸取代或1個刪除或1個插入之庠而丨％ , 心斤列識別：25號的胺基酸序列。 121929-991028.doc 10· 1336333 59. 根據請求項57或58之多肽，其中該多肽包括具有1或2個胺基酸取代之序列識別：25號的胺基酸序列。 60. 根據凊求項μ或μ之多肽，其中該多肤包括具有1或2個保留性胺基酸取代之序列識別：25號的胺基酸序列。 61. 根據清求項57或58之多肽，其中該多肤包括具有1個保留性胺基酸取代之序列識別：25號的胺基酸序列。 62. 根據請求項57或58之多肽，其中該多肽包括具有1個刪除之序列識別：25號的胺基酸序列。 # 63.根據請求項57或58之多肽，其中該多肽包括具有1個插入之序列識別：25號的胺基酸序列。 64·根據請求項57或58之多肽，其中序列識別：25號中的 F c為人類I g g 1之f c。 65. 根據請求項64之多肽，其中序列識別：25號中的以的胺基酸序列為序列識別：60號。 66. —種多核：y：酸，其係編碼根據請求項57至65中任一項之多肽。 ^ 67· 一種表現載體，其包括根據請求項66之多核铝酸。 68. —種宿主細胞，其包括根據請求項67之表現载體。 69·根據請求項68之宿主細胞，其中該細胞為大腸桿菌細胞。 70· —種醫藥組合物，其包括有效含量的根據請求項”至“ 中任一項之多肽’以及在藥學上可接受的载劑。 71_ —種根據請求項57至65中任一項之多肽之用途，其係用於製備在哺乳動物中抑制jk管生成作用之藥物。 72. —種根據請求項57至65中任一項之多肽之用途，其係用 121929-991028.doc 1336333 於製備在哺乳動物中抑制其特徵為不想要的血管生成作用之腫瘤生長之藥物。 73. —種根據請求項57至65中任一項之多肽之用途，其係用於製備與化學治療劑併用以在哺乳動物中治療癌症之藥物。 121929-991028.doc 12-