TWI326308B - Method for concealing a secret information carried within a dna molecule and method for decoding thereof - Google Patents
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Description
1326308 玫、發明說明： 【明 屬 3 發明領域 本發明揭露一種用以隱藏一被攜帶於一DNA分子内的秘 5 密訊息（secret information)的方法以及一種用以將一藉由該隱 藏方法而被隱藏的秘密訊息予以解密的方法。特別地，該隱藏 方法涉及到定序辨識序列、順向引子辨識序列以及反向引子辨 識序列的使用，而該解密方法涉及到分別對應於在用以隱藏該 秘密訊息的方法中所使用到的定序辨識序列、順向引子辨識序 10 列以及反向引子辨識序列的定序引子、順向引子以及反向引子 之使用。 C先前技4^3 發明背景 為了防止被竊取之目的，值得去傳輸或是隱藏僅可以藉由 15 特殊方法或是密碼鑰匙來予以解碼的訊息。關於利用DNA來進 行傳遞秘密訊息之技術已有見於先前技術。例如，US 6,312,911 揭示之藏密方法涉及利用—選定的密碼表來將一秘密訊息編 碼成為一推定的DNA序列’繼而合成出真正的DNA序列並將該 DNA序列藏匿於選定的基因組DNA (genomic DNA)中。此外， 20 該美國專利案所揭示的解碼方法涉及使用與攜帶有該秘密訊 息的DNA序列之侧翼序列相關的PCR引子，俾以藉由pcr來擴 增出攜帶有該秘密訊息的DNA片段’而後將所擴增出的DNA片 段定序，並以密碼表來解讀該DNA片段被定序出來的核普酸序 列，如此即可還原出原始的秘密訊息。 4 但是，上述的藏匿秘密訊息與解密的方式是相當簡易的， 對於那些熟悉分子生物技術之人士而言，一旦得知可被用來進 行PCR之引子時，便能輕易地釣出被隱藏的秘密訊息。 因此，本技藝仍存在有一需要來發展能有效地藏匿被攜帶 5 於DNA分子内的秘密訊息的方法暨其對應的解密方法，俾以達 到提高傳輸秘密訊息時的安全性以及提高使用在商品防偽上 的功能等等之目的。 L發明内容3 發明概要 10 於是，在第一個方面，本發明提供一種用以隱藏一被攜帶 於一DNA分子内的秘密訊息的方法，其係先使秘密訊息分散成 為分開的部分而後再予以隱藏，而使得該秘密訊息被破解的機 率被充分地降低》 依據本發明，該用以隱藏一帶有一秘密訊息之DNA分子的 15 方法包含下列步驟： (a) 提供一攜帶有一秘密訊息的DNA分子，該DNA分子係 由數個核够酸片段所構成，且該等核砮酸片段的每一者 各自帶有該秘密訊息的一個部分； (b) 將該帶有秘密訊息的DNA分子的該等核苷酸片段予以分 20 開，繼而於各個被分開的核省酸片段的5’端或3’端處分 別連接以一個定序辨識序列，藉此而形成一個個別的第 一接合產物； (c) 對於每一個得自於步驟(b)之第一接合產物，在其5’端處 連接以一個順向引子辨識序列以及在其3’端處連接以一 5 1326308 個反向引子辨識序列，藉此而形成一個個別的第二接合 產物；以及 (d)將得自於步驟(c)的個別的第二接合產物置放於一指定的 媒介物中，藉此，該秘密訊息的每一個部分都被隱藏。
5 在第二個方面，本發明提供一種用以將一被攜帶於一DNA 分子内並藉由上述藏密方法而被隱藏的秘密訊息予以解密的 方法，其包含下列步驟： (a)從被懷疑帶有被隱藏的秘密訊息的媒介物上分離出 DNA物質； 10 (b)藉由使用數組各由一個順向引子以及一個反向引子所 構成的PCR引子對作為第一解密鑰匙來擴增得自於步 驟⑻的DNA物質，其中各組PCR引子對的順向引子 的核餐酸序列相同於在上述藏密方法的步驟(c)中為一 個第一接合產物所用的一個順向引子辨識序列的核菇 15 酸序列，而各組PCR引子對的反向引子所具核杳酸序 列是互補於在上述藏密方法的步驟(c)中為同一個第一 接合產物所用的一個反向引子辨識序列的核培酸序 列，藉此而得到個別的PCR產物，其中各個PCR產物 各自包含有從上述藏密方法的步驟(c)所得到的一個第 20 二接合產物的核誓酸序列； (c)藉由使用數個定序引子作為第二解密鑰匙來進行得自 於步驟(b)的個別PCR產物之核笞酸定序，其中各個定 序引子所具核砮酸序列是各自相同於在上述藏密方法 的步驟(b)中為該DNA分子的一個核智酸片段所用的 6 1326308 一個定序辨識序列所具者，藉此而得到個別的定序產 物，其中各個定序產物各自對應於從上述藏密方法的 步驟(b)所得到的一個第一接合產物； (d) 對於步驟(c)所得到的各個定序產物，將各個定序產物 5 扣除掉所用的對應定序引子之部分以推算出位在該各 個定序產物内之對應於在上述藏密方法的步驟(b)所使 用的各個核智酸片段之核帑酸序列；
(e) 利用一驗基殘基順序解密機構（decoding mechanism for the base residue order)來排列由步驟(句所推算出的 10 該等核贫酸序列之順序，藉此帶有秘密訊息且藉 由上述藏密方法而被隱藏於一媒介物内的DNA分子 的全長核瞀酸序列被推算出；以及 (〇依據一指定的核疳酸密碼編譯表來解讀從步驟(d)所推 算出的DNA分子的全長核球酸序列，藉此，被隱藏於 15 該DNA分子内的秘密訊息被解讀出。
本發明之上述以及其他目的與特徵可藉由參照下文之描 述、隨文檢附的申請專利範圍和伴隨之圖式而變得更為明顯， 其中： 圖式簡單說明 20 第1圖示意說明如何利用本發明之藏密方法而將一帶有秘 密訊息的DNA分子隱藏於數個DNA載體内； 第2圖示意說明，如何利用本發明之藏密方法而將第1圖中 所示的該帶有秘密訊息的DNA分子的一個核智·酸片段(agct)& 其5’端至3端依序地連接以一順向引子辨識序列丨、一插入序列 7 ()—定序辨識序列1以及一反向引子辨識序列1，繼而再被 插入至一個可攜帶DNA片段的載體（以來表示）内； 第3圖示意說明’如何利用本發明之藏密方法而將第1圖中 '一、的該帶有秘密訊息的子的一個核替酸片段(agct)從 蠕至3端依序地連接以一順向引子辨識序列1、一定序辨識 序歹I】1、—. —插入序列（…）以及一反向引子辨識序列1，繼而再被 插入至一個可攜帶DNA片段的載體（以^_來表示）内； 第4圖示意說明如何利用本發明之解密方法，使用3組PCR 引子對作為第一解密鑰匙來對3個被懷疑帶有要被解密的核苷 S夂片&之載體進行擴增反應，而得到3個PCR產物； 第5圖不意說明如何利用本發明之解密方法，使用3個定序 引子作為第二解密鑰匙來定序第3圖中所得到的3個PCR產物， 而得到3個定序產物； 第6圖不意說明如何利用本發明之解密方法，使用數個鹼 基殘基順序碼作為第三解密鑰匙來與第4圖中所得到的3個定 序產物進行核#酸序列的驗基殘基順序比對，而推算出一具有 對應於第1圖中所示的該帶有秘密訊息的dna分子的全長核誓 酸序列；以及 第7圖不意說明如何利用本發明之解密方法，使用一個鹼 基殘基順序碼作為第三解⑽匙以及_個鹼基殘基出現頻度 碼作為f四解密錄匙來與第4圖中所得到的3個定序產物進行 核誓酸序列的驗基殘基順序比對，而推算出—具有對應於第i 圖中所不的該帶有秘密訊息的DNA分子的全長核哲酸序列。 C實施方式> 先前技術已有揭示，將被使用於PCR過程當中以便擴增出 一所欲的PCR產物之引子當作用以將一以dna形式被隱藏的秘 密訊息予以解密的解密鑰匙，例如118 6,312,911即是。但是， 若以間接或直接方式而猜測出要被使用於DNA擴增過程當中 的PCR引子時，有心的商品仿冒者或是意圖竊取防偽機密的人 士便能容易地以現今已技術發展成熟的PCR技術去進行密碼破 解，從所擴增出的DNA去解讀出被隱藏於内之秘密訊息。針對 此一問題，為了使經加密處理的秘密訊息在傳遞或解密的期間 當中能受到更安全的保障，申請人於本發明中發展出使用多重 加密的技術來使要攜帶有要被隱藏的秘密訊息的核苷酸序列 能受到不同層面技術的多重保障，進而難以被商業間諜或是仿 冒者所破解。 於是，申請人在本發明中提供-種用以隱藏—被攜帶於一 DNA分子内的秘密訊息的方法，其包含下列步驟： (a) 提供一攜帶有一秘密訊息的DNA分子，該DNa分子係 由數個核#酸片段所構成，且該等核哲酸片段的每一者 各自帶有該秘密訊息的一個部分； (b) 將該帶有秘密訊息的DNA分子的該等核苷酸片段予以分 開，繼而於各個被分開的核普酸片段的5’端或3,端處八 別連接以一個定序辨識序列，藉此而形成一個個別的第 —接合產物； (c) 對於每一個得自於步驟(b)之第一接合產物，在其5，端處 連接以一個順向引子辨識序列以及在其3,端處連接以— 個反向引子辨識序列，藉此而形成一個個別的第二接入 1326308 產物；以及 (d)將得自於步驟(e)的個別的第二接合產物置玫於一指定的 媒介物中，藉此，該秘密訊息的每一個部分都被隱藏。 在本發明之一個較佳具體例中，該攜帶有秘密訊息的1)>1八 5 分子可藉由一包含下列步驟的方法而被獲得： (i)依據一指定的核苦酸密碼編譯表將該秘密訊息編碼成 一核誓酸序列碼條； (11)將得自於步驟⑴的核者酸序列碼條分成數個部分，繼而 藉由人工合成方式來合成出各自對應於該核苷酸序列 10 碼條的其中一個部分的核苷酸片段，藉此一由數個核笮 酸片段所構成的DNA分子被獲得。 用於合成DNA分子的核苷酸序列之技術是熟習此項技術 人士所詳知的。因此，當所欲隱藏的秘密訊息被編碼成一核苷 酸序列碼條後’熟習此項技術人士就可依據所需，將該核苷酸 15序列碼條區分為數個部分，然後藉由人工合成方式來合成出各 自對應於各個部分的核巷酸片段。 在本發明之另一個較佳具體例中，該攜帶有秘密訊息的 DNA分子係藉由一包含下列步驟的方法而被獲得： (i’）依據一指定的核苦酸密碼編譯表將該秘密訊息編碼成 20 一核苷酸序列碼條； (11’）藉由人工合成方式來合成出一所具核苷酸序列係對應 於步驟(Γ)所編碼出的該核苷酸序列碼條的核昝酸序 列之DNA分子。 當全長的DNA分子被合成出，熟習此項技術人士可以藉由 10 1326308 本技藝所詳知且慣用的限制1¾處理技術將該全長的DNA分子 區分成數個核苷酸片段，俾供本案藏密方法的後續步驟之用。 由於構成DNA分子的核苷酸殘基主要包含腺嘌呤(a)、胸腺 嘧啶⑴、胞嘧啶(c)、鳥嘌伶(g)這四種鹼基，熟習此項技術人士 5 可就這四種鹼基的不同排列順序來事先定義各個鹼基排列順 序所代表的意義，以便用於將一段有意義的文字或訊息編碼成 為一核苷酸序列碼條。在本發明中，被一製造者所預先設計或 是預先定義的一個秘密訊息可以根據一選定的核苷酸密碼編 释表來編碼出一核苷酸序列碼條。核苷酸密碼編譯表可為熟習 10 此項技術人士自行設計，或是採用習知的摩斯密碼表或是US 6,312,911中所提到的密碼表等等。 以下將參照第1·3圖來說明如何進行本發明的藏密方法，並 對當中所提到一些術語作一定義。 在本發明所稱的「定序辨識序列」係指一個DNA片段，其 [5 所具核苷酸序列相同於一個將被使用於DNa的定序反應中的 疋序引子所具之序列。 在本發明所稱的「第一接合產物」，是指一個藉由將一定序 辨識序列連接至一帶有秘密訊息的一個部分的核苷酸片段之5， 端或是3,而形成的產物。 10 1 在本發明所稱的「第二接合產物」，是指—個藉由將一個順 向引子辨識序列以及—個反向引子辨識序列分別連接至已建 構出的第-接合產物的5,端處以及3，端處而形成的產物。 在本發明所稱的「順向引子辨識序列」，是指-個DNA片 -所八核#酸序列係相同於要藉由技術來擴增一標的 11 1326308 DNA分子時所用的一個順向引子之核苷酸序列。 在本發明所稱的「反向引子辨識序列」，是指一個DNA片 段’其所具核苷酸序列係互補於要藉由PCR技術來擴增一標的 DNA分子時所用的一個反向引子之核苷酸序列。 5 在本發明所稱的「插入序列（·.·）」’是指一個不帶有任何意 義的核苦酸序列，其係用以混淆帶有秘密訊息的核智酸片段、 順向引子辨識序列、定序辨識序列、反向引子辨識序列等之所 在位置，俾以增加序列的解密複雜度。 現在參見第1圖所示，其示意說明如何利用本發明之藏密方 10 法而將一帶有秘密訊息的DNA分子隱藏於數個載體内。現在假 設有一製造者想要將“MADE IN BWL”這個秘密訊息隱藏於自 己所生產的某項產品，俾防止該產品被仿冒。於是，該製造者 可利用一選定的核#酸密碼編譯表來將“MADE IN BWL”這個 秘密訊息編碼出一核苷酸序列碼條。為方便說明，現在假設 15 “MADE IN BWL”經選定的核苜酸密碼編譯表所編碼出的核# 酸序列碼條即是“agcttgcgctccgatgca，’(序列辨識編號：1)。 於是’熟習此項技術人士即可根據上述核苷酸序列碼條所 示來合成出一個真正的全長DNA序列，繼而將之切成數個核誓· 酸片段；或者，熟習此項技術人士可將該核普酸序列碼條區分 20 成為數個部分，然後各別地合成出對應於各個部分之核苷酸片 段。 為方便說明之故，上面所舉核替酸序列碼條含有18個核苷 酸殘基，但熟習此項技術人士可以理解到的是，本發明在實際 使用上並不受此所限制》事實上，攜帶有該秘密訊息的〇1^入分 12 1326308 子可以包含有多個各自帶有4〜10000個核：f酸殘基(較佳為1〇 〜5〇00個核有酸殘基’更佳為2〇〜5〇〇個核省r酸殘基，又更佳 為50〜150個核名酸殘基）的核者酸片段。 有關DNA序列或核增酸片段的人工合成方式包括使用 5 DNA合成儀以及重組DNA技術》 就上述所例示的核苷酸序列碼條“agcttgcgctccgatgca，，(序列 辨識編號.1 )，現在將其區分為三個部分，亦即核贫酸片段1 “agct”（序列辨識編號：2)、核苷酸片段2 “tgcgct，，（序列辨識編 號：3)以及核苷酸片段3 “ccgatgca，，（序列辨識編號：句，並以 10 DNA合成儀合成出這三個核苷酸片段。這些核苷酸片段接著可 參照第2圖或第3圖所示來續行本案藏密方法。 以第2圖為例，首先於核苷酸片段1 2)的5’端處連接上一個定序辨識序列， 合產物。或者，也可如第3圖所示，在; agct”（序列辨識編號： 15 列辨識編號：2)的3’端處連接上一 成一個第一接合產物。 列’藉此而形成一個第一接 ，在核苷酸片段1 “agct”（序 個定序辨識序列，藉此而形 依據本發明，可被用於連接至各個财酸片段的5,端或3
引子辨識序列以及在其3,端處連接以一 的5’端處連接以一個順向 —個反向引子辨識序列， 13 1326308 藉此而形成一個個別的第二接合產物° 為方便說明之故，於此皆使用一具有序列辨識編號：6所示 的核替酸序列“gcgcgctaataactacacattta”來作為該順向引子辨識 序列，以及一具有序列辨識編號：7所示的核杳酸序列 5 “cccgggc.tcttatatatttcaattt”來作為該反向引子辨識序列。 依據本發明，該順向引子辨識序列與該反向引子辨識序列 可各自含有4〜1〇〇個核苷酸殘基，較佳為1〇〜5〇個核;I：酸殘 基，更佳為1S〜3〇個核苷酸殘基。 如想增加該秘密訊息被破解之困難度，此時可以在該第一 10接合產物的5’端處（第2圖）或者3’端處（第3圖）連接上一個插入 序列（…），該插入序列的核爷酸序列不同於該帶有一部分的秘 密訊息的核笮酸片段所具者。該插入序列可含有4〜1〇〇〇個核 苷酸殘基，較佳為10〜500個核苷酸殘基，更佳為5〇〜2〇〇個核 酸殘基。 15 然後’如第2圖所示’於已接上有該插人序列的該第-接合 產物的5,端處連接以-個順向引子辨識序列，並於3，端處連接 以一個反向引子辨識序列。 或者，可如第3圖所*，在該第一接合產物的3，端處連接上 20
個插入序列（..·）’ ‘然後，於已接上有該插人序列的該第一接 合產物的5,端處連接以-個順向引子辨識序列，並於3,端處連 接以一個反向引子辨識序列。 當完成該順向引子辨識序列與該反向引子辨識序列之連接 所形成的產物可以藉由本技藝所慣㈣PCR技術來擴增至 所需的數1 ’而後置玫至於—指定的媒介物中，於是該秘密訊 14 1326308 息的每一個部分即被隱藏。 或者，當完成該順向引子辨識序列與該反向引子辨識序列 之連接後，所形成的個別產物可以藉由本技藝所慣用的PCR技 術來擴增至所需的數量，繼而藉由本技藝所慣用的基因工程技 5 術將所得到的擴增產物插入至一可攜帶DNA片段的載體（參見 第2與3圖中以™表示之部分）内。這些習用的基因工程技術包 括限制哲^之選闱、以限制喊來剪切DNA攜帶載體、黏合端的處 理等等，是廣為熟習此項技術人士所知曉並被運用於他們的例 行操作技術中者。
10 依據本發明，要被用來攜帶所得到的第二接合產物之DNA 攜帶載體彼此可以是相同的或是不同的。此外，若該攜帶載體 夠大，亦可將所得到的該等第二接合產物置放於同一載體之不 同插入位置處。 第1圖顯示要將上述所提到的三個各自帶有該秘密訊息的 15 一個部分之核枣酸片段分別置放至載體1、載體2與載體3内。 如想增加該秘密訊息被破解之困難度，可令該等個別的第 二接合產物或是攜帶有個別的第二接合產物之載體來與被確 認不會干擾到秘密訊息之日後解密工作的基因組DNA或隨機 合成的大量DNA相混合，繼而將形成的混合物置放於一指定的 20 媒介物中。
相較於US 6,312,911 (該案為了降低秘密訊息被破解的機 率而使用含有高達3xl09個鹼基對的人類基因組DNA來藏匿該 秘密訊息），本發明所提供的方法因為可以將秘密訊息分散，而 能使用鹼基對數目較低或是具有不同長度之寡核喵元的DNA 15 1326308 來藏匿帶有秘密訊息的核著酸分子，同時又能維持這些帶有秘 密訊息之各個核嘗酸分子被隱藏時的高隱密性。 另一方面，因為使用上述「定序辨識序列」、「順向引子辨 識序列」、「反向引子辨識序列」以及「插入序列（·..）」，本發 5 明更具有以下優點。 要供連接至帶有秘密訊息的一個部分的每一個核爷酸片段 之定序辨識序列各自可以是相同的或是不同的，而順向引子辨 識序列與反向引子辨識序列也是一樣，如此，在無法了解全部 的定序辨識序列、順向引子辨識序列與反向引子辨識序列之情 10 況下，將會使得依據發明之藏密方法而被隱藏的秘密訊息更難 被破解。 另外，該插入序列與DNA攜帶載體之使用可進一步提高依 據發明之藏密方法而被隱藏的秘密訊息的隱密性。特別地，該 插入序列可提供混淆作用，而使得與定序辨識序列相連接的秘 15 密訊息更不易被識破》 依據本發明，要用來藏匿秘密訊息之媒介物可選自於由下 列所構成之群組：紙、玻璃、塑膠、硝基纖維素層、聚碳酸酯 層、尼龍層以及織物。而且該等個別的第二接合產物或是攜帶 有個別的第二接合產物之載體可被藏匿於相同或不同的媒介 20 物内。在一較佳具體例中，該秘密訊息被藏匿於一塑膠薄膜上。 如此所製成的該等媒介物即可被用來標記一所欲鑑定物品 或是任何需要鑑定的物品，以作為防止仿冒或是偽造鑑定之 用。或者該等媒介物即可被用來傳輸秘密訊息。 本發明應用的方向眾多，例如可以將攜帶有秘密訊息的 16 1326308 DNA分子混合以諸如顏料、膠水、塑脂、油墨等特定材料，俾 以當做一種DNA隱性防偽油墨。而因為不同商業化產品之需 求，本發明之藏密方法也可因應印鈔技術之底紋、螢光印刷、 微細字等多元化選擇而被應用於要隱藏秘密訊息的在標籤印 5 刷上。 另外，依據本發明而被隱藏起來的秘密訊息也具有使用時 用量省，成本低廉且可與許多印刷技術做整合之優點。例如， 可被大量使用於一般公司企業的重要或是機密文件；金融產業 的存摺或是諸如股票、支票以及鈔票的有價證券；百貨公司或 10 倶樂部之會員卡或折價券、繪畫或雕塑或其他手製物品之藝術 品以及諸如其他彩券、郵票、海關貼條、貴賓券、紡織品、纖 維以及染料等應用上。 DNA本身是無毒性的，在經過預先設計之後，本身就是一 種獨特的DNA標記，所以依據本發明之藏密方法而被隱藏的秘 15 密訊息甚至可被放入至可食性材料内或是被應用於醫藥產業 上，例如健康食品、製藥產業中所使用之錠劑（例如膠囊、膜衣 錠、糖衣錠）、藥片表面印製；或是被隱藏在食品包裝物上，例 如鋁箔包之内部包裝、包裝盒或包裝瓶之外部包裝上。 當然，依據本發明之藏密方法而被隱藏的秘密訊息也可直 20 接標記於一活體或是有機體，例如重要的植株、疫苗、動物等 等具有有高經濟價值的相關生技產物。 另外，本發明也預期到對一所欲鑑定之標的物體内去判斷 是否為一仿冒品之應用而提供一種自一待鑑定之標的物體内 檢測或是解密一秘密訊息的方法，其中該秘密訊息是一製造者 17 1326308 或是企業者所事先設計，且係如本發明的前述說明所示，是以 數個核苷酸片段而被預先地隱藏於該標的物内。於是本發明能 藉由檢測一標的物中是有該秘密訊息的存在而被應用於判斷 該標的物是否為特定製造者或使用者所擁有或是為遭受偷取 5 之贓物。 而欲查證一待鑑定之標的物體内是否藏匿有一依據本案 藏密方法而被隱藏的秘密訊息，本發明亦提供一種用以將一被 攜帶於一 DNA分子内並藉由上述藏密法而被隱藏的秘密訊息 予以解密的方法，其包含下列步驟： 10 (a)從被懷疑帶有被隱藏的秘密訊息的媒介物上分離出 DNA物質； (b) 藉由使用數組各由一個順向引子以及一個反向引子所 構成的PCR引子對作為第一解密鑰匙來擴增得自於步 驟(a)的DNA物質，其中各組PCR引子對的順向引子的 15 核竽酸序列相同於在上述藏密方法的步驟(c)中為一個 第一接合產物所用的一個順向引子辨識序列的核笮酸 序列，而各組PCR引子對的反向引子所具核苷酸序列 是互補於在上述藏密方法的步驟(c)中為同一個第一接 合產物所用的一個反向引子辨識序列的核省酸序列，藉 20 此而得到個別的PCR產物，其中各個PCR產物各自包 含有從上述藏密方法的步驟（c)所得到的一個第二接合 產物的核苷酸序列； (c) 藉由使用數個定序引子作為第二解密鑰匙來進行得自 於步驟(b)的個別PCR產物之核埼酸定序，其中各個定 18 1326308 序引子所具核有酸序列是各自相同於在上述藏密方法 的步肆(b)中為該DNA分子的-個核：§：酸片段所用的一 個定序辨識序列所具者，藉此而得到_的定序產物， 其中各個定序產物各自對應於從上述藏密方法的步驟 5 (b)所得到的一個第一接合產物； (d)對於步驟(c)所得到的各個定序產物，將各個定序產物扣 除掉所用的對應定序引子之部分以推算出位在該各個 定序產物内之對應於在上述藏密方法的步驟(b)所使用 的各個核·#酸片段之核酸序列； 10 (e)利用—鹼基殘基順序解密機構(decoding mechanism for the base residue order)來排列由步驟⑷所推算出的.該等 核苷酸序列之順序，藉此，一帶有秘密訊息且藉由上述 藏法、方法而被隱藏於一媒介物内的DNA分子的全長核 苷酸序列被推算出；以及 15 ⑴依據一指定的核瞀酸密碼編譯表來解讀從步驟(d)所推 舁出的DNA分子的全長核苦酸序列，藉此，被隱藏於 該DNA分子内的秘密訊息被解讀出。 以下將參照第4 - 7圖來說明如何進行本發明的解密方法。 參見第4圖，首先，對懷疑帶有依據上述藏密方法（圖式第 20 1-3圖）而被隱藏的秘密訊息的媒介物進行分離DNA物質之處 理，而後以選定的PCR引子來對所分離出的DNA物質進行PCR 反應。 依據本發明，在該PCR反應中所用的PCR引子係經選定來 作為第一解密輸匙，因此，各組PCR引子對當中的個別順向引 19 1326308 子與反向引子係依據當初藏密方法當中所用的順向引子辨識 序列以及反向引子辨識序列而被提供。於是，依照前面所用到 的順向引子辨識序列“gCgCgCtaataactacacattta”(序列辨識編號： 6)以及反向引子辨識序列序列“cccgggctcttatatatttcaattt，，(序列辨 5識編號：7)，於此提供具有核苷酸序列相同於該順向引子辨識 序列的順向引子以及具有核苷酸序列互補於該反向引子辨識 序列的反向引子。當然地，該順向引子與該反向引子會因應所 用的順向引子辨識序列與反向引子辨識序列而變化。 若所檢測的DNA物質裡面確實帶有依據前述藏密方法而 10被隱藏的秘密訊息，即可由所用的PCR引子擴增出如第4圖所示 之PCR產物，而各個PCR產物各自包含有從前述藏密方法的步 驟(c)所得到的一個第二接合產物的核书酸序列。例如，參見第 4圖所示，因為前述藏密方法涉及3個核苷酸片段，經過pcR擴 增後生成3個PCR產物》 15 一旦上述的PCR反應有生成PCR產物，即可進行下一步的 定序反應，其中使用數個定序引子來作為第二解密錄匙，而且 所用的定序引子係根據前述藏密方法的步驟(b)中為該dna分 子的一個核膂酸片段所用的—個定序辨識序列來予以選定。有 關定序反應的進行，可以使用傳統的DNA定序儀（dna 20 sequencer)或派羅序列分析法(pyr〇sequence〇 於是’參見第5圖’依照前面所用到的定序辨識序列 “atcaatacttataamgg«，，(序列辨識編號：Q，於此提供具有核替酸 序列相同於該定序辨識序列的定序引子。 ’所得到的定序 可了解到的是，當進行核苷酸定序反應時 20 產物不僅包括定序 核替酸片段，還、列部分與帶有秘密訊息的—部份之 子辨識序列的部分\會讀^於順向引子辨識序列或是反向引 明所用的順向引子與^疋可以予以控制的…來’因為本發 的順向引子辨識序丨子係、分別對應於藏密方法中所用 即可扣除掉屬於這/是反向引子辨識序列，被定序出的序列 序反應被控制在進/部分的序列。另外，也可以使核苛酸定 止，即不會讀「秘密訊息」的核智酸序列後就停 4出其他不相干的驗基殘基。 10 疋對於所得到的各個定序產物，將各個定序產物扣除
掉所用的_⑽谢，即爾綠娜個定序I 物内之對應於在前述藏密方法的步驟⑻所使用的各個核苦酸 片段之核书酸序列。 為確認上述所得到的定序產物内的被推算出是帶有秘密 訊息的核#酸序列之順序，俾以推算出被隱藏於媒介物内的 15 DNA分子的全長核甘酸序列，可利用一驗基殘基順序解密機構 (decoding mechanism for the base residue order)來進行序列的排 列推算。 在本發明之一較佳具體例中，該鹼基殘基順序解密機 構可以包括作為第三解密鑰匙之數個鹼基殘基順序碼。其 20 中，該等鹼基殘基順序碼係根據所提供的該DNA分子的數 個核#酸片段的順序而被以設計，藉此，該等鹼基殘基順 序碼的數目比該DNA分子的核#酸片段的數目少一個，而 且每個鹼基殘基順序碼具有一段序列，依照該DNA分子的 數個核杏酸片段的順序，是契合於（match with)該DNA分 21 1326308 子的數個核苷酸片段當中前，者的3’端部分之驗基殘基序列連 接以（linking to)該DNA分子的數個核苷酸片段當中後一者的5, 端部分之鹼基殘基序列。 第6圖例示說明使用兩個驗基殘基順序碼“cctge，，(序列辨識 5編號：8)與“gctccg，，(序列辨識編號.9)來作為第三解密錄趣的 核苷酸片段排序方式。 在本發明之另一個較值異體例中，該鹼基殘基順序解密機 構可以包括： (i) 一作為第三解密鑰匙之鹼基殘基順序碣來供與步驟(d) ° 所推算出的該等核奢酸序列進行比對，其中該鹼基殘 基順序碼係根據上述藏密方法的步驟(a)中所提供的 DNA分子之驗基殘基順序來予以設計，但省略掉該 DNA分子上被重複的鹼基殘基，藉此，從步驟(d)所推 算出的該等核苷酸序列之順序可被至少部分地確定； 5 以及 (U) —作為第四解密鑰匙之鹼基殘基出現頻度碼來供與步 驟(d)所推算出的該等核苷酸序列進行鹼基殘基出現頻 度的比對，其中該鹼基殘基出現頻度碼係根據上述藏 密方法的步驟(a)中所提供的DNA分子之鹼基殘基出現 Ό 頻度來予以設計，藉此，在與⑴中的鹼基殘基順序碼 合用下，該帶有秘密訊息且藉由上述藏密方法而被隱 藏於媒介物内的DNA分子的全長核昔酸序列被推算 出。 第7圖例示說明使用上述一個驗基殘基順序碼 22 1326308 “agctgcgctcgatgca”（序列辨識編號：10)來作為第三解密錄匙以 及一個鹼基殘基出現頻度碼“1112111112111111”來作為第四解 密鑰匙的核苷酸片段排序方式。 於是，當推算出的DNA分子的全長核苷酸序列後，即可依 5 據一指定的核苷酸密碼編譯表來解讀出被隱藏於該DNA分子 内的秘密訊息。 對於上述第二種較佳實施例中所使用的第三解密鑰匙以 及第四解密鑰匙，在本發明中可以利用揭示於us 6,21〇,891所 示之核#酸定序技術來得到攜帶有該秘密訊息的數個核笮酸 10 片段。 以現今技術而言，熟習此項技術人士有可能會利用隨機引 子(random primer)來去除雜訊，之後進一步使用減數聚合碑連 鎖反應（subtracting PCR)技術’而藉此提咼帶有秘密訊息的核苷 酸序列被找出的機率。再者，自2002年後，許多物種的基因序 15 列被·--定序’而現今電腦分析資料的功能強大，一經基因庫 的核苷酸序列比對後，即可能致使人類基因體DNA序列中帶有 秘密訊息之一特定核苷酸序列之全部序列被破解，而暴露出那 些提高帶有秘密訊息的核并酸序列。 而如上述，可使人了解的是，為了進一步降低秘密訊息被 20 破解的機率’在本發明中的定序辨識序列與順向引子辨識序列 或反向引子辨識序列係事先經過設計，因此，在不知它們的序 列時，是無法進行聚合_連鎖反應以及定序反應的。因此，縱 使有心人士大費周章地利用隨機引子而自基因組DNA與隨機 合成的DNA中獲得許多核杳酸片段，在不知定序引子序列為何 23 之情況下，該有心人士仍然無法了解被藏匿的DNA分子的核苷 酸片段才是真正的秘密訊息所在。另外，縱使有一個定序引子 辨識序列所對應的定序引子被找出，因為秘密訊息被藏匿於不 同的核#酸片段中，有心解密的人士也僅能解讀出該秘密訊息 5 的一個部分，而無法窺知完整的秘密訊息。 另外，欲說明的是，依據本發明之藏密方法與解密方法可 被應應於企業體的供應鏈管理之中，來對商品的製造、物流與 檢測做不同程度的管理。例如，可以由總公司制定一段秘密訊 息而放入商品中一起被製造，當有需要檢測有問題的商品時， 10 可以將第一解密鑰匙交由一檢測單位來執行，以進行初步檢 驗，並藉由有無PCR產物的出現，先做初步判斷以快速達到時 效管制。進一步地，若需要確認秘密訊息的核笮酸序列，僅需 再提供第二解密鑰匙便能得到帶有該秘密訊息的許多核苷酸 片段。接著，可能握有第三解密鑰匙（或者還有第四解密鑰匙) 15 的通貨商，即可比對序列次序有無錯誤。所以便能建立起商品 的多重追蹤選擇，來進行供應鍊管理。 於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入 本案作為參考資料。若有所衝突時，本發明的詳細說明（包含界 定在内）將佔上風。 20 雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不 背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此 意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限 制。 【圖式簡單說明3 24 1326308 第1圊示意說明如何利用本發明之藏密方法而將一帶有秘 密说息的DNA分子隱藏於數個DNA載體内； 第2圖示意說明’如何利用本發明之藏密方法而將第1圖中 所示的該帶有秘密訊息的她分子的一個核f酸片段(㈣從 5其5’端幻端依序地連接以—順向引子辨識序列卜一插入序列 ()疋序辨識序列1以及一反向引子辨識序列卜繼而再被 插入至-個可攜㈣NAr的紐（以—^表示）内； 第3圖7^說明’如何利用本發明之藏密方法而將第1圖中 所不的該帶有秘密訊息的⑽八分子的一個核誓酸片段㈣從 10其5端至3端依序地連接以—順向引子辨識序列卜一定序辨識 序列1、㉟入序列（...）以及一反向引子辨識序列】，繼而再被 插入至-個可攜帶DNAW的載體（以 〜來表示）内； 第4圖tit意說明如何利用本發明之解密方法，使用3組pcR 弓丨子對作為第-解密料來對3個被懷疑帶有要被解密的核誓 15 m之載體進行擴增反應，而得到3個產物； 第5圖7F意說B月如何利用本發明之解密方法使用3個定序 引子作為第一解密錄思來定序第3圖中所得到的3個pcR產物， 而得到3個定序產物； S 6圖4明如何利用本發明之解密方法使用數個驗基 2〇殘基順序碼作為第二解密餘匙來與第4圖中所得到的3個定序 產物進行㈣料—料錄順序比對 ，而推算出一具有對 應於第1圖中所7F的該帶有秘密訊息的DNA分子的全長核普酸 序列；以及 第7圖不意說明如何利用本發明之解密方法，使用-個驗 25 1326308 基殘基順序碼作為第三解密鑰匙以及一個鹼基殘基出現頻度 碼作為第四解密鑰匙來與第4圖中所得到的3個定序產物進行 核替酸序列的鹼基殘基順序比對，而推算出一具有對應於第1 圖中所示的該帶有秘密訊息的DNA分子的全長核苷酸序列。 5 【圖式之主要元件代表符號表】 (無）
26 <110>1326308 <120〉 <130> <160〉 <170> <210〉 <211〉 <212> <213> <400> 序列表 博微生物科技公司 梁明華 用以隱藏一被攜帶於一 DNA分子內的秘密訊息的方法以及用以將 一藉由該隱藏方法而被隱藏的秘密訊息予以解密的方法 NP-17231-TWN 7
WinWord2000 1 18
DNA 人工序列 1 agcttgcgct ccgatgca 18
<210〉 <211> <212> <213〉 <400> DNA 人工序列 2 agct 4 27 1326308 <210〉 3 <211> 6 <212> DNA <213〉人工序列 <400〉 3 tgcgct 6
<210> 4 <211〉 8 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400〉 1 ccgatgca 8 <210> 5
<211> 20
<212> DNA <213〉人工序列 <220>定序引子 <223>用於秘密訊息之定序 <400〉 5 atcaatactt ataatttggtt 20 28 1326308
<210> 6 <211> 23 <2\2> DNA <an> <220>順向引子 <223>用於秘密曾 <40Q> 6 gcgcgctaat aactacacat tta 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> AD^iJ <220>反向引子 <223〉用於秘密 <400> 7 cccgggctct tatatatttc aattt 25 <21Q> 8 <211> 5 <212> DNA <213> ΛΙ^Ο <220> <223〉肅秘概营激序 <40Q> 8 cctgc 5
29 1326308 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> AI^IJ <220> <223〉用於秘密訊微，序 <400> 9 gctccg
<210> 10 <211> 16 d2> DNA <213〉人工 <220> <223〉用於秘密訊害雜序 <400> 10 16 agctgcgctc gatgca
30
Claims (1)
1326308 辦年q月v/曰修(更)正本 公告本 拾了>請專利範圍 1 · 一種用以隱藏一被穩帶於一 DNA分子内之秘密訊息（secret information)的方法，其包含下列步驟： (a) 提供一攜帶有一秘密訊息的DNA分子，該DNA分子係 由複數個核苷酸片段所構成，且每一該等核苷酸片段各 自帶有該秘密訊息的一部分；
(b) 將每一該等核苷酸片段的5’端或3’端處分別連接一定序 辨識序列，藉以形成一第一接合產物； (c) 於該第一接合產物的5’端處連接一順向引子辨識序列， 以及於其3’端處連接一反向引子辨識序列，藉以形成一 第二接合產物；以及 (d) 將該第二接合產物置放於一預設的媒介物中。 2.如申請專利範圍第1項所述的方法，其中構成攜帶有該秘密 訊息之該DNA分子的該核苷酸片段係藉由包含下列步驟的 方法所獲得：
⑴依據一預設的核苷酸密碼編譯表將該秘密訊息編碼成 一核苷酸序列碼條；以及 (ii)將該核苷酸序列碼條分成數個部分，並分別藉由人工合 成方式合成出對應於該核苷酸序列碼條的該核苷酸片 段。 3.如申請專利範圍第1項所述的方法，其中構成攜帶有該秘密 訊息之該DNA分子的該核苷酸片段係藉由包含下列步驟的 方法所獲得： (i’）依據一預設的核苷酸密碼編譯表將該秘密訊息編碼成 31 1326308 一核苷酸序列碼條；以及 (ii’）藉由人工合成方式合成出一對應於該核苷酸序列碼條 的該DNA分子，並將該DNA分子區分成複數個該核苷 酸片段。 4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該DNA分子係藉由 限制酶處理而被區分成複數個該核苷酸片段。
5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該定序辨識序列係 連接於每一該核苷酸片段的5’端。 6. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中被連接於每一該核 苷酸片段之該5’端的該定序辨識序列是彼此相同或不同 的。 7. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中步驟(b)之該第一接 合產物的該5’端進一步連接一插入序列，且該插入序列的 核苷酸序列係不同於該該核苷酸片段所具有者。
8_如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該定序辨識序列係 連接於每一該核苷酸片段的3’端。 9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中被連接於每一該核 苷酸片段之該3’端的該定序辨識序列是彼此相同或不同 的。 10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中步驟(b)之該第一接 合產物的該3’端進一步連接一插入序列，且該插入序列的 核苷酸序列係不同於該該核苷酸片段所具有者。 11. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該媒介物係選自 紙、玻璃、塑膠、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層以 32 1326308 及織物所組成之族群。 12. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該等個別的第二接 合產物被置放在相同的該媒介物内。 13. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中於步驟(c)中進一步 包含將個別的該第二接合產物插入一用以攜帶DNA片段的 載體内之步驟。 14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該載體係為彼此 相同。 15. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中該媒介物係選自 紙、玻璃、塑膠、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層以 及織物所組成之族群。 16. —種用以將藉由如申請專利範圍第1項所述的方法所隱藏 之該秘密訊息予以解密的方法，其包含下列步驟： (a) 從被懷疑帶有隱藏的該秘密訊息之媒介物上分離出 DNA物質； (b) 藉由使用複數組各由一順向引子以及一反向引子所構 成的PCR引子對作為第一解密鑰匙，以擴增該DNA物 質，其中該順向引子的核苷酸序列係相同於該順向引子 辨識序列的核苷酸序列，而該反向引子的核苷酸序列則 係互補於該反向引子辨識序列的核苷酸序列，藉此而得 到個別的PCR產物； (c) 藉由使用複數個定序引子作為第二解密鑰匙以進行 PCR產物之核苷酸定序，其中該些定序引子所具有之核 苷酸序列是相同於該些定序辨識序列，藉此而得到個別 33 1326308 的定序產物； (d) 將該些定序產物扣除其相對應的定序引子部分，以推算 出該些定序產物内之該核苷酸片段的核苷酸序列； (e) 利用一鹼基殘基順序解密機構(dec〇ding mechanism for the base residue order)來排列該些核苷酸片段之核苷酸 序列的順序，藉以推算出攜帶有該秘密訊息之該DNA 分子的全長核苷酸序列；以及 (f) 依據該預設的核苷酸密碼編譯表解讀該DNA分子的該 全長核苷酸序列。 17.如申請專利範圍第16項所述的方法，其中該鹼基殘基順序 解密機構包括一作為第三解密鑰匙之複數個鹼基殘基順序 碼’其係用以供該些核苷酸片段之該核苷酸序列進行排序 比對’其中該鹼基殘基順序碼係根據該DNA分子的複數個 該核苷酸片段的順序來設計，且該鹼基殘基順序碼係由一 契合於(match with)該DNA分子中兩相連該核苷酸片段中 前者的3’端部分之鹼基殘基序列，以及後者的5,端部分之鹼 基殘基序列。 18·如申請專利範圍第16項所述的方法，其中該鹼基殘基順序 解密機構包括： (i) 一作為第三解密鑰匙之鹼基殘基順序碼，其係用以供該 些核苷酸片段之該核苷酸序列進行排序比對，其中該鹼 基殘基順序碼係根據該DNA分子之鹼基殘基順序所設 計’但省略掉該DNA分子上被重複的鹼基殘基；以及 (ii) 一作為第四解密鑰匙之鹼基殘基出現頻度碼’其係用以 34 1326308 供該些核苷酸序列進行鹼基殘基出現頻度的比對，其中 該鹼基殘基出現頻度碼係根據該DNA分子之鹼基殘基 出現頻度所設計。 19. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中該媒介物係選自 紙、玻璃、塑膠、硝基纖維素層、聚碳酸酯層、尼龍層與 織物所組成之族群。
20. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中作為該第一解密 鑰匙用的該複數組PCR引子對中之該順向引子係彼此相同 或不同的。 21. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中作為該第一解密 鑰匙用的該複數組PCR引子對中之該反向引子係彼此相同 或不同的。 22. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中作為該第二解密 鑰匙用的該複數個定序引子是彼此相同的。
23. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中作為該第二解密 鑰匙用的該複數個定序引子是彼此不同的。 35
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